JPS5852636B2 - 抗生物質３５４ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 抗生物質３５３をつくるためのここに明らかにされた発
酵は、既知抗生物質グゲロチンもつくる。

この既知抗生物質は刊行物１人０８９４巻３２７２頁（
１９７２年）に記載されている。

グゲロチンはアスピクラマイシンとしても知られており
、合衆国特許第３８４９３９８号で明らかにされ特許請
求されている。

抗生物質３５４は新規微生物ストレプトミセス・プニセ
ウス亜種ドリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｕ
ｎｉｃｅｕｓ ５ｕｂｓｐ、 ｄｏｌｉｃｅｕｓ ）、
ＮＲＲＬ１１１６０の微生物学的に純粋な培養基を使用
する制御された条件下の発酵において製造できる。

抗生物質３５４と同時につくられるのは既知抗生物質グ
ゲロチンである。

抗生物質３５４は、二つの抗生物質を含有する調製剤を
セルロースカラム上の吸収にかけ、続いてメタノールと
次に水で溶離することにより、回収手順中にグゲロチン
から容易に分離される。

抗生物質３５４はメタノールで溶離し、グゲロチンは水
で溶離する。

抗生物質３５４はグラム陰性菌に対して活性があり、特
にプソイドモナス及びプロテウス菌種に対しては非常に
活性がある。

例えば抗生物質３５４はゲンタマイシン、カナマイシン
、及びナリジキシン酸に対して抗抵するプソイドモナス
・アエルギノサＧＮ−３１５（ＵＣ６１４９）に対して
活性がある。

このため抗生物質３５４はゲンタマイシン、カナマイシ
ン又はナリジキシン酸に対して抵抗する局所的なプソイ
ドモナス感染の処置に使用できる。

またこれは油の防腐剤として、例えば切削油の腐敗を起
すことが知られているプロテウス・ブルガリスの生育を
阻止する静菌剤としても使用できる。

またこれは手の洗浄、汚染された室又は研究室の設備、
床又は家具の洗浄のように衛生用の洗浄溶液に有用であ
る。

また、産業用防腐剤として、例えば洗濯した衣服の静菌
用リンス剤として、及び紙と織物の含浸用に有用である
。

プレート検定及びその他の微生物学用培地で感受性菌の
生育を抑えるのにも有用である。

動物の生長を促進するための食品補助用としても使用で
きる。

抗生物質３５４の化学・物理性状 分子量：１７２（磁場脱離質量分析） 元素分析＝（Ｃ７Ｈ９ＣＩＮ２０）２・Ｈ２Ｓ０４（分
子量４７４） 測定値：Ｃ，３７，０８；Ｈ，４，７９；Ｎ、１２．３
８；０１ 、１５．５２ ； Ｓ 、 ７．４８ ；０
，２２．７５紫外線吸収スペクトルニ 抗生物質３５４の紫外線吸収最大値は、図面の第２図に
再録されているとおり、０．０ＩＮＨＣ１中で λ、ａ、（ｅ）： ２１３ｎｍ、３８．５４．（６，６
５０）及び２５１ｎｍ、 ９．０２．（１，５５０）
赤外線吸収スペクトル： 硫酸塩としての抗生物質３５４は、図面の第１図に示さ
れるように、鉱油フル中で特徴的な赤外線吸収スペクト
ルをもっている。

ピークはセン千メートルの逆数で表わされた次の波長で
観察される。

かぎ：Ｓ−強、Ｍ−中、Ｗ−弱、ｓｈ−ショルダー溶解
度： 抗生物質３５４は水に可溶であり、メタノール、ジメチ
ルスルホキシド及びジメチルホルムアミドに難溶である
。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル： 抗生物質３５４（硫酸塩として）の６０メガサイクルで
の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図面の第３図に示されてい
る。

ＮＭＲスペクトルはパリアンＸＬ−１００スペクトロメ
ーター上で酸化デユーチリウム（Ｄ２０ ）中の抗生物
質３５４試料の溶液（約０．５ｍｌ、約１５％濃度）で
観察されている。

スペクトルは外部テトラメチルシランに対して較正され
、△νの精度は〉±１ ｃ、 ｐ、 ｓ、であった。

周波数はテトラメチルンランからタウンフィールドにｃ
、 ｐ、 ｓ、で記録された。

抗生物質３５４の抗菌スペクトル： 抗生物質３５４は、１■／ｙｄの濃度で標準ディスクプ
レート検定（１２，７ｍｍ検定ディスク）によりミＩＪ
メートル（皿）で次の阻止帯を示す。

プソイドモナス・ミルデンベルギイ ３０ｍｍ栄養培
養液を使用するマイクロプレート培養液希釈検定によっ
て抗生物質３５４を試験したところ、次のスペクトラム
が観察された。

ｒｌＪＯ■」はアップジョン・カンパニー培養基保存株
の登録商標である。

これらの培養基は請求次第、ミシガン州カラマズーのア
ップジョン社から得ることができる。

抗生物質３５４はミシガン州カラマズーのプロンソン病
院から得られたプソイドモナス・アエルギノサ菌株に対
して活性があることが示された。

これらの菌株は既知抗生物質カナマイシン、ゲンタマイ
シン、ナリジキシン酸及びポリミキシンＢに対し比較的
抵抗性がある。

６．３５ｍｍペーパーディスクを一枚当り抗生物質０．
０３ｍ１（１■／ｙｄ）と共に使用して標準寒天ディス
クプレ→検定により比較試験を行に次。

その結果は次のとおりである。微生物 抗生物質３５４及びグゲロチンの製造に用いられる微生
物はストレプトミセス・プニセウス亜種ドリセウス、Ｎ
ＲＲＬ１１１６０である。

この微生物の二次培養基は合衆国イリノイ州ビオリア、
合衆国農務省北部研究所の永久保存株から入手できる。

この保存機関のこの菌株の呼出し番号はＮＲＲＬ１１１
６０である。

二次培養基を入手できるからといって、政府命令により
証書と共に許可された特許権を侵害してまで本発明を実
施する権利を構成するものではないことを理解すべきで
ある。

又、日本国においても上記微生物の二次培養基は昭和５
３年１０月３０日付けで工業技術研究所に、受託番号、
微工研菌寄第４７０４号ももって保管委託された。

本発明の微生物はアップジョン研究所のアルマ・ダイエ
ツツ（Ａｌｍａ Ｄｉｅｔｚ ）及びブレース・ビー・
リー（Ｇｒａｃｅ Ｐ、 Ｌｉ ）により研究され、特
性化された。

アップジョン土壌スクリーンから単離されたある放線菌
が、ストレプトミセス・グリセウス変種プルプレウス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ５ｒｉｓｅｕｓ ｖａｒ。

ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ）、ニス・カリホルニクス（Ｓ、
０ａｌｉｆ。

ｒｎｉｃｕｓ ）、及びニス・ビナセウス（Ｓ、 ｖｉ
ｎａｃｅｕｓ ）の培養基に培養基特性上類似している
ことがわかった。

１９５５年にパークホルダー等（Ｂｕｒｋ−ｈｏｌｄｅ
ｒ、 Ｐ、 Ｒ，、ニス−エッチ・スン（Ｓ、Ｈ，Ｓｕ
ｎ入エル・イー・アンダーソン（Ｌ、 Ｂ、 Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ）及びジエー・ニアリッチ（Ｊ 、 Ｅｈｒｌ
ｉｃｈ ）、１９５５年、「ストレプトミセスのビオマ
イシン産生培養基の確認」、Ｂｕｌｌ 、 Ｔｏｒｒｅ
ｙ ｂｏｔ、 ０１ 、８２巻１０８〜１１７頁〕は、
ニス・グリセウス変種プルプレウスと命名されたニス・
グリセウスの新変種とビオマイシン産生培養基が同義と
されるべきであると提案した。

ビオマイシン産生菌は多くの培地上で明白な赤紫色裏面
及び色素によってニス・グリセウスから区別される〔ブ
キャナン・アール・イ（Ｂｕｃｈａｎａｎ、 Ｒ，Ｅ−
）及びエフ・イー・ギボンス（Ｎ、 Ｅ、 Ｇｉｂｂｏ
ｎｓ ）、１９７４年、バーギーの細菌分類書第８版。

ウィリアムス・アンド・ウイルキンス社、バルチモア〕
〔前掲、パークホルダー・ビー・アール〕〔シャーリン
グ・イー・ビー（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、 ＩＢ−Ｂ−）及
びディー・ゴツトリーブ（Ｄ、Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ）、
１９６８年、ストレプトミセス型培養基の協力記載。

■、最初の研究からの種記載。

Ｉｎｔ、Ｊ、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １
８巻６９〜１８９頁〕〔シャーリング・イー・ビー及び
ディー・コツトリーブ、１９６９年。

ストレプトミセス型培養基の協力記載。

■、第二、第三、及び第四研究からの種記載。

Ｉｎｔ、Ｊ、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １
９巻３９１〜５１２頁〕。

これらの培養基は温度、炭素利用能及び全般的生育必要
条件、又は胞子連鎖又は胞子表面の模様の点ではニス・
グリセウスと異なるところはない〔シャーリング・イー
・ビー及びディー・ゴツトリーブ、１９６８年。

ストレプトミセス型培養基の協力記載。

■、第−及び第二研究からの追加の種記載。

Ｉｎｔ、 Ｊ、５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌ、
１８巻２８０〜３９９頁〕。

１９６６年にブキャナン等（Ｂｕｃｈａｎａｎ、 Ｒ，
Ｅ。

ジエー・ジー・ホルト（Ｊ、 Ｇ、 Ｈｏ１ｔ ） 、
及びイー・エフ・レツセル・ジュニア（Ｅ、 Ｆ、 Ｌ
ｅｓｓｅｌ 、 Ｊｒ、）、１９６６年。

Ｉｎｄｅｘ Ｂｅｒｇｅｙａｎａ、ウィリアム・アンド
・ウイルキンス社、バルチモア〕は、パークホルダー等
のニス・グリセウス変種プルプレウスを規則違反の名前
だと宣言した。

ワクス（Ｗａｋｓ、）及びヘンリーライ（Ｈｅｎｒｉｃ
ｉ ）のニス・ビナセウス（メイヤー（Ｍａｙｅｒ ）
等）も規則違反だと宣言すした。

ニス・カリホルニクス、ニス・フロリタ工及びニス・プ
ニセウスは正しい名前と考えられた。

バーギーの分類書第８版〔ブキャナン・アール・イー及
びエフ・イー・ギボンス、前掲〕では、最後の三つの名
前の培養基が型培養基として引用されている。

シャーリング及びゴツトリーブ（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ及び
Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、前掲、１８巻６９〜１８９頁及び１
９巻３９１〜５１２頁〕では、Ｓ、カリホルニクヌ、Ｓ
、プニセウス及びＳ、ビナセウスが型培養基として引用
されている。

前掲パークホルダー前掲シャーリング及びボラトリ・−
１１８巻６９〜１８９頁、及びバーギーの分類書第８版
〔ブキャナン・アール・イー及びエフ・□イー・ギボン
ズ前掲〕で引用されたニス・プニセウスに対する培養基
特性は、新規土壌単離菌と比べた培養基に対して認めら
れた特性と一致している。

これらの培養基のうち、ニス・プニセウス・パテルスキ
（１９５０年）は最も早く記載されたものである〔パー
クホルダー、ピー・アール、前掲〕。

新単離菌は、生育の色及び抗生物質産生の点では上に引
用された培養基とは若干の差を示している。

こうした差に基づいて、この新培養基に対してストレプ
トミセス・プニセウス亜種ドリセウス亜種ノブ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｕｎｉｃｅｕｓ ５ｕｂｓｐ、
ｄｏｌｉｃｅｕｓＳｕｂｓｐ、 ｎｏｖ、 ）の指定
をわれわれは提案する。

使用の方法はグイエツッ（Ｄｉｅｔｚ、Ａ、 １９５４
年。

放線菌分類の補助手段としてのエフタフローム透過度。

Ａｎｎ、 Ｎ、 Ｙ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ 、 ６０
巻１５２〜１５４頁〕〔グイエッソ・エイ、１９６７年
。

ストレプトミセス・ステフイスバーゲンシス・スペシー
ズ・エフ、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ９４巻２０２
２〜２０２６頁〕、ダイエツツ及びマシューズ（Ｄｉｅ
ｔｚ、 Ａ、及びＪ。

Ｍａｔｈｅｗｓ、 １９７１年。

ストレプトミセス胞子表面を５群へ分類。

Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２１巻５２７〜５
３３頁〕、及びシャーリングとゴツトリーブ（Ｓｈｉｒ
ｌｉｎｇ、 Ｅ、 Ｂ、及びり、 Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、
１９６６年。

ストレプトミセス種の特性方法。

Ｉｎｔ−Ｊ、５ｙｓｔ。Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １６巻
３１３〜３４０頁〕によって９用されたものである。

Ｓ、プニセウス亜種ドリセウスを、エフタフローム上で
それが最もよく似ている（第１表）と思われる次のビオ
マイシン産生培養基と比較した。

すなわちＳ、グリセウス変種プルプレウスＮＲＲＬ２４
２３（ＵＣ２４６８）、Ｓ、グリセウス変種プルプレウ
ス０ＢＳ（ＵＣ２４６８）、ｓ、ヒナセウスＮＲＲＬ２
２８５（ＵＣ２９２０）及びｓ、カリホルニクスＡＴＯ
０３３１２（ＵＣ５２７０）。

分類法 ストレプトミセス・プニセウス・フインレー・アンド・
ソビン亜種ドリセウス・ダイエツッ・アンド・り一亜種
ノブ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｕｎｉｃｅｕｓＦ
ｉｎｌａｙ ＆ ５ｏｂｉｎ ５ｕｂｓｐ、 ｄｏｌｉ
ｃｅｕｓ Ｄｉｅｔｚ ａｎｄ Ｌｉ５ｕｂｓｐ、 ｎ
ｏｖ、 ）。

色特性 気中生育はクリーム色ないしクリーム桃色ないしラベン
ダー桃色。

メラニン陰性。エフタフローム上の外観を第１表に示す
。

基準色特性を第２表に示す。

新培養基とＳ、カリホルニクスＵＤ ５２７０をトレス
ナーとバッカス（Ｔｒｅｓｎｅｒ、 Ｈ，Ｄ、及びＥ、
Ｊ、 Ｂａｃｋｕｓ、 １９６３年。

放線菌綱分類用のカラーホイール系統。

Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、 １１巻３３５〜
３３８頁〕の灰色及び紫色群の中に置き、ｓ。

グリセウス変種プルプレウスＵＯ２４１４を赤及び紫の
色群に、及びＳ、グリセウス変種プルプレウスＵＣ２４
６８及びＳ、ビナセウスＵＣ！ ２９２０を灰色群中に
置いた。

顕微鏡特性 プリダム（Ｐｒｉｄｈａｍ、 Ｔ、 Ｇ、、シー・ダブ
リュー・ヘシルタイン（Ｃ，Ｗ、 Ｈｅ５ｓｅｌｔｉｎ
ｅ ）及びアール・ジー・ベネディクト（Ｒ，Ｇ、 Ｂ
ｅｎｅｄｉｃｔ）。

１９５８年。

選ばれた群による放線菌綱の分類指針。

形態的区分への菌株の分類。Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒ。ｂ
ｉｏｌ、 ６巻５２〜７９頁〕の意味では胞子連鎖は長
く波状（ＲＦ）。

胞子連鎖はふさ状でもありうる。胞子は走査式電子顕微
鏡で調べると直方体で押しつけられた形をし、押されて
うね状になった滑らかな表面をもつ。

炭素利用 第３，４表を参照のこと。

培養基及び生化学特性 第５表を参照のこと。

温度 全培養基は、４８時間に１８°Ｃで生育は劣り、２４°
Ｃで良好、２８〜３７°Ｃでは非常に良好であった。

４°Ｃ９４５℃又は５５℃では生育なしであった。

１４日後に腐卵器からプレートを除去した。生育を示さ
ないプレートを次に２４℃で培養した。

４℃からの全プレートは２４°で２４時間のうちに生育
を示した。

４５°Ｃ及び５５℃からのプレートは、新培養基を入れ
たプレートを除いて生育を示さなかった。

この培養基はすでに４５°Ｃで培養されたプレートから
生育を始めた。

抗生物質産生性 参照培養基は抗生物質ビオマイシン〔パークホルダー・
ピー・アール、前掲〕をつくる。

ＵＯ２４］、４は新培養基のバシルス・スブチリス及び
クレブシェラ・ニューモニアエ活性をつくりだす。

新培養基は抗生物質グゲロチン及び抗生物質３５４をつ
くる。

本発明方法の化合物類は、水性栄養培地中で水面下の好
気的条件下に同化作用を行なう生物を生育させる時につ
くられる。

また限定量の製造には表面培養基及びビン類を使用でき
ることも理解すべきである。

炭素源例えば同化できる炭水化物、及び窒素源例えば同
化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有する栄養培地
中で生物を生育させる。

好ましい炭素源はぶどう糖、黒砂糖、蔗糖、グリセロー
ル、殿粉、とうもろこし殿粉、乳糖、デキストリン、糖
蜜等を包含する。

好ましい窒素源はコーンスチープリカー、酵母、固型乳
を伴った自己消化醸造酵母、大豆粉、綿実粉、コーンミ
ール、固型乳、カゼインの膵液消化物、魚粉、デイスチ
ラーズソリッド、動物ペプトン液、肉と骨の砕片等を包
含する。

これらの炭素源と窒素源の組合せを使用するのが有利で
ある。

痕跡量の金属、例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、
コバルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。

というのは、水道水や未精製成分が培地の滅菌前に培地
成分として使用されるからである。

本発明方法による化合物類の製造は、微生物の満足な生
育をもたらす任意の温度、例えば約１８゜と４０℃の間
、好ましくは約２０°と２８℃の間で実施できる。

普通には、化合物類の最適製造は約３〜１５日で得られ
る。

発酵中の培地は酸性にとどまる。

最終ｐＨは一部にはもしあれば緩衝液に、また一部には
培養基培地の最初のｐＨによる。

大容器及びタンク内で生育を実施する時は、化合物の製
造における著しい遅れと、それに伴う設備利用の非能率
とをさけるため、接種微生物の胞子型よりも増殖型を使
用するのが好ましい。

従って、栄養培養液培養基中で、この培養基に土壌、液
体窒素寒天プラグ又は斜面培養基からの−すくいを接種
することにより増殖期の接種菌をつくるのが望ましい。

こうして若く活発な増殖期の接種菌が確保されたら、こ
れを無菌的に大容器又はタンクへ移す。

増殖期の接種菌をつくる培地は、微生物の良好な生育が
得られる限り、化合物の製造に利用されるものと同じ、
又は異なるものでありうる。

本発明によってつくられる化合物類を発酵液から分離精
製するには種々の手順が、例えば木炭吸収、１−ブタノ
ール抽出、及びセルロースならびに陽イオン交換樹脂上
の吸着が使用できる。

好ましい回収方法では、本発明方法でつくられる化合物
類は、慣用手段例えばろ過又は遠心分離により気菌糸及
び未溶解固体を分離することによって培養基培地から回
収される。

次に抗生物質は木炭カラム上の吸収によって、ろ過又は
遠心分離された培養液から回収される。

抗生物質を除くためには、水中の１０〜５０％アセトン
（ｖ／ｖ）を通過させることによって木炭を溶離できる
。

溶離液を貯えて水溶液まで濃縮する。

次にこの溶液をアンモニウム型の弱い陽イオン交換樹脂
、例えばペンシルバニア州フィラデルフィアのローム・
アンド・ハース社の供給によるＩＲＯ−５０上に通す。

この樹脂を無機塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム（好適）、過塩素酸カルシウム等で溶離できる
。

集められたフラクションの抗菌活性を本明細書で述べた
とおりに検定する。

抗菌活性を示すフラクションを１−ブタノールで抽出し
て不純物を除くことができる。

抗生物質は水相にとどまる。

水相を木炭カラム上に通し、次に２５％アセトン−水（
Ｖ／Ｖ）で溶離してフラクションを集める）。

これらのフラクションを水相まて濃縮し、次いで凍結乾
燥する。

精製手順の次の段階は抗生物質３５４をグゲロチンから
分離することになる。

上記の抗生物質３５４とグゲロチンを含有する凍結乾燥
した固体を最少量の水に溶かす。

この材料をセルロースカラム上に注射するか層状におく
かする。

カラムをメタノールで溶離し、フラクションヲ集める。

これらのフラクションは抗生物質３５４を含有する。

グゲロチンはカラムを水で溶離スることによってセルロ
ースカラムから除去される。

抗生物質３５４は、初めに集められた溶離液を固体まで
濃縮し、最少量の水に溶解された固体を強い陽イオン交
換樹脂、例えばダウエックス５０（ミシガン州ミドラン
ド、ダウ・ケミカル社の供給による）上に通すことによ
り、上記のメタノール溶離液から本質的に純粋な形で得
られる。

無機塩（硫酸アンモニウムが好適）の溶液でカラムを溶
離し、本質的に純粋な３５４を含有するフラクションを
集める。

本質的に純粋なグゲロチンは、グゲロチンを含有するフ
ラクションを上記のセルロースカラムから取り、これを
上記のとおり抗生物質３５４用の強い陽イオン交換樹脂
上に通すことによって得られる。

抗生物質３５４は強塩基化合物であるから、抗生物質３
５４の粗調製剤の精製には陽イオン交換樹脂上の吸収及
び有機塩基又はアンモニアによる溶離を含めた手順が使
用できる。

また、抗生物質３５４の粗調製剤は無機又は有機酸での
処理による塩型への転化によっても精製できる。

抗生物質の塩基型は、アンモニアその他の無機又は有機
塩基による酸陰イオンの中和によって回収できる。

下に例示的な形で明らかにされるとおり、無機又は有機
酸で抗生物質３５４の塩類をつくるには、抗生物質３５
４の酸性ｐＨにおける不安定性のため、この物質の水溶
液に酸を注意深く加える必要がある。

使用できるが限定的に考えられるべきでない無機及び有
機酸の例は塩酸、硫酸、燐酸、酢酸、こはく酸、くえん
酸、乳酸、マレイン酸、フマール酸、パモイツクアシッ
ト、コール酸、バルミチン酸、粘液酸、ショウノウ酸、
ゲルタール酸、クリコール酸、フタール酸、酒石酸、ラ
ウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、３−フェニルサ
リチル酸、５−フェニルサリチル酸、３−メチルゲルタ
ール酸、オルトチオスルホ安息香酸、シクロヘキサンス
ルファミン酸、シクロペンクンプロピオン酸、１，２−
シクロヘキサンジカルボン酸、４−シクロヘキセンカル
ボン酸、オクタデセニルこはく酸、オクテニルこはく酸
、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、へりアンチ
ン酸、ライネケ酸、ジメチルジチオカルバミン酸、ソル
ビン酸、モノクロロ酢酸、ウンデシレン酸、４′−ヒド
ロキシアゾベンゼン−４−スルホン酸、オクタデシル硫
酸、ピクリン酸、安息香酸、桂皮酸等である。

ある塩類をつくるその他の手順は以下のとおりである。

硫酸塩は、陽イオン交換樹脂からの硫酸アンモニウム溶
離を使用してつくることができる。

また、酢酸塩は、陽イオン交換樹脂から抗生物質を溶離
するのに酢酸ピリジニウムを使用してつくることができ
る。

更に、抗生物質３５４の塩化物塩は、陽イオン交換樹脂
から抗生物質を溶離するのに塩化アンモニウムを使用し
てつくることができる。

硫酸塩は、これを陰イオン交換樹脂たとえばダウエック
ス１（０１”−）及びダウエックス２（Ｏｆ ）上に
通すことによって塩化物へ転化できる。

樹脂をＯＨ−型で使う場合には、３５４の遊離塩基が単
離される。

抗生物質３５４の塩は親杭生物質と同じ生物学的目的に
使用できる。

抗生物質３５４のアシレート類は次のようにつくられる
。

抗生物質３５４の一試料をＴＭＳ−イミダゾール又はビ
スーＴＭＳ−トリフルオロアセトアミドのようなシリル
化試薬の過剰量に溶解する。

トリメチルクロロシランのような触媒及び／又はピリジ
ンのような塩基を使用してもよいが、いずれも必要では
ない。

次にトリフルオロアセチルイミダゾール又は無水酢酸の
ようなアシル化試薬を加える。

アシル化はガスクロマトグラフィと質量分析の組合せに
よって判断されるとおり急速で定量的である。

シリル化された抗生物質３５４（モノ及びジシリル化誘
導体の両方が存在し得る）に対応するピークは消え、よ
り長い滞留時間と、アシル化されかつモノシリル化され
た抗生物質３５４のしるしである質量スペクトルをもつ
新しいピークが現われる。

次にこの誘導体をメタノール又は水で選択的に加水分解
すると、抗生物質３５４のアシル化された誘導体を生ず
る。

適当な酸結合剤はピリジン、キノリン及びイソキノリン
のようなアミン類と、酢酸ナトリウムのような緩衝塩を
包含する。

好ましい塩基はピリジンである。

アシル化に適したカルボン酸類は（ａ）飽和又は不飽和
直鎖又は分枝鎖脂肪族カルボン酸、例えば酢酸、プロピ
オン酸、酪酸、イソ酪酸、第三ブチル酢酸、吉草酸、イ
ソ吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、デカン酸、ドデカ
ン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペン
タデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン
酸、アクリル酸、クロトン酸、ウンデシレン酸、オレイ
ン酸、ヘキシン酸、ヘプチン酸、オクチン酸等、（ｂ）
飽和又は不飽和脂環族カルボン酸、例えばシクロブタン
カルボン酸、シクロペンクンカルボン酸、シクロペンテ
ンカルボン酸、メチルシクロペンテンカルボン酸、シク
ロヘキサンカルボン酸、ジメチルシクロヘキサンカルボ
ン酸、ジプロピルシクロヘキサンカルボン酸等、（Ｃ）
飽和又は不飽和脂環式脂肪族カルボン酸、例えばシクロ
ペンクン酢酸、シクロペンクンプロピオン酸、シクロヘ
キサン酢酸、シクロヘキサン酪酸、メチルシクロヘキサ
ン酢酸等、（ｄ）芳香族カルボン酸、例えば安息香酸、
トルイル酸、ナフトエ酸、エチル安息香酸、イソブチル
安息香酸、メチルブチル安息香酸等、及び（ｅ）芳香族
脂肪族カルボン酸、例えばフェニル酢酸、フェニルプロ
ピオン酸、フェニル吉草酸、桂皮酸、フェニルプロピオ
ン酸、及びナフチル酢酸等を包含する。

また適当なハロー、ニトロ−、ヒドロキシ−、アミノ−
、シアノ−、チオシアノ−１及び低級アルコキシ炭化水
素カルボン酸類は、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、ア
ミノ、シアノ又はチオシアノ、又は低級アルコキシ、有
利には６個を越えない炭素原子の低級アルコキシ、例え
ばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、アミロ
キシ、ヘキシロキシ、及びそれらの異性体型の一つ又は
それ以上で置換されている上記の炭化水素カルボン酸類
を包含する。

このような置換炭化水素カルボン酸の例は、 モノ−、ジー及びトリクロロ酢酸、 α−及びβ−クロロプロピオン酸、 α−及びγ−ブロモ酪酸、 α−及びδ−ヨード吉草酸、 メバロン酸、 ２−及び４−クロロシクロヘキサンカルボン酸、シキミ
酸、 ２−ニトロ−１−メチルシクロブタンカルボン酸、 １．２，３，４，５，６−へキサクロロシクロヘキサン
カルボン酸、 ３−ブロモ−２−メチルシクロヘキサンカルボン酸、 ４−及び５−ブロモ−２−メチルシクロヘキサンカルボ
ン酸、 ５−及び６−ブロモ−２−メチルシクロヘキサンカルボ
ン酸、 ２．３−ジブロモ−２−メチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ２．５−ジブロモ−２−メチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ４．５−ジブロモ−２−メチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ５．６−シプロモー２−メチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ３−ブ＆モー３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、 ６−ブロモ−３−メチルシクロヘキサンカルボン酸、 ■、６−ジプロモー３−メチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ２−ブロモ−４−メチルシクロヘキサンカルボン酸、 １．２−ジブロモ−４−メチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ３−ブロモ−２，２，３−トリメチルシクロペンクンカ
ルボン酸、 １−ブロモ−３，５−ジメチルシクロヘキサンカルボン
酸、 ホモゲンチシン酸、 ｏ −、ｍ−及びｐ−クロロ安息香酸、 アニス酸、 サリチル酸、 ｐ−ヒドロキシ安息香酸、 β−レゾルシル酸、 没食子酸、 ベラトルム酸、 トリメトキシ安息香酸、 トリメトキシ桂皮酸、 ４．４′−ジクロロベンジル酸、 ｏ−、ｍ＝、及びｐ−ニトロ安息香酸、 シアン酢酸、 ３．４−及び３，５−ジニトロ安息香酸、２．４，６−
トリニトロ安息香酸、 チオシアノ酢酸、 シアノプロピオン酸、 乳 酸、 エトキシ蟻酸（炭酸水素エチル）等を包含する。

抗生物質３５４の上のアシレート類は、親化合物の品質
を高めるのに有用である。

すなわち親化合物をアシル化し、次にアシル基を除去す
ることによって、親化合物はより純粋な形で単離される
。

抗生物質３５４のトリメチルシリル化は、気相クロマト
グラフィ及び質量スペクトル分析作業に有用な揮発性の
ジーＴＭＳ誘導体を（少量のモノーＴＭ８誘導体と共に
）与える。

この誘導体は、抗生物質３５４の試料を、ビストリメチ
ルシリルアセトアミドの過剰量を伴ったテトラヒドロフ
ラン中で、約６０℃に約３０分加熱することによってつ
くられる。

また、モノーＴＭＳ誘導体はトリメチルシリルイミダゾ
ール又はビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミ
ドを使用してつくることができる。

モノシリル化された抗生物質３５４はトリフルオロアセ
チルイミダゾール、無水トリフルオロ酢酸又は無水酢酸
を使用してその場でアシル化できる。

これらも気相クロマトグラフィー質量スペクトル分析作
業に有用であり、抗生物質３５４の選択的（Ｏ対Ｎ）保
護への実際的径路を表わしている。

以下の実施例は本発明方法及び生成物の例示であるが、
限定的に考えられてはならない。

他に注意がなければ百分率はすべて重量に、溶媒混合物
の割合はすべて容量による。

実施例 Ｉ Ａ０発酵 ストレプトミセス・プニセウス亜種トリセウス、ＮＲＲ
Ｌ１１１６０、の生物学的に純粋な培養基を使用して、
次の成分からなる無菌培地１００−を含有する５００ｍ
１の種菌用三角フラスコへ接種する。

ぶどう糖 １０ｇ／を 酵母エキス ２．５ｇ／ｌ ペプトン １ｏｇ／を 脱イオン水 １ｔとする量 種菌培地の滅菌前ｐＨは６．５である。

種接種菌を２５ Ｏｒｐｍで操作されるガンプ回転振と
う機上で２８℃で３日間生育させる。

上記のようにしてつくった種接種菌を使用して、次の成
分からなる無菌発酵培地１００ｍ１を含有する５ｏＯｒ
ｆＬｌ三角発酵フラスコに接種する。

ブレア・ラビット／シュフレスト米 ２０ｒｒｔｌ／
を酵母エキス／醸造酵母未来 ２ｇ／、１デキ
ストリン舶昧 １０ｇ／ｌセレロース米
米米 未来 １５ｇ／ｌプロテオースーペブ
トン＃３米米 １０ ｉ／１落花生粉
５ ｇ／ｌ水
１ｔとする量米 ＲＪＲフーズインコポレイテツ
ド（Ｆｏｏｄｓ。

Ｉｎｃ、 ）ニューヨーク州ニューヨーク。

未来 ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）研究所、ミシガン州デト
ロイト。

未来米ＣＰＣインターナショナル社、ニューシャーシー
州イングルウッド・クリフス （Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃ１１ｆ ｆ ｓ ）滅菌前ｐ
Ｈは７．０である。

発酵培地１００ｍ１当り種接種菌５７′ｆｌｌの率で発
酵フラスコを接種する。

２５ Ｏｒｐｍで操作されるガンプ回転振とう機上で発
酵フラスコを２５°〜２８℃の温度で３日間生育させる
。

３日後に取入れられた代表的な振とうフラスコ発酵は、
プソイドモナス・ミルデンベルギイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｍｉｌｄｅｎｂｅｒｇｉｉ ） （ＵＯ３０２
９）に対し次のような検定パターンを示す。

この検定は微生物Ｐ、ミルデンベルギ不を使用する寒天
ディスクプレート検定である。

寒天培地は０．１ Ｍ燐酸塩緩衝液で７，４のｐＨに緩
衝される。

検定しようとする物質を含有する溶液の単位容積（０，
０８ｍ１）を１２．７ｍｍのペーパーディスク上に置き
、次にこれを検定生物で種付けられた寒天プレート上に
置く。

次に寒天プレートを３７℃で１６〜１８時間培養する。

−生物単位（ＢＵ）とは、上の検定条件下に２０ｍｍの
阻止帯を与える抗生物質濃度と定義される。

このように例えば発酵液又は抗生物質を含有するその他
の溶液が２０ｍｍの阻止帯を生ずるために１／１００に
希釈する必要がある場合、このような発酵液又は溶液の
力価は＋７１１当り１００ＢＵである。

Ｂ０回収 （１） 炭素収着 上記のとおり振とうフラスコで生育させた発酵ｇｌｏｗ
を洗浄した粒状木炭４Ｌと共に１５分かきまぜる。

木炭を１０分間沈降させ、発酵液を傾斜させる。

水が透明になるまで木炭を脱イオン水で洗う。

頭上パドル（ｏｖｅｒ ｈｅａｄ ｐａｄｄｌｅ）かき
まぜ機を第一段階で使用し、１０ｔのバケツを第二段階
で用いる。

木炭を脱イオン水と共にクロマトグラフィ管へスラリー
状に入れる。

可能な最高の流量で重力流を使用して、活性物を２５％
アセトン−水で溶離する。

黄色が現われるまで１ｔのフラクションを集める。

黄色がほとんど検出できない時は、小フラクションを再
び集める。

黄色フラクション（１１４）を３５〜ｂ タを下の第１表に載せる。

ＵＯ３０２９の生物単位の８０％がカラムから回収され
ることがわかる。

（２）ＩＲＣ！−５０収着 上記のように４回の実験（発酵液計約４８ｔ）からの炭
素溶離液を一緒にすると水相３３ｔを生じ、これは計９
１，０００ ＵＣ３０２９生物単位の検定値を示す。

これをクロマトグラフィ管中でＩＲＯ−５０（ＮＨ４＋
）２ポンド上に毎時５〜苦６ｔで通す。

次にカラムを脱イオン水４ｔで洗い、Ｉ Ｍ （ＮＨ４
）２ Ｓ ０４溶液で溶離する。

水でに１０に希釈後、フラクションをＵＶで検定する。

ＵＶデータに基づいて、始めの二溶離液ソー緒にする。

第三溶離液は取っておく。データを下の第２表に示す。

（３）脱塩 クロマトグラフィ管内の粒状木炭２００ｒＩＬｌ上に上
の第三溶離液（２０００ｍＡ）を通す。

カラムを脱イオン水５００ＴｆＬｌで洗う。

使用済み液も洗浄液もＵＶ吸光度をもたない。

活性物質を２５％アセトン−水７００ＴｒＬｌで溶離す
る。

溶離液を５００ＴＬｌの水溶液まで濃縮する。

これの１：１０希釈は２５５ｎｍで強い吸光度をもつ。

メタノールによるセルロース上のバイオオートグラフィ
は、グゲロチン及び抗生物質３５４の存在を示している
。

（４）限外ろ過 上からの脱塩された水溶液をアミコンＵＭ２ウルトラフ
ィルター（アミコン社、ＭＡ（０２１７３）、レキシン
トン、バートウェル・アベニュー２１番地）上に通す。

滞留物は活性をまったく示さず、１容量の洗浄液を通し
てから捨てられる。

第一ろ液と洗浄液を一緒にして凍結乾燥する。

残留物は重さ４．５ｇである。

これは２５２ｎｍにＵＶ最最大を示し、強い末端吸収で
は２１２ｎｍに屈曲をもつ。

（５）抗生物質３５４からのグゲロチンの分離（限外ろ
過塩外は）本質的に上記のとおりに処理された調製剤６
８ｇは、Ｂ、スブチリスに対して０．６８ＢＵ／ｍ９の
検定値を示す。

これを調製剤２１６−４と付せんを付ける。

これがグゲロチン及び抗生物質３５４を含有することを
バイオオートグラフィが示している。

５．０Ｘ１５０Ｃｒｎのセルロース３００（７）カラム
をメタノールで毎分２０ｍ１（１０ｐｓｉ）でフラッシ
ュする。

床容量は２．９ｔである。上の調製剤２１６−４の３０
．９を水６５ｒｒＬｌに溶解し、溶液をカラム上に射出
する。

これがメタノールと接触する時に固体が幾分沈殿するが
、これがカラムを詰まらせたり、手順に干渉したりする
ことはない。

カラムを毎分２０７７１１でメタノールで溶離する。

溶離液フラクションは、１：１０希釈を使用して、ＵＶ
で検定される。

データを第３表に示す。

フラクション３〜８を一緒にし、濃縮すると、淡褐色の
固体１０．：ｌを生ずる。

バイオオートグラフィはこれが抗生物質３５４を含有し
、グゲロチンを含有しないことを示している。

試料の残りを用いて同様に分析された第二の注入物は同
様な調製剤１２．１’を生ずる。

フラクション＃１１後、溶媒を水に切り替え、毎分２０
ｍＡ’で溶離を続ける。

データを下の第４表に示す。

フラクション２と３を一緒にし、凍結乾燥すると、淡褐
色固体１７．９ 、！ｉ’を生ずる。

第二の注入物は２２．１ｇを生ずる。

バイオオートグラフィはこれがグゲロチンのみを含有す
ることを示す。

６２１試料（２１６−４）は抗生物質３５４を含有する
固体２２．２．！ｉ’ （３２，６％）及びグゲロチン
含有固体４０．！ｉ！（５８，８％）を生ずる。

抗生物質３５４材料２２ｇはＢ、スブチリスに対して０
．３５ＢＵ／１ｒｌＩ？及びＵＣ３０２９に対して０．
８３ＢＵ／〜の検定値を示す。

第二の実験から得られるグゲロチン材料２２ｇは、Ｂ、
スブチリスに対して０．５ＢＵ／■及びＵＯ３０２９に
対して１．５ ＢＵ／■の検定値を示す。

画調製剤とも、総体的に不純である。

（６）純粋なグゲロチン 上記と同様な（限外ろ過も行なった）二階のセルロース
操作からの貯液は５．８ｇの量である。

これを水１５ｒＩｌｌに溶解し、２．５Ｘ１００Ｃｒｒ
ｌの２００〜４００メツシユのアンバーライトＣＧ−１
２０（ＮＨ４＋）カラム（ローム・アンド・バース社、
ペンシルバニア州フィラデルフィア）へ注入する。

これを水からＩ Ｍ （ＮＨ４）２ Ｓ ０４までの勾
配で毎分１２ｍ１で溶離する。

２５１７１１の量のフラクションを集める。

５番目のフラクション毎にＵＣ３０２９に対して検定す
る（１００λ／１２．７皿ディスク）。

管＃２５０まで活性がない。

１０番目の管毎にに１０希釈でＵＶ検定を行なう。

これは管＃２５０まで２６５ｎｍの吸収帯を示さない。

その後の管に対するＵＶデータを第５表に示す。

管２６０〜３７０で得られるＢ、スブチリス阻止帯は非
常に小さい。

管２８０〜３４０を一緒にすると、１．４７の溶液を生
ずる。

クロマトグラフィ管内でこれを木炭２００１ｎｌ上で脱
塩する。

木炭を水洗し、２５％アセトン−水で溶離する。

フラクションを２６８ ｎｍでのＵＶ吸光度によって監
視する。

水性溶離液を凍結乾燥すると、本質的に純粋なグゲロチ
ン１．０ｇを白色固体として生ずる。

（７）硫酸塩としての純粋な抗生物質 上記のようにセルロースカラム段階を通して処理された
種々のフラクションの貯液をつくる。

その量は３．７８Ｆ！であり、これを水１０ＴｒＬｌに
溶解する。

これを上記のグゲロチン用のＣＧ−１２０（ＮＨ４＋
）カラム上に注入し、同じ勾配と同じ速度で溶離する。

１０番目毎の管の−すくいを水で１：１０に希釈し、Ｕ
Ｖで検査して生物検定する。

管＃２２０までは何も溶離してこない。それ以後の管に
対するデータを第６表に示す。

フラクション２４８〜３４０を一緒にすると、Ａ２５□
−１，２７の溶液２．５ｔを生ずる。

これをグゲロチンに対して述べたとおりに、３．５Ｘ２
８ｃＩｒＬ（２７０ｍ）の木炭床を使用して脱塩し、適
当な波長で監視する。

脱塩された溶離液を凍結乾燥すると、本質的に純粋な抗
生物質３５４の２．３６ｇを淡褐色固体として生ずる。

これはＵＯ３０２９に対して８ＢＵ／■の検定値を示す
。

実施例 ２ 抗生物質３５４のアセチル化 抗生物質３５４の試料をテトラヒドロフラン中でピリジ
ン及び無水酢酸と共にかきまぜる。

真空下に溶媒を除去し、残留物を酢酸エチルと０．０１
ＮＨＯＩとの間で分配する。

水相を凍結乾燥する。固体を水に再溶解し、結晶を生成
させて集める。

これらの結晶は質量スペクトル分析により抗生物質３５
４の七ノーＮ−アセチル脱塩化水素誘導体であることが
示される。

実施例 ３ 抗生物質３５４・Ｈ２ＳＯ４からの抗生物質３５４・Ｈ
ＯＩの調製 抗生物質３５４・Ｈ２ＳＯ４の試料１４■を水０．３ｍ
ｌ中に溶解し、ｉｏｏ〜２００メツシュダウエックス２
Ｘ８（０１−）の０．４Ｘ８（ｌｌ’ｍカラム上に通す
。

蒸留水で溶離し、各３．０１ｒＬｌフラクシヨンをセル
ロースＴＬＯ（薄層クロマトグラフィ）板上に点滴後、
ニンヒドリン噴霧によって、及びＵＶ吸光度（２５１及
び２１１に１：４の比で吸収帯）によって検定する。

適当な貯液を凍結乾燥する。固体残留物は質量スペクト
ル分析によって塩酸塩であることが判る。

実施例 ４ グゲロチンと抗生物質３５４との混合物からの抗生物質
３５４・ＨＯＡ Ｏの調製 グゲロチン及び抗生物質３５４を含有する水性の炭素溶
離液（４ｔ）をダウエックス５０Ｗ×８（Ｈ）２００．
！ｉ’のカラム上に通す。

カラムを脱イオン水で洗い、ｐＨ５の゛２．ＯＭ酢酸ピ
リジニウム緩衝液で溶離する。

フラクション１３〜１７（各４５１ｒＬｌ）をＵＯ３０
２９に対する生物活性（１２，７間ディスク、寒天トレ
ー）に基づいて一緒にし、凍結乾燥する。

主たる活性がアセテート型であるに違いない抗生物質３
５４であることを示すバイオオートグラフのパターンを
固体は与えている。

こうして得られるアセテート混合物は、上記のセルロー
スクロマトグラフィによってグゲロチンアセテートと抗
生物質３５４アセテートとに分離される。

【図面の簡単な説明】

第１図は鉱油フル中の抗生物質３５４硫酸塩の赤外線吸
収スペクトル図である。 第２図は０．０１Ｎ塩酸溶液中の抗生物質３５４の紫外
線吸収スペクトル図である。 第３図は重水巾約１５％の抗生物質３５４の核磁気共鳴
スペクトル図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プソイドモナス及びプロテウスに対して活性があり
   、その本質的に純粋な形で次の特性をもつ硫酸塩として
   特徴づけられる抗生物質３５４：（ａ） 分子量１７
   ２（磁場離脱質量分析）。 （ｂ） 元素分析値Ｃ９３７，０８；Ｈ，４，７９；
   Ｎ。 １２．３８；Ｃ！ｔ、１５．５２； Ｓ 、７．４８；
   ０゜２２．７５ （Ｃ） 水に可溶、メタノール、アセトン、ジメチル
   スルホキシド及びジメチルホルムアミドには比較的に不
   溶、 （ｄ） 鉱油フル中に溶解された時に、図面の第１図
   に示す特徴的な赤外線吸収スペクトルをもつ、（ｅ）
   図面の第２図に示す特徴的な紫外線吸収スペクトルを
   もつ、及び （ｆ） 図面の第３図に示す特徴的なＮＭＲスペクト
   ルをもつ。 ２ 抗生物質３５４の酸付加塩類。 ３ 特許請求の範囲第２項による化合物の抗生物質３５
   ４硫酸塩。 ４ 特許請求の範囲第２項による化合物の抗生物質３５
   ４塩酸塩。 ５ 特許請求の範囲第２項による化合物の抗生物質３５
   ４酢酸塩。 ６ 抗生物質３５４のアシレート類。 ７ 特許請求の範囲第６項による化合物の抗生物質３５
   ４号のモノ−Ｎ−アセチル脱塩化水素処理された誘導体
   。 ８ 抗生物質３５４のトリメチルシリル誘導体。 ９ ＮＲＲＬ１１１６０の確認特徴をもつストレプト
   ミセス・プニセウス亜種ドリセウス（Ｓｔｒｅｐｔ。 ｍｙｃｅｓ ｐｕｎｉｃｅｕｓ ５ｕｂｓｐ、 ｄｏｌ
   ｉｃｅｕｓ ）を、抗生物質３５４の実質活性が培地に
   付与されるまで、好気的条件下に水性栄養培地中で培養
   し、その培地から抗生物質３５４を採集することからな
   る、抗生物質３５４の製法。 １０ 水性栄養培地が同化できる炭水化物源と同化でき
   る窒素源を特徴する特許請求の範囲第９項による方法。 １１ （ａ）ＮＲＲＬ １１１６０（７，）確認特徴
   をもツストレプトミセス・プニセウス亜種ドリセウス（
   Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｕｎｉｃｅｕｓ ５ｕｂ
   ｓｐ、 ｄｏｌｉｃｅｕｓ）を、抗生物質３５４の実質
   活性が培地に付与されるまで、好気的条件下に水性栄養
   培地中で培養して得られる発酵液を炭素収着させ、抗生
   物質３５４とグゲロチンを含有する炭素溶出液を得るた
   め、２５％アセトン−水（ｖ／ｖ）で炭素収着物から溶
   離し、 （ｂ） 炭素溶離液を陽イオン交換吸収させ、抗生物
   質３５４及びグゲロチンを含有する樹脂溶離液を得るた
   め硫酸アンモニウム溶液で溶離し、（ｃ） 樹脂溶離
   液を粒状木炭で脱塩し、抗生物質３５４及びグゲロチン
   を含有する脱塩水溶液を得るためこれを２５％アセトン
   −水（ｖ／ｖ）で溶離し、 （ｄ） 脱塩水溶液を限外ろ過にかけ、抗生物質３５
   ４及びグゲロチンを含有する貯液を得て、（ｅ） こ
   の貯液をセルロースカラム上の吸収にかけ、抗生物質３
   ５４をグゲロチンから分離するためにメタノールでカラ
   ムを溶離し、別々の物質を含有するフラクションを得て
   、 （ｆ） プソイドモナス・ミルデンベルギイに対する
   活性を示すフラクションを強い陽イオン交換樹脂に通し
   、本質的に純粋な抗生物質３５４を得るため硫酸アンモ
   ニウムで樹脂を溶離することからなる、 抗生物質３５４及びグゲロチンを含有する発酵液から抗
   生物質３５４を回収する方法。