DE2339136A1 - Steffimycin b, ein neues antibiotikum - Google Patents

Description

Die erfindungs.remä^fc- Verbindung dteffimycin B (U-4o 615) wird erhalten durch Züchtung von Streptoinyces elgreteus sp. n., N^URL 563^ ir wässrigem Nährmedium. Steffimycin B ict ein° saure Verbindung und besitzt die Eigenschaft, das «vachntum von gram-positiven Bakteri^an wie z.B. Bbo'llus .-u'rtilis, Bacillus cereus, staphylococcus aureus, Streptococcus h^irolyticus, Streptococcup faecalis un-J Diploccccus npchteili^ zu beeinflussen. Steffimyoin B ka^n

daher allein ο ier im G-emisch mit anderer, itntibi o.t⁴ ka einge-

* j -τ L. · - ,Bakterien-

t werden zur /erhm"ierun_er des ..ach^tvms oder zur Ver-

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minderung der Bakterienanzarl in verschiedenen Ä'.ilieus.

Steffimycin B besitzt folgende chminch^ und r-hysik^li ^c-rhe ^c haften:

■kleinentaranalyse '· Ber, für CppH^pO^.,:

'Jj 59,13; H: 5,48: 0: 35,54 Gefunden: C: 5^,68; H: 5,53; U: 35,74 (uiff.)

kolekulargewichfc;588 (durch kaspensp-ktryff.).

spez. Drehung: £jj' = +94° (c = 2, UHl1,)

Lltraviolettab^orptionsgpektren:

In Äthanol: Λ max· bei 234 m,u (a = 4-7,3)

iiohulter bei 254 n,u (a = 36,9) Schulter be"! 27 ■* m,u (a = ~^A 3,3)

In o,In-alkohcl. KOH: Λ max. bei 223 nyu (a = 53,7)

dchulter bei 259 cyu (a = ^5,o)

In o, In-alkohol. HGl: A max. bei 23-- m,u (a = A6,^)

Schulter bei 254 ir u ^ra = 36,^) Schulter bei 274 m υ (q = 33,ο)

Infrarotabsorptionsspektren:

5¹Jg-U- 1 zei^t das Inf rareit-Ähsorpt ^;onsf?pf->truin von 'Jteffimycin 5 in duspens^on in LineralöZ.. Jie /erbindung zei?t Pea>3 bei folgender •/eile-längen (in er, ):

i'reT:^finz (cm~ ) Int-ersität ?'req';enz (cr.~ } Intensität

3-r1o (dch)	/1	12-c
^^5o ^dCh)	I.	12oo
^53c	d	1185
3410	L	M6C
■^ο7 ο (dch)	«;	1135
293o (ül)		111c
23So (01)	d	1o"
1717 (ochl		Io 77
171?		1ο5γ

BADOR.GINAL

-1

-1

(err ) Irtenn⁴¹,ä⁺ . ireqnenz (cm ) Intent τ tä^

1S68 (och)

1 M< ⁽ S<*h )

14 60

1 ·1Λ5 (dch)

14.1 η (üCh)

141c

-M 7^I:

1 Vo (;icO

1 ^ 1 ;>

IOTP 995

Q6? 927 918 88 π

87 ο

3 K

827 81 ^a 8o3 79-761 742

698 688

.pei der Aufnahire des Infrarot-Absorpticmsspektrurr.s in einem Kaliuirbroirid-Pellet werden folgenden «'ellenlangen er-

Vif

k IVJ

IVi

W It la" ■8

IvI L· M

9 8 1 1 / 1 2 0

BAD ORIGINAL

Frequenz (cm~ ) Intensität Frequenz (cro~ ) Intensität

352o	M	1275	(sch)	3
343o (Jch)	M	1240		S
3o7o	W	12?O	(Sch)	3
298o	M	12oo		3
294ο	B	1185	(Sch)	S
2910 (Sch)	M	1164		S
1717 (Sch)	M	1135		3
171o	S	mo		S
1675	M	1095	(Sch)	S
162o	S	1o77	(Sch)	S
16o5 (Sch)		1055		3
1560	M	1o35		S
1475 (Sch)	3	1015		S
1458	S	1oo5	(Sch)	S
145o	S	990		S
14o8	S	960		S
1389	3	925		M
1375 (Sch)	3	917		M
132o (Sch)	B	880	(Sch)	W
131ο	3	865		M
1288	S	845		M
		83o		M
		818		W
		803		M
		788		M
		761		S
		742		M
		73o		M
		715		M
		7oo		M
		687		M

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Die Intensitäten werden in obiger Tabelle und in der folgenden Beschreibung mit ¹¹S", "M^w bzw. "W" angegeben, wobei die Bezeichnungen auf den Hintergrund in der Nähe der Banden bezogen sind. Eine "S"-Bande ist von gleicher Größenordnung der Intensität wie die stärksten Banden im Spektrum; "!"-Banden sind zwischen 1/3 und 2/3 so intensiv wie die stärksten Banden, und "W"-Banden sind weniger als i/3 so intensiv wie die stärkste Bande. Die Schätaungen erfolgen auf der Grundlage einer prozentualen Transmissionsskala. "Sch" bezeichnet eine Schulter.

Kernmagnetisches Kesonanzspektrusii Steffimycin B besitzt das in Figur ? gezeigte charakteristische NMR-Sρektrum. Das Spektrum wurde mit einem Varian A-6o Spektrometer in Lösung in Deuterochloroform aufgenommen (ca. o,5 ml, ca. 15$ige Konzentration). Das Spektrum wurde gegen Tetramethylsilan als innerem Standard kalibriert, die Genauigkeit von Δ ν betrug + 1 c.p.s. . Die Frequenzen sind in c.p.s. feldabwärts von Tetramethylsilan angegeben.

Papierehromatogramm; Steffimycin B unterscheidet sich von Steffimycin durch einen charakteristischen R„-Wert, wie aus Figur 3 ersichtlich.

Mobile Phase: 1 Teil Benzol, 1 Teil Methanol, 2 Teile K/asser (zum Entwickeln wird nur obere Phase verwendet).

Matrix: Schleicher und Schüll 589 Blauband-Papier. Zur Ermittlung verwendeter Organismus: S. lutea. Anti bakterielle Wirkung von Steffimycin Bt

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Test-Mieroorganisnms Minimale inhibierende

Konzentration in /

Staphylococcus aureus 4,ο

Streptococcus hemolyticus 7,3 + 4,ο

Streptococcus faecalis 7,3

Escherichia coli >5oo.

Proteus vulgaris ->5oo

Klebsiella pneumoniae _>5oo

Pseudomonas aeruginosa >5oo

Diplococcus pneumoniae 1,o

Der Verdünnungstest im fteagensglas wurde mit dein BHI-Medium (Hirn-Herz-Infusionslösung, Hersteller Difeo, Detroit, Mich.) durchgeführt. Die Teströhrchen (13 x 1oo mm) wurden in üblicher V/eise wie in Snell, E.E., Vitamin Methods, Bd. 1, Academic Press, Inc., New York 195o, S. 327 beschrieben, vorbereitet. Die Sestorganismen wurden 13 Stunden bei 37°U gezüchtet und zur Inokulierung des Testmediums verwendet. Die Ergebnisse wurden nach 17 Stunden ermittelt.

Der zur Herstellung des erfindungsgemäüen Antibiotikums verwendete Mikroorganismus erhielt die Bezeichnung Streptoffiyces elgreteus sp. n. . Eines seiner Charakteristika ist die Produktion von Steffimyein B. Eine Subkultur des lebenden Organismus wurde hinterlegt und kann aus der permanenten Sammlung der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Hesearch Service, ti.S.-Landwirtsehaftsministerium, Preoria, Illinois, U.S.A. bezogen werden. Me Hinterlegungsnummer lautet NRkL 5634·

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Taxonoiri e: otreptomyees elgreteus Dietz sp. n.

Farbeigenschäften; Luftwaehstum lavendel-grau bis grau-rosa; Melanin-negativ. Das Aussehen auf Lktachrome ist in Tabelle I erläutert. Die Farbeigensehaften im Vergleich sind aus Tabelle II ersichtlich. Die Kultur kann in der grauen (GY) oder roten (R) Farbgruppe von Tresner und Backus (Treaner,

H. D. und E.J. Backus, 1963,"System of color wheä-S for streptomyce te taxonomy", Appl. Microbiol. 11:335-338) eingeordnet werden«,

Mikroskopische Eigenschaf ten: Die Spcrophoren sind lang und gerade (RF) im Sinn von Pridham et al (Priiham, T.G., Cw. Hessen tine, und R.G. Benedict, 1958 "A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections", Appl. Lierobiol. 6:52-79). Bei der Untersuchung mit dem i'ransiri^sionselektronenmikroskop erscheinen die Sporen lang (oft recht eckig) mit abgeflachten Enden und glatter Oberfläche bei direkter Untersrehimg. Bei der Untersuchung von Kohlenstoff-Abdruck präparat en scheint die Überfläche abgeschält zu sein un." sir- nieht lockig aus. Bei der direkten Untersuchung der dporenoberfläehe mit dem abtastenden- Elektronenmikroskop erscheint diese haarig mit wolligem Aussehen. Die elektronenmikroskopipchen Untersuchungen wurden nach Dietz und Mathews (Dietz, A. und J. Kathews,1962 "Taxonomy by carbon replication. T. An exarination of Streptomyces hygroscopicus", Appl.

;'6^; s.a. Appl. Kicrobiol. 21:526-53?) durchgeführt.

Kultur- und biochemische Eigenschaften: Diese Eigenschaften sind in iabelle III zusammengestellt.

Kohlen stoff verwertun.tr: Ik synthetischen fcedium von Pridham und Gottlieb (Pridham, 'x'.G. und D. Gottlieb, 1948, "The utilization of carbor ompounds by some Actinomycetales as an aid for species determination", J. Bacteriol. 56:1o7-114) zeigt S.

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BAD ORtGfNM.

elgreteus schlechtes Wachstum im Vergleichsmedium (G-rundmedium ohne Zusatz einer Kohlenstoffverbindung), ferner auf D-Xylose, L-Arabinose, Lactose, Haffinose, Inulin, JJulcit, D-Mannit, D-Sorbit, Üalicin, Natriumacetat und Natriumeitrat; mäßiges W_achstum auf Hhamnose, D-J?ructose, Maltose, Sucrose, Dextrin und Natriumsuccinat, gutes v/achstum auf D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose, Cellobiose, löslicher Stärke, Glycerin und Inosit und kein Wachstum auf Phenol, Eresol, Natriumformiat, -oxalat, -tartrat^und r-salj-cyij-at. Im synthetischen Medium

und GottliebCöEirling
von Shirling/I.B. und D. Gottlieb, 1966, »Methods for characterization of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol I6:313-34o) wächst die Kultur ρchlecht auf dem negativen Vergleichsmedium, (synth.etiach.es Medium ohne Zusatz einer Kohlenstoffverbindung) und auf D-Xylose und D-Mannit, gut auf dem positiven Vergleichsmedium (synthetisches Medium mit D-Grlucose), ferner auf Inosit, und mäßig gut auf D-.Pructose und Rhamnose. Die Kultur wächst nicht auf L-Arabinose, Sucrose, Raffinose und Cellulose.

!Temperatur; S. elgreteus zeigt gutes Luftwachstum auf Bennett ¹S-Agar-Medium bei 18-28°C und auf Maltose-Trypton-Agar bei 24 bis 28⁰C. Die Kultur ergibt auf diesen Medien bei 37°C ein befriedigendes vegetatives Wachstum, kein wachstum hingegen

innerhalb 24 Stunden bei 45 und 55°C.

Antibiotika-produzierende Eigenschaften; Die Kultur produziert Steffimycin B und etwas Steffisburgensimycin (US-PS 3 3o9 273), das auch als Steffimycin bekannt ist.

Quelle: Erde.

Kulturtyp: Streptomyces elgreteus sp. n. UC 5453.

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Ein neues, zur Produktion des Antibiotikums Steffimycin befähigtes Bodenisolat wurde charakterisiert und als neue Streptomyceten-Species bestimmt. Die neue Kultur unterscheidet sich deutlich von dem Steffimycin-produzierenden Mikroorganismur Streptomyces steffisburgensis (Dietz, A, 1967, Streptomyces steffisburgensis sp. n. J. Bacteriol. 94:2o22-2o26). Die Kultur besitzt ein lavendel-graues bis grau-rosa Luftwachstum, int Melanin-negativ, solubiliniert Tyrosin, solubilisiert Xanthin nicht und besitzt gerade Sporophoren , die lange Sporen mit glatt bis lockiger bis haariger Oberfläche tragen. S. steffisburgensis besitzt ein graues Luftwachstum, ist Melanin-positiv, solubilisiert i'yrosin nicht, solubilisiert hingegen Xanthin und besitzt kurze, gerade, offen-spiralige bis spiralige Sporophoren, die kleine, dornartige Sporen (Dietz, A, 1967, Streptomyces steffisburgensis sp. n. J. Bacteriol. 94:2o22-2o26)

Sporen tragen ,ι

oder warzige Γ( Diet ζ Α., und ·^τ . Mathews, 197o, Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups", _t Appl. Microbiol. 21:527-533). Das neue Bodenisolat unterscheidet sich von den in V/aksiran (Waksman, S. A, 1961, "The Actinomycetes, Bd. 2, Classification, Identification, and Descriptions of Genera and Species, The Williams & Wilkins Co., Baltimore), Hütter (Hütter, R, 1967, Systematik der Streptomyceten. S. Karger, Basel S. 382) und Shirling und Gottlieb (Shirling, E.B., und D. Gottlieb, 1968 "Cooperative description of type cultures of Streptoipyces. IX* Species deserir tions from first study", Int. J. Syst. Bacteriol. 18:69-189, Shirling, E.B. und D. Gottlieb, 196S, "Cooperative description of type cultures of Streptomyces. III. Additional species descriptions from first and second studies", Int. J. Syst. Bacteriol. 18:279-399, Shirling, E.B. und D. Gottlieb, 1969 "Cooperative description of type cultures of Streptomyces. IV. Species descriptions from the second, third and fourth studies", Int. J.Syst. Bacteriol. 19:391-512)

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to

charakterisierten Kulturen.sowie von den Kulturen der The Upjohn Culture Collection. Es wird daher vorgeschlagen, der Kultur die Bezeichnung .itreptomvcep elgreteur üietz u.n. zu geben. Diese l'ypen-Spezies Kann auch als 'fypen-Variätät gem&ti Regel 7 des internationalen !Tomeniclatureodef; für Bakterien (ΙΝΤΕΙίΓΑΪ IONAL GOL⁵E OF NUkSKGLAi¹URE OF BACi¹KkIa, 1966, Herausg. Editorial Board of the Judicial Commission of the International Committee on Nomenclature of Bacteria, Intern» J. Syptem. Bacteriol. 16j459-49o) betrachtet werden.

Die Eigenschaften von Streptomyces elgreteus NKRL 5634 werden in den folgenden Tabellen angegeben:

Tabelle I

Aussehen von Streptomyces elgreteu« auf Ektachrome

Agar-Mediuni Oberfläche Unterseite

Bennett-MediUBJ gut Xavendel-grau rot-lederf.

Gsapek'a Sucrose farblos bis blaß grau farblos

Miiltoae-iErypton stärker lavendel-grau blau rot-lederf-

Pepton-Eiaen Spur lavendel-grau gelb

0,15c Tyrosin üpur lavendel-grau blaß rot-lederf.

Casein-Stärke Spur lavendel-grau blau grau-rosa

Dietz, A. 1954} "E jctachrome transparencies as aids in

aotinomycete classification", Ann. N.Y. Acad. oci. 60:152-154.

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Tabelle II

.iarbeigenac haften Agar-Medium

von Streptomycea elgreteua im Vergleich

Color Harmony Manual NBS Circular 553, 1955" 3. Aufl. 194β⁺

Bennett-Medium	S
	R
	P
Czapek's Sucrose	3
	R
	P
MaI t ο r? e-'i1 ry pt on	3
	R
	P
Hefeextrakt- Malzextrakt (I3P-2)	3 R

2fe gedeckt grau

3ig beige-braun, verschwommen braun

2ge gedeckt lederf., griege

3dc natürlich 3ge beige, kamel

4ge hell rehfarben, rose beige

5dc weidenkäts3i;h.en-grau 4ie korkbraun

4ge hell rehfarben, rose beige

3dc natürlich

51g kakaobraun, rosenholzbraun, rotbraun

6ig dunkel Lolzrot 94g hell oliv-braun
112 gm hell oliv-grau

8om gräulich-gelblich braun 95g mäßig oliv-braun

94m hell oliv-braun

1o9 gm hell gräucEich-oliv

79m hell gräulich-gelb]ich braun 94m hell oliv-braun

6ogin hell gräulich-r braun

1ogm roaa-grau
57gm hellbraun
6ogm hell gräulich-braun

43g mäßig rötlich braun 46m gräulich-rötlich braun

19m gräulich-rot

46gm mäßig rötlich-braun

CaJ CO

'l'abelle II (tforts.)

Agar-Medium

ο to
co

Color Harmony Manual 3· Aufl. 1948⁺

NBS Circular 553, 1955"

Hafermehl
(lSP-3)

anorganische
Salze-Stärke
(ISP-4)

S R P S R P

Glycerin-Aspara- 8 gin (IS₁P-S) _R

3dc natürlich 3dc natürlich

5ba muschelrosa 5ba musche]rosa

3fe silbergrau 2ig schieferbraun

9m rosa-weiß 9m roaa-weiß

63gm hell bräunlich-grau

11og gräulich-oliv 112m hell oliv-grau

S = Oberfläche

H = Unterseite
P = Pigment

Jacobson E., W.C. §ranville und Ca. foas, 194-8, Color harmony manual, 3· Aufl.,
Container Corporation of America, Chicago.

⁺⁺ Kelly, K.L. und D.B'. Judd, 1955, The I3CC-NB3 method of designating colors and a
dictionary of color names, U.S.-v»irtschaftsministerium, Circ. 553, Washington, D.C

Tabelle III
Kultur- und biochemische Eigenschaften von S. elgreteus

Medium Oberfläche Unterseite andere Eigen-

; schäften

Aga r

Pepton-Eisen - lederf.

Üac]l_iummalat

GrIy ce rin-Aspa ragin Magenril'Ch

grau-rosa Luftwachstum grau-rosa

grau-rosa

Tyrosin Xanthin Nähhrstärke rosa-lederf,
gelb-lederf,

blaß lederf,
c reme

blaß rosa Luftwachstum rosa-lederf, blaß lederf.
Melanin-negativ

rosa Pigment
Malat wird nicht solubilisiert

rosa Pigment

gelb-lederf.
Casein wird nicht solubilisiert .^

blaß lederf. ^ Tyrosin wird solubili-r siert

•creme Pigment
Xanthin wird nicht solubilisiert

rosa-lederf.
Stärke wird nicht hydrolysiert

Ca) CaJ

Medium

Tabelle III (Ports.) Oberfläche Unterseite

Hefeextrakt-Malzextrakt

Pepton-Hefeextrakt-Ei^en (TtJP-6)

Tyrosin (IöP-7)

	Gelatine
O to	einfach
OO
»1 —k	Nährgelatine
M204	MrU he Lackmuam11cn

Nähr-Nitrat

blaid grau-rosa Luftwachstum

graues Luftwachstum

farbloser bia lederf.-roter Überflächenring

farbloser Oberflächenring rot-lederf,
farblos*
gelb-lederf,

brauner Oberflächenring -

synthetisches Nitrat -

farbloser Überflächenring andere Eigenschaften

dunkelroaa Pigment

Melanin-negativ

gelb-lederf. Melanin-negativ

gelb-rotes Pigment Verflüssigung i/4

gelbes Pigment Verflüssigung

pH 6,7

flockiges farbloses Bodenwaohstum Nitrat wird nicht zu Nitrit reduziert

durch und durch trüb, kompaktes Bodenwachstuir, Witrat wird nicht zu Nitrit reduziert

TH erfirHunrsfreinäup Verb^ηdun^ wi""d produziert, wenn man -ien neigen urganiFEus in wäns r' gem Nähmied ium unter submersen aen bp^r Bedingungen züchtet. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Kengen auch Oberfläch^rjn>ulturen und !«'laschen verwendet werder. Der Organismus wird in einem Nährm^diuip gezüchtet, welches eine Kohlenstoff quelle, z. ta. ein assinilierb'-vres Kohlehydrat, und eine Stickstofflueilr, z.B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweißhaltiges Laterial, erthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind z.B. Glucose, Rohzucker, Sucrose, Gy^Lcerin, Stärke, Laisstärke, -L-actose, Dextrin, belassen und dgl. Bevorzugte Stickstoffque33en sind z.B. Cornsteep Liquor, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Lilchfeststof fen, So.iabohnenmehl, Batnnv/ollsamenisefal, Iviaisrehl, lülchfeststoffe, pankreatisches Casein-Verdauungsprodukt, Brennereifeststoffe, tierische Peptonflüssigkeiten, fleisch- und Knochenschnitzel und dgl . Auch Gemische dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können mit Erfolg verwendet werden. Der Zusatz von Spureniretallen wie z.B. Zink, Magnesium, Kobalt, Eisen und dgl. zum ^ermen^ationsmedium i^t nich⁴· erforderlich, da man mit Leitungswasser und ungereinigten Ausgangsmnterialien arbeitet.

Di^ Produktion der erfindungse-emäkäen Verbindungen kann bei beliebiger Temperatur erfolgen, die zv einem befriedigenden vyachstum des l.ikroorganisirus führt, beispielsweise zwischen 1¹^ und 4o und vorzugsweise zwischen 2o und ?2⁰<". Gewöhnlich werden optimale !sengen innerhalb etwa 2 bis 1o Tagen erzielt. Das JViedium bleibt nonral^rweise während der i'eriüentation basisch. Der letzte pH-wert hängt teilweise von gegebenenfa"il"! vorliegenden Puffern und teilweise vom Ausgangs-pH des Kulturmediums ab.

wird das Wachstum in großen Gefäßen und Tanks durchgeführt, so bevorzugt man die vegetative i?orm vor der Sporenform

409811/1204 BAD ORIGINAL

zur Inokulierung, um einen spürbaren Zeitverlust bei der Produktion der neuen Verbindungen, der mit unbefriedigender Ausnutzung der Anlage verbunder ist, zu vermeiden. Es empfiehlt sich somit, in einer Nährbrühenkultur ein vegetatives Inokulum durch Inokulierung dieser Brühenkultur mit einer Probe aus einer Erd- oder ochrägbodenkultur herzustellen. Sobald ein junges, aktives vegetatives Inokulum erhalten ist, wird dieses aseptisch in große Gefäße oder l'anks überführt. Das Medium, inöe^. das vegetative Inokulum produziert wird, kann mit dem zur Produktion der neuen Verbindung verwerteten Medium indentisch oder davon verschieden sein, wobei die Bedingungen dahin gehen, daß man ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erhält.

Stef'fimyein B bildet Salze mit Alkalimetaller, Erdalkalimetallen und Aminen. Metallsalze können hergestellt werden, indem man öteffimycin B in Methanol löst, eine verdünnte Metallbase bis zum pH der Lösung· von etwa ⁿ bis 8 zusetzt und die Lösung dann gefriertrocknet, wobei man einen Rückstand aus den öteffimycin B-Metallsalzen erhält. Jteffimycin B-Metallsa'lze sind z.B. das Natrium-, Kalium- rnd Calciumsalz. Aminsalze des öteffimyein B einschließlich solcher mit organische^ Basen wie primären, sekundären und tertiären feon.0-, Di- und Polyaminen können ebenfalls nech dem vorstehend beschriebenen, sehr gebräuchlichen Verfahren dargestellt werden, heitere oalze mit therapeutisch wirksamen Basen, die einen zusätzlichen therapeutischen Effekt beisteuern, kennen hergestellt werden. Derartige Basen sind z.B. die Purinbasen wie Theophyllin, 'Theobromin, Gaffein oder Derivate der Purinbasen, Anyhistaminbasen, die zur Salzbildung mit schwachen Säuren befähigt sind, Pyridinverbindungen wie Nieotinsäureamid, Isonicotinsäurehydrazid und dgl., Phenylalkylamine wie Adrenalin, Ephedrin und dgl., Gholin und weitere.

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.)tef f iiryc in B und seine Snlze sind wirksair ge sen .Jtaphylococous aureus und .Streptococcus faecalis, sie können daher z"!m De^¹' η ffizi ?re~ von ger-nülter und gestapelten Gegenständen, die zur Nahrungsmittelzubereitung oder -aufbewahrung verwendet werden und durch die-e Bakterien verunreinigt sind, eingesetzt werden. ^if: können ferner als Desinfektionsmittel für z'ihnir.^dizi nisrhe un ^ redizinisohe i£inr^: chtungen, die mit ,.staphylococcus aureus verunreinigt sind, gebraucht werder. Da -iteffimycin B und seine Salze wirksam sind gegen Streptococcus hemolyticus, kann iran diese Verbindungen auch zum Desinfizieren von Instrumenten und Gegenständen gebrauchen, die von diesem Kikroorganismus zu befrei?n sind.

Die erfipdungsgemäföe neue Verbindung ist sauer. Sie ist in halogenierten Kohlenwasserstoffen und niederen Alkoholen löslich, in Kohlenwasserstoffen und wasser relativ unlöslich.

Zur Isolierung und Reinigung von Üteffimycin B könner verschiedene Verfahren angewendet werden, beispielsweise die Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatographie, Silikagel-Chromatographie, Flüssigkeits-Flüssigkeits-Verteilung nach Craig, Harzabsorption und Kristallisation aus Lösungsmitteln. Lösungsmittelextraktionen werden bei technischer Ausführung bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und weniger teuer sind. Gemäß einem bevorzugten Aufarbeitungsverfahren wird Steffimycin B aus dem Kulturmedium durch konventionelle Abtrennung von Mycel und ungelösten Feststoffen, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren, isoliert. Das Antibiotikum wird dann durch Extraktion aus der filtrierten ßrühe gewonnen. Zur Extraktion des Steffimycin B kann iran mit wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel," in denen der wirkstoff löslich ist, verwenden, z.B. 1-Butanol, Methyläth,vlkⁿton, Benzol oder vorzugsweise Methylenchlorid. Zweckmäßig wird die Extraktion durchgeführt, nachdem man

BAD 11/12 0 4 *

die filtrierte Brühe mit βλ η-τ Mineralsäure auf einer pH-^ von etwa 2 bis 4 eingestellt hat. uie teethy]enchloridextrakte v/erden vereinigt und im Vakuum zur l'rockene eingeengt.

Steifimyein B kann in reiner ί'οππ aus dem so erhaltenen Lethyüenchloridextrakt durch Silikageichromatographie gewonnen werden.

Nach einem weiteren Verfahren wird iJteff imycin B aus der filtrierten Brühe unter Verwendung eines Harzes aus einem nicht-ionischen, makro-porösen, mit Divinjlbenzol vernetzten Styrol-Copolymer abgetrennt. Geeignete Harze sind die in der Ud-PS 3 515 717 offenbarten Harze Amberlite XAD-1 und XAD-2. Das Harz wird mit einem organischen oder wässrigorranischen Lösungsmittel, in welchen) das adsorbierte Antibiotikum löslich ist, eluiert.

Jiine weitere Reinigungsirethode besteht darin, dafö man ein fohes Präparat von Steffimyein B nacheinander aus niederen alkoholen, z.B. Methylanol, Äthanol, Propanol oder dgl., Uhlorkohlenwasserstoffen, z.B. Chloroform, Kethylenchlorid oder dgl., Kohlenwasserstofflösungsmitteln, z.B. Pentan, Hexan, Heptan oder dgl. oder Gemischen davon kristallisiert.

Selbstverständlich ist das vorliegende mikrobiologische Verfahren, welches mit speziellen: Bezug auf den neuen Mikroorganismus otreptomyces elgreteus sp. n., NRkL 5634 beschrieben ist, nicht auf diesen durch die vorstehenden Kultureigenschaften beschriebenen Mikroorganismus beschränkt. Vielmehr umfaßt die Erfindung auch die Verwendung von Stämmen oder Lutanten dieses Mikroorganismus, die nach bekannten Methoden erhalten werden können, beispielsweise indem man den iiikroorganiamus einer Höntgen- oder UV-Strahlung aussetzt, mit Stickstofflost, Phagen oder dgl. behandelt.

«59811/1204 BADDRIGINAL

^nT⁴liehe ProzentIn den folgenden Beispielen beziehen sich angaben auf das Gewicht und dl«-» Mischungsverhältnisse von Lösungsmitteln auf das Volumen, falls nichts anderes angegeben wird.

Beispiel 1

a: fl'ennertati on

lycel und/oder Sporen e^.nes Sehrägnährbodens von Streptomyces elgreteur, sp. n., NKItL 56Ή werden zur Inokuiierung einer ' oerie von 5^o ml-i-rlenmeyerkolben verwendet, von denen jeder 1oo ml eines Impfnediums aus folgenden Bestandteilen enthält:

Glucosemonohydrat 25 g

Phnrniamedia 25 g

Lei ^ingswasser auf 1 Liter

PHarmamedia ist ein technisch.ee Baum wo Hf? amende hl, Hersteller Trader's Oil Uo., J?t. worth, "Texas.

D»r pH bei der Vo^sterilir.if rung des Impfm^diuinfi beträgt 7,2. Der Ansatr wi^d 3 1'8^e be-i 28 ⁰C auf einer Gump-Schütte!- maschine mit 25<"> Bewegungen pro Minute gezüchtet.

Die eigentliche Fermentation erfolgt in einem fcedium folgender Zusammensetzung:

belasse 25 gm/1

Gelbes kaismehl 2ο grn/1

Pharmaniedia 15 gm/1

Das Medium wird mit 5o^>iger Natriumhydroxydlösung auf pH 7,2 eingestellt, in I00 ml-Volumina auf 5oo ml-Erlenmeyerkolben

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BAD ORiGfNAL

verteilt und 25 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Die inokulierten Kolben (5 Volumen-^ Inokulum) werden bei 28⁰C auf einer Grump-Schüttelmaschine mit 25o Bewegungen/Minute inkubiert. Eine typische fermentation liefert folgende Ergebnisse:

Tag Test (Bü/ml)'

1 0

2 4

3 7

4 16

5 13

Test diente ein Agarscheiben-Plattentest gegen den Mikroorganismus Sareina lutea. Der Test gegen Sarcina lutea wird auf Agar durchgeführt, welches mit Phosphatpuffer auf pH 7,4 gepuffert ist. Ein Einheitsvolumen (0,08 ml) der die zu testende Substanz enthaltenden Lösung wird auf eine 12,7 mm-Papierscheibe gegeben, die dann auf eine mit dem Testorganismus angeimpfte 1 mm tiefe Platte aus Penassay Seed Agar (Difco) gelegt wird. Die Agar-Platte wird sodann 16 bis 18 Stunden bei 32°C inkubiert, üine Bioeinheit (BU)' ist definiert als die Konzentration des Antibiotikums, die unter Standard-Testbedingungen eine Inhibierungszone von 2o mm ergibt. Ms ü beispielsweise eine ie^rentationsbrühe 1/100 verdünnt werden zur Erzielung einer 2o mm-Inhibierzone, so beträgt die Stärke der Brühe "Oo BU/ml.

Teil B: Aufarbeitung

Die gemäß Teil A erhaltene, gesamte Ferrcentationsbrühe wird unter Verwendung von Diatomeenerde als .Filterhilfsmittel filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen, die-Waschlösung wird mit der klaren Brühe vereinigt und die vereinigte Lösung wird 2 χ mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte

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werden vereinigt und unterhalb 4o°C im Vakuum zur Trockene eingeengt. Die Stärke der klaren Brühe, der extrahierten Brühe und des Extrakts werden durch Tauchbefleckung (12 mm-Scheiben) auf mit S. lutea geimpftem Agar ermittelt. (Die Stärke des Präparats wird bestimmt, indem man eine 5o mcg/ml-Lösung in CHpGlp herstellt und Serienverdünnungen bis 5o y/ml vornimmt, 8o mcl auf 12 mm-Papierscheiben appliziert und auf mit S. lutea angeimpftes Agar legt. Die Verdünnung, die eine 2o mm-Inhibierungszone ergibt, bestimmt die Anzahl der Bioeinheiten). Die Zusammensetzung des Präparats wird durch Dünnschichtenchromatographie an Silikagel unter Verwendung eineikobilen Phase aus folgenden Lösungsmitteln bestimmt:

CH₂Gl₂ 3o Teile

Aceton ' 1o Teile

Hexan 3 Teile

Methanol 2 Teile

Die Chromatographiersäule wird unter Verwendung der obigen mobiles Phase mit 5o bis 1oo g Silikagel H (Merck) pro Gramm zu verarbeitendem Steffimycin B-Präparat gepackt. Nachdem die Säule sich abgesetzt hat, wird eine Lösung des Steffiiüjcin B-Präparats im geringstmöglichen Volumen Methylejachlorid auf die Säule aufgegeben. Die Säule wird mit der obigen mobilen Phase bei einer Durchflußgeschwindigkeit von ca. 1o ml/Minute eluiert. Während der Eluierung entwickeln sich mehrere gefärbte Banden. Die die erste sehwach gelbe Bande enthaltende fraktion wird verworfen und die . 'die erste tieforange Bande enthaltende fraktion wird verwertet. Diese ii'raktion wird so abgetrennt, daß sie nichts aus der zweiten rot-orangen Bande, die das Steffimycin enthält, aufweist. Die Reinheit des .Steffimycin B wird dünnschichtenchromatographisch an Silikagel unter Verwendung

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der mobilen Phase kontrolliert. Das so erhaltene gereinigte Steffimycin B enthält gemäß dem Dünnschichtenchromatogramm keine weiteren gefärbten oder fluoreszierenden Materialien.

Steifimycin B wird in reiner kristalliner Ji'orm erhalten, indem man die obige, Steffimyein B enthaltende Fraktion wiederholt aus Methanol kristallisiert.

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Claims (3)

1. Patentansprüche

   . Neue Verbindung, der die Bezeichnung uteffimycin B gegeben wurde und die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie

   (a) das Wachstum von gram-positiven Bakterien wirksam inhibi ert,

   (b) eine optische Drehung von /j*_7^= +94° (c = 2, CHCl ) besitzt,

   (c) folgendes charakteristische Ultraviolett-Absorptionsspektrum aufweist:

   In Äthanol: Λ max. bei 234 m/u (a = 47,3)

   Sch bei 254 m/u (a = 36,9) Sch bei 274 nyu (a = 33,3)

   In o,In-alkoholischer KOH: A max. bei 233 m/U (a = 53,7)

   üch bei 259 m/u (a = 45,o)

   In o,In-alkoholischer HCl: \ max. bei 234 m/u (a = 46,7)

   Sch bei 254 nyu (a = 36,6) Jch bei 274 m/u (a = 33,o)

   (d) ein charakterisches Infrarot-Absorptionsspektrum iii Mineralöl wie aus J?'igur 1 ersichtlich besitzt,

   (e) bei der ülementaranalyse folgende .<erte liefert: O: 58,63; H: 5,58; O: 35,74

   (f) ein charakteristisches kernmagr. et inches Kesonanzspektruir. wie aus Figur 2 ersichtlich besitzt,

   (g) einen sie vom Steffinr'cin unterscheidenden charakteristischen Κ,,-toert gemäß J?^ligur 3 aufweist und

   (h) ein Molekulargewicht gemäß Massenspektrum von 588 besitzt, und deren nicht-toxische Basenadditionssalze.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man otreptomyces elgreteus sp. n.,

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   ORIGINAL INSPECTED

   oder dessen lutanten in wässrigem Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, bis das liedium durch Bildung von •Steffimycin J? eine wesentliche antibiotische Wirkung erhalten
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Nährmedium eine Quelle für assimilierbares Kohlehydrat und assimilierbaren Stickstoff enthält.

   4· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß. man die Verbindung aus der Fermentationsbrühe isoliert.

   Für: The Upjohn Company Kalamzoo, Mich., V,St.A.

   Dr.H.J.Wo!ff

   Rechtsanwalt

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