DE2835295A1 - Biologisch reine kultur des mikroorganismus streptomyces puniceus subsp. doliceus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum 354 und verfahren zur herstellung des antibiotikums 354 sowie von gougerotin - Google Patents

Biologisch reine kultur des mikroorganismus streptomyces puniceus subsp. doliceus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum 354 und verfahren zur herstellung des antibiotikums 354 sowie von gougerotin

Info

Publication number
DE2835295A1
DE2835295A1 DE19782835295 DE2835295A DE2835295A1 DE 2835295 A1 DE2835295 A1 DE 2835295A1 DE 19782835295 DE19782835295 DE 19782835295 DE 2835295 A DE2835295 A DE 2835295A DE 2835295 A1 DE2835295 A1 DE 2835295A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antibiotic
gougerotin
gray
tan
carbon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19782835295
Other languages
English (en)
Inventor
Clarence Deboer
Lester Arthur Dolak
Durey Harold Peterson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmacia and Upjohn Co
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of DE2835295A1 publication Critical patent/DE2835295A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Bei der erfindungsgemäßen Fermentation zur Gewinnung des Antibiotikums 354 entsteht auch das bekannte Antibiotikum Gougerotin. Dieses bekannte Antibiotikum wird in "JACS" Band 94, Seite 3272 (1972) beschrieben. Gougerotin wird auch als Aspiculamycin bezeichnet (vgl. US-PS 3 849 398).
Das Antibiotikum 354 erhält man bei einer unter gesteuerten Bedingungen durchgeführten Fermentation unter Verwendung einer biologisch reinen Kultur des neuen Mikroorganimus Streptomyces puniceus subsp. doliceus DSM 1342 . Gleichzeitig mit dem Antibiotikum 354 entsteht das bekannte Antibiotikum Gougerotin. Das Antibiotikum 354 läßt sich von dem Gougerotin während der Reindarstellung ohne weiteres abtrennen, Indem man eine die beiden Antibiotika enthaltende Zubereitung auf einer Cellulosesäule absorbiert und dann mit Methanol und schließlich mit Wasser eluiert. Das Antibiotikum 354 wird durch das Methanol, Gougerotin durch das Wasser eluiert.
Das Antibiotikum 354 ist gegen Gram-negative Bakterien aktiv. Besonders aktiv ist es gegen Pseudomonas- und Proteus-Arten. So ist beispielsweise das Antibiotikum 354 gegen Pseudomonas aeruginosa GN-315 (UC 6149), das gegen
909816/0647
Gentamycin, Kanamycin und Nalidixinsäure resistent ist, wirksam. Somit kann also das Antibiotikum 354 zur Bekämpfung topischer Pseudomonas-Infektionen durch gegen Gentamycin, Kanamycin und Nalidixinsäure resistente Pseudomonas-Arten verwendet werden. Ferner eignet es sich auch als ölkonservierungsmittel, beispielsweise als bakteriostatisches Mittel zur Inhibierung des Wachstums von Proteus vulgaris, das bekanntlich einen Verderb von Schneidölen hervorruft, verwendet werden. Ferner eignet es sich als' Bestandteil von Waschlösungen für sanitäre Zwecke, beispielsweise in Handwaschmitteln und Mitteln zum Säubern von Anlagen, Fluren oder Möbeln kontaminierter Räume oder Laboratorien. Weiterhin kann es als industrielles Konservierungsmittel, beispielsweise als bakteriostatisches Spülmittel gewaschener Kleidungsstücke und zum Imprägnieren von Papier und Geweben verwendet werden. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Unterdrückung des Wachstums empfindlicher Organismen auf Versuchsplatten oder sonstigen mikrobiologischen Medien. Schließlich eignet es sich als Nahrungsmittelzusatz zur Förderung des Wachstums von Tieren.
Chemische und physikalische Eigenschaften von Antibiotikum 354:
Molekulargewicht: 172 (ermittelt durch Felddesorptionsmassenspektroskopie)
Elementaranalyse der Verbindung (C7I92224 (Molekulargewicht: 474):
gef.: C = 37,08 % H = 4,79 %; N = 12,38 %; Cl = 15,52 %; S = 7,48 %; O = 22,75 %.
UV-Absorptionsspektrum:
Die UV-Absorptionsmaxima des Antibiotikums 354 ergeben sich
aus Figur 2. Sie sind:
16/0647
In 0,01 η HCl, \ , a, [S ): 213 nm, 38,54, (6.650) und 251 nm, 9,02, (1 .550).
Infrarotabsorptionsspektrum:
Das Antibiotikum 354 besitzt in Form des Sulfatsalzes als Auf schweTnmung in einem Mineralölgemisch (mineral oil mull) ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Figur 1. Bei folgenden Wellenlängen (ausgedrückt in reziproken Centimetern) sind Peaks festzustellen:
Erläuterung: S = stark; M = mittel; W = schwach; Sh = Schulter
Bandenfrequenz Intensität
(Wellenzahl)
3170 S, Sh
3070 S
2950 S (öl)
2920 S (öl)
2850 S (öl)
2750 S, Sh
1687 S
1572 M
1462 S (öl)
1377 M (öl)
1342 M
1300 W
1285 W
1252 W
1217 M
1187 M
1100 S
1062 S, Sh
992 M
975 M
940 M
925 M
890 W
862 M
800 M
730 M
705 M
660 M
608 S
909316/0647
Löslichkeitsverhalten:
Antibiotikum 354 ist in Wasser löslich, in Methanol, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid schlecht löslich.
Kernresonanzspektrum:
Das 'H-Kernresonanzspektrum des Antibiotikums 354 in Form des Sulfats bei 60 Megazyklen ist in Fig. 3 dargestellt. Das Kernresonanzspektrum wird mittels einer Lösung (etwa 0,5 ml-, etwa 15 %ige Konzentration) einer Pro be des Antibiotikums 354 in Deuteriumoxid (D-O) in einem Varian XL 100-Spektrometer aufgenommen. Das Spektrum wird gegen externes Tetramethylsilan geeicht. Die Genauigkeit von Δ γ beträgt *> + 1 c.p.s. Die Frequenzen ο —
werden in c^p.s. "downfield" von Tetramethylsilan aufgezeichnet.
Antibakterielles Spektrum von Antibiotikum 354: Bei einer Konzentration von 1 mg/ml zeigt das Antibiotikum 354 bei einem Standardscheiben-(12,7 mm)-Plattentest folgende Inhibierungszonen:
Mikroorganismus Inhibierungszone
Bacillus subtilis 25 mm
Pseudomonas mildenbergii 30 mm
Bei mit dem Antibiotikum 354 durchgeführten Mikroplattenbrühenverdünnung mit einer Nährbrühe wird folgendes Spektrum beobachtet:
Mikroorganismus geringste inhibierende Konzentration (mcg/ml)
Staphylococcus aureurs UC 76 31,2
Streptococcus fecalis UC 694 125 Escherichia coli UC 45 15,6
Klebsieila pneumoniae UC 57 31,2
Klebsieila pneumoniae UC 58 7,8
Salmonella schottmuelleri UC 126 7,8
909816/06A7
Mikroorganismus
Proteus vulgaris UC 93 Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa UC 95 Serratia marcescens UC 131 Shigella flexneri UC 143 Salmonella typhi
geringste inhibierende Konzentration (mcg/ml)
1 5,6
3 1,2
1 5,6
3,9
1 5,6
1 5,6
"UC" steht für The Upjohn Company Culture Collection. Die aaO zahlenmäßig definierten Kulturen sind auf Anfrage von The Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan,
erhältlich.
Das Antibiotikum 354 hat sich gegen vom Bronson Hospital, Kalamazoo, Michigan, erhaltene Pseudomonas aeruginosa-Stämme als aktiv erwiesen. Die erhaltenen Stämme waren gegen bekannte Antibiotika, nämlich Kanamycin, Gentamycin, Nalidixinsäure und Polymyxin B. relativ resistent. Bei diesem Vergleichstest, der mit 0,03 ml Antibiotikum (1 mg/ml) pro Scheibe im Rahmen eines Standardagarscheibenplattentests mit 6,35 mm Papierscheiben durchgeführt wurde, werden folgende Ergebnisse erhalten:
Inhibierungszone (mm)
P. aeruginosa Kana Genta- Nalidi Polymyxin Antibio
Stamm Nummer mycin mycin xinsäure B tikum 354
6429 11 14 13 Spuren 22
6430 11 14 13 Spuren 33
6431 0 Spuren 12 Spuren 22
6433 Spuren 11 13 Spuren 21
6434 13 22 13 Spuren 20
6435 0 13 17 Spuren 24
6436 0 9 13 9 22
909816/0647
25 Lf)
25 ,5
25
25
12
12
25
Ferner wurde das Antibiotikum 354 auch im Rahmen eines Nährbrühenverdünnungstests gegen dieselben Pseudomonas-Stämme getestet. Die Teströhrchen wurden 18 h lang bei einer Temperatur von 320C inkubiert. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten:
P. aeruginosa- geringste inhibierende
Stamm Nummer Konzentration mcg/ml)
6429 6430 6431 6433 6434 6435 6436
Der Mikroorganismus
Zur Gewinnung von Antibiotikum 354 und Gougerotin bedient man sich des Mikroorganismus Streptomyces puniceus subsp. doliceus DSM 1342.
Eine Subkultur dieses Mikroorganismus ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für Strahlen und Umweltforschung mbH, München, Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen unter der Hinterlegungsnummer DSM 1342 hinterlegt.
Eine aus den Upjohn-Testböden isolierte Actinomycete hat sich in ihren Kultureigenschaften als zu Streptomyces griseus var. purpureus, S. californicus und S. vinaceus ähnlich erwiesen. 1955 haben Burkholder und Mitarbeiter (vgl. P. R. Burkholder, S. H. Sun, L.E. Anderson und J. Ehrlich "The identity of viomycin-
909816/0847
producing cultures of Streptomyces" "Bull. Torrey bot. Cl." Band 82, Seiten 108 bis 117 (1955)) vorgeschlagen, die Viomycin produzierenden Kulturen in einer neuen Varietät von S. griseus, nämlich S. griseus var. purpureus, in Synonymie zu bringen. Die Viomycin-Produzenten unterscheiden sich von S. griseus durch ihre ausgeprägt rotpurpurne Rückseite und Pigmentbildung auf zahlreichen Medien (vgl. R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, 1974 in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, The Williams and Wilkins Co., Baltimore), P.R. Burkholder Ic, E.B. Shirling und D. Gottlieb, 1968 in "Cooperative description of type cultures of Streptomyces. II. Species descriptions from first study". "Int. J. Syst. Bacteriol.", Band 18, Seiten 69 bis 189, E.B. Shirling und D. Gottlieb, 1969 "Cooperative description of type cultures of Streptomyces. IV. Species descriptions from the second, third and fourth studies." "Ing. J. Syst. Bacteriol." Band 19, Seiten 391 bis 512). Sie unterscheiden sich von S. griseus in ihren Temperatur-, Kohlenstoffausnutzung- und allgemeinen Wachstumerfordernissen bzw. in ihrer Sporenkette oder in ihrem Sporenoberflächenmuster nicht (vgl. E.B. Shirling und D. Gottlieb, 1968 "Cooperative description of type cultures of Streptomyces. III. Additional species descriptions from first and second studies" "Int. J. Syst. Bacteriol.", Band 18, Seiten 280 bis 399).
1966 bezeichneten Buchanan und Mitarbeiter (vgl. R.E. Buchanan, J.G. Holt und E.F. Lessei, Jr. in "Index Bergeyana" The Williams and Wilkins Co., Baltimore 1966) S. griseus var. purpureus Burkholder und Mitarbeiter als illegitimen Namen. Auch S. vinaceus (vgl. Mayer und Mitarbeiter) Waks. und Henrici wird als illegitim bezeichnet. S. califormicus, S. floridae und S. puniceus werden als legitime Namen angesehen. In Bergey's Manual, 8. Ausgabe (vgl. R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, Ic)
909816/0647
werden die letzten drei genannten Kulturen als Typenkulturen bezeichnet. Von Shirling und Gottlieb (vgl. Shirling und Gottlieb. Ic in 18, Seiten 69 bis 189 und 19, Seiten 391 bis 512) werden S. californicus, S. puniceus und S. vinaceus als Typenkulturen bezeichnet. Die bei Burkholder Ic, von Shirling und Gottlieb Ic in 18, Seiten 69 bis 189 und in Bergey's Manual, 8. Ausgabe von R.E. Buchanan und N.E. Gibbons Ic auch für S. puniceus aufgeführten Kultureigenschaften stimmen mit den für die mit dem neuen Bodenisolat verglichenen Kulturen festgestellten Eigenschaften überein. Von diesen Kulturen ist S. puniceus Patelski (1950) die am frühesten beschriebene (vgl. P. R. Burkholder Ic). Das neue Isolat zeigt zu den zitierten Kulturen geringere Unterschiede der Wachstumsfärbung und der Antibiotikumproduktion. Auf der Basis dieser Unterschiede wird für diese neue Kultur die Bezeichnung Streptomyces puniceus subsp. doliceus subsp. nov. vorgeschlagen.
Die angenannten Methoden finden sich bei Dietz (vgl. A. Dietz 1954 "Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification" "Ann. N.Y. Acad. Sei." Band 60, Seiten 152 bis 154, A. Dietz 1967 "Streptomyces steffisburgensis sp. n." "J. Bacteriol." Band 94, Seiten 2022 bis 2026), Dietz und Mathews (vgl. A. Dietz und J. Mathews 1971 "Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups" "Appl. Microbiol." Band 21, Seiten 527 bis 533) und Shirling und Gottlieb (vgl. E.B. Shirling und D. Gottlieb 1966 "Methods for characterization of Streptomyces species" "Int. J. Syst. Bacteriol." Band 16, Seiten 313 bis 340). S. puniceus subst. doliceus wird mit den in der folgenden Tabelle I angegebenen Viomycin produzierenden Kulturen, denen es auf Ektachrom am meisten ähnelt, verglichen. Hierbei handelt es sich um S. griseus var.
909816/Q6A7
purpureus NRRL 2423 (UC 2414), S. griseus var. purpureus CBS (UC 2468) , S. vinaceus NRRL 2285 (UC 2920) und S. californicus ATCC 3312 (UC 5270).
Taxonomie: Streptomyces puniceus Finlay & Sobin subsp. doliceus Dietz und Li subsp. nov.
Farbeigenschaften: Luftwachstum: cremefarben bis cremefarbenrosa bis lavendelrosa. Melanin-negativ. Das Aussehen auf Ektachrom-Filmen geht aus Tabelle I hervor. Referenzfarbcharakteristika finden sich in der Tabelle II. Die Kulturen können in die grauen und violetten Farbreihen von Tresner und Backus (vgl. H.D. Tresner und E. J. Backus 1963 "System of color wheels for streptomycete taxonomy" Άρρί. Microbiol." Band 11, Seiten 335 bis 338) eingeordnet werden. S. griseus v. purpureus UC 2414 gehört in die roten und violetten Farbreihen. S. griseus v. purpureus UC 2468 und S. vinaceus UC 2920 gehören in die graue Farbreihe.
Mikroskopische Eigenschaften: Langkettige Sporen, die im Sinne von Pridham und Mitarbeitern (vgl. T.G. Pridham, CW. Hesseltine und R.G. Benedict 1958 "A guide for the classification of streptpmycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections" in "Appln. Microbiol." Band 6, Seiten 52 bis 79) gewunden (RF) sind. Die Sporenketten können in Büscheln vorliegen. Die Sporen erscheinen bei der Prüfung mit einem Abtastelektronenmikroskop rechteckig und dicht beieinander liegend. Sie zeigen glatte Oberflächen mit Einbuchtungen entsprechend einer Art "Satteleffekt" .
909818/06A7
Kohlenstoffausnutzung: Vergleiche Tabellen III und IV.
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften: Vergleiche Tabelle V.
Temperatur: Sämtliche Kulturen wachsen in 48 h bei 180C schlecht, bei 240C gut und bei 28° bis 370C sehr gut. Bei 40C, 45°C bzw. 550C ist kein Wachstum feststellbar. Die Platten werden nach 14 Tagen aus dem Inkubationsraum herausgenommen. Die kein Wachstum zeigenden Platten werden nun bei einer Temperatur von 240C inkubiert. Sämtliche zunächst bei 40C inkubierten Platten (die kein Wachstum zeigten) zeigen nun bei einer Temperatur von 24°c in 24 h ein Mikroorganismuswachstum. Die zunächst bei 450C bzw. 550C inkubierten Platten zeigten mit Ausnahme der die neue Kultur enthaltenden Platten kein Wachstum. Letztere Kultur wächst bei den vorher bei 450C inkubierten Platten heraus.
Antibiotikabildungseigenschaften: Die Vergleichskulturen produzieren das Antibiotikum Viomycin (vgl. P. R. Burkholder lc). UC 2414 ist für die Bacillus subtilis-und Klebsiella pneumoniae-Aktivitäten der neuen Kultur verantwortlich. Die neue Kultur liefert die Antibiotika Gougerotin und das Antibiotikum 354.
909816/0647
Agar-Medium Be Aussehen Tabelle I Ektachrom-Filmen* S. vinaceus ϊ S.californicus
stim S. puniceus von Kulturen auf S. griseus NRRL 2285 V i*.
'£ ■*
1 r *
i i.t-		 ATCC 3312
mung subsp. S. griseus var. 1avende1-rosa \c Spuren
doliceus var. purpureus lavendel-rosa
Bennetts S tJSIl 1342 purpureus UC 2468 rot-lohfarben rot-lohfarben
lavendel-rosa NRRL 2423 lavendel-rosa fahl-rosa sehr schwache
R lavendel-rosa Spuren rosa
Czapeks S rot -lohfarben rot-lohfarben fahl-rosa fahl-rosa
Saccharose fahl-rosa rct .-lohfarben rosa lavendel-rosa stark fahl-
R rosa rosa
Maltose-Trypton S fahl-rosa fahl-rosa rot-lohfarben gelb-lohfarben ·
lavendel-rosa rosa lavendel-rosa Spuren -
R lavendel-rosa lavendel-rosa
co Pepton-Eisen S rot-lohfarben rot-lohfarben gelb-lohfarben gelb-lohfarben
O - rot .-lohfarben Spuren fahl-rosa Spuren fahl- A
rosa ^
10 R Spuren lavendel-rosa rot-lohfarben '
00 0,1 % Tyrosin S gelb-lohfarben lavendel-rosa gelb-lohfarben fahl-rosa sehr schwacne fJ
ce fahl-rosa gelb-lohfarben fahl-rosa lavendel- rosa Spuren rosa υ
R fahl-rosa grau-lohfarben '
O Casein-Stärke S gelb-lohfarben fahl-rosa grau-lohfarben
cn 1avende1-r οsa rot-lohfarben lavendel-rosa
R lavendel-rosa
-j grau-lohfarben grau-lohfarben
grau-lohfarben
S = Oberfläche
R = Rückseite
* A. Dietz 1954 'Ektachrome transparencies as ids in actxnomycete classification"
"Ann. N.Y. Acad. Sei.", Band 60, Seiten 152 - 154
Tabelle II
Referenzfarbeigenschaften von ISCC-NBS-Farbnamenkarten mit Centroid-Farben*
Agar-Medium Be R S. puniceus S. griseus S. griseus liches braun 93 gelbliches S. vinaceus S. californicus I
stim subsp. var. var. 253 graues grau 260 sehr χ.
mung doliceus purpureus purpureus purpurnes dunkle1^ .
P DSIi 134 2 NRRL 2423 UC 2468 rosa 93 gelbliches NRRL 2285 ATCC 3312 purpur-ι '
Blatt- Farbe Blatt- Farbe Blatt- Farbe 237 stark röt grau Blatt- Farbe Blatt- Farbe nes rot -^.
chen chen chen liches chen chen 60 helles ^
Nr. Nr. Nr. Purpur — — Nr. Nr. graues '
Bennetts S 240 hell 32 graues 63 helles — — 63 helles 229 dunkel braun
rötlich gelbliches bräunliches bräunliches graues 223 schwa
O purpur bis rosa grau grau purpur ches
OO 93 gelblich purpur
grau 223 schwa
CO .R 17 sehr dunkel 21 schwarz 19 grau 20 dunkles ches
rot rot rot graues Purpur _£
O rot OO
O) CO
P 57 hell 45 helles 60 helles graues 60 helles cn
braun graues röt braun graues CO
braun cn
Czapeks S 253 grau 93 gelbliches
Saccharose purpurn- · grau
rosa
253 grau 244 fahl-röt
purpurn- liches
rosa Purpur
— —
Tabelle II Fortsetzung
'' Agar-Medium Be S. puniceus S. griseus S. griseus S . vinaceus S. californi· 1 Nr. 1-3
stim subsp. var. var. CUS \ 228 graues f
I
mung doliceus purpureus purpureus purpur· 227 fahlas *"
DSM 1342 NRRL 24 23 UC 2468 NRRL 2285 ATCC 3.3JI2.- 1. purpar
Blatt- Farbe Blatt- Farbe Blatt- Farbe Blatt- Farbe Blatt-'""?arb 257 sehr
chen chen chen chen chen ~: ' tiefes 260 sehr
Nr. Nr. Nr. Nr. purpur- . dunkles
Maltose- S 226 stark 32 graues 93 gelbliches 93 gelbliches nes ' purpurnes
Trypton fahl gelbliches grau grau rot
purpur rosa 60 helles
R 21 schwarz- 17 stark 62 dunkel 81 dunkel- graues
co rot dunkel- graues graues braun y^u
O rot braun gelbliches CO
C£>
UO		 braun CO
■■ » P 57 hell 45 helles 60 helles 60 helles ro
braun graues röt graues braun graues CD
θ liches braun in
e» braun
Hickey- S 63 helles 32 graues 93 gelbliches 93 gelbliches
Tresner bräunliches gelbliches grau grau
grau rosa
R 17 sehr 260 sehr dunkles 259 dunkles pur 20 dunkles
dunkelrot purpurnes purnes rot graues
rot rot
P 57 helles 45 helles 60 helles graues 60 helles
braun graues braun graues
rötliches braun
braun
Tabelle II Fortsetzung
Agar-Medium Be S. puniceus 1342 helles S. griseus S. griseus gelb bis gelb bis S. vinaceus 93 gelbliches S. californi- NACh 257 sehr 09
stim subsp. Blatt- Farbe bräunliches var. var. grau CUS dunkles I
mung doliceus chen grau purpureus purpureus 46 graues röt purpurnes
DSM Nr. NRRL 24 23 UC 2468 liches NRRL 2285 fahl-orange ATCC 3312 rn rot
63 Blatt- Farbe Blatt- Farbe braun Blatt- Farbe gelb bis Blatt- Farbe CHT j
chen chen 45 helles chen chen
Nr. Nr. graues Nr dunkel- Nr.
Hefe-Extrakt- S 73 32 graues 93 gelbliches rötliches 93 graues 234 dunkles
Malz -Extrakt gelbliches grau braun rot purpur
(ISP-2) 21 rosa 226 stark helles nes grau
R fahl-orange-73 fahl-orange-73 fahl-orange fahles 73 graues 17 sehr
co gelb bis purpur braun
O schwarz-
co 57 rot 46 graues rötli-20 gelbliches
_Λ ches braun grau
en
P hell dunkles rot
ο 240 braun
ö> 60 helles graues6 0 - —
*** braun
Hafer S 93 hell röt
mehl lich pur _ _ VjZ
(ISP-3) purn bis 63 helles \
I
gelblich braunes
grau grau
Tabelle II Fortsetzung
Agar-Medium Bestim
mung
S. puniceus
subsp.
doliceus
DSM 134 2 ■
Blatt- Farbe Blatt- Farbe chen chen Nr. Nr,
S. griseus
var.
purpureus NRRL 2423
S. griseus
var. purpureus
UC 2468
S. vinaceus
NRRL 2285
Blättchen
Nr.
Farbe
Blättchen
Nr.
Farbe
S. californicus
ATCC 3312
Blättchen
Nr.
Farbe
Anorganische R 242 dunkel- 259 dunkles 259 Sunkles 262 graues 17 21 sehr dunkles I fahles .
Salze - rötlich purpur purpurnes purpur rot purpur *
Stärke purpurn nes rot rot nes rot schwarz- (
(ISP-4) P 57 hell 45 helles 60 helles • 60 helles 60 60 helles rot
braun graues graues graues graues
%o rötliches braun braun braun helles
CO braun graues
00 S 63 helles 32 graues 93 gelbliches braun
—» bräunliches gelbliches grau 93 gelbliches227
O) grau rosa grau
1^ R 242 dunkel 257 sehr dunk 257 sehr dunk 259 dunkel
O
O)		 rötliches les pur les pur purpurnes
*>■» purpur purrot purrot rot
P 57 heil 45 helles 60 helles 60 helles
braun graues graues graues
rötliches braun braun
braun
Tabelle II Fortsetzung
Agar-Medium Be S. puniceus S. griseus S. griseus chen S. vinaceus purpurnes purpur S. californi- Z1 60 helles H1 1S
stim subsp. var. var. Nr. rot rot CUS S graues
mung doli ~eus purpureus purpureus 93 gelbliches 60 helles 60 helles Pl . braun
DSM .1342 NRRL 2423 UC 2468 grau NRRL 2285 graues graues ATCC 3312 m
Blatt- Farbe Blatt- Farbe Blatt- Farbe Blatt- Farbe braun braun Blatt- Farbe 5
chen chen chen chen
Nr. Nr. Nr. Nr.
Glycerol- S 63 helles 32 graues 93 gelbliches 227 fahles
Asparagin bräunliches gelbli • grau purpur
GD (ISP-5) grau ches
O rosa
OO R 21 schwarz- 257 sehr dunkles257 sehr dunkles259dunkles 21 schwarz-
OO rot purpurnes rot
—λ rot
cn P 57 hell 45 helles
ο braun graues
en rötliches
braun
S = Oberfläche, R = Rückseite, P = Pigment
Vergl. K.L. Kelly und D.B. Judd. 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors
and a dictionary of color names" "U.S. Dept. of Comm. Circ."553 Washington, D.C.
co co cn ro co cn
Tabelle III
Wachstum auf Kohlenstoffverbindungen in dem künstlichen Medium von Pridham und Gottlieb*
S. puniceus subsp. doliceus
■·;. DSM 134'2
S. griseus
var.
purpureus NRRL 2423
S. griseus
var.
purpureus UC 2468
S. vinaceus S. californicus
NRRL 2285 ATCC 3312
Vergleichsversuch
1. D-Xylose
2. L-Arabinose
3. Rhamnose
4. D-Fruktose
5. D-Galaktose
6. D-Glukose
7. D-Mannose •8. Maltose
9. Saccharose
10. Laktose
11. Cellobiose
12. Raffinose
13. Dextrin
14. Inulin
15. Lösliche Stärke
16. Glycerin
17. DuIcit
18. D-Mannit
19. D-Sorbit
20. Inosit
■cn ro co cn
Fortsetzuna Tabelle III
co O co
21. Salicin
22. Phenol
23. Kresol
24. Na-formiat
25. Na-oxalat
26. Na-tartrat
27. Na-salicylat
28. Na-acetat
29. Na-citrat
30. Na-succinat
S. puniceus S. griseus S. griseus subsp. var. var.
doliceus purpureus purpureus
DSM 1342 NRRL 2423 UC 2468
S. vinaceus
NRRL 2285
S. californicus
ATCC 3312
+ = gutes Wachstum (+) = mäßiges Wachstum (-) = Spurenwachstum - = kein Wachstum
* T.G. Pridham und D. Gottlieb 1948 "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination" in "J. Bacteriol", Band 56, Seiten 107 bis 114.
Tabelle IV
Wachstum auf Kohlenstoffverbindungen in dem künstlichen Medium nach Shirling und Gottlieb*
S. puniceus S. griseus S. griseus
subsp. var. var.
doliceus purpureus purpureus S. vinaceus S. californicus
DSfo 134 2 NRRL 2423 UC 2468 NRRL 2285 ATCC 3312
Negatives Vergleichsmedium (künstliches
Medium ISP-9) +' + + +
Positives Vergleichs- ~
medium (künstliches Medium + D-Glukose) ++ ++ ++ ++ ++
Kohlenstoff-Verbindungen;
L-Arabinose + + + + +
Saccharose +
D-Xylose ++ ++ + + ++
Inosit -
D-Mannit ++ ++ ++ ++ ++
D-Fruktose + ++ + ++ ++
-CO
cn
CO
cn
Tabelle IV Fortsetzung
S. puniceus S. griseus S. griseus
subsp. var. var.
doliceus purpureus purpureus
DSM 1342 KRRL 2423 UC 2468
S. vinaceus S. californicus NRRL 2285 ATCC 3312
Rhamnose Raffinose Cellulose
++ starke Ausnutzung + positive Ausnutzung + Ausnutzung zweifelhaft - Ausnutzung negativ
* E.B. Shirling und D. Gottlieb 1966 "Methods for characterization of Streptomyces species" in "Int. J. Syst. Bacteriol." Band 16, Seiten 313 bis 340.
co co
cn
Κ3 CO OI
*.· Medium Züchtungs- Tabelle V S. griseus chemische Eigenschaften S. vinaceus trum, creme 0 I i farbenes Luft I kastanienbrau
Be- bzw. Kulturcharakteristika und var. S. griseus NRRL 2285 farbene Kante \v wachstum nes Zentrum,
stim- S. puniceus purpureus var. fahl cremefar fahl-rosa farblos I lohfarbene
mung subsp. NRRL 2423 purpureus ben—rosa S. californi- H Malat wird Kante
Agar
Pepton-Eisen		 doliceus fahl creme UC 2468 gelb-lohfarben cus ATCC 3312 in Lösung fahl-rosa
S DSM 1342 farben rosa cremefarben Spuren cre gebracht
cremefarben- gelb-lohfar Melanin mefarben c reme farben-
R rosa ben gelb-lohfar negativ gelb-loh rosa
gelb-lohfarben Melanin ben cremefarben farben
ir
0		 negativ Melanin Melanin
Calcium- Melanin cremefarben negativ negativ
malat S negativ Spuren farblos Spuren creme
sehr schwache cremefarben Malat wird
CO Spuren creme- farblos nicht in Lö
R
ηη 		farben-rosa Malat wird farblos sung gebracht
sr
0		 farblos nicht in Lö Malat wird cremefarben
Malat wird sung gebracht nicht in Lö
ffi Glukose- nicht in Lö cremefarben sung gebracht fahl-rosa-
5 Asparagin S sung gebracht cremefarben rotes Zentrum, rotes Zen
cremefarben- er emefarbene
R rosa kastanienbrau- fahl-rosa- Kante
kastanienbrau nes Zentrum, fahl-rosa
nes Zentrum, lohfarbene
lohfarbene Kante
P Kante fahl-rosa
fahl-rosa
cn ro co cn
Tabelle V Fortsetzung
Medium
Magermilch
to
O
CO
Tyrosin
Xanthin
Bestimmung
R P 0
S R
P 0
S R
S. puniceus
subsp. dolineus DSM 134 2
sehr schwache Spuren cremefarben-rosa gelb-lohfarbenorange
gelb-lohfarben-orange Casein geht in Lösung
cremefarben
schwach lohfarben lohfarben Tyrosin wird in Lösung gebracht
cremefarben schwach cremefarben-lohfar- ben
cremefarben lohfarben bis sehr fahl-lohfarben
Xanthin geht nicht in Lösung
S. griseus
var.
purpureus
NRRL 24 23
S. griseus
var.
purpureus
UC 2468
S. vinaceus NRRL 2285
cremefarben
gelb-lohfarben-orange
gelb-lohfarben-orange
Casein geht
in Lösung
cremefarben
lohfarben
lohfarben
Tyrosin
wird in Lösung gebracht
cremefarben
cremefarbengelb
cremefarben cremefarbenrosa
gelb-lohfarben-orange gelb-lohfarben-orange Casein geht in Lösung
gelb-lohfarben-orange gelb-lohfar· ben-orange Casein geht in Lösung
cremefarben cremefarben
lohfarben
lohfarben
Tyrosin
wird in Lösung gebracht
cremefarben cremefarbengelb
lohfarben
lohfarben Tyrosin wird in Lösung gebracht
cremefarben cremefarbenge Ib
S. califomicus ATCC 2312
gelb-lohfar-
ben-orange
gelb-loh-
farben-orange
Casein geht
in Lösung
Spuren cremefarben fahlgelb ,
fahlgelb ΐ Tyrosin ,
wird in Lösung gebracht
Spuren cremefarbe-i fahlgelb
cremefarben- cremefarben- cremefarben- sehr fahlgelb
gelb bis fahl- gelb bis gelb bis
lohfarben fahl-lohfar- fahl-loh-
v=„4-k-t, ^,=1,4- ken farben
xantnin gent Xanthin geht Xanthin geht
nicht m Lo- schwach in nicht in Lö_
sun9 Lösung sung
Xanthin geht in Lösung
cn ro co cn
Tabelle V Fortsetzung
Medium Be S. puniceuE S.. griseus cremefarbener S. griseus S. vinaceus netzartiger S. californicus V I \ I
stim subsp. var. Kante var. NRRL 2285 Kante ATCC 3312
mung doliceus purpureus kastanien purpureus cremefarben kastanien Spuren creme \
DSP'. 1342 NRRL 2423 braun mit UC 2468 braun mit farben 1
Nährstärke S cremefarben cremefarben lohfarbener cremefarben fahl creme lohfarbener sehr fahl
Kante farben, rosa- Kante gelb
R fahl creme- cremefarben fahlrot- fahl creme lohfarben sehr fahl
farben-loh- gelb lohfarben farben, rosa- sehr fahl lohfarben
farben Spuren creme lohfarben rosa-lohfar- weiß
P nicht bis cremefarben farbenes Luft sehr fahl •ben
sehr schwach gelb bis sehr wachstum auf rosa-lohfar- Stärke wird Stärke wird
lohfarben fahl-lohfarben farblosem ben in Lösung in Lösung 9O
O Stärke wird Stärke wird Vegetativum Stärke wird gebracht gebracht OO
O in Lösung in Lösung farblos in Lösung cremefarben gelb-lohfar- Spuren CO
(O gebracht gebracht gebracht mit fischnetz- mit fisch ben cremefarben <_n
00 Hefeextrakt- S fahl-laven- fahl-laven Spuren loh cremefarben artiger Kante gelb-lohfar- ro
Oi Malzextrakt del mit creme- del mit farben ben CD
farbener Kan Melanin kastanien Melanin fahlrötlich - cn
O te negativ braun mit negativ lohfarben
R kastanien lohfarbener
braun mit Kante
lohfarbener sehr schwach sehr fahles
Kante lohfarben rot-lohfarben
P fahlrot- weiß farbloses
lohfarben Vegetativum
Pepton-Hefe- S farblos
Extrakt-Eisen vegetativ
(ISP-6)
gelb-lohfar- gelb-lohfar-
ben ben
R farblos gelb-lohfar- gelb-lohfar
ben ben
P Spuren loh Melanin Melanin
farben negativ negativ
O Melanin
negativ
Tabelle V Fortsetzung Be S. puniceus S. griseus S. griseus S. vinaceus \ S.californicus Spuren weißes gelb \1\
Medium stim subsp. var. var. NRRL 2285 ATCC 3312 Luftwachstum Verflüssigung keine
mung doliceus purpureus purpureus grau-creme
DSM 1342 NRRL 2423 UC 2468 farben lavendel- gelb
S gesprenkelt cremefarben grau-creme farben
Tyrosin cremefarben- farben kastanien kastanien
(ISP-7) lavendel braun braun
R kastanien kastanien kastanien grau-rosa fahlrot-
braun braun braun lohfarben
P Spuren fahl- Spuren fahl- grau-rosa
rot-lohfar- rot-loh- Melanin Melanin
ben farben negativ negativ
ca 0 Melanin Melanin Melanin Spuren weis-
ο
t Λ		 negativ negativ negativ ses Luft - I
\XJ
OO		 S Spuren weis- Spuren weis- Spuren farb wachstum
-* Gelatine sen Luft sen Luft loses Vege- fahlgelb fahlgelb I
reine Gelatine wachstums wachstums tativum Verflüssi keine
O P fahlgelb fahlgelb fahlgelb gung Verflüssigung
en 0 Verflüssigung Verflüssigung Verflüssigung 1/3
1/3 1/3 1/3
S Spuren weis- Spuren weißes Spuren weißes
Nährgelatine ses Luftwachs Luftwachstum Luftwachstum
tum
P gelb gelb gelb
0 Verflüssigung Verflüssigung Verflüssigung
1/3
1/3
1/3
Verflüssigung 1/3
cn ro co cn
Tabelle V Fortsetzung
Medium Be
stim
mung		 S. puniceus
subsp.
dolieeus
DSM 134 2
Nitratbrühe
künstliche
Brühe		 S
Nährbrühe
S. griseus
var.
purpureus NRRL 2423
S. griseus
var.
purpureus UC 2468
S. vinaceus NRRL 2285
S. calxfornicus ATCC 3312
cremefarbenrosa, Luftwachstum auf lavendelfarbenem rosa vegetativem Häutchen
P
O		 kompaktes Bo Spuren Boden kompaktes Spuren Boden Reduktion, rot grau-creme kompaktes I
denwachstum, wachstum , Eodenwachs- wachstum, Re mit Zn-Staub farbenes Luft Bodenwachs V
keine Reduk keine Reduk tum, keine duktion lavendelfar- wachstum auf tum, keine
tion, rot mit tion, rot mit benes Luft kastanien Reduktion, rot 1
Zn-Staub Zn-Staub wachstum auf braunem Ring mit Zn-Staub
S cremefarbenes lavendelfar- Oberflächen- Spuren Boden grau-loh-
Luftwachs benes Luft- häutchen wachstum, farbenes Luft -
tum auf ka wachstum auf Spuren Bo Reduktion wachstum auf
stanienbrau Oberflächen- denwachs kastanien
1D nem Ring häutchen tum , Reduk braunem Ring
Jr
0		 Spuren Boden Spuren Bo tion Spuren
wachstum, denwachs Bodenwachs
keine Reduk tum, Reduk tum, Reduk 2835295
tion, rot mit tion tion
Zn-Staub
Tabelle V Fortsetzung
O (O GO
Medium Be S. puniceus S. griseus S. griseus S. vinaceus S.californicus Um
1 ffl I 		I O
stim subsp. var. var. NRRL 2285 ATCC 3312 I
mung doliceus purpureus purpureus graues Luft Spuren graues \R\
DSM 134 2 NRRL 2423 UC 2468 wachstum auf Luftwachs Sl
Lakmus-MiIch S cremefarbenes graues Luft graues Luft blau-grauem tum auf blau-
Luftwachs wachstum wachstum auf Ring graurotem
tum auf einem auf blauem blau-grauem Ring
blauen vege vegetativem Ring - —
tativen Ring Ring
P schwach schwach -
purpurfarben purpurfarben Peptonisie- Peptonisie-
O Spuren Spuren rung rung gut
Peptonisie- Peptonisie- Peptonisie- Lakmus wird
rung rung rung auf einmal
reduziert
pH 7,07 pH 7,07
pH 7,07 pH 7,12 pH 7,3
S = Oberfläche R = Rückseite P = Pigment 0 = Sonstige Eigenschaften
-κτ-
Die Verbindungen gemäß der Erfindung bilden sich, wenn der sich ausbreitende Organismus in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen; aeroben Bedingungen wächst. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Mengen (an den erfindungsgemäßen Verbindungen) Oberflächenkulturen und Flaschenkulturen zum Einsatz gelangen. Der Organismus wird in einem Nährmedium mit einer Kohlen-stoffquelle, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einer Stickstoffquelle, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen. Bevorzugte Kohlenstoff quellen sind Glukose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melassen und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststof'fen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, in Destillationsanlagen anfallende Feststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen dem Fermentationsmedium nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisation Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile zum Einsatz gelangen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann bei jeder Temperatur, die das Mikroorganismuswachstum fördert, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 40°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 28°C ablaufen gelassen werden. In der Regel dauert eine optimale Gewinnung der betreffenden Verbindungen etwa 3 bis 15 Tage. Das Fermentationsmedium bleibt während der Züchtung in der Regel sauer. Der End-pH-Wert hängt teilweise (sofern mitverwendet) von den vorhandenen Puffern und teilweise vom
S09816/0647
Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
Wenn die Züchtung in großen Gefäßen und Tanks vonstatten geht, bedient man sich zur Beimpfung vorzugsweise der vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus, um eine deutliche Verzögerung bei der Bildung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen und die damit einhergehende unzureichende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Folglich ist es zweckmäßig, (zunächst) in einer Nährbrühekultur, in" einer über flüssigem N2 aufbewahrten Agarscheibe oder in einer geneigten Kultur einen vegetativen Impfstoff herzustellen, indem man die betreffende Nährbrühe und dergleichen mit einem aliquoten Teil aus einem Erdevorrat beimpft. Wenn auf diese Weise ein junger, aktiver, vegetativer Impfstoff erhalten wurde, wird dieser auf aseptischem Wege in große Gefäße oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wird, kann aus demselben oder einem anderen Medium, als es bei der Herstellung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen verwendet wird, bestehen, solange der Mikroorganismus in dem betreffenden Medium nur gut wächst.
Zur Isolierung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen aus der Fermentationsbrühe und zur Reinigung der abgetrennten Verbindungen kann man sich der verschiedensten Maßnahmen, beispielsweise einer Holzkohleabsorption, einer Extraktion mit 1-Butanol und einer Adsorption an Cellulose oder Kationenaustauscherharzen bedienen.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Reindarstellung der erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen werden diese aus dem Kulturmedium nach Abtrennen des Mycels und ungelöster Feststoffe nach üblichen bekannten Verfahren, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren,
: abgetrennt. Die HoIz-
909816/0S47
kohle kann dann zur Entfernung der Antibiotika durch Hindurchleiten von 10 bis 50 % Aceton in Wasser (v/v) eluiert werden.
Die Eluate werden gesammelt und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt. Diese Lösung wird dann über ein schwaches Kationenaustauscherharz in Ammoniumform, beispielsweise IRC-50 der Firma Rohm & Haas, Philadelphia, Pennsylvania, laufengelassen. Das Harz kann mit einem anorganischen Salz, beispielsweise Ammoniumchlorid, vorzugsweise Ammoniumsulfat, Calciumperchlorat und dergleichen eluiert werden. Die gesammelten Fraktionen werden wie später noch beschrieben wird auf ihre antibakterielle Aktivität hin getestet. Die eine antibakterielle Aktivität zeigenden Fraktionen können zur Entfernung von Verunreinigungen mit 1-Butanol extrahiert werden. Die Antibiotika verbleiben in der wäßrigen Phase.
Die wäßrige Phase kann dann über eine Holzkohlesäule geleitet werden. Nach dem Eluieren der Holzkohlensäule mit 25 % Aceton in Wasser (v/v) werden bestimmte Fraktionen aufgefangen und zu einer wäßrigen Flüssigkeit eingeengt. Letztere wird dann lyophilisiert. In der nächsten Reinigungsstufe erfolgt dann eine Trennung des Antibiotikums 354 von Gougerotin.
Das Antibiotikum 354 und Gougerotin enthaltende lyophilisierte feste Material wird in einer Mindestmenge Wasser gelöst, worauf die Lösung in eine Cellulosesäule eingespritzt oder auf diese aufgetragen wird. Die Säule wird mit Methanol eluiert, wobei bestimmte Fraktionen aufgefangen werden. Die Fraktionen enthalten das Antibiotikum 354. Das Gougerotin wird aus der Cellulosesäule durch Eluieren der Säule mit Wasser entfernt.
909818/0847
Das Antibiotikum 354 erhält man aus den in der geschilderten Weise erhaltenen Methanol-Eluaten in praktisch reiner Form, indem man die gesammelten Eluate zu einem festen Verdampfungsrückstand einengt und danach das feste Material, das in einer Mindestmenge Wasser gelöst worden war, über ein starkes Kationenaustauscherharz, z.B. Dowex 50 der Firma Dow Chemical Co., Midland, Michigan, laufen läßt. Die Säule wird mit einer Lösung eines anorganischen Salzes, vorzugsweise von Ammoniumsulfat, eluiert. Die im wesentlichen reines Antibiotikum 354 enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen.
Im wesentlichen reines Gougerotin erhält man, indem man die aus der Säule gewonnenen und Gougerotin enthaltenden Fraktionen in ähnlicher Weise wie bei der Gewinnung des Antibiotikums 354 über ein starkes Kationenaustauscherharz laufen läßt.
Da das Antibiotikum 354 eine stark basische Verbindung darstellt, kann man sich zur Reinigung roher Zubereitungen von Antibiotikum 354 einer Adsorption an einem kationischen Austauscherharz und einer Eluation durch organische Basen oder Ammoniak bedienen. Fernerkann man rohe Zubereitungen von Antibiotikum 354 durch überführen desselben in Salzform (durch Behandeln mit anorganischen oder organischen Säuren) reinigen. Die Baseform des Antibiotikums läßt sich durch Neutralisation des Säureanions mit Ammoniak oder einer sonstigen anorganischen oder organischen Base rückgewinnen.
Bei der Herstellung von Salzen des Antibiotikums 354 mit Hilfe anorganischer oder organischer Säuren muß die jeweilige Säure der wäßrigen Lösung des Antibiotikums 354 sorgfältig einverleibt werden, da das Antibiotikum bei sauren pH-Werten instabil ist. Beispiele für verwendbare anorganische oder organische Säuren sind Chlorwasserstoff-,
909816/Q847
Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Bernstein-, Zitronen-, Milch-, Malein-, Fumar-, Pamoi-, Chol-, Palmitin-, Muco-, Kampfer-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, 3-Phenylsalicyl-, 5-Phenylsalicyl-, 3-Methylglutar-, Orthosulfobenzoe-, Cyclohexansulfan-, Cyclopentanpropion-, 1 ^-Cyclohexandicarbon-, 4-Cyclohexencarbon-, Octadecenylbernstein-, Octenylbernstein-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Helianth-, Reinecke's-, Dimethylthiocarbam-, Sorbin-, Monochloressig-, Undecylen-, 4'-Hydroxyazobenzol-4-sulfon-, Octadecylschwefel-, Picrin-, Benzoe- und Zimtsäure.
Andere Verfahren zur Herstellung bestimmter Salze sind: Die Sulfatsalze erhält man durch Eluieren mit einem Ammoniumsulfateluiermittel aus einem Kationenaustauscherharz. Die Acetatsalz'e erhält man unter Verwendung von Pyridinlumacetat zum Eluieren des Antibiotikums aus den Kationenaustauscherharzen. Die Chloridsalze des Antibiotikums 354 erhält man bei Verwendung von Ammoniumchlorid zum Eluieren des Antibiotikums aus einem Kationenaustauscherharz. Die Sulfatsalze lassen sich in das Chlorid überführen, indem man sie über ein Anionenaustauscherharz, beispielsweise Dowex 1 (Cl") und Dowex 2 (Cl") leitet. Wenn das Harz in OH~-Form verwendet wird, wird die freie Base Antibiotikum 354 isoliert.
Die Salze des Antibiotikums 354 eignen sich auf denselben biologischen Gebieten wie das Ausgangsantibiotikum.
Acylate von Antibiotikum 354 erhält man wie folgt: Eine bestimmte Menge Antibiotikum 354 wird in einem Überschuß eines Silylierungsmittels, z.B. TMS-Imidazol oder Bis-TMS-trifluoracetamid gelöst. Gegebenenfalls kann ein Katalysator, z.B. Trimethylchlorsilan und/oder eine Base, wie Pyridin, mitverwendet werden. Danach wird ein Acylie-
909816/0647
rungsmittel, z.B. Trifluoracetylimidazol oder Essigsäureanhydrid zugesetzt. Die Acylierung verläuft aufgrund einer Bewertung durch kombinierte Gaschromatographie/Massenspektroskopie rasch und quantitativ. Die dem silylierten Antibiotikum 354 (es können mono- und disilylierte Derivate vorhanden sein) entsprechenden Peaks verschwinden, wobei ein neuer Peak mit längerer Retentionszeit und einem Massenspektrum, das auf ein acyliertes und monosyliertes Antibiotikum 354 hindeutet, erscheint. Dieses Derivat kann mit Methanol oder Wasser selektiv hydrolysiert werden, wobei dann ein acyliertes Derivat des Antibiotikums 354 erhalten wird.
Geeignete Säurebindemittel sind Amine, wie Pyridin, Chinolin und Isochinolin sowie Puffersalze, wie Natriumacetat. Die bevorzugte Base ist Pyridin. Zur Acylierung geeignete Carbonsäuren sind beispielsweise a) gesättigte oder ungesättigte, gerad- oder verzweigtkettige aliphatische Carbonsäuren, wie Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, tert.-Butylessig-, Valerian-, Isovalerian-, Capron-, Capryl-, Decan-, Dodecan-, Laurin-, Tridecan-, Myristin-, Pentadecan-, Palmitin-, Margarine-, Stearin-, Acryl-, Croton-, Undecylen-, öl-, Hexyn-, Heptyn- oder Octynsäure, b) gesättigte oder ungesättigte alicyclische Carbonsäuren, beispielsweise, Cyclobutan-, Cyclopentan-, Cyclopenten-, Methylcyclopenten-, Cyclohexan-, Dimethylcyclohexan- und Dipropylcyclohexancarbonsäure, c) gesättigte oder ungesättigte alicyclische aliphatische Carbonsäuren, z.B. Cyclopentanessig-, Cyclopentanpropion-, Cyclohexanessig-, Cyclohexanbutter- oder Methylcyclohexanessigsäure, d) aromatische Carbonsäuren, z.B. Benzoe-, Toluol-, Naphthoe-, fithylbenzoe-, Isobutylbenzoe- und Methylbutylbenzoesäure und e) aromatische aliphatische Carbonsäuren, z.B. Phenylessig-, Phenylpropion-, Pheny!valerian-,
909816/0647
Zimt-, Phenylpropion- oder Naphthy!.essigsäure. Ferner eignen sich Halogen-, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano-, Thiocyano- und niedrigalkoxysubstituierte Kohlenwasserstoff carbonsäuren, z.B. Kohlenwasserstoffcarbonsäuren der angegebenen Art, die ein- oder mehrfach Halogen-, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyano- oder Thiocyano- oder Niedrigalkoxy-, zweckmäßigerweise durch Alkoxyreste mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen, z.B. Methoxy-, Äthoxy-, Propoxy-, Butoxy-, Amyloxy- oder Hexyloxyreste oder deren Isomeren substituiert sind. Beispiele für solche substituierte Kohlenwasserstoffcarbonsäuren sind: Mono-, Di- und Trichloressigsäure;
01- und ß-Chlorpropionsäure; 0t- und γ -Brombuttersäure; α- und 4-Jodvaleriansäure; Mevalonsäure;
2- und 4-Chlorcyclohexancarbonsäure; Shikimsäure;
2-Nitro-1-methylcyclobutancarbonsäure; 1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexancarbonsäure; 3-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure;
4- und 5-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure;
5- und 6-Brom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 2,3-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 2,5-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 4,5-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; 5,6-Dibrom-2-methylcyclohexancarbonsäure; S-Brom-S-methylcyclohexancarbonsäure; e-Brom-S-methylcyclohexancarbonsäure; 1,S-Dibrom-S-methylcyclohexancarbonsäure; 2-Brom-4-methylcyclohexancarbonsäure; 1,2-Dibrom-4-methylcyclohexancarbonsäure; 3-Brom-2,2,S-trimethylcyclopentancarbonsäure; 1-Brom-3,5-dimethylcyclohexancarbonsäure; Homogentisinsäure, o-, m-, und p-Chlorbenzoesäure;
909816/0647
Anisinsäure;
Salicylsäure;
p-Hydroxybenzoesäure;
ß-Resorcylsäure;
Gallussäure;
Veratrinsäure;
Trimethoxybenzoesäure;
Trimethoxyzimtsäure;
4,4"-Dichlorbenzilsäure;
o-, m- und p-Nitrob.enzoesäure;
Cyanoessigsäure;
3,4- und 3,5-Dinitrobenzoesäure;
2,4,6-Trinitrobenzoesäure;
Thiocyanoessigsäure;
Cyanopropionsäure;
Milchsäure;
Äthoxyameisensäure (Äthylhydrogencarbonat) und dergleichen.
Die genannten Acylate von Antibiotikum 354 eignen sich zur Reinheitssteigerung der Ausgangsverbindung durch Acylieren der Ausgangsverbindung, anschließendes Entfernen der Acylreste und Isolieren der Ausgangsverbindung in reinerer Form.
Bei der Trimethylsilylierung von Antibiotikum 354 erhält man ein flüchtiges Di-TMS-Derivat heben etwas Mono-TMS-Derivat), das sich für Dampfphasenchromatographie und Massenspektroskopie eignet. Dieses Derivat erhält man durch etwa 30 minütiges Erwärmen einer bestimmten Menge Antibioti kum 354 auf eine Temperatur von etwa 600C in Tetrahydrofuran mit einem Überschuß von Bistrimethylsilylacetamid.
Das Mono-TMS-Derivat erhält man unter Verwendung von entweder Trimethylsilylimidazol oder Bistrimethylsilyltrifluoracetamid. Das monosilylierte Antibiotikum 354 läßt
9G981S/0S47
sich unter Verwendung von Trifluoracetylimidazol, Trifluoressigsäureanhydrld oder Essigsäureanhydrid in situ acylieren. Die genannten Derivate eignen sich ebenfalls bei der Dampfphasenchromatographie/Massenspektroskopie und eröffnen einen praktischen Weg zum selektiven (0 gegen N)-Schutz bei Antibiotikum 354.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Soweit nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gew.-%". Die Angaben bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich soweit nicht anders angegeben auf "Volumina".
Beispiel 1 Ä. Fermentation
Eine biologisch reine Kultur von Streptomyces puniceus subsp. doliceus DSM 1342 dient zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Saatkolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Mediums mit folgenden Bestandteilen:
Glukose 10 g/l
Hefeextrakt 2,5 g/l
Pepton 10 g/l
mit entionisiertem
Wasser aufgefüllt auf 1 1
Der pH-Wert des Saatmediums vor der Sterilisation beträgt 6,5. Das Saatinokulum wird während 3 Tagen bei 280C auf einem mit 250 u.p.m. betriebenen handelsüblichen Drehrüttler wachsen gelassen. Das in der geschilderten Weise bereitete Saatinokulum dient zum Beimpfen einer Reihe von 500 ml fassenden Erlenmeyer-Fermentationskolben mit jeweils 100 ml eines sterilen Fermentationsmediums mit folgenden Bestandteilen:
'909816/0647
Brer Rabbit/Scurest * 20 ml/1
Hefeextrakt/Brauerei-Hefe ** 2 g/1
Dextrin *** 10 g/1
Cerelose *** 15 g/1
Proteose-Pepton Nr. 3 ** 10 g/1
Erdnußmehl · 5 g/1
mit Wasser aufgefüllt auf 1 1
* RJR Foods, Inc., New York, N.Y. ** Difco Laboratories, Detroit, Mi., *** CPC International, Inc., Englewood Cliffs, N.Y.
Der pH-Wert vor der Sterilisation beträgt 7,0. Die Fermentationskolben werden mit 5 ml Saatinokulum pro 100 ml Fermentationsmedium beimpft. Danach werden die Fermentationskolben zum Wachsen 3 Tage lang bei einerTemperatur von 25° bis 28°C auf einem mit 250 u-.p.m. betriebenen Drehrüttler gerüttelt.
Ein repräsentatives Rüttelflaschenfermentationsprodukt, das nach 3 Tagen geerntet wurde, zeigt folgendes Testmuster gegen Pseudomonas mildenbergii (ÜC 3029) :
Tag Testergebnisse (Bü/ml)
1 0
2 14
3 14
Bei dem Test handelt es sich um einen Agarscheibenplattentest unter Verwendung des Mikroorganismus P. mildenbergii. Das Agarmedium wird mit 0,1 m-Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 7,4 gepuffert. Ein Einheitsvolumen (0,08 ml) Lösung mit der zu testenden Substanz wird auf eine 12,7 mm Papierscheibe aufgebracht,'worauf die Papierscheibe auf eine mit dem Testorganismus "infizierte" Agarplatte gelegt wird. Danach wird die Agarplatte 16 - 18 h lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert. Eine Bioeinheit (BU) ist
909816/0647
als diejenige Konzentration des Antibiotikums, die unter den geschilderten Testbedingungen eine 20 mm Inhibierungszone liefert, definiert. Wenn also beispielsweise eine
Fermentationsbrühe oder eine sonstige Lösung mit dem
Antibiotikum auf 1/100 verdünnt werden muß, um eine 20 mm Inhibierungszone zu liefern, beträgt die Aktivität einer solchen Brühe oder Lösung 100 BU pro ml.
B Gewinnung
1. Kohlenstoffsorption
10 1 der in dem Schüttelkolben "gewachsenen" Brühe
werden 15 min lang mit 4 1 gewaschener körniger Holzkohle gerührt. Danach wird die Holzkohle 10 min lang
absetzen gelassen, worauf die Brühe dekantiert wird.
Nun wird die Holzkohle mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser klar bleibt. In der ersten Stufe wird ein kopfüberlaufender Paddelrührer, in der zweiten Stufe ein 10 1 Kübel verwendet. Die Holzkohle wird nun in einem Chromatographierohr mit entionisiertem Wasser aufgeschlämmt. Die aktiven Verbindungen werden unter Ausnutzung ihrer Schwerkraft mit der höchstmöglichen Strömungsgeschwindigkeit mit 25 % Aceton in Wasser eluiert. Es werden 11 Fraktionen aufgefangen, bis (aus der Säule) eine gelbe Flüssigkeit austritt. Wenn die gelbe Farbe nahezu nicht mehr nachweisbar ist, werden erneut kleine Fraktionen aufgefangen. Die gelben
Fraktionen (11 1) werden bei einer Temperatur von 35° bis 400C unter einem Druck von 1,3 mbar zu einer wäßrigen Flüssigkeit eingeengt und getestet. Die Versuchsergebnisse finden sich in der Tabelle VI. 80 % der
UC 3029-Bioeinheit werden aus der Säule wiedergewonnen.
909816/0647
-yr-
Tabelle VI
Probe
Volumen Verdünnung
Pseudo- Bacillus Cone.BU/mg monas subtilis mildenbergii UC 3029
Vollbrühe 10 1 FS * 28 mm 24 mm
1:2 23 21 -
1 :4 Spuren 20 -
1:8 NZ ** 19 -
gebrauchte
Brühe		 11 1 FS NZ 20 -
1. Eluat 3 1 FS NZ -
2. Eluat 9 1 FS 25 _
3. Eluat 2 1 FS NZ - . -
wäßriger
Pool		 8 1 FS
1 :2		 29
23		 23 16,9 mg/ml 0,18
19 (3 BU/ml)
1:4 16 Spuren
FS * = volle Stärke NZ ** = keine Zone
2. IRC-50-Sorption
Die Kohlenstoffeluate aus 4 Versuchen (etwa 48 1 Brühe insgesamt), die wie beschrieben erhalten wurden, werden zu 33 1 einer wäßrigen Flüssigkeit mit insgesamt 91.000 UC 3029-Bioeinheiten gepoolt. Die erhaltene wäßrige Flüssigkeit wird mit einer Geschwindigkeit von 5-61 pro h in einem Chromatographierohr über etwa 900 g IRC-50 (in NH. Form) laufen gelassen. Danach wird die Säule mit 4 1 entionisiertem Wasser gewaschen und mit 1 m . (NH.J2SO4-Lösung eluiert. Die Fraktionen werden nach dem Verdünnen auf 1:10 mit Wasser UV-spektralanalytisch analysiert. Auf der Basis der UV-Spektralanalysenergebnisse werden die ersten beiden Eluate gepoolt. Das dritte Eluat wird aufge-
90981S/0647
NZ 1,4 265 nm
NZ 0,24 265
20 mm 0,62 265
30 5,80 260
20 2,18 255
NZ 1,29 255
NZ 1,13 255
hoben. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle VII.
Tabelle VII
Probe Volumen Pseudo- Bacillus A^
monas subtills
mildenbergii
(ÜC 3029)
ausgebrau- 33,4 1 NZ
chte
Waschflüs- 3,5 1 NZ
sigkeit
1.Eluat 320ml 21 mm
2.Eluat 2000 ml 31
3.Eluat 2000ml 23
4.Eluat 1000 ml 18
5.Eluat 1000 ml NZ
3. Entsalzen
Das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Eluat Nr. 3 (2000 ml) wird über 200 ml körniger Holzkohle in ein Chromatographierohr geleitet. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Weder das ausgebrauchte Eluat noch die Waschflüssigkeit zeigen irgendeine UV-Absorption. Die aktiven Verbindungen werden mit 700 ml 25 %Aceton in Wasser eluiert. Das Eluat wird zu 500 ml einer wäßrigen Flüssigkeit eingeengt. Eine 1:10 Verdünnung dieser wäßrigen Flüssigkeit zeigt bei 255 nm eine starke Absorption. Durch Bioautographie auf Cellulose mit Methanol zeigt es sich, daß Gougerotin und Antibiotikum 354 vorhanden sind. .
4. ultrafiltration
Die entsalzte wäßrige Flüssigkeit aus Stufe 3 wird über ein Amicon UM 2-ültrafilter geleitet. Der Filterrückstand zeigt keine Aktivität und wird nach dem Waschen mit 1 Vo-
909816/0647
lumen verworfen. Das erste Filtrat und die Waschflüssigkeit werden gepoolt und lyophilisiert. Der Rückstand wiegt 4,5 g. Dieser zeigt ein UV-Maximum bei 252 nm mit einer Einbiegung bei 212 nm an einer starken Endabsorption.
5. Trennung von Gougerotin von Antibiotikum 354
68 g einer im wesentlichen in der geschilderten Weise (mit Ausnahme der Ultrafiltration) behandelten Zubereitung einer Testaktivität von 0,68 BU/mg gegen B. subtilis wird als Zubereitung 216-4 benannt. Durch Bloautographie zeigt sich, daß sie Gougerotin und Antibiotikum 354 enthält.
Eine Cellulose 300-Säule der Abmessungen 5,0 χ 150 cm wird mit jeweils 20 ml Methanol pro min bei einem Druck von 0,69 bar gespült. Das Bettvolumen beträgt 2,9 1.
30 g der Zubereitung 216-4 werden in 65 ml Wasser gelöst,· worauf die erhaltene Lösung auf die Säule injiziert wird. Beim Inberührunggelangen mit dem Methanol fällt etwas Feststoff aus. Dieser verstopft jedoch weder die Säule noch stört er in sonstiger Weise den Verfahrensablauf. Die Säule wird mit jeweils 20 ml Methanol pro min eluiert. Die Eluatfraktionen werden in Form von 1:10 Verdünnungen UV-spektralanalytisch getestet. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle VIII. Die Fraktionen 3 bis 8 werden gesammelt und zu 10,2 g eines lohfarbenen Feststoffs eingeengt. Eine Bioautographie zeigt, daß dies das Antibiotikum 354, jedoch kein Gougerotin enthält. Eine zweite Injektion unter Verwendung des Rests der Zubereitung liefert bei entsprechender Analyse 12,0 g einer entsprechenden Zubereitung.
909816/0647
Volumen
Nr.		 Tabelle VIII Pseudomonas
mildenbergii
(UC 3029)
Fraktion
Nr.		 1300 ml Farbe A255-265
1 1200 ml farblos 0,00 -
2 400 ml farblos 0,21 30 mm
3 400 ml farblos 2,13 40
4 425 ml hellgelb 9,30 39
5 500 ml hellgelb 12,8 36
6 500 ml hellgelb 12,4 27
7 500 ml Spuren gelb 8,4 23
8 500 ml farblos 1,12 20
9 500 ml farblos - 19
10 500 ml farblos - Spuren
11 farblos —
Nach der Fraktion Nr. 11 wird das Lösungsmittel auf Wasser umgeschaltet und die Eluierung mit 20 ml Wasser pro min fortgesetzt. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle IX. Die Fraktionen 2 und 3 werden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 17,9 g eines lohfarbenen Feststoffes erhält. Bei einer zweiten Injektion erhält man 22,1 g. Die Bioautographie zeigt, daß der Feststoff lediglich Gougerotin enthält.
Volumen Tabelle IX A269
Fraktion
Nr.		 1000 ml
1000 ml
900 ml
1400 ml		 Farbe 0,30
11,0
2,64
0,08
1
2
3
4		 farblos
gelb
hellgelb
farblos
909818/0647
Die 68 g-Probe (216-4) liefert in 32,6 %iger Ausbeute 22,2 g Antibiotikum 354 enthaltende Feststoffe und in 58,8 %iger Ausbeute 40 g Gougerotin enthaltende Feststoffe.
Das 22 g Antibiotikum 354 enthaltende, Material zeigt 0,35 BU/mg gegen B. subtilis und 0,83 BU/mg gegen UC 3029.
Die 22 g Gougerotinmaterial aus dem zweiten Versuch zeigen 0,5 BU/mg gegen B. subtilis und 1,5 BU/mg gegen UC 3029.
Beide Zubereitungen sind stark verunreinigt.
6. Reines Gougerotin
Ein Pool aus zwei Celluloseversuchen entsprechend den beschriebenen Celluloseversuchen (einschließlich einer Ultrafiltration) wiegt 5,8 g. Der Pool wird in 15 ml Wasser gelöst und auf eine 2,5 χ 100 cm große mit 200 bis 400 Mesh Amberlite CG-120 (in NH4 +-FOrIn) gefüllte Säule injiziert. Diese wird mit einer Geschwindigkeit von 12 ml pro min mit Wasser bis zu einem 1 m (NH4)2SO4-Gradienten eluiert.
25 ml Fraktion werden aufgefangen. Jede fünfte Fraktion wird gegen UC 3029 getestet (100 λ/12,7 mm Scheibe). Bis zum Rohr 250 ist keine Aktivität festzustellen. Der UV-Test wird mit 1:10 Verdünnungen jeden 10. Rohrs durchgeführt. Hierbei erscheint bis zum Rohr 250 keine 265 nm-Bande. Die UV-Ergebnisse für die folgenden Rohre finden sich in der folgenden Tabelle X. Die B.subtilis-Zonen für die Rohre 260 - 370 sind sehr klein. Die Rohre 280 bis 340 werden zu 1,4 1 Lösung gesammelt. Diese wird über 200 ml
Holzkohle in einem Chromatographierohr entsalzt. Die HoIz-
mit kohle wird mit Wasser gewaschen und 25 % Aceton-in Wasser
909816/0647
2335295
eluiert. Die Fraktionen werden aufgrund ihrer UV-Absorption bei 268 nm überwacht. Das wäßrige Eluat wird lyophilisiert, wobei 1,0g praktisch reines Gougerotin in Form eines weißen Feststoffs erhalten wird.
Tabelle X
Fraktion A0 CQ Nr. 268
Fraktion
Nr.		 A268
260 0,26
270 0,27
280 0,45
290 1,30
300 2,46
320 1,87 330 -
340 0,68
350 0,32
360 0,20
310 2,55 370 0,15
7. Reines Antibiotikum 354 als Sulfat
Aus verschiedenen in der geschilderten Weise in der Cellulosesäule behandelten Fraktionen wird ein Pool des Gewichts von 3,78 g hergestellt. Dieser wird in 10 ml Wasser gelöst, worauf die Lösung auf eine auch für Gougerotin verwendete CG-120-Säule (in NH4 +-Form) injiziert wird. Das Eluieren erfolgt mit demselben Gradienten und derselben Geschwindigkeit. Ein aliquoter Teil jeden 10. Rohrs wird mit Wasser 1 : 10 verdünnt und durch UV-Analyse und biologische Analyse geprüft. Bis zu Rohr 220 erfolgt keine Eluierung. Die Ergebnisse für die folgenden Rohre finden sich in der folgenden Tabelle XI. Die Fraktionen 248 werden gesammelt, wobei 2,5 1 Lösung mit A252 = 1,27 erhalten werden. Die Lösung wird in der für Gougerotin beschriebenen Weise entsalzt, wobei ein Holzkohlebett in einer Größe von 3,5 χ 28 cm (270 ml) verwendet wird. Die Überwachung erfolgt bei geeigneten Wellenlängen. Das entsalzte Eluat wird lyophilisiert, wobei 2,36 g praktisch
909816/0647
-U-
2333295
reinen Antibiotikums 354 in Form eines lohfarbenen Feststoffs erhalten werden. Es liefert 8 BU/mg gegen UC 3029.
Fraktion
255
230 0,23
240 1,10
250 1 ,60
260 1,87
270 2,75
280 2,05
290 1,49
300 1,03
310 0,69
320 0,46
330 0,31
340 0,20
350 0,15
Beispiel 2
Tabelle XI Pseudomonas
mildenbergii
(UC 3029)
A212 -
1 ,08 -
5,39 -
8,20 35 mm
8,60 40
10,1 39
9,00 37
6,95 33
4,60 26
2,41 NZ
1,88 NZ
1 ,25 NZ
0,82 NZ
0,51
Acylierung von Antibiotikum 354
Eine Probe Antibiotikum 354 wird zusammen mit Pyridin und Essigsäureanhydrid in Tetrahydrofuran gerührt, worauf das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen Ä'thylacetat und 0,01 η NCl verteilt wird. Die wäßrige Flüssigkeit wird lyophillsiert. Nach dem Wiederauflösen der Feststoffe in Wasser bilden sich Kristalle, die abgetrennt werden. Durch Massenspektroskopie ergibt sich, daß diese Kristalle aus dem mono-N-acetyldehydrochlorinierten Derivat von Antibiotikum 354 bestehen.
909816/0647
Beispiel 3
Zubereitung von Antibiotikum 354-HCl aus Antibiotikum 354-H2SO4
14 mg Antibiotikum 354-H2SO4 werden in 0,3 ml Wasser ge- · löst und in Form der Lösung über eine 0,4 χ 8 cm mit 100 bis 200 Mesh Dowex 2x8 (Cl~) gefüllte Säule laufen gelassen. Eluiert wird mit destilliertem Wasser. Jede 3,0 ml Fraktion wird nach der Fleckenbildung auf einer aus Cellulose bestehenden dünnschichtchromatographischen Platte mit Ninhydrinspray durch UV-Absorption (Banden bei 251 und 211 im 1:4-Verhältnis) getestet. Ein geeigneter Pool wird lyophilisiert. Der feste Rückstand besteht aufgrund massenspektroskopischer Untersuchungen offensichtlich aus dem Hydrochlorid.
Beispiel 4
Herstellung von Antibiotikum 354«HOAc aus einem Gemisch aus Gougerotin und Antibiotikum 354
4 1 eines wäßrigen Kohlenstoffeluats mit Gougerotin und Antibiotikum 354 werden über eine mit 200 g Dowex 5OW χ 8 (H -Form) laufen gelassen. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit 2,0 m-Pyridiniumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 5 eluiert. Die Fraktionen 13-17 (jeweils 45 ml) werden auf der Basis ihrer Bioaktivität (12,7 mm Scheiben, Agarschale) gegen UC 3029 gepoolt und lyophilisiert. Die Feststoffe liefern bioautographische Muster, die anzeigen, daß die Hauptaktivität von Antibiotikum 354, das in der Acetatform vorliegen muß, herrührt. Das erhaltene Acetatgemisch wird durch Cellulosechromatographie in der geschilderten Weise Gougerotinacetat und Antibiotikum-354-Acetat getrennt.
S09816/0847
Leerseite

Claims (15)

Patentansprüche
1. Antibiotikum 354, das gegen Pseudomonas und Proteus aktiv ist und als Sulfatsalz in im wesentlichen reiner Form folgende Eigenschaften aufweist:
a) ein Molekulargewicht von 172 (bestimmt durch FeIddesorptionsmassenspektroskopie);
b) die Elementaranalysenwerte:
C = 37,08 %;
H = 4,79 %; N = 12,38 %,-Cl = 15,52 %; S = 7,48 % und - O =22,75 %;
c) Löslichkeit in Wasser und relative Unlöslichkeit
in Methanol, Aceton, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid ;
d) ein charakteristischem Infrarotabsorptionsspektrum (in Form einer Aufschwemmung in einem Mineralöl) gemäß Figur 1;
e) ein charakteristisches UV-Absorptionsspektrum gemäß Figur 2 und
f) ein charakteristisches Kernresonanzspektrum gemäß Figur 3.
909816/064
2. Säureadditionssalz des Antibiotikums 354.
3. Antibiotikum 354 in Form seines Sulfatsalzes gemäß Anspruch 2.
4. Antibiotikum 354 in Form seines Hydrochloridsalzes gemäß Anspruch 2.
5. Antibiotikum 354 in Form seines Acetatsalzes gemäß Anspruch 2.
6. Acylate von Antibiotikum 354.
7. Mono-N-acetyidehydrochloriertes Derivat von Antibiotikum 354 gemäß Anspruch 6.
8. Trimethylsilylderivat von Antibiotikum 354.
9. Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum 354, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces puniceus subsp. doliceus DSM 1342 solange in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, bis das betreffende Medium eine merkliche Antibiotikum-354-Aktivität erhalten hat.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem wäßrigen Nährmedium mit einer assimilierbaren Kohlenhydrat- und assimilierbaren Stickstoffquelle vornimmt.
11. Verfahren zur Herstellung von antibiotisch wirksamem Gougerotin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces puniceus subsp. doliceus DSM 134 2 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen solange züchtet bis das betreffende Medium eine merkliche antibiotische Gougerotin-Aktivität erhalten hat.
909816/0647
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem wäßrigen Nährmedium mit einer assimilierbaren Kohlenhydrat- und assimilierbaren Stickstoffquelle vornimmt.
13. Verfahren zur Gewinnung von Gougerotin aus einer Antibiotikum 354 und Gougerotin enthaltenden Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) zur Gewinnung von Kohlenstoffeluaten mit Antibiotikum 354 und Gougerotin eine Kohlenstoffsorption der Fermentationsbrühe und eine Eluation aus der Kohlenstoffeluation mit 25 % Aceton in Wasser
• (v/v) vornimmt;
b) zur Gewinnung von Harzeluaten mit Antibiotikum 354 und Gougerotin eine Kationenaustauschabsorption der Kohlenstoffeluate und eine Eluation mit einer Ammoniumsulfatlösung durchführt;
c) zur Gewinnung einer entsalzten wäßrigen Flüssigkeit mit Antibiotikum 354 und Gougerotin die Harzeluate mit körniger Holzkohle entsalzt und die körnige Holzkohle mit 25 % Aceton in Wasser (v/v) eluiert;
d) zur Gewinnung von Pools mit Antibiotikum 354 und Gougerotin die entsalzte wäßrige Flüssigkeit einer Ultrafiltration unterwirft;
e) zur Trennung von Antibiotikum 354 von Gougerotin und zur Gewinnung von Fraktionen mit den betreffenden Verbindungen die Pools einer Absorption an einer Cellulosesäule unterwirft und die Säule mit Methanol eluiert und
f) zur Gewinnung von praktisch reinem Gougerotin die eine Aktivität gegen Bacillus subtilis zeigenden Fraktionen über ein starkes Kationenaustauscherharz laufen läßt und das Harz mit Ammoniumsulfat eluiert.
14. Verfahren zur Gewinnung von Antibiotikum 354 aus einer
16/064
2635295
Antibiotikum 354 und Gougerotin enthaltenden Fermentationsbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) zur Gewinnung von Kohlenstoffeluaten mit Antibiotikum 354 und Gougerotin eine Kohlenstoffsorption der Fermentationsbrühe und eine Eluation aus der Kohlenstoffeluation mit 25 % Aceton in Wasser (v/v) vornimmt;
b) zur Gewinnung von Harzeluaten mit Antibiotikum 354 und Gougerotin eine Kationenaustauschabsorption der Kohlenstoffeluate und eine Eluation mit einer Ammoniumsulfatlösung durchführt;
c) zur Gewinnung einer entsalzten wäßrigen Flüssigkeit mit Antibiotikum 354 und Gougerotin die Harzeluate mit körniger Holzkohle entsalzt und die körnige Holzkohle mit 25 % Aceton in Wasser (v/v) eluiert;
d) zur Gewinnung von Pools mit Antibiotikum 354 und Gougerotin die entsalzte wäßrige Flüssigkeit einer Ultrafiltration unterwirft;
e) zur Trennung von Antibiotikum 354 von Gougerotin und zur Gewinnung von Fraktionen mit den betreffenden Verbindungen die Pools einer Absorption an einer Cellulosesäule unterwirft und die Säule mit Methanol eluiert und
f) zur Gewinnung von praktisch reinem Antibiotikum die eine Aktivität gegen Pseudomonas mildenbergil zeigenden Fraktionen über ein starkes Kationenaustauscherharz laufen läßt und das Harz mit Ammoniumsulfat eluiert.
15. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Streptomyces puniceus subsp. doliceus DSM 1342 , die bei der Züchtung in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Substanzen enthaltenden wäßrigen Nährmedium eine reindarstellbare bzw. gewinnbare Menge des Antibiotikums gemäß Anspruch 1 liefert.
909816/0647
DE19782835295 1977-09-19 1978-08-11 Biologisch reine kultur des mikroorganismus streptomyces puniceus subsp. doliceus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum 354 und verfahren zur herstellung des antibiotikums 354 sowie von gougerotin Withdrawn DE2835295A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/834,286 US4136171A (en) 1977-09-19 1977-09-19 Antibiotic 354 and process for producing same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2835295A1 true DE2835295A1 (de) 1979-04-19

Family

ID=25266579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19782835295 Withdrawn DE2835295A1 (de) 1977-09-19 1978-08-11 Biologisch reine kultur des mikroorganismus streptomyces puniceus subsp. doliceus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum 354 und verfahren zur herstellung des antibiotikums 354 sowie von gougerotin

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4136171A (de)
JP (2) JPS5852636B2 (de)
BE (1) BE870597A (de)
CA (1) CA1103180A (de)
DE (1) DE2835295A1 (de)
FR (1) FR2403348A1 (de)
GB (1) GB2004271B (de)
IT (1) IT7827799A0 (de)
NL (1) NL7809302A (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63195369A (ja) * 1987-02-10 1988-08-12 Agency Of Ind Science & Technol シリンダ内直接噴射型水素エンジンにおける水素供給及び給気方法
US6933288B2 (en) * 2002-02-04 2005-08-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyranosyl cytosines: pharmaceutical formulations and methods

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB687500A (en) * 1949-08-25 1953-02-18 Pfizer & Co C An antibiotic and the preparation thereof
US3988441A (en) * 1975-10-02 1976-10-26 The Upjohn Company Antibiotic U-43,120 and process for preparing same

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5852636B2 (ja) 1983-11-24
NL7809302A (nl) 1979-03-21
IT7827799A0 (it) 1978-09-18
FR2403348A1 (fr) 1979-04-13
US4136171A (en) 1979-01-23
JPS5931687A (ja) 1984-02-20
JPS5452004A (en) 1979-04-24
GB2004271A (en) 1979-03-28
BE870597A (fr) 1979-03-19
CA1103180A (en) 1981-06-16
GB2004271B (en) 1982-05-26
FR2403348B1 (de) 1982-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2841361A1 (de) Antibiotikum cc-1065, verfahren zu seiner herstellung und gewinnung und dabei verwendeter mikroorganismus
DE2532568A1 (de) Aclacinomycine a und b und verfahren zu ihrer herstellung
EP0366060A1 (de) Glykosidase-Inhibitor Salbostatin, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
DE2521197C2 (de) 1-(2-Deoxy-&amp;beta;-D-erythro-pentofuranosyl)-5,6-dihydro-5-methyl-s-triazin-2,4(1H,3H)-dion und Derivate
DE3036361A1 (de) Antibiotikum u-59 761, verfahren zu seiner gewinnung und isolierung sowie dabei verwendete biologisch reine kultur des mikroorganismus saccharopolyspora hirsuta, stamm 367 (nrrl 12045,dsm 1886)
CH435560A (de) Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotica
DE1957980C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines Streptomyces
DE2537902A1 (de) Neue rifamycine
CH625830A5 (de)
DE2167325C2 (de) Antibiotikum A-201B und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2418460A1 (de) Verfahren zur herstellung von lincomycin
DE2835295A1 (de) Biologisch reine kultur des mikroorganismus streptomyces puniceus subsp. doliceus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum 354 und verfahren zur herstellung des antibiotikums 354 sowie von gougerotin
DE2737943C2 (de) Antibiotisch wirksames Oligosaccharid, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dieses enthaltende Arzneimittel
DE2652677C2 (de) Antibiotica 890A&amp;darr;1&amp;darr; und 890A&amp;darr;3&amp;darr;, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Antibiotika enthaltende antibakterielle Mittel
CH646712A5 (de) Istamycine und deren herstellung.
DE2660964C2 (de)
DE3102136A1 (de) Neue verbindung bay i 3265 komponente a, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2823207A1 (de) Von einer neuen subspezies von streptosporangium gebildetes neues polypeptidantibiotikum
DE2806220A1 (de) Biologisch reine kultur des neuen mikroorganismus streptomyces espinosus subsp. acanthus, unter seiner verwendung hergestelltes antibiotikum acanthomycin und verfahren zur herstellung des acanthomycins
DE2026595A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Antibiotika
DE2339136A1 (de) Steffimycin b, ein neues antibiotikum
DE2601398A1 (de) Neues antibiotikum
AT266316B (de) Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
DE1792818C2 (de) Tenebrimycin-Antibiotikum IV und ein Verfahren zu dessen Herstellung
AT216143B (de) Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums

Legal Events

Date Code Title Description
8128 New person/name/address of the agent

Representative=s name: HENKEL, G., DR.PHIL. FEILER, L., DR.RER.NAT. HAENZ

8139 Disposal/non-payment of the annual fee