FR2461001A1

FR2461001A1 - Culture du micro-organisme streptomyces zelensis

Info

Publication number: FR2461001A1
Application number: FR7918124A
Authority: FR
Inventors: Ladislav James Hanka; David Glenn Martin
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1977-10-17
Filing date: 1979-07-12
Publication date: 1981-01-30
Also published as: SU797591A3; FR2405956A1; DE2841361A1; US4169888A; CH643564A5; GB2008088A; FR2405956B1; JPS5464695A; GB2008088B; IT7828063A0; NL7809639A; FR2461001B1

Abstract

L'INVENTION SE SITUE DANS LE DOMAINE DES ANTIBIOTIQUES. ELLE CONCERNE UNE CULTURE DU MICROORGANISME STREPTOMYCES ZELENSIS PRESENTANT LES CARACTERISTIQUES DE LA SOUCHE NRRL 11183 ET CAPABLE DE PRODUIRE L'ANTIBIOTIQUE CC-1065, PAR FERMENTATION DANS UN MILIEU NUTRITIF. CETTE CULTURE MONTRE UNE ACTIVITE CONTRE LES BACTERIES GRAM-POSITIVES AINSI QUE CONTRE LES BACTERIES GRAM-NEGATIVES.

Description

La présente invention concerne un antibiotique nouveau appelé antibiotique

CC-1065, que l'on peut préparer par fermentation dans des conditions contrôlées avec une culture biologiquement pure d'un micro- organisme nouveau, Streptomyces zelensis NRRL 11 183. L'antibiotique CC- 1065 est actif contre diverses

bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Par exemple, l'an-

tibiotique CC-1065 est actif vis-à-vis de Proteus vulgaris et

on peut donc l'utiliser comme préservateur de l'huile pour inhi-

ber le développement de cette bactérie, dont on connaît l'apti-

tude à altérer cette matière. Cet antibiotique peut aussi être utilisé dans des solutions de lavage à usage sanitaire. Comme l'antibiotique CC1065 est actif contre Bacillus subtilis, on peut l'utiliser pour traiter les élevages de vers à soie afin

d'éviter ou de minimiser les infections bien connues que pro-

voque cette bactérie.

D'autres caractéristiques et avantages de l'in-

vention ressortiront de la description détaillée qui va sui-

vre. Propriétés chimiques et physiques de l'antibiotique CC-1065

Poids moléculaire: environ 700.

Analyse élémentaire: trouvé: C = 61,06; H = 4,92;

N = 13,17 %.

Spectre d'absorption ultraviolet: une solution de l'antibioti-

que CC-1065 dans le dioxanne présente une forte absorption ter-

minale avec des inflexions à 230 nm (absorptivité a = 68,00)

et 258 nm (a = 51,10) et un maximum à 364 nm (a = 66,10).

Spectre d'absorption infrarouge: l'antibiotique CC-1065 pré-

sente un spectre d'absorption infrarouge caractéristique, en pâte dans l'huile minérale, compris dans la plage des nombres d'ondes (cm 1) de 3800 à 600, comme le montre la figure 1. Le

spectre illustré par la figure 1 a été obtenu avec un spectro-

photomètre "Digilab" modèle 14 D à transformation de Fourier, la transmission (%) étant représentée en ordonnées et le nombre

d'ondes (cm -) étant représenté en abscisses.

On observe des pics aux longueurs d'ondes indi-

quées ci-après, qui sont exprimées en cm 1 Les pics à 2960, 2920, 2850, 1465 et 1377 cm- sont dus en partie aux vibrations

2 2461001

des liaisons C-H aliphatiques de l'huile minérale.

Légende: F = fort; M = moyen; f = faible; é = épaulement.

Fréquence des bandes (nombre d'ondes) Intensité

3460 F

3350 F

3230 F, é

2960 F

2920 F

2850 F

2610 M

1635 F

1610 F, é

1570 F

1520 F

1480 F, è

1465 F

1445 F

1420 F

1403 F

1377 F

1354 F

1333 F

1304 F

1268 F

1243 M, é

i187 M

1175 M

1156 M

1125 M

1100 M, é

1078 M

1047 M

1023 M

1005 M

962 f 948 f 918 f 888 f

3 2461001

Fréquence des bandes (nombre d'ondes) Intensité

856 M

805 M

779 f 760 f

737 M

678 f Solubilités: L'antibiotique CC-1065 est soluble dans des

solvants tels que le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide,.

l'acétone, le chlorure de méthylène, l'acétate d'éthyle, le

dioxanne et le chloroforme.

Spectre de résonance magnétique des noyaux de 13C Le spectre RMN du 3C de l'antibiotique CC-1065 à 20 MHz est illustré par la figure 2. Ce spectre RMN du 13C a été enregistré sur un spectromètre "Varian CFT-20" pour une

solution (.1,0O ml;-v-75 mg/l) d'un échantillon de l'antibio-

tique CC-1065 dans le diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6). On règle le spectre sur la raie centrale du DMSO-d6 à laquelle

on attribue la valeur de 39,6 ppm par rapport au tétraméthyl-

silane auquel correspond la valeur O ppm. On enregistre les

fréquences en ppm par rapport au tétraméthylsilane.

Spectre de résonance magnétique des protons Le spectre de RMN-1H de l'antibiotique CC-1065 à 100 MHz est illustré par la figure 3. On a enregistré le spectre RMN de 1H sur un spectromètre "Varian XL-100-15", pour

une solution (-.v O,5 ml; e.150 mg/ml) d'un échantillon d'an-

tibiotique CC-1065 dans le diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6).

Le spectre a été établi par rapport au tétraméthylsilane uti-

lisé comme étalon interne et les fréquences ont été exprimées

en ppm par rapport au tétraméthylsilane.

Spectre antibactérien de l'antibiotique CC-1065

L'antibiotique CC-1065 est actif contre les di-

verses bactéries Gram-positives et Gram-négatives et les divers

champignons indiqués dans le tableau ci-après. Le mode de dé-

termination est le suivant:

On détermine la concentration inhibitrice mini-

male selon des méthodes classiques d'évaluation du pouvoir bac-

téricide en utilisant des dilutions de facteur 2 de l'anti-

biotique dans du bouillon coeur-cervelle (Difco Lab., Détroit, Michigan). Les inoculums sont des cultures d'environ 18 heures des organismes étudiés, diluées de façon que la population finale soit d'environ 105 cellules/ml. On fait incuber les tu-

bes à 28-37"C pendant 42 heures. Pour déterminer la concentra-

tion inhibitrice minimale, on transfère 0,1 ml de bouillon des tubes de 42 heures ne présentant pas de croissance dans 10 ml de bouillon ne contenant pas d'antibiotique; on considère que

les tubes ne présentant pas de croissance en 24 heures corres-

pondent à une concentration bactéricide. On utilise très avan-

tageusement pour la culture des champignons un bouillon renfer-

mant 0,5 % de phosphate monopotassique, 3,0 % de dextrose et

0,7 % d'extrait de levure.

Micro-orqanismes Bactéries Gram-positives: Staphylococcus aureus UC 76 Staphylococcus aureus UC 552 Staphylococcus aureus UC 70 Staphylococcus aureus UC 3665 Bacillus subtilis UC 564 Streptococcus pyogenes UC 6055 Sarcina lutea UC 130 Streptococcus faecalis UC 157 Streptococcus faecalis UC 3235 Bactéries Gram-négatives: Escherichia coli UC 51 Proteus vulgaris UC 93 Pseudomonas aeruginosa UC 95 Pseudomonas mildenbergii UC 3029 Salmonella gallinarum UC 265 Klebsiella pneumoniae UC 57 Salmonella schottmuelleri UC 126 Salmonella pullorum UC 267 Champiqnons: Candida albicans UC 1392 Saccharomyces cerevisiae UC 1337 Saccharomyces pastorianus UC 1342 Penicillium oxalicum UC 1268 Concentration inhibitrice minimale (gq/ml)

0,00O15

0,003 o0,oo15 0,003 0,025

0,0008

0,012 0,012 0,003 0,32 0,08 0,08 0,3 2,5 0,08 0,3 0,08 0,3 0,04 0,3 0,02 "UC"I est une marque déposée de The Upjohn Company Culture Collection. On peut obtenir ces cultures auprès de la

firme The Upjohn Company à Kalamazoo, Michigan.

L'antibiotique CC-1065 est également actif vis-

à-vis de cellules tumorales L 1210 cultivées in vitro. L'anti- biotique CC-1065 inhibe in vivo chez la souris de laboratoire

la leucémie L 1210, la leucémie P 388 et le mélanome B 16.

Le micro-organisme utilisé pour la production de

l'antibiotique CC-1065 est Streptomyces zelensis NRRL 11 183.

On peut, pour obtenir une culture de repiquage de ce micro-organisme, s'adresser à la souchothèque permanente

du Northern Regional Research Laboratory, Ministère de l'Agri-

culture des E.U.A., Peoria, Illinois, U.S.A.". Le numéro de dépôt de ce micro-organisme est NRRL 11 183. Bien entendu, la

fourniture de cette culture ne confère en soi aucun droit d'ex-

ploitation de l'invention.

Le micro-organisme de l'invention a été étudié et caractérisé par Alma Dietz et Grace P. Li des Laboratoires

de recherche de la firme Upjohn.

in nouveau germe isolé du sol, qui produit l'anti-

biotique CC-1065, a été caractérisé et considéré comme espèce nouvelle du genre Streptomyces du fait qu'il est conforme aux caractères généraux de ce genre [Pridham, T.G. et H.D. Tresner, 1974, Partie 17. Actinomycetes and related organisms. Famille VII. StreDtomycetaceae Waksman et Henrici 1943. Genre I. Streptomyces. P. 748, in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ème édition, Buchanan et Gibbons (eds), The

Williams and Wilkins Co., Baltimore].

Ce micro-organisme nouveau présente une culture aérienne de couleur vertgris, il ne produit pas de mélanine

et comporte des chaînes courtes, droites ou enrouléesen spira-

les ouvertes ou non, de spores arrondies à surface épineuse.

On peut différencier cette culture de la plupart des Streptomyces du groupe limité des "verts" (les cultures de ce groupe correspondent à la série viridis de Waksman

[Waksman, S.A. 1961. The Actinomycetes, volume 2, Classifica-

tion, Identification and Descriptions of Genera and Species.

The Williams and Wilkins Co., Baltimore] et Baldacci [Baldacci,

E. 1958, Development in the Classification of Actinomycetes.

Giornale di Microbiologia. 6:10-27]; du groupe à couleur de prasinus de Ettlinger et coll. [Ettlinger, L., R. Corbaz et R. HUtter. 1958. ZurSystematik der Actinomyceten. 4. Eine Arteinteilung der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici;

Archiv. fUr Mikrobiologie. 31:326-358.]; du groupe azureus-

glaucus à odeur de prasinus de Hutter [H tter, R. 1967, Systematik der Streptomyceten unter besondere BerUcksichigung der von ihnen gebildeten Antibiotica. S. Karger, Bâle.]; du groupe malachiticus de KSster [Klster, E. 1970. Note on the Taxonomy and Ecology of Streptomyces malachiticus and re-'

lated species. International Journal of Systematic Bacteriolo-

gy. 20:25-29]; du groupe X à spores vertes de Kutzner [Kutzner, H.J. 1956. Beitrag zur Systematik und Okologie der Gattung

Streptomyces Waksm. et Henrici. Diss. Landw. Hocksch.

Hokenhein.]; des organismes producteurs de prasinomycine de

Myers et coll. [Myers, E., G.J. Miraglia, D.A. Smith, H.I.

Basch, F.E. Pansy, W.H. Trejo et R. Donovick. 1968. Biological Characterization of Prasinomycin, a Phosphorus-containing Antibiotic. Appl. Microbiol. 16:603-608] [la prasinomycine est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 493 653; des micro-organismes des tableaux Il et 12 de KSster [KUster,

E. 1972. Simple Working Key for the Classification and Iden-

tification of named Taxa included in the International Strepto-

myces Project. Int. J. Syst. Bacteriol. 22:139-148]; et des microorganismes de la série verte de Pridham et Tresner [Pridham, T.G. et H.D. Tresner. 1974. Partie 17. Actinomycetes and related Organisms. Famille VII. Streptomycetaceae Waksman et Henrici 1943. Genre I. Streptomyces. Tableau 17.46 a-d Green Series. page 825, in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ème édition Buchanan and Gibbons (eds).The

Williams et Wilkins Co., Baltimore], par son aptitude à pro-

duire l'antibiotique CC-1065, sa croissance à 4-45 C et les

caractères distinctifs de ses chaines de spores et de ses spo-

res. On peut également la distinguer d'une culture plus ré-

cemment caractérisée, Streptomyces espinosus [brevet des Etats-

Unis d'Amérique N 3 697 380 concernant la production de la lincomycine; brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 833 475 décrivant un procédé de préparation de la lincomycine] par son mode de coloration sur "Ektachrome", son mode d'utilisation des sources de carbone, sa croissance à 4-45 C et son aptitude à

produire l'antibiotique CC-1065.

Il est donc proposé de nommer ce micro-organisme nouveau isolé du sol Streptomyces zelensis (du tchèque zeleny = vert)Dietz et Li sp. n. et de désigner cette espèce-type comme sous-espèce type Streptomyces zelensis subsp. zelensis selon les règles du Code International de Nomenclature des Bactéries [Lapage, S.P. et coll., Edition corrigée de 1976. International Code of Nomenclature of Bacteria. Amer. Soc. for Microbiol.,

Wash. D.C. 180 pp.].

Taxonomie:

Streptomyces zelensis Dietz et Li sp. n.

Caractéristiques de couleur: culture aérienne gris-vert ou

vert-gris. Pas de production de mélanine. L'aspect de la cul-

ture sur "Ektachrome" est indiqué dans le tableau I. Les carac-

téristiques de couleur de référence figurent dans le tableau II. On peut ranger la culture dans les séries jaune (Y) et

verte (GN) de 2resner et Backus [Tresner, H.D. et E.J. Backus.

1963. System of Color Wheels for Streptomycetes Taxonomy.

Applied Microbiol. 11:335-338].

Caractéristiques microscopiques: les chaînes de spores sont tout d'abord rectilignes, puis forment des spirales ouvertes

à serrées (RF, RA, S) selon les définitions de Pridham et coll.

[Pridham. T.G., C.W. Hesseltine et R.G. Benedict. 1958. A Guide for the Classification of Streptomycetes according to selected Groups. Placement of Strains in morphological Sections. Applied

Microbiol. 6:52-79]. La surface des spores est épineuse.

Caractéristiques culturales et biochimiques: les caractéristi-

ques culturales et biochimiques figurent dans le tableau III.

Utilisation du carbone: on a déterminé la croissance sur des composés du carbone selon la méthode de Pridham et Gottlieb [Pridham, T.G., et D. Gottlieb. 1948. The Utilization of Carbon

Compounds by some Actinomycetales as an Aid for Species Deter-

mination. J. Bacteriol. 56:107-114] et celle de Shirling et Gottlieb [Shirling, E.B., et D. Gottlieb. 1966. Methods for Characterization of Streptomyces species. International Journal

8 2461001

of Systematic Bacteriology 16:313-340]. Dans le premier cas,

la culture se développe bien sur D-xylose, D-fructose, D-

galactose, D-glucose, D-mannose, maltose, cellobiose, dextrine, amidon soluble, glycérol, D-mannitol et inositol; modérément sur L-arabinose, oxalate de sodium, acétate de sodium et succi-

nate de sodium; et médiocrement sur rhamnose, saccharose, lac-

tose, raffinose, inuline, dulcitol, D-sorbitol, salicine, phé-

nol, formiate de sodium, tartrate de sodium, salicylate de so-

dium, citrate de sodium et le témoin (sans composé de carbone).

Il n'y a pas de croissance sur crésol. Dans le second cas, la culture se développe bien sur le témoin positif (D-glucose)} le

D-xylose, l'inositol, le D-mannitol et le D-fructose; modéré-

ment sur le L-arabinose; et médiocrement sur le témoin négatif (milieu de base). Il n'y a pas de croissance sur le saccharose,

le rhamnose, le raffinose ou la cellulose.

Température: la croissance est faible à 4 CW, modérée à 18; 24-

et 45 C et bonne à 28; 32 et 37 C. Il n'y a pas de croissance

à 55 C. Pour l'étude de la température de croissance, on uti-

lise la gélose de Bennett, la gélose au saccharose de Czapek,

la gélose au maltose-tryptone et la gélose d'Hickey-Tresner.

Propriétés de production des antibiotiques: La culture produit

l'antibiotique CC-1065.

TABLEAU I

Aspect de Streptomyces zelensis sur Ektachrome Milieu qélosé Surface Revers Gélose de Bennett traces de gris brun-jaune Gélose au saccharose de Czapek gris pâle incolore Gélose au maltose et à la tryptone vert-gris tan Gélose à la peptone et au fer blanc-gris tan

Gélose à O,1 % de tyro-

sine traces de gris tan -jaune pâle Gélose à l'amidon et à la caséine vert-grispâle tan pâle

TABLEAU II

Caractéristiques colorées de référence de Streptomyces zelensis Milieu gélosé Détermination Selon les "ISCC-NBS Centroid Color Charts"; Standard Sample n 2106 [Supplément à la circulaire NBS 553*1 Gélose de Bennett Gélose de Czapek Gélose au maltose et

à la tryptone.

Gélose d'Hickey-Tresner S R P S R P S R P S R p p Pastille colorée 121 p. YG

86 1. Y

76 1. yBr 121 p. YG 92 y. White m 122 gy. YG 91 d. gy. Y 76 1. yBr 122 gy. YG gy. Y 76 1. yBr Couleur Vert-jaune pâle jaune clair brun jaunâtre clair vert-jaune pâle blanc jaunâtre

vert-jaune gri-

sâtre jaune grisâtre foncé brun jaunâtre clair

vert-jaune gri-

sâtre jaune grisâtre brun jaunâtre clair Gélose à l'extrait de levure et à l'extrait de malt (ISP-2) S R P Gélose à la farine d'avoine

(ISP-3)

122 gy. YG 91 d. gy. Y 77 m. yBr 121 p. YG 104 p. gy. Y S R P

vert-jaune gri-

sâtre jaune grisâtre foncé brun jaunâtre moyen vert jaune pâle jaune grisâtre pâle %o o -s do a% a TABLEAU II (Suite) Milieu gélosé Détermination Selon les "ISCC-NBS Centroid Color Charts"; Standard Sample n 2106 rSupplément à la circulaire NBS 553*' Pastille colorée Gélose à l'amidon et aux sels minéraux (ISP-4) S R P Gélose au glycérol et à l'asparagine (ISP-5) 122 gy. YG gy. gY 76 1. yBr Couleur

vert-jaune grisâ-

tre jaune verdâtre grisâtre brun jaunâtre clair v S R P 121 p. YG gy. Y vert-jaune pâle jaune grisâtre S = surface R = revers P = pigment * Kelly K.L. et D.B. Judd. 1955. The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary

of Color Names. U.S. Dept. Comm. Circ. 553.

o a% -.,. r Caractéri Milieu Milieux gélosés Gélose à la peptone et au fer Gélose au malate de calcium Gélose au glucose et à l'asparagine Gélose au lait écrémé Gélose à la tyrosine Gélose à la xanthine

Gélose nutritive à l'ami-

don Gélose à l'extrait de levure et à l'extrait de malt Gélose à la peptone, à l'extrait de levure et au fer (ISP-6)

TABLEAU III

stiques culturales et biochimiques de Streptomyces zelensis Surface Revers Autres caractéristiques vert-gris pâle vert-gris pâle vert-gr.is pale

traces de gris-

rose pâle gris-vert gris-vert gris-vert vert blanc-gris pâle tan olive chartreuse pâle tan -orangé brun

tan pâle..

tan -vert-

jaune tan. tan pigment tan mélanine-négatif pas de pigment pas de solubilisation des malates pas de pigment pigment.tan -orangé solubilisation de la caséine pigment brun clair solubilisation de la tyrosine pigment brunâtre pas de solubilisation de la xanthine tan clair hydrolyse de l'amidon pigment tan Po 0% --% _a, pigment tan mélaninenégatif TABLEAU III (Suite) Milieu Gélose à la tyrosine (ISP-7) Milieux à la gélatine Gélatine ordinaire Gélose nutritive Surface vert-gris Revers gris culture aérienne blanche sur une

pellicule super-

ficielle culture aérienne blanche sur une

pellicule super-

ficielle Autres caractéristiques pas de pigment mélanine-négatif pigment tan-jaune liquéfaction complète pigment tan-jaune liquéfaction complète Bouillons Synthétique croissance très faible au fond réduction des nitrates en nitrites culture aérienne blanc-vert sur une

pellicule super-

ficielle Lait tournesolé culture aérienne blanc-vert grisâtre sur une pellicule superficielle pigment jaune à tan culture très faible au fond réduction des nitrates en nitrites pigment superficiel bleu dans deux des trois tubes pigment tan peptonisation pH 7,9 co O) Nutritif Fi L3

Pour obtenir le composé de l'invention, on cul-

tive l'organisme producteur dans un milieu nutritif aqueux, en conditions aérobies submergées. Bien entendu, pour préparer des quantités limitées, on peut effectuer des cultures en surface et utiliser des flacons. On cultive l'organisme dans un milieu

nutritif contenant une source de carbone, par exemple un glu-

cide assimilableiet une source d'azote, par exemple un composé

azoté assimilable ou une matière protéique. Les sources de car-

bone que l'on préfère sont le glucose, la cassonade, le saccha-

1O rose, le glycérol, l'amidons l'amidon de mais, le lactose, la dextrine, la mélasse, etc. Les sources d'azote que l'on préfère

sont l'extrait soluble de mais, les levures, l'autolysat de le-

vure de bière additionné de lait en poudre, la farine de soja, la farine de graines de cotonnier, la farine de mais, le lait en poudre, un produit de digestion pancréatique de la caséine,

la farine de poisson, des résidus secs de distillation, des li-

queurs peptonées animales, des déchets de viande et d'osy etc.

On peut utiliser de façon avantageuse des mélanges de ces sour-

ces de carbone et d'azote. Il n'est pas utile d'ajouter au mi-

lieu de fermentation des oligo-éléments métalliques tels que, par exemple, du zinc, du magnésium, du manganèse, du cobalt, du fer, etc., car on utilise comme composants du milieu, avant

sa stérilisation, de l'eau de ville et des ingrédients non pu-

rifiés.

On peut mettre en pratique le procédé de prépara-

tion du composé de l'invention à une température quelconque fa-

vorable à une culture satisfaisante du micro-organisme, par exemple entre environ 18 et 40C, de préférence entre environ et 280C. Généralement, on obtient la production optimale du composé en 3 à 15 jours environ. Normalement, le milieu demeure alcalin pendant la fermentation. Le pH final dépend en partie des tampons éventuellement présents et en partie du pH initial

du milieu de culture.

Lorsqu'on effectue la culture dans des récipients ou des cuves de grande capacité, on préfère utiliser les formes végétatives plutôt que les formes sporulées du micro-organisme

pour l'ensemencement afin d'éviter un délai important dans l'ob-

* tention du composé et par conséquent une immobilisation inutile

14 2 4 2461001

de l'appareillage. Il est donc souhaitable de préparer un ino-

culum végétatif dans un bouillon nutritif par ensemencement de ce bouillon avec un échantillon de sol, un cube de culture

sur gélose conservé par l'azote liquide ou une culture inclinée.

Lorsqu'on a ainsi obtenu un inoculum végétatif jeune et actif,

on le transfère dans des conditions aseptiques dans des réci-

pients ou des cuves de grande capacité. Le milieu dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être ou non le même que

celui que l'on utilise pour la production du composé, à condi-

tion qu'on obtienne une bonne culture du micro-organisme.

Le composé produit par le procédé de l'invention peut être isolé des liquides de fermentation et purifié selon divers procédés. On peut effectuer l'isolement par extraction avec des solvants tels que le chlorure de méthylène, l'acétone, le butanol, l'acétate d'éthyle, etc.; et on peut utiliser une chromatographie sur gel de silice pour purifier les préparations

brutes de l'antibiotique.

Selon un procédé d'isolement préféré, on recueille

le composé produit du milieu de culture par séparation du my-

célium et des maatières solides non dissoutes selon des techni-

ques classiques telles que filtration ou centrifugation et ex-

traction au solvant du gâteau de mycélium et du bouillon cla-

rifié. On extrait le gâteau de mycélium par l'acétone et on

évapore l'extrait sous pression réduite pour obtenir un concen-

tré aqueux. On ajoute le concentré aqueux au bouillon filtré et on extrait trois fois avec un demi-volume de chlorure de

méthylène. On évapore sous pression réduite les extraits ras-

semblés et on dilue l'huile obtenue avec du "Skellysolve B"

(isomères de l'hexane). On refroidit la suspension pendant en-

viron 16 heures, puis on recueille les matières solides, on les lave au "Skellysolve B" et on les sèche pour obtenir une

préparation relativement brute (solide jaune-brun) de l'anti-

biotique CC-1065.

On soumet la préparation brute d'antibiotique ainsi obtenue à des purifications pour obtenir une préparation cristalline pratiquement pure de l'antibiotique CC-1065. Un

-:,procédé de première purification consiste à extraire la pré-

paration brute de l'antibiotique CC-1065 par l'acétone. Après

246100 1

évaporation de l'acétone, on triture le résidu avec du méthanol

pour obtenir une préparation cristalline de l'antibiotique CC-

1065. On peut laver les cristaux avec du méthanol froid pour

accroître leur pureté. On peut effectuer une purification com-

plémentaire de la préparation de l'antibiotique CC-1065 par chromatographie sur du gel de silice et cristallisation des fractions actives. On atteint la pureté finale (préparation

pratiquement pure de l'antibiotique CC-1065) par recristallisa-

tion de la préparation de l'antibiotique CC-1065 ci-dessus dans

un mélange d'acétone et de méthanol.

On détermine les fractions actives obtenues par'

chromatographie sur une colonne de gel de silice comme précé-

demment indiqué, par bio-autographie en chromatographie sur couche mince. Selon ce procédé, on dépose à la touche 1 jg d'échantillon d'antibiotique sur un gel de silice souple Baker

(J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, New Jersey) et on effec-

tue une bio-autographie avec Bacillus subtilis (milieu synthé-

tique) ou Sarcina lutea, après développement dans un solvant constitué de 90 parties de chloroforme, 10 parties de méthanol

et 0,5 partie d'hydroxyde d'ammonium concentré. On peut égale-

ment mettre en évidence la zone correspondant à l'antibiotique CC-1065 obtenue par chromatographie sur couche mince à partir d'un échantillon cristallin de 1 gg ou plus, par observation en lumière ultraviolette (254 nm) et on peut également repérer

cette zone par sa couleur ambrée en lumière ordinaire.

Le milieu synthétique de culture de Bacillus subtilis précédemment indiqué a la composition suivante: Na2HPO4 1,7 g KH2PO4 2,0 g (NH4)2SO4 1, 0 g MgSO4 0,1 g Glucose 2,0 g Ions métalliques 1,0 ml Gélose 15,0 g Eau distillée 1 litre L'exemple non limitatif suivant illustre le

procédé et le produit de l'invention. Sauf indications con-

traires, tous les pourcentages sont exprimés en poids et toutes

16 2461001

les proportions des mélanges solvants sont exprimées en vo-

lumes.

Exemple

A. Fermentation: On utilise une culture biologiquement pure de Streptomyces zelensis NRRL 11 183 pour ensemencer des fioles d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile constitué des ingrédients suivants: Extrait de levure* 0,3 % Bacto-tryptone* 0,5 % Dextrine* O,1 %

"Fourni par Difco Labs., Détroit, Michigan.

** Fourni par A.E. Staley Mfg., Decatur, Illinois.

On fait incuber le milieu d'ensemencement à

28 C pendant 48 heures sur une secoueuse rotative Gump fonc-

tionnant à 250 tr/min.

On utilise l'inoculum d'ensemencement préparé

comme précédemment décrit pour ensemencer des fioles d'Erlen-

meyerde fermentation de 500 ml contenant 100 ml d'un milieu de fermentation. stérile constitué des ingrédients suivants: Melasses résiduaires l % Dextrine % Bacto-Tryptone l % CaCO3 0,5 % NaCl 0,2 %

* Fourni par Knappen-Milling Co., Augusta, Michigan.

Le pH avant la stérilisation est égal à 7,2. On

ensemence les fioles de fermentation à raison de 5 ml d'inocu-

lum d'ensemencement pour 10O ml de milieu de fermentation. On fait incuber les flacons de fermentation pendant 120 heures à

28 C sur une secoueuse rotative Gump fonctionnant à 250 tr/min.

Pour évaluer l'antibiotique CC-1065, on extrait

la totalité du milieu avec 2 volumes de chlorure de méthylène.

On dépose à la touchediverses quantités d'extrait chlorométhylénique (20 pl, 10 jl, 5 pl, 2 jl, 1 jil) sur des feuilles de gel de

silice "Polygram SIL-N-HR" (Macherey-Nagel & Co., Doren, Alle-

magne) et on effectue une bio-autographie avec Sarcina lutea après développement dans un mélange de solvants formé de 10 ml

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d'alcool méthylique, 90 ml de chloroforme et 0,5 ml d'hydroxyde d'ammonium. Préparation des plateaux de qélose pour la culture de Sarcina lutea UC 130 (ATCC 9341) en vue de la bio-autoqraphie: On verse 125 ml de"Penassay Seed Agar" (Difco LaboratoriesDétroit, Michigan) refroidi à 480C et ensemencé avec un bouillon de culture décongelé de S. lutea (0,5 ml/l) dans des plateaux de matière plastique mesurant 200 mm x 500 mm

et on laisse le milieu se solidifier. On fait incuber les pla-

teaux de gélose pendant 20 à 24 heures à 32 C.

On conserve des fragments de l'inoculum de S.

lutea contenant 109 cellules/ml dans la phase gazeuse de l'azo-

te liquide.

B. Isolement On filtre le bouillon de fermentation, obtenu comme précédemment décritdans quatre cuves de fermentation de 10 litres, à travers un tampon de "Celatom FW 40" (terre de diatomées d'Eagle Picher). On extrait le gâteau mycélien

avec de l'acétone et on évapore l'extrait sous pression ré-

duite pour obtenir un concentré aqueux. On ajoute le concen-

tré aqueux au bouillon clarifié que l'on extrait ensuite trois fois avec un demi-volume de chlorure de méthylène. On évapore les extraits chlorométhyléniques sous pression réduite pour

obtenir une huile que l'on dilue avec 1,5 litre de "Skellysol-

ve Bufet on refroidit la suspension pendant environ 16 heures.

On recueille les matières solides, on les lave au "Skellysolve B" et on les sèche pour obtenir une préparation relativement

brute de l'antibiotique CC-1065 sous forme d'une matière soli-

de brun-jaune. On peut évaluer cette préparation brute par

bio-autographie en chromatographie sur couche mince, comme pré-

cédemment décrit.

C. Purification

On extrait une préparation brute de l'antibioti-

que CC-1065 obtenue comme précédemment décrit avec 400-800 ml

d'acétone pour éliminer de petites quantités de matières inso-

lubles dans l'acétone. On évapore l'acétone et on triture le résidu avec du méthanol (10 ml/g). On refroidit la suspension pendant environ 16 heures et on recueille la matière solide 1.8 cristalline cu'on lave avec du méthanol froid et qu'on sèche

pour obtenir 40 à 180 mg d'une préparation cristalline de l'an-

tibiotique CC-1065. On évalue cette préparation cristalline par bioautographie en chromatographie sur couche mince de gel de silice, comme précédemment décrit. On effectue une purification complémentaire par

chromatographie sur gel de silice et cristallisation des frac-

tions actives. Par exemple, on dissout 470 mg de ces matières solides cristallines dans 940 ml d'acétone et on évapore sur 10 ml de gel de silice (Geduran 0 SI60, E.M. Laboratories, Inc. Elmsford, New York). On chromatographie la poudre obtenue sur ml de gel de silice, on élue avec un solvant constitué de parties de chloroforme, 20 parties de méthanol et 4 parties

d'hydroxyde d'ammonium. On recueille 20 fractions de 20 ml cha-

cune que l'on évapore à sec. On évalue les fractions par bio-

autographie en chromatographie sur couche mince. On regroupe les fractions 6 à 19 et on les triture avec du méthanol pour obtenir 218 mg de l'antibiotique CC-1065 cristallin de qualité

supérieure. On peut effectuer une purification finale par re-

cristallisation dans un mélange d'acétone et de méthanol pour obtenir 167 mg (rendement: 77 %) de cristaux pratiquement

purs de l'antibiotique CC-1065.

2 4 6410 0 1

Claims

REVENDICATION

Une culture biologiquement pure du micro-orga-

nisme StreDtomvces zelensis présentant les caractéristiques

de la souche NRRL 11 183 et capable de produire l'antibio-

tique CC-1065 en une quantité propre à être recueillie, par fermentation dans-un milieu nutritif contenant des sources

assimilables de carbone, d'azote et des substances minérales.