DE2823207A1

DE2823207A1 - Von einer neuen subspezies von streptosporangium gebildetes neues polypeptidantibiotikum

Info

Publication number: DE2823207A1
Application number: DE19782823207
Authority: DE
Inventors: Walter Daniel Celmer; Walter Patrick Cullen; Charles Edward Moppett; John Broderick Routien; Riichiro Shibakawa; Junsuke Tone; Paul Colson Watts
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1977-06-01
Filing date: 1978-05-25
Publication date: 1978-12-14
Also published as: JPS543001A; JPS5632318B2; US4083963A; FR2393007B1; AU3600378A; IE781043L; GT197852447A; CA1096796A; ZA783025B; IT7849558A0; IE46977B1; PH13972A; IT1156774B; LU79715A1; NL177326B; NL177326C; BE867443A; GB1554838A; DK145063C; NL7805305A

Description

- 3 - P 9o8

Pfizer Inc., New York, N.I., V. St. A.

Von einer neuen Subspezies von Streptosporangium gebildetes neues Polypeptidantibiotikum

Die Erfindung betrifft ein neues Mitglied der schwefelhaltigen Polypeptidgruppe von Antibiotika» Zu dieser Familie von Antibiotika gehören Thiostrepton (Antibiotics Ann., 1955-1956, 554-559), Siomycin (j. Antibiotics, 14:255, 1961), A-59 (J. Antibiotics, AH:194, 1961), Thiopeptin (J. Antibiotics, 23:113-119, 197o) und Sporangiomycin (J. Antibiotics, 21:525-531, 1968).

Die Erfindung betrifft ein neues schwefelhaltiges Polypeptidantibiotikum, das von jeweils zwei Stämmen einer neuen Subspezies von Streptosporangium unter aeroben Bedingungen unter tfasser in einem wässrigen Nährmedium gebildet wird. Die antibiotische Verbindung 46,192 ist gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen aktiv und bewirkt eine Verbesserung der Futterverwertung bei Wiederkäuern»

Die antibiotikumbildenden Mikroorganismen der Erfindung, die aus Erde in Kanada und Frankreich isoliert wurden, haben, wie

bei der Untersuchung festgestellt wurde, die morphologischen Herkraale von Streptosporangium. Diese Art unterscheidet sich von anderen zu der Gruppe von Actinomyceten gehörenden Arten durch die Bildung von gewundenen Ketten von runden bis elliptischen Sporen, die in Sporangien enthalten sind, und die Bildung eines an der Luft lebenden Myzels auf der Oberfläche der Kultur.

Die beiden Stämme von Streptosporangium, Pfizer P.D. 25824 und Pfizer F.D. 25898, sind in The American Type Culture Collection, Rockville, Md. unter den Eintragungsnummern ATOÖ 31265 und ATCG 31266 hinterlegt worden. Die Portdauer der Hinterlegung und die leichte Zugänglichkeit dazu für die Öffentlichkeit sind für den Fall gewährleistet, daß das Patent erteilt wird. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der hinterlegten Kulturen für die Öffentlichkeit werden nach Erteilung des Patents unwiderruflich aufgehoben werden.

Beide Kulturen wurden zur Ansiedlung auf Kulturmedien- nach · der in Inter.Jr.Sys.Bacteriology 16(3):322, 1966 beschriebenen Methode gebildet. Die Inkubationstemperatur war 28⁰C. Die Ergebnisse wurden in Zeitabständen bis zu 21 Tagen ermittelt. Die Farben wurden durch Vergleich mit Chips aus dem Color Harmony Manual, 4.Auegabe, sowie auch duroh peraönliohe beschreibende Angaben festgelegt.

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j Die für die Charakterisierung der Kulturen verwendeten Identii

; fikationskulturraedien und die Literaturhinweise für die Zusammensetzung der letzteren sind wie folgt:

¹ 1. Trypton - Hefeextraktbrühe (ISP 44 1 - Difco) ! 2. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 44 2-Difco)

; 3. Hafermehl-Agar (ISP 44 3-Difco),

I 4. Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP 44 4-Difco) j 5. Glyeerin-Asparagin-Agar (ISP 44 5-Difco)

6. Pepton-IJefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 44 6-Difco)

7. Tyrosin-Agar (ISP 44 7-Difco)

8. Dextrose-Nitrat-Brühe - S.A. Waksman, The Aotinomycetes, Vol. 2, Medium 1, Seite 328, 1961, unter Ersatz von 3o g Sucrose durch 3 g Dextrose und Weglassen des Agars

9. Organische Nitrat-Brühe - R.E. Gordon und J.M-. Mihm. Jr₀BaC

73:15-27, 1957

10. Gelatine - ibid.

11. Stärke - ibid.

12. Magermilch - Difco

13. Leitungswasser-Agar

14. Glucose-Asparagin-Agar - S.A. Waksman, op.cit., Medium 2, Seite 328

15. Czapek-Sucrose-Agar - ibid. Medium 1, Seite 328

16. Emerson's Agar,- ibid., Medium 28, Seite 331

17. Nähragar - ibid. Medium 14, Seite 33o

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18. Öaloiummalat-Agar - S.A. Waksman, Baot. Rev. 21:1-29, 1957

19. Cellulose

a) H.L. Jensen, Proc. Linnean Soc. F.S. Wales 55:231-248, 193o

b) M.Levine und H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, Medium 2511, 193o

20. Kohlenhydrate - G.M. luedemann und B.C. Brodsky, Antimicrobial Agent and Chemotherapy 1964:47, 1965

Die Kulturen werden wie folgt charakterisiert: Hefe-Malzextrakt-Agar - Wachstum mäßig bis gut, erhoben, farblos

bis.blaßrosarot ( 6 1/2 gc und 6 1/2 Ie) mit weißem an der Luft wachsendem Myzel, das in 21 Tagen rosa wurde; Rückseite weiß bis rosa; hellrosafarbenes lösliches Pigment in 21 Tagen.
Hafermehl-Agar - Wachstum schwach bis mäßig, cremefarben bis

blaßrosa, an der Luft wachsendes Myzel, zusammenhängend | . überall oder ringförmig, Rückseite cremefarben oder blaßrosa, '■ . blaßrosafarbenes lösliches Pigment. !

Anorganische Salze-Stärke-Agar - Wachstum schwach bis mäßig, i

blaßrosa oder farblos (5 ca bis 6 ca), an der Luft ringförmig wachsendes Myzel, Rückseite wie Oberfläche, kein . lösliches Pigment.
Glyoerin-Asparagin-Agar - Wachstum schwach, kleine isolierte Punkte, weiß, Rückseite farblos bis cremefarben, kein

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lösliches Pigment.

ί Qzapek-Suorose-Agar - Wachstum schwach, blaßrosa (6 ca) bis weiß, kleine isolierte Punkte., Rückseite weiß, kein lösliches Pigment.
Glucose-Asparagin-Agar - Wachstum schwach bis mäßig, weiß, leicht erhöht, glatt mit kleinem an der Luft wachsendem Myzel, Rückseite die Farbe der Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Nähragar - Wachstum schwach bis mäßig, blaßgelblich, erhöht, leicht runzelig, mit einem kleinen weißen oder keinem an der Luft wachsenden Myzel, Rückseite gleiche Farbe wie die Oberfläche, kein lösliches Pigment. Emerson* s Agar - Wachstum mäßig, blaßgelblich, stark erhöht, runzelig, kein an der Luft wachsendes Myzel oder kleine Bereiche von weißem an der Luft wachsendem Myzel, Rückseite wie die Farbe der Oberfläche, kein lösliches

Pigment.

■ Stärke-Agar - Wachstum mäßig bis gut, weiß bis blaßgräulich, erhöht, runzelig, kein an der Luft wachsendes Myzel, Rückseite bräunlich (4 Ie), blaßrosafarbenes lösliches Pigment.

Gelatine - Wachstum mäßig, weiß, leicht erhöht, runzelig, Rückseite gelblichbraun (5 ic), sehr blasses rosafarbenes bis Jcein lösliches Pigment.

Qalciummalat-Agar - Wachstum schwach, weiß bis blaßrosafarben (nahe 6 ca) erscheinend wie kleine isolierte Punkte,

Rückseite farblos, kein lösliches Pigment. Tyrosin-· Ag ar - Wachstum schwach bis mäßig, weiß bis blaßrosa, aussehend wie kleine isolierte Punkte, rosafarbenes lösliches Pigment.

Leitungswasser-Agar - Weiße bis blaßrosafaxbene kleine Punkte, Rückseite die gleiche Farbe wie die Oberfläche, kein lösliches Pigment.

Sporangien und Sporen (von Czapek Sucrose-Agar) - Sporangien meistens rund, 6,5-1 ο (meistens 7-8) /u lang, Sporen rund bis breit elliptisch, meistens 2,2 χ 1,6 /u, aber wechselnd von 1,6 - 2,7 x 1,1-2,2/U oder rundherum 2,2 /u breit, unbeweglich.

Biochemische Eigenschaften - Melanin wird nicht gebildet, kein

HpS, Gelatine wird verflüssigt, Stärke wird sehr schwach hydrolysiert, Nitrate werden reduziert, Wachstum auf (Jenses's Cellulose, aber keine Aufspaltung und kein Wachstum auf levine und Schoenlein's Cellulose, keine Wirkung auf Milch, Calciummalat wird nicht hydrolysiert. Kohlens to ffverwertung - Verwertet: Glucose, Cellobiose, Fructose, Galactose, Inosit, Mannose, Trehalose, Rhamnose, Ribose, Stärke, Xylose; nicht verwertet: Adonit, Arabinose, Duloit, Glycerin, Lactose, Mannit, Melezitose, Raffinose, Sorbit, Sorboee, Sucrose; veränderlich für die beiden Stämmeι Melibiose, Salicin.

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Die beiden Kulturen wurden außerdem auf ganz bestimmten Kulturmedien, wie sie von J.N. Couch, Jr. Elisha Mitchell Soc. 79:53-7o, 19631 angegeben sind, gezüchtet und außerdem auf ihr Wachstum hin bei verschiedenen Temperaturen auf dem ATGC-KuIturmedium φφ 172 getestet. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Gzapek-Sucrose-Agar - Kolonien 8-11 mm Breite in 4-5 Wochen,

flach, dünn, mit gefransten runden Linien aus rosafarbenem an der Luft wachsendem Myzel am Rand oder mit einem Hof aus niedergehaltenem blaßrosafarbenem Myzel; an der Luft wachsendes Myzel Hortensienrosa bis Blaßkongorosa (Ridgway). Pepton-Czapek-Agar - Kolonien 1o-15 mm Breite, flach oder leicht

erhöht, leicht rauh im Mittelteil, aber mit flachem äußerem Teil, Rand regulär, meist kahl, Oliv-Braungelb bis Blaßoliv-Braungelb (Ridgway), etwas weißes an der Luft wachsendes Myzel nahe des Rands; lösliches Pigment sehr blaßrosa bis rosa-weinrot.
Kartoffel-Dextrose-Agar - Kolonien 1o-15 mm Breite, erhöht, etwas

aufgerauht, bedeckt mit weißlichem bis rosafarbenem an der Luft wachsendem Myzel (Blaßkongorosa - Ridgway), Rand unversehrt, gelbbraunes lösliches Pigment. Emerson* s Agar - Kolonien 12-17 mm Breite, wahrnehmbar erhöht, unregelmäßig auf der gesamten Oberfläche aufgerauht, Rand irregulär, kahl, Farbe nahe dem tiefen Oliv-Braungelb (Ridgway).

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- 1ο -

Temperaturbeziehungen -

42⁰O

37°G

28⁰C

21 °C

kein Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum

Die beiden neuen Kulturen von Streptosporangium wurden mit nahverwandtem Streptosprangium roseum ATOG 12428 und S.vulgäre subsp. antibioticum ATGG 2i9o6 verglichen. Es wurde festgestellt, daß die beiden neuen Kulturen von S.vulgäre subsp. antibioticum ATCC 219o6 verschieden, aber in mancher Hinsicht dem S.roseum ATCC 12428 ähnlich waren. Auf ISP-Kulturmedium 2, ISP-Kulturmedium 5, ISP-Kulturmedium 5, Tyrosin-Agar, Czapek-Sucrose-Agar, Czapek-Pepton-Agar, Emerson's Agar, Nähragar, Leitungswasser-Agar, Kartoffel-Karotten-Agar und Calciummalat-Agar glichen die Kolonien von den beiden neuen Kulturen sehr stark denen von S.roseum. Die beiden neuen Kulturen und S.roseum zeigten positive Stärkehydrolyse, positive Gelatineverflüssigung, positive Nitratreduktion, negative Melaninbildung, negative Celluloseaufspaltung und den gleichen Bereich von Wachstumstemperaturen, Die Größe und die Form von Sporangien und Sporangiosporen von diesen drei Kulturen waren identisch. Das Spektrum der Verwertbarkeit von sieben Kohlenwasserstoffen war bei diesen drei Kulturen ähnlich.

Beim Vergleich mit den Kolonien von S.roseum unterscheiden sieh die Kolonien der beiden neuen Kulturen von $enen auf Kartoffel-Dextrose-Agar und Stärke-Agar und unterscheiden sich geringfügig

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auf ISP-Kulturmedium 4, Glucose-Asparagin-Agar und G-elatine-Agar. Streptosporangium roseum verwertet Arabinose, während die "beiden neuen Kulturen dieses nicht tun.

Aufgrund der Züchtungswerte, morphologischen Daten und der Vergleichswerte wurde der Schluß gezogen, daß die beiden neuen Kulturen voneinander ununterscheidbar sind und eine neue Subspezies von Streptosporangium roseum darstellen. Der für die beiden neuen Kulturen vorgesehene Name ist wegen ihrer rosa Farbe Streptosporangium roseum subsp. incarnatum Reutien subsp. nov.

Die Züchtung der Streptosporangium-KuItüren findet vorzugsweise in Nährmedien bei einer Temperatur von 28 bis 36 ö und unter aeroben Bedingungen unter Wasser und unter Rühren statt. Zu Nährmedien, die für solche Zwecke geeignet sind, gehören ein Material, das assimilierbaren Kohlenstoff liefert, wie z.B. Zuckerarten und Stärken, ein Material, das organischen Stickstof: liefert, wie z.B. Kasein, der enzymatischen Digestion unterworfenes Kasein, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl und Weizengluten. Ein Material, das Wuohssubstanzen liefert, wie z.B. die bei der Brennerei anfallenden löslichen Substanzen ¹ ("distillers' solubles")» Fischmehl und Hefeextrakt, »owie ι Salze, wie z.B. Natriumchlorid und Galciumcarbonat, und Spuren- : mineralien, wie Z₀B. Eisen, Magnesium, Zink, Kobalt und Mangan, können ebenfalls mit vorteilhaften Ergebnissen verwendet werden·

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Wenn übermäßiges Schäumen während der Fermentation auftritt, können Antischaummittel, wie z.B. pflanzliche Öle oder Silioone, dem Fermentationsmedium zugegeben werden. Die Belüftung des Mediums in Tanks zum Züchten unter Wasser wird vorzugsweise j bei einem Grad von o,5 bis 2 Volumen freie Luft je Volumen j Brühe je Minute gehaltene Das Bewegen kann mittels Bewegungsvor-

; richtungen, die in der Fermentationsindustrie allgemein üblich sind, vorgenommen werden. Aseptische Bedingungen müssen natürlich während des Eintragens des Organismus und während des Wachstums desselben aufrechterhalten werden.

Ein Impfstoff für die Herstellung der antibiοtisehen Verbindung 46,192 kann erhalten werden unter Benutzung des gezüchteten Materials einer Schrägkultur auf einem Kulturmedium, wie z.B. ATCC-Kulturmedium 172 (ATCÖ-Katalog, 1o.Ausgabe, Seite 235,1972). Das gezüchtete Material kann zum Beimpfen von entweder Schüttelkolben oder Impftanks benutzt werden oder andererseits können die Impftanks aus den Schüttelkolben her beimpft werden. Das Wachstum in Schüttelkolben erreicht im allgemeinen seinen maximalen Wert in etwa 4 Tagen, während der Impfstoff in Unterwasserimpftanks im allgemeinen am vorteilhaftesten bei einer Dauer von 2 bis 3 Tagen ist. Eine wesentliche antibiotische Aktivität wird in der Endfermentierungsstufe in etwa 72 bis 12o Stunden erhalten.

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I Der Prozess der Antibiotikumbildung wird in bequemer Weise j j während der Fermentierung durch biologische Untersuchung der j

J :

! Brühe unter Benutzung eines empfindlichen Stamms von Staphylo- !

;coccus aureus verfolgt. Eine Standardplattenversuchstechnik wird

ι
angewendet, bei der die Hemmzone, die eine Filterpapierscheibe

umgibt, welche mit der Brühe gesättigt ist,als Maß für die antibiotische Wirksamkeit benutzt wird. Nachdem die Fermentati-

onsbrühe einen erwünschten Grad von antibiotischer Wirksamkeit erreicht hat, wird das Antibiotikum entweder aus der gesamten Brühe oder der filtrierten Brühe isoliert. Im letzteren Fall wird das Myzel durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt. Verschiedene Vorrichtungstypen, wie Filterpressen, Zentrifugen usw., können benutzt werden.

DieDünnschichtChromatographie unter Verwendung von Silikagel ist ein geeignetes Mittel zur Analysierung der antibiotischen Verbindung 46,192, die gemeinsam mit einer Reihe kleinerer antibiotischer Komponenten in Fermentationsmedien gebildet werden, und der Zusammensetzung von rohen und gereinigten Materialien, die aus der Fermentationsbrühe extrahiert worden sind. Die Trennung der Komponenten des antibiotischen Gemische ist von Bedeutung, und zwar je nach der in dem System vorhandenen Menge Antibiotika. Eine zu geringe antibiotische Wirksamkeit verhindern daß in kleineren Anteilen vorhandene antibiotische Komponenten festgestellt werden; eine zu starke antibiotische Wirksamkeit führt zu einem Mitsohleppeffekt, was eine schlechte Trennung

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zur Folge hat.

Das Entwicklungssystem für die Dünnschichtchromatographie ist ; OHCl,:(OH₅)₂G0 (3:1 Volumen/Volumen). Die Antibiotika können sichtbar gemacht werden, indem sie 254-nm-Licht ausgesetzt werden, mit Wasser besprüht werden, um wasserabstoßende Stellen

j feststellen zu können, oder mit einem Agar überschichtet werden,

j der mit einem empfindlichen Stamm von Staphylococcus aureus ; beimpft worden ist„

j Die Komponenten des antibiotischen Gemische können aus der Fermentationsbrühe durch Lösungsmittelextraktion, Gegenstromverteilung, Adsorption, Säulenchromatographie oder kombinierte Methoden dieser Art abgetrennt und isoliert werden. Die Antibiotika können aus der gesamten Brühe bei einem pH-Bereich von 4,o bis 1o,o unter Benutzung eines organischen Lösungsmittels, wie z.B. Butanol, Pentanol, Äthylacetat, Methylisobutylketon und anderen verwandten mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, extrahiert werden. Das Lösungsmittel wird dann unter Vakuum konzentriert, und die Antibiotika werden durch Zugabe eines Lösungsmittels, wie u.B· n-Heptan, ausgefällt.

Ein Verfahren zur Trennung und Isolierung der antibiotischen Verbindung 46,192 ist wie folgt: Die gesamte Fermentationsbrühe i wird mit 5o#iger Schwefelsäure auf ein pH von etwa 5,ο eingestellt und mit Methylisobutylketon extrahiert. Das Lösungs-

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; - 15 -

mittel wird in Yakuum entfernt. Das dunkle ölige Konzentrat i

wird mit Heptan, Diäthyläther und schließlich mit Äthylacetat verrieben. Die erhaltene feste Substanz wird dann in Methanol

j gelöst und durch Abkühlen ausgefällt_r wobei ein nicht ganz weißes Pulver erhalten wird. Ein Teil dieses Pulvers, gelöst

j in Ghloroform, wird auf Silikagel, vorzugsweise Silikagel 60 (B. Merck, Darmstadt), ehromatographiert und mit Chloroform, das zunehmende Mengen Methanol bis herauf zu einem Höchstwert von 3 % Methanol-97 % Ghloroform enthält, eluiert. Die Fraktionen von der Säulenchromatographie, die reich an der Verbindung 46,19 sind, werden weiter gereinigt durch präparative Dünnschichtchromatographie (Silikagel PF-254i E. Merck, Darmstadt), entwickelt und eluiert mit Äthylacetat. Die Verbindung 46,192 kristallisiert aus Methanol. Alle Schritte bei der Aufreinigungsverfahrensfolge werden durch DünnschichtChromatographie (Analtech Silikagel Gf, Chloroform-Aceton, 3:1) überwacht. Die Verbindung 46,192 wird sichtbar gemacht, indem sie (a) mit ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge von 254 nm bestrahlt wird, (b) unter Verwendung einer Agarsuspension, die einen empfindlichen Stamm von Staphylococcus aureus enthält, bioüberschichtet wird oder (c) mi.t Wasser besprüht wird-, um wasserabweisende Stellen festzustellen.

Die Verbindung 46,192 ist gegen viele grampositive Bakterien wirksam, wie die Tabelle 1 erläutert.

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'fabelle I

Organismus

Staphylococcus aureus sp. Bacillus subtilis Staphylococcus pyogenes j Streptococcus faecalis Clostridium sp.

Mindesthemmkonzentration (mcg/ni.)

< o,1o C o,1o

< 0,12-5,12

Die Verbindung 46,192 verleiht bei Dosierungen von 5o bis 2oo mg/kg und einer oralen Dosierung von 2oo mg/kg Mäusen, die experimentell mit Staphylococcus aureus 01A005 infiziert worden sind, einen signifikanten Schutz.

Rohe Antibiotikagemische, wie sie direkt aus der Brühe oder bei einer der dazwischen liegenden Gewinnungsstufen erhalten werden, und auch die gereinigte Verbindung 46,192 können zur Behandlung von gegenüber Antibiotika empfindlichen Infektionen beim Menschen und bei Tieren bei parenteralen Dosierungen von 2oo bis 1ooo mg je naoh der Art und Schwere der Infektion und dem Gewicht des zu behandelnden Patienten bzw. Tiers verwendet werden. Lösungen der Verbindung 46,192 in Sesamöl, Erdnußöl und/oder Propylenglykol bei Konzentrationen von 2oo bis 5oo mg/ml können zur subkutanen oder intramuskulären Verabreichung benutzt werden. Die Verbindung kann auch dem *Tier mit dem Futter verabreicht werden, das übliche Futterbeetandteile, wie Mais und

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Sojabohnenmehl, enthält.

Der Effekt von wachstumsfördernden Substanzen in Tierfutter ist im allgemeinen durch direkte Tierfütterung ermittelt worden. Die britische Patentschrift 1 197 826 beschreibt ausführlich eine in vitro-Technik zur Bestimmung einer möglichen wachstumsfördernden Aktivität bei Wiederkäuern, Die Testmethode enthält die Verwendung einer Vorrichtung, mit der die Verdauungsprozesse der Wiederkäuer in vitro durchgeführt und studiert werden. Die Tierfutter, Panseninokulat und verschiedene wachstumsfördernde Substanzen werden unter sorgfältig eingestellten Bedingungen in eine Laboratoriumsanlage eingetragen und unter ebenfalls sorgfältig eingestellten Bedingungen aus der Anlage abgezogen, und stattfindende Änderungen werden kritisch und fortlaufend während des Verbrauchs des Putters durch die mikrobiologische Flora in den Pansenbestandteilen studiert. Eine Zunahme des Propionsäuregehalts in der Pansenflüssigkeit zeigt an, daß eine erwünschte Ansprechbarkeit in bezug auf die gesamte Wirkungsweise bzw. die gesamte Putterausnutzung bei Wiederkäuern durch die wachstumsfordernde Substanz gegeben ist. Die Änderung der Propionsäurekonzentration wird in Prozenten der Propionsäurekonzentration ausgedrückt, die in einer Kontrollpansenflüssigkeit gefunden wird. Längere in vivo-Fütterungsstudien werden benutzt um zu zeigen, daß eine zuverlässige Beziehung zwischen der Zunahme der Propionsäure in der Pansenflüssigkeit und einer verbesserten Putterausnutzung beim Tier besteht.

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j - 18 -

j Pansenflüssigkeit wird von einer mit Fisteln ausgestatteten Kuh

j aufgefangen, die mit einer im Handel erhältlichen Mastration

i und Heu gefüttert wird. Die Pansenflüssigkeit wird sofort durch ein Filtertuch filtriert, und 1o ml werden in einen konischen ¹5o ml-Kolben eingetragen, der 4oo mg Standardsubstrat (68 % Maisstärke + 17 % Cellulose + 15 % extrahiertes Sojabohnenmehl), 1o ml eines pH 6,8-Puffers und die Testverbindung enthält,,

Die Kolben werden für etwa zwei Minuten mit sauerstoffreiem Stickstoff gespült und in einem Schüttelwasserbad bei 39°C für etwa 16 Stunden bebrütet. Alle Tests werden dreifach durchgeführt

Nach dem Bebrüten werden 5 ml der Probe mit 1 ml 25!#iger Metaphosphorsäure vermischt. Nach 1o Minuten wird o,25 ml Ameisensäure zugegeben und das Gemisch bei 15oo rpm für 1o Minuten zentrifugiert. Proben werden dann durch (Jas-flüssig-Ghromatographie nach der Methode von D₀W. Kellog in J. Dairy Science 52» 169o (1969) analysiert. Spitzenwerte für Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure werden für Proben von unbehandelten und behandelten Brutkolben ermittelt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle II angegeben.

	Tabelle II	Propionsäure (%)
Verbindung	Konzentration (ppm)	165 159 163
46,192	2o 1o 5

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- 19 ⁺Unbehandelte Kontrolle = 1oo %,

Unter Zugrundelegung dieser Werte kann erwartet werden, daß eine Verbesserung der Futterverwertung durch. Wiederkäuer, wie Rinder und Schafe, und raonogastrische Tiere, wie Pferde, Schweine und Kaninchen, durch Einarbeiten der Verbindung 46,192 in Tierfutter erzielt wird. Außer der reinen Verbindung 46,192 und der rohen isolierten Verbindung kann die getrocknete Fermentationsbrühe, die die antibiotische Verbindung 46,192 enthält, mit der gewünschten Wirkkonzentration den Futtermassen einverleibt werden.

Beispiel 1

Ein steriles wässriges Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung wird hergestellt:

Bestandteil	pH 7,1-7,2	g/l
Glucose	1o
Stärke	2o
der enzymatisehen Digestion unterworfenes Kasein	VJl
Dikaliumhydrogenphosphat	0,5
Kobaltchlorid	o,oo2
Oalciumcarbonat	4
Fleischmehl	5
Hefeextrakt	VJl

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! - 2o -

Zellen von einer Schrägkultur von S.roseum subsp« incarnatum ATCO 31265 auf ATCC-KuIturmedium 172 werden in eine Reihe von 3oo ml-Kolben übertragen, die jeweils 5o ml dieses Kulturmediums enthalten, und auf einem Drehschüttler für 3 bis 4 Tage bei 26 bis 3o C geschüttelt. Gleiche Teile von diesem gezüchteten Impfstoff werden in 3oo ml-Kolben eingetragen, die jeweils 1oo ml des oben angegebenen sterilen Kulturmediums enthalten. Nach dem Schütteln für 3 bis 4 Tage bei 28 bis 3o°0 werden 5 bis 1o % (Volo/Vol.) des gezüchteten Impfmaterials in einen 4 Liter-Fermentator eingetragen, der zwei Liter des folgenden sterilen Kulturmediums enthält:

!Bestandteil

Glucose	pH	6,9-7,1	2o	ml
Sojamehl		3o	,oo2
Maislaugenflüssigkeit		5
Kobaltchlorid		O

Die Fermentation wird für 7o bis 12o Stunden bei 3o°C unter Rühren bei 17oo rpm und Belüften unter Anwendung eines Volumens Luft je Yolumen Brühe je Minute durchgeführt. Die gesamte Brühe wird mit 1/2 Yolumen Methylisobutylketon nach Einstellung des pH-Werts auf 5,ο mit 5o%iger Säure zweimal extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum konzentriert, und die airtibiotisch wirksame Substanz wird durch Zugabe von mehreren Volumen n-Heptan ausgefällt. Die festen Substanzen werden durch

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Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 kann mit vergleichbaren Ergebnissen unter Verwendung von Streptosporangium roseum subsp. incarnatum ATGC 31266 anstelle von Streptosporangium roseum subsp« incarnatum ATCC 31265 und eines Fermentationsmediums mit der folgenden Zusammensetzung wiederholt werden:

Bestandteil	pH 6,9-7,1	BQ
Glucose	1o
Stärke	2o
Hefeextrakt	5
der enzymatisehen Digestion unterworfenes Kasein	5
Kobaltchlorid	o,oo2
Calciumcarbonat	1

Die gesamte Fermentationsbrühe wird zur Trockne gebracht, vorzugsweise durch Sprühtrocknen.

Beispiel 3

Eine Fermentation im Großmaßstab wird unter Verwendung des Impfstoffs und des Kulturmediums von Beispiel 1 durchgeführt.

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j !

I Ein 189-Liter-I'ermentator, der 95 Liter des Kulturmediums des j

i j

Beispiels 1 enthält, wird nach dem Beimpfen mit 5 % (Vol./Vol.) I Impfstoff von S.roseum subsp. incarnatum 31265 für fünf Tage !

bei 3o°C mit einem Belüftungsgrad von einem Volumen Luft je j

Volumen Brühe je Minute in Betrieb gehalten. 95 Liter der gesamten Fermentationsbrühe werden mit 3o Liter Methylisobutylketon nach Einstellung des pH-Werts der Brühe mit 5o?ö.ger

ί Schwefelsäure auf 5 extrahiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, wobei ein dunkles Öl zurückbleibt. Dieses wird der Reihe nach mit 25o ml Heptan, 5o ml Diäthyläther und dann mit

25 ml Äthylacetat verrieben. Die erhaltene feste Substanz wird i
jdann in Methanol gelöst und durch Abkühlen ausgefällt, wobei 1,77 g eines grauweißen Pulvers erhalten werden. Ein Teil dieses Pulvers (1,5o g) wird in Chloroform gelöst und auf einer Säule chromatogr apliert, die etwa 23o g Silikagel 6o enthält, und dann entwickelt und eluiert mit Chloroform, das zunehmende Mengen Methanol bis herauf zu einem Höchstwert von 3 % Methanol-97 % Chloroform enthält. Bei der Säulenchromatographie erhaltene Fraktionen, die reich an der Verbindung 46,192 sind, werden durch präparative DünnschichtChromatographie unter Verwendung von Silikagel PF054. ^wei"^fcer gereinigt. Das durch Eluieren mit Äthylaoetat erhaltene Material wird aus Methanol umkristallisiert, S. 210-216⁰C.

Die Verbindung 46,192 ist in Chloroform, Äthylaoetat und Methylisobutylketon löslich, in Methanol teilweise löslich und in

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Heptan unlöslich.

Erschöpfende Säurehydrolyse der Verbindung 46,192 zeigt das Vorhandensein von Threonin und mehreren nicht identifizierten Aminosäuren. Das C ⁵ NMR (GDCl₅)-Spektrum zeigt das Vorhandensein von ziemlich 73 Kohlenstoffatomen» Die Analyse ergibt die folgenden mittleren Anteilverhältnisse:

Kohlenstoff 48,49

Wasserstoff 5,o5

Stickstoff 13,o3

Schwefel 1o,88

Sauerstoff (als Rest) 22,55

Die Verbindung 46,192 ist optisch aktiv mit einer Drehung von

Die Ultraviolettabdorptionsmaxima in Äthanol sind wie folgt: max 238 ₁ ■

^_-3oo-3o5_sllnm 80

Das Infrarotspektrum der Verbindung 46,192 ist in der Figur 1 angegeben. Ein Kaliumbromidpellet zeigt charakteristische Absorption in dem Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in Mikron: 2,97, 5,77, 6_fo2, 6,3o, 6,6-6,75, 7,25, 8,25, 9,75 und

Dr. Ve/Wi g g g ₈ "5 q / Q "75g

ee

Claims

1BERLIN33 8MUNCHEN80

Dr. RUSCHKE & PARTNER

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P 9o8

Patentansprüche

■τ-

- 1./Antibiotische Verbindung 46, 192, dadurch gekennzeichnet, j daß sie gebildet worden ist durch Züchten von Streptosporangium roseum subsp. incarnatum Routien ATGC 31265 oder Streptosporangium roseum subsp₀ incarnatum Routien ATGC 31266 unter aeroben Bedingungen unter Wasser in einem wässrigen Nährmediuin, I das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle ent- ; hält, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität erhalten

j worden ist, und Abtrennen des Antibiotikums davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der kristallinen Form einen Schmelzpunkt von 21O-216 C j hat, löslich in Chloroform, Äthylacetat und Methylisobutylketon ist und unlöslich in Heptan ist, Absorptionsmaxima in Äthanol in dem ultravioletten Lichtbereich des Spektrums bei 238 und ί 300-305,.nm hat mit E* -Werten von 35o und 8o, eine mittlere I Sh ι cm

Zusammensetzung von 48,49 ,Gew.-% Kohlenstoff, 5_fo5 Gew.-Ji Wasserstoff, 13,o

3 Gew.-Jo Stickstoff, 1o,88 Gew.-?6 Schwefel

809850/0756

ORIGINAL INSPECTED

und 22,55 Gew.-^ (als Rest) Sauerstoff hat, eine optische

Drehung von C^J _υ= -129 bei einer Konzentration von 1 % in Chloroform hat und bei Pelletieren in KBr eine charakteristische Absorption in dem Infrarotbereich bei den folgenden Wellenlängen in Mikron zeigt: 2,97, 5,77, 6,o2, 6,3o, 6,6-6,75, 7,25, 8,25, 9,75 und 11,2o.

ι 5β Tierfuttermittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Ver-

; bindung nach Anspruch 1 oder 2 und herkömmliche Tierfutter-

bestandteile enthält.

4. Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung durch Wiederkäuer und monogastrisohe Tiere, dadurch gekennzeichnet! daß man den Tieren die antibiotisehe Verbindung 46,192 nach Anspruch 1 oder 2 in einer Konzentration von 5 bis 2o ppm verabreicht»

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die antibiotisehe Verbindung 46,192 in dem getrockneten Fermentationsmedium nach Anspruch 1 enthalten ist.

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