CH643564A5 - Antibiotikum cc-1065, verfahren zu seiner herstellung und seine gewinnung. - Google Patents

Antibiotikum cc-1065, verfahren zu seiner herstellung und seine gewinnung. Download PDF

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CH643564A5
CH643564A5 CH1075178A CH1075178A CH643564A5 CH 643564 A5 CH643564 A5 CH 643564A5 CH 1075178 A CH1075178 A CH 1075178A CH 1075178 A CH1075178 A CH 1075178A CH 643564 A5 CH643564 A5 CH 643564A5
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David Glenn Martin
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Upjohn Co
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    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
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Description

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2
PATENTANSPRÜCHE
1. Gegen grampositive und gramnegative Bakterien sowie gegen L 1210-, P 388-und B 16-Zellenin vivo bei Mäusen aktives Antibiotikum CC-1065, das in im wesentlichen reiner Form folgende Eigenschaften aufweist:
a) Molekulargewicht von etwa 700;
b) folgende Elementaranalysen werte: C 61,06%; H 4,92%; N 13,71%;
c) löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, Methylenchlorid, Äthylacetat und Dioxan;
d) in Form einer Aufschwemmung in einem Mineralöl ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum gemäss Figuri;
e) ein charakteristisches Kernresonanzspektrum gemäss Figur 2 und f) ein charakteristisches Protonenspektrum gemäss Figur 3.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums CC-1065 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Strep-tomyces zelensis NRRL 11183 so lange unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, bis dieses eine merkliche Antibiotikum CC-1065-Aktivität erhält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein wässriges Nährmedium mit einem Lieferanten für assimilierbare Kohlenhydrate und assimilierbaren Stickstoff verwendet.
4. Verfahren zur Gewinnung von Antibiotikum CC-1065 nach Anspruch 1 aus einer Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, dass man die filtrierte Fermentationsbrühe mit einem Lösungsmittel für das Antibiotikum CC-1065 extrahiert und danach das Antibiotikum CC-1065 aus den erhaltenen Extrakten gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösungsmittel für Antibiotikum CC-1065 Aceton, Methylenchlorid, Butanol oder Äthylacetat verwendet.
Das Antibiotikum CC-1065 erhält man bei einer Fermentation unter gesteuerten Bedingungen mit Hilfe einer biologisch reinen Kultur des neuen Mikroorganismus Strepto-myces zelensis NRRL 11 183.
Das Antibiotikum CC-1065 ist gegen die verschiedensten grampositiven und gramnegativen Bakterien, z.B. gegen Proteus vulgaris, aktiv. Somit eignet es sich insbesondere als Ölkonservierungsmittel zur Inhibierung dieses Bakteriums, das bekanntlich eine Ölverunreinigung hervorruft. Ferner eignet es sich vor allem als Bestandteil von Waschlösungen für sanitäre Zwecke. Da das Antibiotikum CC-1065 ferner gegen Bacillus subtilis wirksam ist, kann es auch zur Behandlung der Brutplätze von Seidenraupen zur weitestgehenden Unterdrückung oder Verhinderung einer durch dieses Bakterium hervorgerufenen Infektion verwendet werden.
Das gegen grampositive und gramnegative Bakterien sowie gegen L 1210-, P 368- und B 16-Zellen in vivo bei Mäusen aktive Antibiotikum CC-1065 weist in reiner Form folgende Eigenschaften auf:
a) Molekulargewicht von etwa 700;
b) folgende Elementaranalysenwerte; C 61,06%; H 4,92%; N 13,17%;
c) löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, Methylenchlorid, Äthylacetat und Dioxan;
d) in Form einer Aufschwemmung in einem Mineralöl ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum gemäss Figur 1;
e) ein charakteristisches Kernresonanzspektrum gemäss Figur 2 und
0 ein charakteristisches Protonenspektrum gemäss Figur 3.
Das Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces zelensis NRRL 11 183 so lange unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, bis dieses eine merkliche Antibiotikum CC-1065-Aktivität erhält.
Das erfindungsgemässe Antibiotikum wird aus dem erhaltenen Nährmedium gewonnen, indem man die filtrierte Fermentationsbrühe mit einem Lösungsmittel für das Antibiotikum CC-1065 extrahiert und danach das Antibiotikum CC-1065 aus den erhaltenen Extrakten gewinnt.
Chemische und physikalische Eigenschaften von Antibiotikum CC-1065:
Molekulargewicht: etwa 700 Elementaranalyse:
Gef: C 61,06%; H 4,92%; N 13,17%
UV-Absorptionsspektrum:
Eine Lösung des Antibiotikums CC-1065 in Dioxan zeigt eine starke Endabsorption mit Schultern bei 230 nm (Absorptionsfähigkeit a = 68.00) und 258 nm (a = 51.10) sowie ein Maximum bei 364 nm (a = 66.10).
IR-Absorptionsspektrum:
Das Antibiotikum CC-1065 zeigt in Form einer Mineralölaufschwemmung ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum im Wellenzahlbereich von 3800-600 (cm-1) (vergleiche Figur 1). Das Spektrum wurde unter Verwendung eines Digilab Model 14 D Fourier transform Spektralphotometer aufgenommen.
Peaks treten bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Zentimetern) auf:
2960,2920,2850, 1465 und 1377 cm-1. Diese sind teilweise auf die aliphatischen C-H-Schwingungen des Mineralöls zurückzuführen.
Bandenfrequenz (Wellenzahl)
Intensität
3460
S
3350
s
3230
S, sh
2960
S
2920
S
2850
S
2610
M
1635
S
1610
S, sh
1570
S
1520
S
1480
S, sh
1465
S
1445
S
1420
S
1403
S
1377
s
1354
s
1333
s
1304
s
5
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60
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3
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(Fortsetzung)
Bandenfrequenz (Wellenzahl)
Intensität
1268
S
1243
M, sh
1187
M
1175
M
1156
M
1125
M
1100
M, sh
1078
M
1047
M
1023
M
1005
M
962
W
948
W
918
w
888
w
856
M
805
M
779
W
760
W
737
M
678
W
Erläuterung: S = stark: M = mittel: W = schwach: sh = Schulter
Löslichkeitsverhalten:
Das Antibiotikum CC-1065 ist in Lösungsmitteln, wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Aceton, Methylenchlorid, Äthylacetat, Dioxan und Chloroform löslich.
"C-Kernresonanzspektrum:
Das L,C-Kernresonanzspektrum des Antibiotikums CC-1065 bei 20 M HZ ist in Figur 2 dargestellt. Es ist mittels eines Varian CFT-20 Spektrometers unter Verwendung einer Lösung (etwa 1,0 ml; etwa 75 mg/ml) einer Probe des Antibiotikums CC-1 065 in deutero Dimethylsulfoxid (d 6 Dimethylsulfoxid) aufgenommen. Das Spektrum ist gegen die Mittellinie von d 6 Dimethylsulfoxid (39,6 ppm) bezogen auf Tetramethylsilan (0 ppm) geeicht. Die Frequenzen werden in cps «downfield» von Tetramethylsilan aufgezeichnet.
Protonenmagnetresonanzspektrum:
Das Protonenmagnetresonanzspektrum des Antibiotikums CC-1065 bei 100 MHZ ist in Figur 3 dargestellt. Dieses Spektrum ist mittels eines Varian XL-100-15 Spektrometers unter Verwendung einer Lösung (etwa 0,5 ml; etwa 150 mg/ml) einer Probe des Antibiotikums CC-1065 in deutero Dimethylsulfoxid (d 6 Dimethylsulfoxid) aufgenommen. Das Spektrum ist gegen internes Tetramethylsilan geeicht. Die Frequenzen werden in ppm «downfield» von Tetramethylsilan aufgezeichnet.
Antibakterielles Spektrum des Antibiotikums CC-1065; Das Antibiotikum CC-1065 ist gegen die verschiedensten grampositiven und gramnegativen Bakterien und Pilze aktiv (vergi, die folgende Tabelle). Zu Testzwecken wurden folgende Testprozeduren durchgeführt:
Die geringste inhibierende Konzentration wird nach üblichen bakteriziden Verfahren unter Verwendung zweifacher Verdünnungen des Antibiotikums in Gehirn/Herz-Infusionsbrühe ermittelt. Die Inokulate bestehen aus über Nacht stehengelassenen Kulturen der Testorganismen, die so weit verdünnt sind, dass die Endpopulation etwa 105 Zellen /ml beträgt. Die Röhrchen werden 42 h lang bei einer Temperatur von 28° bis 37°C inkubiert. Die geringste inhibierende Konzentration wird bestimmt, indem 0,1 ml der kein
Wachstum zeigenden Brühe aus den 42 h lang inkubierten Röhrchen in 10 ml Antibiotikum-freie Brühe übertragen werden. Röhrchen ohne Wachstum innerhalb von 24 h werden als solche mit bakterizider Konzentration angesehen. Eine für Pilze gut geeignete Brühe enthält 0,5% KH2PO4,3,0% Dextrose und 0,7% Hefeextrakt.
Mikroorganismus geringste inhibierende
Konzentration
(mcg/ml)
Grampositive Bakterien:
Staphylococcus aureus UC 76 0,0015
Staphylococcus aureus UC 552 0,003
Staphylococcus aureus UC 70 0,0015
Staphylococcus aureus UC 3665 0,003
Bacillus subtilis UC 564 0,025
Streptococcus pyogenes UC 6055 0,0008
Sarcina lutea UC 130 0,012
Streptococcus faecalis UC 157 0,012
Streptococcus faecalis UC 3235 0,003
Gramnegative Bakterien:
Escherichia coli UC 51 0,32
Proteus vulgaris UC 93 0,08
Pseudomonas aeruginosa UC 95 0,08
Pseudomonas mildenbergii UC 3029 0,3
Salmonella gallinarum UC 265 2,5
Klebsiella pneumoniae UC 57 0,08
Salmonella schottmuelleri UC 126 0,3
Salmonella pullorum UC 267 0,08
Pilze:
Candida albicans UC 1392 0,3
Saccharomyces cerevisiae UC 1337 0,04
Saccharomyces pastorianus UC 1342 0,3
Pénicillium oxalicum UC 1268 0,02
«UC» steht für The Upjohn Company Culture Collection. Die aaO zahlenmässig definierten Kulturen sind auf Anfrage von The Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan,
erhältlich.
Das Antibiotikum CC-1065 ist ferner gegen in einer Kultur gezüchtete L 1210-Tumorzellen wirksam (in vitro). Ferner inhibiert das Antibiotikum CC-1065 in vivo bei Laboratoriumsmäusen L 1210 Leukämie, P 388 Leukämie und B 16 Melanome. Der bei der Herstellung bzw. Gewinnung von Antibiotikum CC-1065 verwendete Mikroorganismus ist Streptomyces zelensis NRRL 11 183.
Dieser Mikroorganismus wurde am 4. Oktober 1977 bei der Agricultural Research Culture Collection, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61 604, USA, hinterlegt, was am 13. Oktober 1977 von der Sammelstelle bestätigt wurde.
Ein neues Bodenisolat, das das Antibiotikum CC-1065 produziert, wird aufgrund seiner Übereinstimmung im Hinblick auf die allgemeinen Eigenschaften der Gattung als neue Art der Gattung Streptomyces charakterisiert und angesehen (vgl. T. G. Pridham und H. D. Tresner 1974, Teil 17 «Actino-mycetes and related organisms», Family VII. Streptomyceta-ceae Waksman und Henrici 1943. Genus I. Streptomyces. P. 748. In: «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology» 8. Ausgabe. Herausgeber Buchanan und Gibbons, Verlag The Williams and Wilkins Co., Baltimore). Dieses neue Isolât zeigt ein grau-grünes Luftwachstum, ist melaninnegativ, besitzt kurze, gestreckte bis offen-spiralige bis spiralige Spo5
10
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4
renketten runder Sporen mit stacheliger oder dorniger Oberfläche.
Die neue Kultur lässt sich von den meisten Angehörigen der begrenzten «grünen» Gruppe unterscheiden (Kulturen der grünen Gruppe sind diejenigen in der Viridis-Reihe nach Waksman (vgl. S.A. Waksman 1961 «The actinomycetes» Band 2, Classification, identification and descriptions of genera and species. Verlag The Williams and Wilkins Co. Baltimore und nach Baldacci (vgl. E. Baldacci 1958 «Development in the classification of actinomycetes». Giornale di Microbiologia Band 6, Seiten 10-27); der prasinus-Farb-gruppe nach Ettlinger und Mitarbeitern (vgl. L. Ettlinger, R. Corbaz und R. Hütter 1958 «Zur Systematik der Actino-myceten», 4. «Eine Arteinteilung der Gattung Streptomyces Waksman und Henrici «Archiv für Mikrobiologie», Band 31, Seiten 326-358); der prasinus-Geruch-azureus-glaucus-Gruppe nach Hütter (R. Hütter 1967 «Systematik der Strep-tomyceten unter besonderer Berücksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika», Verlag S. Karger, Basel); der mala-chiticus-Gruppe nach Küster (E. Küster 1970 «Note on the taxonomy and exology of Streptomyces malachiticus and related species», International Journal of Systematic Bacte-riology, Band 20, Seiten 25-29); der Grünsporenfarbgruppe X nach Kutzner (vgl. H. J. Kutzner 1956 «Beitrag zur Systematik und Ökologie der Gattung Streptomyces Waksm. et Henrici, Dissertation an der Landwirtschaftlichen Hochschule Hohenheim); den prasinomycin-Lieferanten nach Myers und Mitarbeitern (vgl. E. Myers, G. J. Miraglia, D. A. Smith, H. I. Bäsch, F. E. Pansy, W. H. Trejo und R. Donovick 1968 «Biological characterization of prasinomycin, aphos-phorus-containing antibiotic», Appi. Microbiol. Band 16, Seiten 603-608); (E. Myers, R. Donovick, F. L. Weisenborn und F. E. Pansy, 1970, US-PS 3 493 653); denen in Tabellen 11 und 12 nach Küster (vgl. E. Küster 1972 «Simple Working Key for the classification and identification of named taxa included in the International Streptomyces Project». Int. J. Syst. Bacteriol., Band 22, Seiten 139-148) und denjenigen der grünen Reihe nach Pridham und Tresner (vgl. T. G. Pridham und H. D. Tresner 1974. Teil 17. «Actinomycetes and related organisms». Familie VII. Streptomycetaceae Waksman und Henrici 1943. Genus I. Streptomyces. Tabelle 17.46 a-d grüne Reihen. Seite 825. In: «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», 8. Ausgabe, Herausgeber: Buchanan und Gibbons, Verlag The Williams and Wilkins Co., Baltimore) unterscheiden. Die unterscheidenden Merkmale liegen in der Bildung des Antibiotikums CC-1065, ihrem Wachstum bei 4° bis 45°C und in unterschiedlichen Sporenketten und Sporen. Sie unterscheidet sich auch von einer in jüngster Zeit charakterisierten Kultur, nämlich Streptomyces espinosus (vgl. US-PS 3 697 380 und 3 833 475) durch ihre Farbmuster auf Ektachrom-Filmen, ihr Kohlenstoffausnutzungsmuster, ihr Wachstum bei 4° bis 45°C und ihre Fähigkeit zur Bildung von Antibiotikum CC-1065.
Es wird vorgeschlagen, das neue Bodenisolat als «Streptomyces zelensis» (von zeleny = tschechisch «grün») Dietz und Li sp. n. und diese Typusart als Typus subspecies Streptomyces zelensis subsp. zelensis zu bezeichnen (dies steht in Übereinstimmung mit den im International Code of Nomenclature of Bacteria gegebenen Vorschriften (vgl. S. P. Lapage und Mitarbeiter [Herausgeber] Ausgabe 1976 «International Code of Nomenclature of Bacteria» Amer. Soc. for Microbiol., Washington D. C. 180 Seiten).
Taxonomie:
Streptomyces zelensis Dietz und Li sp.n.
Farbeigenschaften:
Luftwachstum: grün-grau oder grau-grün. Melaninnegativ.
Das Aussehen der Kultur auf Ektachrom-Film findet sich in der folgenden Tabelle I. Referenzfarbeigenschaften sind in Tabelle II angegeben. Die Kultur kann in die gelbe und grüne Farbreihe nach Tresner und Backus (H. D. Tresner und E. J. s Backus 1963 «System of color wheels for streptomycete taxonomy» Applied Microbiol. Band 11, Seiten 335 bis 338) eingeordnet werden.
Mikroskopische Eigenschaften:
io Sporenketten zunächst gestreckt, dann offen-spiralig bis spiralig (RF, RA, S) im Sinne von Pridham und Mitarbeitern (vgl. T. G. Pridham, C. W. Hesseltine und R. G. Benedict 1958 «A guide for the classification of streptomycetes accor-ding to selected groups». Placement of strains in morpholo-i5 gical sections. Applied Microbiol. Band 6, Seiten 52-79). Sporenoberfläche: stachelig oder dornig.
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften:
Die Kultureigenschaften und biochemischen Eigen-20 Schäften finden sich in der später folgenden Tabelle III.
Kohlenstoffausnutzung:
Das Wachstum auf Kohlenstoffverbindungen wird nach dem von Pridham und Gottlieb entwickelten Verfahren 25 bestimmt (vgl. T. G. Pridham und D. Gottlieb 1948 «The uti-lization of carbon Compounds by some Actinomycetales as an aid for species détermination». J. Bacteriol. Band 56, Seiten 107 bis 114) und nach den von Shirling und Gottlieb entwickelten Verfahren (vgl. E. B. Shirling und D. Gottlieb 30 1966 «Methods for characterization of Streptomyces species». International Journal of Systematic Bacteriology Band 16, Seiten 313-340). Bei ersterem Verfahren wuchs die Kultur gut auf D-Xylose, D-Fructose, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose, Maltose, Cellobiose, Dextrin, löslicher Stärke, 35 Glyzerin, D-Mannit und Inosit, mässig auf L-Arabinose, Natriumoxalat, Natriumacetat und Natriumsuccinat und schlecht auf Rhamnose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Inulin, Dulcit, D-Sorbit, Salicin, Phenol, Natriumformiat, Natriumtartrat, Natriumsalicylat, Natriumeitrat und dem 40 Vergleichsmedium ohne zugesetzte Kohlenstoffverbindung. Die Kultur wuchs nicht auf Kresol. Bei letzterem Verfahren wuchs die Kultur gut auf dem positiven Vergleichsmedium (D-Glucose), D-Xylose, Inosit, D-Mannit und D-Fructose, mässig auf L-Arabinose und schlecht auf dem negativen Ver-45 gleichsmedium (Grundmedium). Sie wuchs nicht auf Saccharose, Rhamnose, Raffinose oder Cellulose.
Temperatur:
Die Kultur wuchs langsam bei 4°C, mässig bei 18°, 24° und so 45°C und gut bei 28°, 32° und 37°C. Bei 55°C war kein Wachstum festzustellen. Für die Temperaturuntersuchungen wurden als Medien Bennett's-, Czapek's-Saccharose-, Mal-tose-Trypton- und Hickey-Tresner-Agars verwendet.
55 Antibiotikum produzierende Eigenschaften:
Die Kultur produziert das Antibiotikum CC-1065.
Tabelle I
Aussehen von Streptomyces zelensis auf Ektachrom-Film
Agar-Medium
Oberfläche
Rückseite
Bennett's
Czapek's Saccharose 65 Maltose-Trypton Pepton-Eisen 0,l%Tyrosin Kasein/Stärke
Spuren grau fahlgrau graugrün grauweiss spuren grau gelb-lohfarben farblos lohfarben lohfarben fahlgelb-lohfarben fahl graugrün fahl-lohfarben
5
643 564
Tabelle II
Referenzfarbeigenschaften von Streptomyces zelensis
Agarmedium
Bestimmung
ISCC-NBS Centroid-Farbkarten Standardprobe Nr. 2106 (Nachtrag zu NBS Circular 553*)
Farbplättchen Farbbezeichnung
Bennett's
S
121 p. YG
fahlgelb-grün
R
86 1. Y
hellgelb
P
76 1. yBr hell-gelblich braun
Czapek's Saccharose
S
121p. YG
fahlgelb-grün
R
D
92 y. weiss gelblich weiss
Maltose-Trypton r
s
122 gy. YG
graues Gelbgrün
R
91 d. gy. Y
dunkelgraues Gelb
P
761. yBr hellgelbes Braun
Hickey-Tresner s
122gy. YG
graues Gelbgrün
R
90 gy. Y
graues Gelb
P
76 1. yBr hellgelbes Braun
Hefeextrakt/ Malzextrakt (ISP-2)
S
122 gy. YG
graues Gelbgrün
R
91 d. gy. Y
dunkelgraues Gelb
P
77 m. yBr schwach-gelbes Braun
Hafermehl (ISP-3)
S
121p. YG
fahlgelbes Grün
R
p
104 p. gy. Y
fahlgelbes Gelb anorganische Salze-Stärke (ISP-4)
I
S
122 gy. YG
graues Gelbgrün
R
105 gy. gY
graugrünes Gelb
P
76 1. yBr hellgelbes Braun
Glyzerin/Asparagin (ISP-5)
S
121p. YG
fahlgelbes Grün
R
90 gy. Y
graues Gelb
P
-
-
S = Oberfläche, R = Rückseite, P = Pigment
* ) K. L. Kelly und D. B. Judd. 1955 «The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names» U.S. Dept. Comm. Circ. 553.
Tabelle III
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften von Streptomyces zelensis
Medium
Oberfläche
Rückseite sonstige Eigenschaften
Agarmedien
Pepton-Eisen fahl graugrün lohfarben lohfarbenes Pigment melaninnegativ
Calciummalat fahl graugrün oliv ohne Pigment
Malat geht nicht in Lösung
Glucose-Asparagin fahl graugrün fahl hellgrün kein Pigment
Magermilch
Spuren fahl grau-rosa orange-lohfarben orange-lohfarbenes Pigment Kasein geht in Lösung
Tyrosin grün-grau braun hellbraunes Pigment Tyrosin geht in Lösung
Xanthin grün-grau hell-lohfarben hell-lohfarbenes Pigment Xanthin geht nicht in Lösung
Nährstärke grün-grau gelb-grün-lohfarben hell-lohfarben die Stärke wird hydrolysiert
Hefeextrakt/Malzextrakt grün lohfarben lohfarbenes Pigment
Pepton/Hefeextrakt-Eisen fahl grau-weiss lohfarben lohfarbenes Pigment
(ISP-6)
melaninnegativ
Tyrosin (ISP-7)
grau-grün grau kein Pigment melaninnegativ
Gelatinemedien
blanke Gelatine weisses Luftwachstum auf einem
Oberflächenhäutchen
gelb-lohfarbenes Pigment vollständige Verflüssigung
Nährgelatine weisses Luftwachstum auf einem
Oberflächenhäutchen
gelb-lohfarbenes Pigment vollständige Verflüssigung
Brühmedien
synthetische Brühe
-
-
sehr schwaches Bodenwachstum
Nitrat wird zu'Nitrit reduziert
643564
Tabelle III (Fortsetzung)
Medium
Oberfläche
Rückseite sonstige Eigenschaften
Nährbrühe Lakusmilch grun-weisses Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen grau-grün-weisses Luftwachstum auf einem Oberflächenhäutchen gelb bis gelb-lohfarbenes Pigment sehr schwaches Bodenwachstum Nitrat wird zu Nitrit reduziert blaues Oberflächenpigment in zwei bis drei Röhrchen lohfarbenes Pigment Peptonisierung ph-Wert 7,9
Bevorzugte Herstellungsbedingungen:
Die erfindungsgemässe Verbindung bildet sich, wenn der sich ausbreitende Organismus in einem wässrigen Nährmedium unter submersen, aeroben Bedingungen wächst. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Mengen (an der erfindungsgemässen Verbindung) auch Oberflächenkulturen und Flaschenkulturen zum Einsatz gelangen. Der Organismus wird in einem Nährmedium mit einer Kohlenstoffquelle, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat und einer Stickstoffquelle, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweissartigen Material, wachsen gelassen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen oder -lieferanten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maisein-weichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe und Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl, in Destillationsanlagen anfallende Feststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisation Leitungswasser und ungereinigte Komponenten zum Einsatz gelangen.
Die Herstellung der erfindungsgemässen Verbindung kann bei jeder Temperatur, die das Mikroorganismus-Wachstum fördert, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 40°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 28°C ablaufen gelassen werden. In der Regel dauert eine optimale Gewinnung der betreffenden Verbindung etwa 3 bis 15 Tage. Das Fermentationsmedium bleibt während der Züchtung in der Regel alkalisch. Der End-ph-Wert hängt teilweise (sofern mitverwendet) von den vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-Ph-Wert des Kulturmediums ab.
Wenn die Züchtung in grossen Gefässen und Tanks von-stattengeht, bedient man sich zur Beimpfung vorzugsweise der vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus, um eine deutliche Verzögerung bei der Bildung der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung und die damit einhergehende unzureichende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Folglich ist es zweckmässig, (zunächst) in einer Nährbrühekultur, in einer über flüssigem N2 aufbewahrten Agarscheibe oder in einer geneigten Kultur einen vegetativen Impfstoff herzustellen, indem man diebetreffende Nährbrühe und dergleichen mit einem aliquoten Teil aus einem Erdevorrat beimpft. Wenn auf diese Weise ein junger, aktiver, vegetativer Impfstoff erhalten wurde, wird dieser auf aseptischem Weg in grosse Gefässe oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wird, kann aus demselben oder einem anderen Medium, als es bei der Herstellung der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung verwendet wird, bestehen, solange der Mikroorganismus in dem betreffenden Medium nur gut wächst.
ls Zur Isolierung der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung aus der Fermentationsbrühe und zur Reinigung der abgetrennten Verbindung kann man sich der verschiedensten Massnahmen bedienen. Die Isolierung erfolgt erfindungsgemäss durch Extraktion mit Lösungsmitteln, z.B. Methylenchlorid, Aceton, Butanol, Äthylacetat und dergleichen. Zur Reinigung roher Chargen des Antibiotikums kann man sich einer Silikagelchromatographie bedienen.
Bei der bevorzugten Reindarstellung der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindung wird diese aus dem Kulturmedium durch Abtrennen des Mycels und ungelöster Feststoffe nach üblichen bekannten Verfahren, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und Lösungsmittelextraktion sowohl des Mycelkuchens als auch der geklärten Brühe gewonnen. Der Mycelkuchen wird mit Aceton extrahiert, worauf der Extrakt unter vermindertem Druck zu einem wässrigen Konzentrat eingedampft wird. Das wässrige Konzentrat wird der filtrierten Brühe zugesetzt, worauf das Ganze dann dreimal mil dem halben Volumen Methylenchlorid extrahiert wird. Die vereinigten Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft, worauf das erhaltene Öl mit handelsüblichen isomeren Hexanen verdünnt wird. Die hierbei erhaltene Suspension wird über Nacht gekühlt, worauf die hierbei gebildeten Feststoffe gesammelt, mit den handelsüblichen isomeren Hexanen gewaschen und schliesslich getrocknet werden. 40 Hierbei erhält man relativ rohes Antibiotikum CC-1065 in Form eines gelbbraunen Feststoffs.
Das in der geschilderten Weise erhaltene rohe Antibiotikum kann dann zu einem praktisch reinen kristallinen Antibiotikum CC-1065 gereinigt werden. Zu diesem Zweck wird 45 zunächst das rohe Antibiotikum CC-1065 vorzugsweise mit Aceton extrahiert. Nach dem Verdampfen des Acetons wird der anfallende Verdampfungsrückstand gewöhnlich mit Methanol verrieben, wobei kristallines Antibiotikum CC-1065 gebildet wird. Dieses kann zur Erhöhung der Reinheit mit 50 kaltem Methanol gewaschen werden. Eine weitere Reinigung des Antibiotikums CC-1065 erreicht man z.B. durch Chromatographieren auf Silikagel und Kristallisieren der aktiven Fraktionen. Praktisch reines Antibiotikum CC-1065 kann man schliesslich durch Umkristallisieren des (chromatogra-55 phierten) Antibiotikums CC-1065 aus Aceton/Methanol erhalten.
Die aktiven Fraktionen aus der Silikagel-Chromatogra-phiersäule bestimmt man durch Dünnschicht-Chromatogra-phie-Bioautographie. Bei diesem Verfahren wird eine 1 ag 60 Antibiotikumprobe als Fleck auf flexibles Siliciumdioxidgel 1B-F (J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) aufgetragen und nach der Entwicklung in einem Lösungsmittel aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilfen Methanol und 0,5 Teil konzentriertem Ammoniumhydroxid auf Bacillus subtilis (syn-65 thetisches Medium) oder Sarcina lutea bioautographiert. Die Antibiotikum CC-1065-Dünnschichtchromatogrammzone (bei Verwendung von 1 ug oder schwereren Proben des kristallinen Antibiotikums) kann auch mit UV-Licht (254 nm)
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sichtbar gemacht werden. In normalem Licht ist sie als bernsteinfarbene Zone zu sehen.
Das synthetische Medium für Bacillus subtilis besitzt folgende Zusammensetzung:
Na:HP04 1,7 g
KH:P04 2,0 g
(NH4):S04 1,0 g
MgS04 0,1g
Glucose 2,0 g
Metallionen 1,0 ml
Agar 15,0g destilliertes H2O 1 Liter
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Soweit nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben «Gew.-%». Die Angaben bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf «Volumina».
Beispiel 1
A) Fermentation
Eine biologisch reine Kultur von Streptomyces zelensis N RRL 11 183 dient zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Saatkolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Mediums aus folgenden Bestandteilen:
handelsüblicher Hefeextrakt 0,3%
handelsübliches Bacto-Trypton 0,5%
handelsübliches Dextrin 0,1%
Das Saatinokulum wird 48 h lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem handelsüblichen, mit 250 UpM umlaufenden Drehrüttler inkubiert.
Das in der geschilderten Weise bereitete Saatinokulum dient zum Beimpfen von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Fer-mentationskolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums mit folgenden Bestandteilen:
Black Strap Melasse 1%
Dextrin 1%
Bacto-Trypton 1%
CaCCb 0,5%
NaCl 0,2%
Der pH-Wert vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Fermentationskolben werden mit jeweils 5 ml Saatinokulum pro 100 ml Fermentationsmedium beimpft. Danach werden die Fermentationskolben 120 h lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem handelsüblichen, mit einer Geschwindigkeit von 250 UpM umlaufenden Drehrüttler inkubiert.
Die Prüfung des Antibiotikums CC-1065 erfolgt durch Extrahieren der gesamten Brühe mit 2 Volumina Methylenchlorid. Wechselnde Mengen des Methylenchloridextrakts (20 p.1,10 jj.1,5 ul, 2 ul, 1 (j.1) werden auf Polygram SIL-N-HR-Silikagelfolien (Macherey-Nagel und Co., Dören) aufgetragen und nach der Entwicklung in einem Lösungsmittelsystem aus 10 ml Methanol, 90 ml Chloroform und 0,5 ml Ammoniumhydroxid auf Sarcina lutea bioautographiert.
Herstellung von Agarschalen von Sarcina lutea UC 130 (ATCC 9341) zur Bioautographie:
125 ml gekühlten (48°C) Penassay Saatagar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) werden mit einer aufgetauten Kulturbrühe von S. lutea (0,5 ml/1) beimpft, worauf das Ganze in 200 mm x 500 mm Plastikschalen gegossen und verfestigen gelassen wird. Die Agarschalen werden 20 bis 24 h lang bei einer Temperatur von 32°C inkubiert.
Das S. lutea Inokulum mit 10~9 Zellen/ml wird in aliquoten Teilen in der Gasphase von flüssigem Stickstoff gelagert.
B) Gewinnung
Die in der geschilderten Weise aus Fermentationen in 101-Tanks gewonnene Fermentationsbrühe wird durch einen Pfropfen aus Celatom FW 40 (Eagle Picher's Diatomeenerde) filtriert. Der hierbei angefallene Mycelkuchen wird mit Aceton extrahiert, worauf der Extrakt unter vermindertem Druck zu einem wässrigen Konzentrat eingeengt wird. Das wässrige Konzentrat wird danach der geklärten Brühe zugesetzt, worauf das Ganze dreimal mit dem halben Volumen Methylenchlorid extrahiert wird. Die hierbei erhaltenen Methylenchloridextrakte werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingedampft. Dieser wird mit 1,5 ml handelsüblicher isomerer Hexane verdünnt, worauf die erhaltene Suspension über Nacht gekühlt wird. Die hierbei ausgefallenen Feststoffe werden abgetrennt, mit handelsüblichen isomeren Hexanen gewaschen und getrocknet, wobei relativ rohes Antibiotikum CC-1065 in Form eines gelbbraunen Feststoffs erhalten wird. Dieses rohe Antibiotikum kann in der geschilderten Weise durch Bioautographie getestet werden.
C) Reinigung
Das in der geschilderten Weise erhaltene rohe Antibiotikum CC-1065 wird mit 400-800 ml Aceton extrahiert, umgeringe Mengen acetonunlöslichen Materials zu entfernen. Danach wird das Aceton abgedampft und der Rückstand mit 10 ml/g Methanol verrieben, worauf die Suspension über Nacht gekühlt wird. Der hierbei ausgefallene kristalline Niederschlag wird abgetrennt, mit kaltem Methanol gewaschen und getrocknet, wobei 40-180 mg kristallines Antibiotikum CC-1065 erhalten werden. Dieses kristalline Antibiotikum lässt sich in der geschilderten Weise durch Bioautographie auf Silikagel testen.
Eine weitere Reinigung erreicht man durch Chromatographieren auf Silikagel und Kristallisieren der aktiven Fraktionen. So werden beispielsweise 470 mg kristalliner Feststoff in 940 ml Aceton gelöst, worauf das Ganze auf 10 ml Silikagel (Geduran ™SI60, E. M. Laboratories, Inc., Elmsford, N.Y.) eingedampft wird. Das hierbei erhaltene Pulver wird auf 100 ml Silikagel chromatographiert, wobei als Eluier-mittel ein Lösungsmittelgemisch aus 80 Teilen Chloroform, 20 Teilen Methanol und 4 Teilen Ammoniumhydroxid verwendet wird. 20 Fraktionen von jeweils 20 ml werden aufgefangen und zur Trockene eingedampft. Die einzelnen Fraktionen werden durch dünnschichtchromatographische Bioautographie getestet. Die Fraktionen 6-19 werden gesammelt und mit Methanol verrieben, wobei 218 mg qualitativ hochwertiges kristallines Antibiotikum CC-1065 erhalten werden. Die endgültige Reinheit erreicht man durch Umkristallisieren aus Aceton/Methanol, wobei 167 mg (77% der theoretischen Ausbeute) praktisch reines kristallines Antibiotikum CC-1065 erhalten werden.
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