DE2525189C2

DE2525189C2 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin

Info

Publication number: DE2525189C2
Application number: DE2525189A
Authority: DE
Inventors: Malcolm Edward Bergy; John Henry Coats; Vedpal Singh Kalamazoo Mich. Malik
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1974-06-10
Filing date: 1975-06-06
Publication date: 1983-10-27
Also published as: GB1454735A; IE41371B1; FR2273867B1; JPS50157590A; JPS5841840B2; FR2273867A1; HU169145B; NL172257B; CH625830A5; DE2525189A1; NL7506732A; US4271266A; AU8129775A; IE41371L; BE830068A; NL172257C; JPS58216685A

Description

Dietz Im Forschungslabor der Anmelderin studiert und in seinen Eigenschaften beschrieben. Er stellt eine wärmebeständige Streptomyces-Spezles dar, die aus Bodenproben aus Arizona isoliert wurde, und bildet das Antibiotikum. Lincomycin. Die Kulturen dieses Mikroorganismus können leicht von anderen Lincomycin bildenden Mikroorganismen unterschieden werden, wie dies aus den Einzelheiten zu ersehen ist, die in der Tabelle IV zusammengestellt sind. Die Eigenschaft der Wärmebeständigkeit, die unter dem Mikroskop zu beobachtenden langen geraden Sporenketten, die am Ende eingerollt sind, die Sporen mit langen Dornen und Haaren und die deutliche antibiotikum-bildende Fähigkeit des Mikroorganismus Streptomyces veliosus, wurden bisher für keine andere Streptomyces-Spezies beschrieben, welche die blaugraue gefärbte Sporenmasse besitzen, wie sie in den signifikanten und klassifizierenden Streptomyces betreffenden Publikationen von verschiedenen Autoren beschrieben sind.

Daher wird vorgeschlagen, den isolierten und erfindungsgemäß eingesetzten Stamm Streptomyces vellosus NRRL 8037 als »Streptomyces vellosus Dietz, sp. n.« und diese Spezies durch die Arten-Varietät Streptomyces vellosus var. vellosus zu bezeichnen. Die Bezeichnungen der Spezies und der Varietät werden nach den Regeln des International Code of Nomenclature of Bacteria (1966), herausgegeben vom Editorial Board of the Judicial Commission of the International Committee on Nomenclature of Bacteria, Int. J. Syst. Bacterlaol. 16: 459-490, vorgenommen.

Farbeigenschaften dieses Mikroorganismus Streptomyces vellosus Dietz, sp. n.

Beim Wachstum an der Luft Ist der blaugrau bis grau. Melaninpositiv. Die Färbung auf Ektachrom (vgl. A. Dietz In Ann. N. Y. Acad. ScI., Bd. 60 [1954], S. 152-154) wird in der Tabelle I angeführt. Farbeigenschaften zu Vergleichszwecken sind In der Tabelle II zusammengefaßt. Streptomyces vellosus kann in die blaue (B) Farbserle und die weiße (W) Farbserie von Tresner und Backus eingeordnet werden (vgl. H. D. Tresner und E. J. Backus In Applied Mlcroblol., Bd. 11 [1962], S. 335-338).

Unter dem Mikroskop beobachtbare Eigenschaften des

Mikroorganismus:

45

Die Sporenketten sind lang und gerade mit einer festen bis offenen Spirale an Ihrem Ende. Sporenketten-Spirale (S), wie sie von Pridham et al beschrieben wurde (vgl. T. G. Pridham, C. W. Hesseltlne und R. G. Benedict In Applied Mlcroblol., Bd. 6 [1958], S. 62-79). Die Sporen sind groß und In den meisten Fällen oval. Die Sporenoberfläche weist lange Dornen und Haare auf. Die Sporenoberfläche Ist also In der Weise haarig, wie dies von Dietz und Mathews definiert wurde (vgl. A. Dietz und 55 Bennet J. Mathews In Appl. Mlcroblol., Bd. 21 [1971], S. 527-533).

medien von Pridham und Gottlieb (J. Bacteriol., Bd. 56 [1948], S. 107-114) bzw. von Shlrling und Gottlieb (Int. J. of Syst. Bacteriol., Bd. 16 [1966], S. 313-340) verwendete. In dem synthetischen Medium von Pridham und Gottlieb zeigte die Mikroorganlsmenkuitur nur eine Spur eines Wachstums auf dem Kontrollmedium (Grundmedium ohne Zugabe Irgendeiner Kohlenstoff enthaltenden Verbindung) sowie auf einem Medium, das als Kohlenstoffquelle die folgenden Verbindungen enthielt: DuIcIt, D-Sorbit, Natriumoxalat und Natrlumtartrat. Ferner zeigte die Kultur ein mäßiges Wachstum auf Natriumacetat, Natriumzitrat oder Natriumsucclnat und ein gutes Wachstum auf D-Xylose, L-Arablnose, Rhamnose, D-Fructose, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose, Maltose, Saccharose, Lactose, Cellobiose, Raffinose, Dextrin, Inulin, lösliche Stärke, Glycerin, D-Mannit und Inosit. Die Kultur wuchs Oberhaupt nicht auf Sallcln, Phenol, Cresol, Natrlumformiat und Natriumsalicylat.

In dem Medium von Shirllng und Gottlieb wuchs die Kultur leicht auf dem negativen Medium zu Vergleichszwecken (negatives Kontrollmedium), nämlich dem Grundmedium ohne Zugabe irgendeines Kohlenstoff enthaltenden Materials, und ebenso auf dem positiven Medium zu Vergleichszwecken (positives Kontrollmedium), nämlich dem Grundmedium unter Zugabe von D-Glucose. Das Wachstum war gleich wie oder besser als auf dem Grundmedium plus Glucose auf D-Xylose, Inosit, D-Mannlt, Rhamnose oder Raffinose. Das Wachstum war wesentlich besser als auf dem negativen Medium zu Vergleichszwecken, jedoch schlechter als auf dem D-Glucose enthaltenden positiven Verglelchsmedlum auf L-Arabinose, Saccharose oder D-Fructose. Es Ist zweifelhaft, ob ein Wachstum auf Cellulose auftritt.

Temperaturbedingungen bei der Züchtung:

Der Mikroorganismus S. vellosus gehört zur Gruppe der wärmebeständigen Actinomyceten. Er wächst gut bei Temperaturen im Bereich von 18 bis 55⁰C. Das optimale Wachstum erfolgt bei Temperaturen Im Bereich von 28 bis 37°C, und zwar In 10 bis 14 Tagen, und bei 45° C In 48 Stunden.

Eigenschaften des Mikroorganismus bezüglich der Bildung von Antibiotika:

Der Mikroorganismus S. vellosus bildet das Antibiotikum Lincomycin.

Tabelle I

Aussehen des Streptomyces vellosus auf Ektachrome *)

Agar-Medium

Oberfläche

Rückseite

grau

gelblich braun bis braun

Eigenschaften des Mikroorganismus in der Kultur und biochemische Eigenschaften:

Diese Eigenschaften sind In der Tabelle III zusammengestellt.

Vom Mikroorganismus aufgenommene Kohlenstoff enthaltende Materlallen:

Das Wachstum des Mikroorganismus S. vellosus auf verschiedenen Kohlenstoff enthaltenden Materlallen wurde beobachtet, Indem man die synthetischen Nähr-

60

65 Czapek-Saccharose eine Spur grau gelb bis

gelblich braun

Maltose-Trypton - braun

Pepton-Eisen - braun

braun

0,1% Tyrosin
Kasein-Stärke

eine Spur
grau-blau

blau-grau

gelblich braun bis braun

*) vgl. Ann. N. Y. Acad. Sei. 60 (1954): 152-154.

Tabelle Π

Färbeeigenschaften zu Vergleichszwecken des Streptomyces vellosus

Agar-Medium	Bestimmung	Co'or Harmony Manual	3b	-
		3. Ausgabe 1948 ♦)	31e	15ba Blaufärbung
		(g)	15cb trübblau
Bennett's	O	lSba bis Sba Blaufärbung		2fb hambusfarhen lerifirfarhp.n
		bis muschelrosa	2gc bambusfarben, chamois
	R	3gc leicht gelbbraun	-
	P	3ie karamel, Ahornzucker,	19dc wäßrig-grau
		gelbbraun
Czapek-Saccharose	O	3cb sandfarben	2fb bambusfarben, ledergelb,
	R	3ec gelb, hell-beige	strohgelb, weizenfarben
	P	-
Maltose-Trypton	O	Sba muschelrosa
	R	31g ziegelbraun, zimtbraun, hellbraun
	P	3ie karamel, Ahornzucker,
		gelbbraun
Hickey-Tresner	O	15ba bis 3cb blaufarben bis
		sandfarben
	R	31g ziegelbraun, zimtbraun,
		leicht braun
	P	3Ie zimtfarben, gelblich-
		ahornzuckerfarben
Hefeextrakt-	O	lSba bis 2ba Blaufärbung bis
Malzextrakt		perl, muschelfarben
(ISP-2)
	R
	P
Hafermehl	O
(ISP-3)
	R
	P
anorganische Salze,	O
Stärke
(ISP-4)	R

	P
Glycerin-	O
Asparagin
(ISP-5)	R

NBS Zirkular 553 1955 ")

strohfarben, weizenfarben

184 m, sehr blab-blau 189 gm, bläulich-weiß 9 m, weiß mit Stich ins rosa

76 gm, leicht gelblich-braun

76 m, leicht gelblich-braun

77 g, mäßig gelblich-braun

79 gm, leicht gräulich-gelblich

braun 90 gräulich-gelb

9 weiß mit Rosastich

77 gm, mäßig gelblich-braun

76 m, leicht gelblich-braun

77 g, mäßig gelblich-braun

184 m, sehr blaß-blau 189 gm, bläulich-weiß

77 m, maßig gelblich-braun

74 g, stark gelblich-braun 76 m, leicht gelblich-braun

184 m, sehr blaß-blau

189 gm, bläulich-weiß 92 gm, gelblich-weiß

74 g, stark gelblich-braun

76 m, leicht gelblich-braun

74 g, stark gelblich-braun

76 m, leicht gelblich-braun

184 m, sehr blaß-blau

190 g, leicht bläulich-grau

90 gm, gräulich-gelb

149 g, blaß-grün

190 m, leicht bläulich-grau

87 g, mäßig gelb

89 m, blaß-gelb

184 m, sehr blaß-blau

189 gm, bläulich-weiß

87 g, mäßig-gelb

89 m, blaß-gelb

*) Jacobson, E., W. C. Granville, und C. E. Foss. 1948. Color harmony manual, 3. Ausgabe, Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

**) Kelly, K. L., und D. B. Judii. 1955. »The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names.« U.S. Dept. Comm. Circ. 553.

Die in der Spalte »Bestimmung« erscheinenden Abkürzungen bedeuten das Folgende:

O Oberfläche R Rückseite P Pigment Die Abkürzungen in der vorletzten Spalte bedeuten das Folgende:

(g) alle von der glänzenden Oberfläche des Farbgranulates

g glänzende Oberfläche des Farbgranulates

m matte Oberfläche des Farbgranulates

gm glänzende oder matte Oberfläche des Farbgranulates

Tabelle III

Eigenschaften der Kultur und biochemische Eigenschaften von Streptomyces vellosus

Medium	Oberfläche	Rückseite	andere Eigenschaften
	(Wachstum an der Luft)
Agrar-Medien
Pepton-Eisen	kein Wachstum bei 28° C	braun	braunes Pigment
	grau bei 45° C		Melanin-positiv
Calcium-malat	Spur, weiß	farblos	kein Pigment
			Malat nicht löslich gemacht
Glucose-	blaß, rosa bis weiß	creme-farben	gelbes Pigment bei 28° C
Asparagin		bei 28° C	kein Pigment bei 45° C
		olive bei 45° C
entrahmte Milch	Spur, grau bei 28° C	gelb-braun bis braun	gelb-braun bis braunes Pigment
	kein Wachstum bei 45° C		Casein nicht löslich gemacht
Tyrosin	Spur, grau bei 28° C	braun bei 28° C	braunes Pigment bei 28° C
	gut, grau bei 45° C	gelb-braun bei 45° C	gelb-braunes Pigment bei 45° C
			Tyrosin bei 28° C
			nicht löslich gemacht
			Tyrosin unter Wachstum
			bei 45° C löslich gemacht
Xanthin	kein Wachstum bei 28° C	gelb	gelbes Pigment
	rosa bis weiß bei 45° C		Xanthin nicht löslich gemacht
Nährstärke	kein Wachstum bei 28° C	gelb bis gelb-braun	gelbes bis gelb-braunes Pigment
	rosa bis weiß bei 45° C	bei 28° C	bei 28° C
		gelb bei 45° C	gelbes Pigment bei 45° C
			Stärke wird nicht hydrolysiert
HpfppYtrakt-	rosa bis weiß	rnt hi^ ppih-hraiin	int hi« af»lh-hraiinpc Piompnt
Malzextrakt	(am besten bei 45° C)	bei 28° C	bei 28° C
		gelb-braun bei 45° C	gelb-braunes Pigment bei 45° C
Bennett	blaß baumwoll-farben	gelb-braun	gelb-braunes Pigment
	bläulich-weiß
Czapek-Saccharose	blaß creme-farben rosa	gelb	gelbes Pigment
Maltose-Trypton	blaß baumwollfarben,	braun	braunes Pigment
	bläulich-weiß
Hickey-Tresner	blaß baumwollfarben,	orange bis gelb-braun	blaß gelb-braunes Pigment
	bläulich-weiß
Pepton-	keines	braun	braunes Pigment
Hefeextrakt-Eisen			Melanin-positiv
nSP-6)
Tyrosin	rosa bis weiß	braun	braunes Pigment
(ISP-7)			Melanin-Dositiv

Fortsetzung

Medium

Oberfläche
(Wachstum an der Luft)

Rückseite

andere Eigenschaften

Gelatine-Medien

ohne weitere Zusätze -

Nährmedium

Brühen-Medien
synthetisches Nitrat

Nährmedium Nitrat

Lackmusmilch

weiß-graues Luftwachstum
am Oberflächenring

Lincomycin wird durch den neuen Mikroorganismus, der beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, produziert, wenn dieser Mikroorganismus In einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Für die Herstellung von beschränkten Mengen des Antibiotikums können Oberflächenkulturen und Züchtungen in Kolben oder Flaschen angewandt werden. Der Mikroorganismus wird In einem Nährmedium gezüchtet, das ein kohlenstofflieferndes Material, wie z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und ferner ein Stickstoff lieferndes Material, wie z. B. eine assimilierbare Stickstoff enthaltende Verbindung oder ein Protein oder proteinartiges Material enthält. Bevorzugte Kohlenstoff liefernde Materialien sind beispielsweise Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Getreidestärke, Lactose, Dextrin und Melassen.

Bevorzugte Stickstoff liefernde Materialien sind Malsquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, vermahlenes Getreide, vermahlener Mais, Milchfeststoffe, durch Pankreas abgebautes Kasein, bei der Branntwein-Destillation verbleibende Rückstände, tierisches Pepton enthaltende Materialien, Fischmehl, Fleischabfälle und Knochensplitter. Es kann vorteilhaft sein. Kombinationen aus derartigen Kohlenstoff liefernden Materialien und Stickstoff liefernden Materialien einzusetzen.

braunes Pigment
an der Oberfläche
olives Pigment
in der oberen Hälfte
keine Verflüssigung

braunes Pigment
an der Oberfläche
gelb-braunes Pigment
in der gesamten Kultur
keine Verflüssigung 2 Röhrchen

eine Spur Verflüssigung 2 Röhrchen

farbloses vegetatives Wachstum
durch die gesamte Brühe
und am Grund; kein Pigment
Nitrat wird nicht zu Nitrit
reduziert

farbloses kompaktes Wachstum

am Boden

gelbes Pigment

Nitrat wird nicht zu Nitrit

reduziert

braunes Pigment
Lackmus wird bei pH 6,8
reduziert

Spurenmetalle, wie z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Elsen und ähnliche Metalle müssen üblicherweise den Fermentationsmedien nicht zugesetzt werden, denn Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile werden üblicherweise als Komponenten der Zuchtmedien verwendet, und in diesen sind Im allgemeinen bereits die erforderlichen Mengen der Spurenelemente enthalten.
Die Herstellung von Lincomycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann bei einer Temperatur durchgeführt werden, die im Bereich von etwa 18 bis

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liegt. Üblicherweise wird eine optimale Bildung von Lincomycin während eines Zeitraumes von etwa 2 bis 10 Tagen erreicht. Der endgültige pH-Wert ist zum Teil von Puffern, die gegebenenfalls anwesend sind, und zum Teil von dem anfänglichen pH-Wert, der In dem Zuchtmedium angewandt wurde, abhängig.

Wenn die Züchtung In großen Gefäßen und Tanks durchgeführt wird, dann ist es vorzuziehen, für die Impfung dieser Gefäße mit dem Mikroorganismus die vegetative Form des Mikroorganismus einzusetzen und nicht die Sporenform, und zwar deshalb, weil durch die Verwendung der vegetativen Form eine zu lange Verweilzeit bei der Bildung von Lincomycin und damit eine zu wenig intensive Nutzung der Fermentationsvorrichtung verhindert wird. Aus diesem Grund 1st es wünschenswert, ein vegetatives Impfmedium in einer Nährbrühen-

Tabelle IV

Vergleich von Streptomyces vellosus mit anderen Lincomycin produzierenden Mikroorganismen

	S. vellosus	S. lincolnensis	S. espinosus	S. pseudogriseolus	S. variabilis
	NRRL 8037	NRRL 2936	NRRL 3890	chemovar linmyceticus	chemovar Iiniabilis
				NRRL 3985	NRRL 5618
Luftmyzel	blau-grau bis grau	creme-farben bis rosa	grau-grün	grau bis weiß bis rot	grau bis weiß
		bis grau
Melanin	positiv	positiv	negativ	negativ	negativ
Sporenketten	Spirale (S) sehr lang	lang, beweglich (RF)	kurz, gerade bis beweglich	kurz bis mittellang,	kurz bis mittellang
	und an den Spitzen eingerollt		bis zu offenen Spiralen	gerade (RF)	beweglich (RF)
			(RF, RA) - kurz	bis offene Spirale (RA)	bis offene Spirale (RA)
				bis Spirale (S)
Sporen	kugelförmig	rechteckig	kugelförmig	oval bis länglich	oval bis länglich
Sporenoberfläche	lange Dornen und Haare	glatt mit Oberflächendetail	zackig bis dornig	leicht dornig bis glatt	glatt bis schwach
			Übergang zu haarig		warzig bis dornig
			auf manchen Dornen
Calciummalat-	Malat wird nicht	Malat wird nicht	Malat wird nicht	Malat wird nicht	Malat wird löslich gemacht
Agar	löslich gemacht	löslich gemacht	löslich gemacht	löslich gemacht
entrahmte Milch-	Kasein wird nicht	Kasein wird nicht	Kasein wird nicht	Kasein wird unter	Kasein wird löslich gemacht
Agar	löslich gemacht	löslich gemacht	löslich gemacht	Wachstum löslich gemacht
Tyrosin	wird nicht löslich gemacht	wird löslich gemacht	wird löslich gemacht	löslich gemacht	löslich gemacht
Xanthin	wird nicht löslich gemacht	wird um das Wachstums	wird nicht löslich gemacht	lölich gemacht	löslich gemacht
		zentrum löslich gemacht
Nährstärke	Stärke wird nicht	Stärke wird hydrolysiert	Stärke wird hydrolysiert	Stärke wird hydrolysiert	Stärke wird um
	hydrolysiert				die Wachstumszentren
					hydrolysiert

kultur herzustellen, und zwar Indem man diese Brühenkultur mit einem Anteil einer Bodenprobe oder mit einer Schrägkultur beimpft. Wenn man so ein junges aktivvegetatives Impfmedium hergestellt hat, dann wird dieses unter aseptischen Bedingungen In die großen Gärbehälter oder Tanks übergeführt. Das Medium, In dem das vegetative Impfmedium hergestellt wird, kann das gleiche sein wie dasjenige, das zur Erzeugung des Llncomyclns auf dem mikrobiologischen Weg herangezogen wird, oder es kann sich von diesem unterscheiden. Wesentlich 1st, daß In dem Impfmedium ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erzielt wird.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lincomycin kann beispielsweise nach denjenigen Arbeltsverfahren Isoliert werden, die In der US-PS 30 86 912 beschrieben sind.

Bei bevorzugten Isolierverfahren wird das Lincomycin aus dem Zuchtmedium gewonnen, indem man die Myzele und die nicht gelösten Feststoffe nach üblichen Arbeltsverfahren abtrennt, beispielsweise durch Filtration oder durch Zentrifugleren. Das Lincomycin wird dann aus der durchfiltrierten oder zentrlfugierten Brühe gewonnen, Indem man diese Brühe über ein harzartiges Material leitet, das ein nichtionisches macroporöses Copolymeres des Styrols, welches mit Divlnylbenzol vernetzt Ist, enthält. Harzartige Materialien dieser Art, die verwendet werden können, sind In der US-PS 35 15 717 beschrieben. Das Lincomycin wird aus dem Harz unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems elulert, das aus Methanol und Wasser In einem Mischungsverhältnis von 95 Vol. zu 5 Vol. besteht.

Bioaktive Eluatfraktionen werden bei der Elutlon durch eine standardisierte mikrobiologische Plattentestmethode bestimmt, wobei man als Test-Mlkroorganlsmus Sarclna lutea verwendet. Die biologisch aktiven Fraktionen werden dann vereinigt und zu einer wäßrigen Lösung konzentriert, die dann einem Gefriertrocknungsverfahren unterworfen wird. Das gefriergetrocknete Material wird dann mit Methylenchlorld angerleben. Der so gewonnene Methylenchloridextrakt wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand mit Aceton angerleben. Das Flltrat wird dann mit Äther vermischt, wobei man einen Niederschlag erhält, der abgetrennt wird. Das zurückbleibende Filtrat wird dann mit einer In methanolischen Chlorwasserstoffsäure vermischt, um das farblose Llncomycln-Hydrochlorld auszufällen. Dieser Niederschlag wird dann durch Filtrieren isoliert und aus Wasser plus Aceton umkrlstallislert, wobei man das kristalline Lincomycin-Hydrochlorld erhält.

Die Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert, wobei In diesen alle Prozentsätze sich auf das Gewicht beziehen und alle Anteile in Lösungsmitteln sich auf das Volumen beziehen, außer es werden ausdrücklich andere Angaben gemacht.

Beispiel 1
(A) Gärverfahren bei 28° C

Eine Bodenschrägkultur von Streptomyces vellosus NRRL 8037 wurde verwendet, um eine Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben zu beimpfen, die 100 ml eines sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthielten:

Glucose-monohydrat
Baumwollsamenmehl
Leitungswasser
pH-Wert des Mediums
vor der Sterilisation

25 g/l

auf 100 ml

Die Erlenmeyer-Kolben wurden 3 Tage bei 28° C auf einer Rotatlonsschüttelmaschine behandelt.

Das so erhaltene Impfmedium wurde verwendet, um eine Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben zu Fermentationszwecken zu beimpfen, die jeweils 100 ml eines sterilen Mediums mit folgender Zusammensetzung enthielten:

Glucose-monohydrat 15 g/l hydrolyslerte Proteine

tierischen Ursprungs 15 g/l

Hefeextrakt 2,5 g/i

Leitungswasser auf 100 ml

pH-Wert vor der Sterilisation 6,0

Die Kolben wurden mit 5 ml des Impfmediums pro 100 ml des Fermentationsmediums beimpft. Dann wurden die Kolben bei 28° C auf einer Rotatlonsschüttelmaschine bebrütet, die mit 250 Umdrehungen pro Minute und einem Anschlag von 6 cm arbeitete.

Der Kolbeninhalt wurde nach 96 Stunden Gärzelt dem Aufarbeitungsverfahren unterworfen.

(B) Gärverfahren bei 45° C

Das unter (A) beschriebene Impfmedium wurde verwendet, um eine Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Fermentatlonskolben zu beimpfen, die jeweils 100 ml eines sterilen Mediums mit folgender Zusammensetzung enthielten:

*) Peptonmasse in Pulverform, die durch enzymatlschen Abbau von Kasein mittels Pankreas erhalten wurde.

Die Kolben wurden mit 5 ml des Impfmediums pro 100 ml des Fermentationsmediums beimpft. Die Kolben wurden dann bei 45° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bebrütet, die mit einer Umdrehungszahl von 250 Umdrehungen pro Minute und einem Anschlag von 6 cm arbeitete. Der Kolbeninhalt wurde nach 96 Stunden Fermentationszelt der Aufarbeitung unterworfen.

(C) Aufarbeitung der Fermentationsmedien

Das Lincomycin, das In den Züchtungsmedien nach den Stufen (A) und (B) durch Fermentation erzeugt wurde, wurde in reiner Form gewonnen, indem man zunächst die Fermentationsmedien oder Gärbrühe unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtrierte. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen, und die Waschwässer wurden mit dem klaren Filtrat vereinigt. Das klare Material, das durch die Vereinigung des Filtrates mit dem Waschwasser gewonnen wurde, wurde dann über eine Säule geleitet, die mit einem nichtionischen Copolymeren von Styrol und Dlvinylbenzol beschickt war, wobei die Füllung der Säule unter Verwendung von Wasser erfolgte. Das Lincomycin wurde aus dem Harz unter Verwendung von Methanol plus Wasser In einem Vol.-Verhältnis von 95 : 5 eluiert. Die austretenden Fraktionen wurden aufgefangen und durch Dünnschichtchromatographie an Slliziumdloxidgel analysiert, wobei man zur Entwicklung der Dünnschichtplatten ein Lösungsmittelsystem aus Methyläthylketon plus Aceton plus Wasser im Vol.-Verhältnis 186 : 52 : 20 verwendete. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, bis sie wäßriee Fraktionen darstellten, und

Glycerin	30 g/l
Peptonmasse *)	20 g/l
Hefeextrakt	2 g/l
Natriumchlorid	3 g/l
Leitungswasser	auf 100 ml
pH-Wert vor der Sterilisation	7,2

15 16

dann einer Gefriertrocknung unterworfen. Das trockene Material aus, da* durch Filtrieren entfe

Material wurde anschließend mit Metiiylenchlorid ange- das dabei erhaltene Filtrat wurde mit eine

rieben. Der so gewonnene Methylenchloridextrakt wurde sehen Chlorwasserstoffsäure vermischt.

dann bis zur Trockne eingtengt. Der dabei erhaltene comycin-Hydrochlorid in farbloser Form

Abdampiungsrückstand wurde mit Aceton angerieben. 5 durch Filtrieren isoliert. Dieses Material

Das im Aceton unlösliche Material wurde durch Filtra- die kristalline Form umgewandelt, inde

tion entternt und das so gewonnene Filtrat im Äther ver- Wasser plus Aceton umkristallisierte.
misch:. Zu diesem Zeitpunkt fiel wieder unlösliches

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin durch Züchten eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, bis In dem Medium eine wesentliche Antibiotikum-Aktivität durch die Bildung von Lincomycin erreicht 1st, und Isolieren des gebildeten Lincomyclns aus der Garbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Mikroorganismus Streptomyces vellosus NRRL 8037 züchtet.

zelnen Testorganismen In Millimetern angegeben. Dieser Test Ist ein standardisierter mikrobiologischer Plattentesi, der unter Verwendung von Rundfilterpapier von 13 mm Durchmesser durchgeführt wurde:

Tabelle

Die Erfindung betrifft das Im Patentanspruch beschriebene Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin.

Aus der US-PS 30 86 912 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin, das früher als Llncolnensln bezeichnet wurde, durch Züchten des Mikroorganismus S. llncolnensls var. lincolnensis, NRRL 2936, In einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, bis In dem Medium eine wesentliche Antlblotlkum-Aktlvltät durch die Bildung von Lincomycin erreicht 1st, und Isolieren des gebildeten Llncomycins aus der Gärbrühe bekannt. Der Temperaturbereich, bei dem die Züchtung in dem bekannten Verfahren zur Herstellung von Lincomycin vorgenommen wurde, lag im Bereich von 18 bis 40° C und vorzugsweise im Bereich von 26 bis 30° C. Bei dem bekannten Verfahren zur Herstellung von Lincomycin wurde gleichzeitig eine weitere Verbindung (4'-Despropyl-4'-äthylllncomycin) gebildet, die als Lincomycin B bezeichnet wird. Obwohl Lincomycin und Lincomycin B im wesentlichen gegen das gleiche Spektrum von Mikroorganismen wirksam sind, Ist jedoch Lincomycin B bedeutend weniger wirksam gegen diese Mikroorganismen als Lincomycin. Aus diesem Grund stellt das Lincomycin das bevorzugte Antibiotikum der beiden dar.

Bei der Durchführung des bekannten Fermentationsverfahrens war es notwendig, in den meisten der Vorrichtungen eine große Menge an Kühlwasser einzusetzen, um die erwünschte Fermentationstemperatur aufrechtzuerhalten. Außerdem führte die Aufrechterhaltung einer Temperatur Im Bereich von 18 bis 40° C, die für die Herstellung des Antibiotikums notwendig war, zu einer Begünstigung der Entwicklung, Vermehrung und Sprossung von verunreinigenden Mikroorganismen in dem Gärbehälter.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur fermentatlven Herstellung von Lincomycin in erhöhter Ausbeute und ohne gleichzeitige Herstellung von Lincomycin B bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man als Mikroorganismus den Mikroorganismus Streptomyces vellosus NRRL 8037 züchtet.

Das erfindungsgemäße Gärverfahren kann bei einer Temperatur Im Bereich von 18 bis 45° C durchgeführt werden. Dabei zeigte sich In völlig unerwarteter Welse, daß der Titer des Lincomycins, das bei 45⁰C gebildet wird, vergleichbar dem Titer des Llncomycins ist, das bei 28° C gebildet wird.

In der folgenden Tabelle wird anhand der Hemmung von Testorganismen gezeigt, welche Mengen Lincomycin bei 28° C und bei 45° C mit Hilfe des erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismus erhalten werden. In dieser Tabelle sind die Zonengrößen der Hemmung für die ein-

Mikroorganismus 28° C 45° C io Bacillus subtilis 21 18 Staphylococcus aureus 22 24 Sarcina lutea 31 29 Klebsieila pneumoniae 0 0 ¹⁵ Escherichia coli C 0 Salmonella schottmuelleri 0 0 Mycobacterium avium 22 25 PenicilJium oxalicum 0 0

Die Ergebnisse der vorstehenden Tabelle sind völlig unerwartet, da der bekannte Mikroorganismus S. lincolnensis var. llncolnensls, NRRL 2936 kein Lincomycin bildet, wenn er bei einer Temperatur von etwa 45° C gezüchtet wird.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces vellosus NRRL 8037 zur Herstellung von Lincomycin Hegt darin, daß die Kühlung des Gärbehälters weniger kritisch ist, d. h., daß der Gärbehälter eine geringere Kühlkapazität benötigt. Dieser Vorteil fällt vor allem in Gebieten, die ein warmes Klima aufweisen, und auch in Gebieten, In denen die Wasserversorgung beschränkt Ist, da Wasser das übliche Kühlmittel ist, um die Fermentationstemperaturen aufrechtzuerhalten. Ins Gewicht. Ein weiterer bedeutender Vorteil des erflndungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß Lincomycin gebildet wird, ohne daß gleichzeitig eine Erzeugung von Lincomycin B erfolgt.

Die Menge an Lincomycin B, die bei einer üblichen Fermentation unter Verwendung von Streptomyces lincolnensis var. llncolnensls gebildet wird, hängt von der Zusammensetzung des Züchtungsmediums, von der Bebrütungszelt, von der Temperatur, der Belüftung und ähnlichen Bedingungen ab. Unter üblichen Arbeltsbedingungen liegen die Mengen an Lincomycin B, die bei einer derartigen Gärung gebildet werden, Im Bereich von 5 bis 10%, bezogen auf die gesamte Menge an Lincomycin, das anwesend ist. Das Lincomycin B wird durch wiederholte Umkrlstalllslerung des Lincomycln-Produktes unter Verwendung von geeigneten Lösungsmitteln entfernt, beispielsweise unter Verwendung von Mischungen aus Wasser plus Aceton oder Wasser plus einem niederen Alkohol.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch kein Lincomycin B gebildet und deshalb sind derartige Umkrlstallisatlonsverfahren nicht nötig.

Der neue Mikroorganismus, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von LIncomycln angewandt wird, Ist Streptomyces vellosus. Eine Subkultur dieses lebenden Mikroorganismus kann auf Anfrage von der ständigen Sammlung der Northern Regional Research Laboratories, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peorla, 111.,

V. St. A. unter der Hinterlegungsnummer NRRL 8037 erhalten werden.

Der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens herangezogene Mikroorganismus wurde von Alma