DE2418460C2

DE2418460C2 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin

Info

Publication number: DE2418460C2
Application number: DE2418460A
Authority: DE
Inventors: Alexander Demetrios Portage Mich. Argoudelis; Fritz Reusser
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1973-04-23
Filing date: 1974-04-17
Publication date: 1983-05-26
Also published as: DE2418460A1; PL88733B1; GB1428069A; US3833475A; JPS49134896A; FR2226465A1; CH594049A5; HK14281A; FR2226465B1; BE814067A; NL7405377A; HU167540B; JPS5654000B2; SU707527A3; AU6758374A

Description

Tabelle A Lincomycin-Produktion durch S. espinosus-Stämme

(thermodur)

55

Biotyp	Temp.	Tag	pH	Licomycin 60
22,149 a	28⁰C	1	7,7	0
= NRRL 5731		2	8,7	7 65
		3	9,0	9
		4	9,0	23
		5	9,0	38

22,149 a

= NRRL 5731

45° C

10 21,987 a

= NRRL 5729

15

20

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin. Der Patentanspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Wie aus der US-PS 30 86 912 bekannt, kann das Antibiotikum Lincolnensin (Lincomycin) mit Hilfe des Mikroorganismus S. lincolnensis van Iincolnensis, NRRL 2936, bei einer Inkubationstemperatur von 18 bis 40⁰C, und vorzugsweise von 26 bis 30⁰C, produziert werden. Aus der US-PS 36 97 380 ist die fermentative Herstellung von Lincomycin unter Verwendung des Mikroorganismus S. espinosus Dietz, sp. n., NRRL 3890 bekannt Hier beträgt die offenbarte Inkubationstempera ;ur von 18 bis 55° C, wobei das Wachstum bei 18° C, 45°C und 55°C leidlich, bei 24°C gut und bei 28 bis 37°C besonders stark sein soll.

Bei Durchführung der obigen Fermentationen bei den bevorzugten Temperaturen muß man große Mengen Kühlwasser verwenden, um die gewünschte Fermentationstemperatur aufrecht zu erhalten. Die Aufrechter- haltung einer Temperatur zwischen 26 und 36"¹C, die nach den vorsiehenden Verfahren für die Antibiotika-Produktion bevorzugt wird, führt zur Entwicklung und Prolifikation verunreinigender Mikroorganismen im Fermentationsgefäß.

Es wurde nun gefunden, daß die Mikroorganismen S. espinosus NRRL5729,5730 und 5731 bei Inkubationstemperaturen von 44 bis 48° C, und vorzugsweise bei 45°C, wesentlich höhere Lincomycinmengen als bei 28° C produzieren. Ein Vergleich der Fermentationsaus· beuten bei 45 und 28° C für die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen ist aus Tabelle A ersichtlich:

28° C

45° C

22,061 a

= NRRL 5730

28° C

45° C

1 2 3 4 5

1 2 3' 4 5

1 2 3

4 5

1
2
3
4

1 2 3 4 5

8,6 9,2 9,0 8,8 8,8

8,1 8,6 9,0 9,0 9,1

8,3 9,1 8,9 8,7 8,7

7,9 8,7 9,0 9,0 9,0

8,8 9,1 8,9 8,9 8,8

17 24 60 60 110

2 6 2 8 13

10 12 30 36 48

Spuren

5 14 19

Spuren 30 33 54 76

*) Standardtest auf Lincomycin (S. Iutea = Testorganismus, Verd.-PufTer = 0,1 M PO₄, pH 7,0, ATCC 9341, UC 130). Bemerkung:

Sämtliche Fermentationen verwendeten identische Inipfund Fermentationsmedien. Die Medien und sämtliche weitere Fermentationsbedingungen sind aus Beispiel 1 ersichtlich.

Die Ergebnisse von Tabelle A sind im Hinblick auf die bisherigen Kenntnisse über die Produktion von Lincomycin durch S. espinosus überraschend. Es wurde auch gefunden, daß S. lincolnensis var. lincolnensis, NRRL 2936 bei einer Inkubationstemperatur von etwa 45° C kein Lincomycin produziert. Die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Stämme von S. espinosus zur Lincomycin-Produktion bei •'iner Inkubationstemperatur von 44 bis 48° C ist daher völlig unerwartet.

^in Vorteil bei Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von Lincomycin besteht, neben den höheren Fermentationsausbeuten, wie aus Tabelle A ersichtlich, darin, daß weniger Kühlwasser für das Fermentationsgefäß benötigt wird. Der Bedarf an weniger Kühlwasser ist besonders günstig in warmen Klimazonen und in Gebieten mit begrenztem Wasservorrat, da zum Kühlen und Aufrechterhalten der Fermentationstetnperaturen im allgemeinen Wasser verwendet wird.

Die erfindungsgemäß zur Produktion von Lincomycin verwendeten neuen Actinomyceion sind Streptomyces espinosus NRRL 5729, NRRL 5730 und NRRL5731. Ein Stammescharakteristikum dieser Mikroorganismen ist die Produktion von Lincomycin bei einer Inkubationstemperatur von 44 bis 48° C. Eine Subkultur des lebenden Mikroorganismus kann von der permanenten

Sammlung der Northern Regional Research Laboratories, Agricultural Research Services, US, Landwirtschaftsministerium, Peoria, Illinois, USA, bezogen werden,

Farbeigenschaften:

Luftwachstum grau-grün; Melanin-negativ, Aussehen auf Ektachrome (Dietz, A, (1954), »Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classification«, Ann.N.Y.Acad.ScL60: 152-554) ist aus Tabelle 1 ersichtlich. Die Tabellen 2 und 3 geben die Referenz-Farbeigenschaften wieder. Die Kulturen können in der grünen (GN) Farbserie gemäß Tresner und Backus (Tresner, H. D. und E. J. Backus (1963) »System of color wheels for streptomyces taxonomy«, Applied MicrobioL 11: 335—338) untergebracht werden.

Mikroskopische Eigenschaften:

Sporophoren kurz, gerade bis gebogen, bis offenspiralig bis spiralig (RF, RA, S) im Sinn von Pridham et aL(Pridham, T. G, C W. Hesseltine und R. G. Benedict (1958). »A guide for the classification of streptomyces according to selected groups. Placement of strains in morphological sections«, Applied Microbiol.6: 52-79). Die Sporen sind hauptsächlich kugelförmig, zahlreiche zeigen eine deutliche Bindung. Die Sporenoberfläche ist dornig bis stachelig im Sinne von Dietz und Mathews (Dietz, A. und J. Mathews (1971). »Classification of Streptomyces spore surfaces into five groups«, Applied MicrobioL 21: 527-533). Einige Dorne zeigen einen Übergang zu haariger Form. Die Dorne sind reichlich und zeige.-. Markierungen, wenn sie an Sporen beobachtet werden, die mittels der Kohlenstoff-Replikamethode -pn Dietz und Mathews (Dietz, D. und J. Mathews (1962). »Taxonomy by carbon replication. I. An examination of Streptomyces hygroscopicus«, Applied MicrobioL 10:258-263) behandelt wurden.

Kultur- und biochemische Eigenschaften:
Siehe Tabelle 4.

Kohlenstoff-Verwertung:

Das Wachstum der Kulturen auf Kohlenstoffverbindungen wurde im synthetischen Medium von Pridham und Gottlieb (Pridham T. G. und D. Gottlieb (1948) »The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination«, J. Bacterial. 56: 52—79, Tabelle 5) und im synthetischen Medium von Shirling und Gottlieb (Shirling, E. B. und D. Gottlieb (1966), »Methods for characterization of Streptomyces species«, Int. J. Syst Bacteriol. 16:313-340, Tabelle 6) ermittelt.

Temperatur;

Wachstum mäßig bei 18 und 55" C, gut bei 24⁰C, schwer bei 28 bis 37° C Bei 45° C mäßiges (vegetatives) Wachstum in 24 Stunden und schwere (gute) Sporenbildung in 72 Stunden. Es wurden Bennett-, Czapek's Saccharose-, Maltose-Trypton- und Hickey-Tresner-(modifiziert)Medien verwendet

Quelle:

Erde aus Südost-Texas.

Kulturtyp:

Streptomyces espinosus Dietz sp. n, NRRL 3890.

Typenvarietät:

Streptomyces espinosus var. espinosus Dietz NRRL 3890.

Eine im Untersuchungslaboratorium der Anmelderin aus einer Bodenprobe aus Südost-Texas isolierte Actinomyceten-Kultur wurde in der US-PS 36 97 380 als Streptomyces espinosus sp. n. charakterisiert Drei weitere Isolate aus Bodenproben aus Südost-Texas besaßen auf Ektachrome das gleiche Farbverhalten wie die obige Kultur. In vertieften Untersuchungen wurde festgestellt daß die Isolate die gleichen Sporophoren und Sporentypen und die allgemeinen Kultureigenschaften des obigen Kulturtyps besitzen. Besondere Eigenschaften dieser Kulturen sind ihr grau-grünes Luftwachstum, die kurzen Sporophoren mit runden dornigen Sporen, und das wärmeharte (thermodur) Wachstum. Die Kulturen werden nicht als thermophil betrachtet da sie bei Temperaturen von etwa 18° C wachsen, während thermophile gewöhnlich unterhalb 40⁰C nicht wachsen. Die neuen Isolate und der Kulturtyp produzieren Lincomycin bei 45°C. Unterschiede in den Kultureigenschaften (siehe Tabellen) und antagonistischen Eigenschaften beeinflussen nicht die oben erwähnten signifikanten Kriterien und sind nicht ausreichend, um eine Varietätsbezeichnung dieser neuen Isolate zu gewährleisten. Sie werden daher in

Übereinstimmung mit Regel 8, Empfehlung 8a(3) Typ des internationalen Codes der Nomenklatur von Bakterien (International Code of Nomenclature of Bacteria (1966), Herausg. Editorial Board of the Judical Commission of the International Committee on Nomenclature of Bacteria, Intern. J. System. Bacteriol. 16: 459—490) als Biotypen bezeichnet (es wird empfohlen, daß die Bezeichnung Biotyp oder physiologischer Typ für infrasubspezifische Formen verwendet wird, basierend auf Unterschieden in physiologischen oder biochemischen Eigenschaften). Die Isolate werden als Streptomyces espinosus Biotyp 21 987a, Streptomyces espinosus Biotyp 22 061a und Streptomyces espincsus Biotyp 22 149a bezeichnet.

Tabelle 1

Aussehen von Streptomyces espinosus-Kulturen auf Ektachrome

Agar-Medium^a)

NRRL 5729

NRRL 5730

NRRL 5731

Bennett
S
R

Czapek's Saccharose
S
R

grau-grün
blaßgelb-braun

grau-grün
blaß grau

weiß bis graugrün
blaßgelb

grau-grün
blaß grau

grau-grün
blaßgelb-braun

grau-grün
blaß grau

5 Fortsetzung	24 18	460	6
Agar-Medium*)	NRRL 5729	NRRL 5730	NRRL 5731
Maltose-Trypton S R	grau-grün gelb-braun bis oliv	grau-grün gelb	grau-grün gelb-braun
iPepton-Eisen S R	weiß gelb	weiß gelb	weiß gelb-Iederfarben
0,1% Tyrosin S R	farblos rot	farblos rot	grau-grün rot
Casein-Stärke S R	grau-grün blaß grau-grün	grau-grün blaß grau-grün	grau-grün blaß ^ au-grün

^a) S = Oberfläche, R = Unterseite.

	Tabelle 2	von S. espinosus-KuIturen	NRRL	Aufl. 1948(1)")	NBS-Circular	553, 1955 (2)^c)	NRRL
	Referenz-Farbeigenschaften	Color Harmony Manual, 3	5730	NRRL	NRRL	NRRL	5731
J	Agar-MediunV)	NRRL		5731	5729	5730
		5729	a				122 gm
			24Vi ih	24 Vi fe	263 gm	263 gm
	Bennett	a			122 m	122 m
':	S	24'Λ ih			127 g	127 g
i-		Ige	l'/2gC		109 gm		90 gm
.'				2ec	89 gm	102 g	90 gm
		Vh ca		Vhcc	87 g	105 gm	93 m
	R	2fb			89 m
		2ec	-		90 gm
				-
		-	2 ig				110 g
	P			2 ig	llOgm	HOg	112m
	Czapek's-Saccharose	1 Ii	2fe		112m	112m	121 m
	S	2 ig		£ CC	112m	94 g	122 g
		lec			121 m	112gm
	R	2 ig			122 g
			-		HOg
				-	112m
		-	3ba				122 gm
	P		24Vi ih	24¹A fe	122 gm	-
	Maltose-Trypton	24'Λ fe			112m	122 m
	S	1 ih	2 ic		113g	127 g	106 gm
				l'/iie	90 gm	87 gm
		2 gc			109 gm
	R	1 '/2 ge

Fortsetzung

Agar-Medium^J)

Color Harmony Manual. 3. Aufl. 1948 (l)^b)

NRRL NRRL NRRL

5729 5730 5731

NBS-Circular 553, 1955 (2)^c) NRRL 5729

NRRL

5730

NRRL

5731

Hickey-Tresner (modifiziert)	lig
S	2ee
R	-
P
Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt (ISP-2)	24 '/> ih
S	2 ih
	2gc
R	2 ie

3ba

24'/2 ih 2 gc

24V₂ ih

21 e

24V₂ ih

2 gc

247: ih

2gc

109 gm	—	122 m
HOg	127 g	127 g
90 gm	90 gm	90 gm

122 m 12/ g 122 m 113g

90 gm

91 gm 94 g

122 m 12/g

88 gm 94 g

122 m U/g

90 gm

Hafermehl (ISP-2)
S

2 ig 2fe

1 ec 2ec

24'/2fe

2ec

24'/2 ih

2ec 109 gm HOg 94 g 112gm 121 m 90 gm

122 gm

90 gm

122 gm

90 gm

Anorg. Salze-Starke (ISP^l)
S

Glycerin-AsDaragin
(ISP-5)

24'/2 ih 1 ih

2gc 2ec

a
2fe

2gc 2 ge

24'/2 ih

2gc 2ec

3ba 24¹A fe

2 ge

24'Λ ih

2ec 2 ig

2 ge

122 m	122 m	122 m
112m
H3g
90 gm	90 gm	90 gm
90 gm	90 gm	HOg
		112m

2,63 gm	-	-
94 g	122 gm
112gm
90 gm	94 m	94 m
94 m	109 gm	109 gm
109 gm

^a) S = Oberfläche, R = Unterseite, P = Pigment.

^b) Chips von glänzender Oberfläche abgel.

^c) Chip-Oberfläche: m (matt), g (glänzend), gm (glänzend oder matt).

(1) Jacobson, E., W. C. Granviile und C. E. Foss. (1948). Color harmony manual, 3. Aufl. Container Corporation of Amerika, Chicago, liiinois.

(2) Kelly, K. L. und D. B. Judd (1955). »The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names«. US-Dept Comm. Circ 553.

ίο

Tabelle 3	Tabelle 2	(1)	NBS Circular	553,(1955)(2)
Farbcode für	Color Harmony Manual	Farbname
	3. Aufl. (1958)		Farbe	Farbname
Farbe	weiß	Chip
Chip	hell zitronen-grau.	263 gm	weiß
a	gelblich hellgrau	121 m	blaß gelb-grün
1 ec
	zitronen-grau	122 g	glclUlllfl gCIU-glUM
	oliv-grau	109 gm	hell gräulich-oliv
Ige		109 gm	hell gräulich-oliv
Hg	oliv-grau	110g	gräulich oliv
		112m	hell oliv-grau
I ih		113 g	oliv-grau
	hell oliv graubraun	127 g	gräulich olivgrün
	creme	llOgm	gräulich oliv
11 i	biscuit, ecru, hafermehlf.,	89 gm	blaß gelb
1 '/2 ca	sandf.	90 gm	gräulich gelb
1 '/2 ec	staubig gelb	93 m	gelblich grau
		102 g	mäßig grünlich-gelb
1 '/2 gc	hell oliv-grau	105 gm	gräulich/grünlich-gelb
	hell oliv	109 gm	hell gräulich-oliv
Vh ge	olivgrau	196 gm	hell oliv
1 '/2 ie	hell elfenbeinf.-eierschaler.·".	-	-
Γ/2 ig	hell weizen/maisf.	89 gm	blaß gelb
2 ca	biscuit, ecru, hafermehlf.,	86 gm	hellgelb
2ea	sandf.	90 gm	gräulich-gelb
2ec	bambus, lederf., strohf.,
	weizenf.	87 g	mäßig gelb
2fb	gedeckt grau	89 m	blaßgeib
		94 g	hell oliv-braun
2fe	bambus, chamois	122 gm	hell oliv-grau
	gedeckt braun, griege	90 gm	gräulich gelb
2gc		94 m	hell oliv-braun
2 ge	honiggold, hell gold	109 gm	hell gräulich-oliv
	hell senf-braun	87 gm	mäßig gelb
2 ic		91 gm	dunkel gräulich-gelb
2 ie		94 g	hell oliv-braun
	schieferbraun	106 g	hell oliv
		HOg	gräulich-oliv
2 ig		112m	hell oliv-grau

	24	it	-	(I)	18 460	12
		Farbname
Fortsetzung	Color Harmony Manual			553,(1955)(2)
3. AuH. (1958)	dunkel gedeckt grau	NBS Circular
Farbe			Farbname
['; Chip	senf, altgold	Farbe
: ·;. 2 ih		Chip	hell oliv-grau
	perlenf., muschelf.	112m	oliv-grau
H 2 le	beige-grau, mausf.	113g	dunkelgelb
		88 gm	hell oliv-braun
3ba	hell misielgrau	94 g	-
3 ih	mistelgrau	-	oliv-grau
		113g	mittelgrau
24'Λ fe	265 m	gräulich gelbgrün
24'Λ ih	122 gm	gräulich gelbgrün
122 m	gräüiiCn OiiV-grUn
127 g

(1) Jacobson, E., W. C. Granville und C. E. Foss (1948), Color harmony manual, 3. Aufl.. Container Corporation of Amerika, Chicago, Illinois.

(2) Kelly, K. L. und D. B. Judd. (1955). »The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names«. U. S. Dept. Coram. Circ. 553.

Tabelle 4

Kultur- und biochemische Eigenschaften von Streptomyces espinosus-Kulturen

Medium")	NRRL 5729	NRRL 5730	NRRL 5731
Agar
Pepton-Eisen
S	grau-weiß bis grau-grün	Spur grau-grün-weiß	grau-grün-weiß
■ R	gelb	gelb	gelb
; O	Melanin-negativ	Melanin-negativ	Melanin-negativ
., Calciummalat
Crt	Spur grau-grün	Spur grau-grün	Spur grau-grün
13 ^R	blaß grau	blaß grau	blaß grau
i °	Malat wird nicht solubilisiert	Malat wird nicht solubilisiert	Malat wird nicht solubilisiert
■ϊ Glucose-Asparagin
;- S	grau-weiß bis Spur grün	mäßig grau-weiß	mäßig grau-weiß
%	creme	creme	creme
I Magermilch
Crt	weiß am Rand	weiß am Rand	weiß am Rand
	bis grau-grün rosa
R	gelb-lederf.	gelb-lederf.	gelb-lederf.
O	gelb-lederf. Pigment	gelb-lederf. Pigment	gelb-lederf. Pigment
	Casein wird während	Casein wird während	Casein wird während
	Wachstum vollständig	Wachstum solubilisiert	Wachstum solubilisiert
	solubilisiert	'j
Tyrosin
S	gut bis schwer grau-grün	gut grau-grün	gut grau-grün
R	rot-lederf. rotbraun	rot-lederf.	rot-lederf.
O	rot-lederf. bis rotbraun	roMederf- Pigment	rot-lederf. Pigment
	Pigment
	Tyrosin wird solubilisiert	Tyrosin wird solubilisiert	Tyrosin wird solubilisiert

Fortsetzung	13	24 18 460	14
M cdi UTi'')	NRRL 5729	NRRL 5730	NRRL 5731
Xanthin S R 0	gut grau-grün blaßgelb-grün bis creme Xanthin wird nicht solubilisiert	gut grau-grün creme Xanthin wird nicht solubilisiert	gut grr.u-grün creme Xanthin wird nicht solubilisiert
Nährstärke S R O	gut grau-grün creme-oliv Stärke wird hydrolysiert	gut grau-giun cienv-oliv StäiKe wird hydrolysiert	gut grau-grün creme-oliv Stärke wird hydrolysiert
Hefeextrakt- Malzextrakt S R	gut grau-grün creme-gelb-lederf.	gut grau-grün creme-gelb-lederf.	gut grau-grün ei eme-gelb-lederf.
Bennett S R	grau-grün-weiß bis schwer-grau-grün creme bis oliv	Spur gpiu-creme gelb	creme gelb

Czapek s- Saccharose S R	grau-grün grau-grün	grau-grün grau-grün
Maltose- Tiypton S R	gut bis schwer grau-grün oliv bis creme	grau-grün-weiß gelb
Hickey-Tresner (modifiziert) S R	schwer grau-grün creme	grau-grün-weiß tief gelb-lederf.
Pepton-Hefe- extrakt-Eisen (ISP-6) S	blaßrosa bis grau-grün	creme bis blaßrosa
O	Melanin-negativ	Melanin-negativ
Tyrosin (ISP-7) S R O	grau-grün-weiß bis grau-grün blaß gelb-grün bis grau-creme Melanin-negativ	grau-grün grau-creme Melanin-negativ
Gelatine einfach O	farblos veeetatives Wachst	grau-weißes Luftw

bis grau-weißes Luftwachst, Verflüssigung vollständig
Verflüssigung 'h bis vollständig

grau-grün grau-grün

blaß grau-grün gelb-oliv

grau-grün gelb-oliv

creme mit Spur grau-grün bis blaßrosa Melanin-negativ

grau-grün

grau-creme

Melanin-negativ

grau-weißes Luftwachst, Verflüssigung vollständig

Fortsetzung	15	24 18 460 16
Medium³)	NRRL 5729	NRRL 5730 NRRL 5731
Nähr-

Brühe

Synthetisches

Nitrat

Nähr-Nitrat
O

Lackmusmilch
O

weißes bis grau-weißes Luftw., Verflüssigung ¹A bis vollständig

Spur weiß bis rosa-creme Luftwachst, a. Oberfl.haut, Wachst i. ganz:n Medium, Nitrat wird nicht z. Nitrit reduziert

grau-grün-weißes Luftw. a. Oberfl.haut, flockiges Bodenwachst., Nitrat w. nicht z. Nitrit reduziert

rosa-lederf. bis grau-grünes Luftwachst, auf Oberfl.ring; Lackmus wird reduziert; Peptonisierung; pH 7,3

grau-weißes Luftw.,
Verflüssigung vollständig

Spur weißes Luftw.
a. Oberfl.haut, Wachst
i. ganzen Medium, Nitrat
wird nicht z. Nitrit reduziert

grau-grün-weißes Luftw.
p.. Oberfl.haut, flockiges
Bodenwachst., Nitrat w.
nicht z. Nitrit reduziert

lederf. Luftwachst, auf
Oberfl.ring; Lackmus
wird reduziert; Peptonisierung; pH 7,3

Spur grau-weißes Luftw., Verflüssigung vollständig

Spur weißes Luftw. a. OberfLhaut, Spur Wachst i. ganzen Medium, Nitrat wird nicht z. Nitrit reduziert

Spur weißes Luftw. a. Oberfl.haut, kompaktes b. flockiges Bodenwachst, Nitrat w. nicht z. Nitrit reduziert

grün-weißes Luftwachst, auf Oberfl.ring; partielle Reduktion; partielle Peptonisierung; pH 7,1

^a) S = Oberfläche, R = Unterseite. P = Pigment, O = andere Eigenschaften.

Tabelle 5	in ^vnthptisrhpm	35	NRRL NRRL	NRRL	107-114.	NRRL NRRL	Medium
	ill oyi'Liiwwovii&iiJ (D		5729 5730	5731		5729 5730
Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch
Streptomyces espinosus-Kulturen Medium von Pridham und Gottlieb	NRRL NRRL		24. Na-Formiat (-) - (+)	(+)
	5730 5731		25. Na-Oxalat (-H), (-) (H-)	(+)		Vergleich Negatives Grundmedium -,±" ±	NRRL
NRRL		4 U	26. Na-Tartrat (-), - (H-)	(+)		Positives Grundmedium + +	5731
5729			27. Na-Salicylat	-		plus D-Glucose
	(+) (+)		28. Na-Acetat (+) (H-)	(+)	Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch Strep
	+ + -\|- -f.		29. Na-Citrat (H-) +	(+)	tomyces espinosus-Kulturen in synthetischem	₊
Vergleich (-)"		4 5	30. Na-Succinat (-) (H-)	(+)	von Shirling und Gottlieb (1)	+
1. D-Xylose + T I _ArahinnQP -f"	+ +		(1) Pridham. T. G. und D. Gottlieb (1948). »The ι	utilization
	+ +		of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid
J. IxIIaIUIIUbG > 4. D-Fructose (+) + 5. Galactose +	+ +	50	for species determination«, J. Bacteriol. 56: + = gute Verwertung, (-) = zweifelhafte Verwertung,
6. D-Glucose +	+ H-		( + ) = schlechte Verwertung,
7. D-Mannose +	-) (H-) (H-)		= kein Wachstum,
8. Maltose +	+ +		" = Ergebnisse verschiedener Untersuchungen.
9. Saccharose (-), (H	+ +
10. Lactose H-	(+) (+)	55	Tübcllc 6
11. Cellobiose +	_{+ +}
12. RafTinose (-)	(+) (+)
13. Dextrin +	+ +
14. Insulin (-)	+ +
15. iösl. Stärke H-	(+) (+)	IjO
16. Glycerin +	+ +
17. Dulcit (-)
18. D-Mannit +	(+) (+)
19. D-Sorbit (-) 20 Inosit (+) 21. Salicin (+)	_
22. Phenol (-)
23. Krcsol

308 121/79

Fortsetzung

NRRL 5729

NRRL NRRL 5730 5731

Kohlenstoffverbindungen L-Arabinose ±, + ± ± Saccharose ±, — — —

D-Xylose ±,++ ++ ++

Inosit ±,+ ++ ++

D-Mannit ++ ++ ++

D-Fructose ±,+ ++ ++

Rhamnose ++ ++ ++

Rafünose — — —

Cellulose ±, - + +

(1) Shirling, E.B. und D. Gottlieb (1966), »Methods for characterization of Streptomyces species«. Int J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340.

++ starke Verwertung,

+ positive Verwertung,

± Verwertung zweifelhaft,

— negative Verwertung,

" Ergebnisse verschiedener Untersuchungen.

Lincomycin wird durch die erfindungsgemäß vorgesehenen neuen Mikroorganismen produziert, wenn diese in wäßrigem Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Für begrenzte Mengen können selbstverständlich auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Die Organismen werden in einem eine Kohlenstoffquelle, z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, z. B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweißartiges Material enthaltenden Nährmedium gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind z. B. Glucose, Kochzucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melassen und dergl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind z. B. Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, mit Pankreas verdautes Kasein, Rückstände der Alkoholdestillation, tierische Peptonflüssigkeiten, Fischmehl, Fleisch- und Knochenschnitzel und dergl. Auch Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können mit Verteil verwendet werden. Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergl., müssen gewöhnlich nicht zugesetzt werden, da man mit Leitungswasser und ungereinigten Ausganpsmaterialien arbeitet.

Die Herstellung des Lincomycins wird im erfindungsgemäßen Verfahren bei einer Temperatur von 44 bis 48° C und vorzugsweise bei 45° C durchgeführt Gewöhnlich erhält man eine optimale Lincomycin-Produktion innerhalb etwa 2 bis 10 Tagen. Das Medium bleibt gewöhnlich während der Fermentation basisch. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.

Wird das Wachstum in großen Gefäßen und Tanks durchgeführt, so verwendet man vorzugsweise zur Inokulierung die vegetative und nicht die Sporenform des Mikroorganismus, um einen spürbaren Zeitverlust bei der Produktion des Lincomycins, mit gleichzeitiger unwirtschaftlicher Ausnützung der Anlage, zu vermeiden. Es empfiehlt sich daher, das vegetative Inokulum in einer Nährbrühenkultur zu erzeugen, indem man diese Brühenkultur mit einer Probe einer Boden- oder Schrägnährkultur inokuliert Sobald ein junges, aktives vegetatives Inokulum auf diese Weise sichergestellt ist, wird es aseptisch in große Gefäße oder Tanks überführt Das Medium, in dem das vegetative Inokulum produziert wird, kann dem Produktionsmedium gleich oder von diesem verschieden sein, solange nur ein gutes

ίο Wachstum der Mikroorganismen erreicht wird

Das erfindungsgemäß hergestellte Lincomycin kann nach dem Verfahren der US-PS 30 86 912 aufgearbeitet werden. Gemäß einem zweckmäßigen Aufarbeitungsverfah ren werden Mycel und ungelöste Feststoffe in konventioneller Weise abgesondert, z. B. durch Filtrieren und Zentrifugieren. Das Lincomycin wird dann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe erhalten, indem man diese über ein Harz leitet, welches aus einem nichtionischen makroporösen Styrolcopolymer, das mit Dävinyibenzo! vernetzt ist, besteht Harze dieser Art sind aus der US-PS 35 15 717 bekannt Als Beispiel sei das Harz »Amberlite XAD-2« angegeben. Das Lincomycin wird aus dem Harz mit einem Lösungsmittelsystem aus Methanol/Wasser (Volumenverhältnis 95 :5) eluiert Bioaktive Eluatfraktionen werden durch einen Standardplattentest unter Verwendung des Mikroorganismus Sarcina lutea ermittelt Die biologisch aktiven Fraktionen werden dann vereinigt und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, die gefriergetrocknet wird. Das gefriergetrocknete Material wird mit Methylenchlorid verrieben, der Methylenchlorid-Extrakt wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird mit Aceton verrieben. Das Filtrat wird mit Äther vermischt, wobei man einen Niederschlag erhält, der abgetrennt wird. Das restliche Filtrat wird mit 1 n-methanolischem Chlorwasserstoff vermischt, wobei das farblose Lincomycinhydrochlorid ausgefällt wird. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und aus Wasser/Aceton kristallisiert; dabei erhält man das kristalline Lincomycin-hydrochlorid.

Im folgenden Beispiel beziehen sich sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht und sämtliche Lösungsmittelanteile auf Volumenanteile, falls nichts anderes gesagt wird.

Beispiel

Ein Schrägnährboden von Streptomyces espinosus NRRL 5729 wird zur Inokulierung eine: 500 ml-Erlenmeyerkolbens verwendet, der 100 ml steriles Impfmedium folgender Zusammensetzung enthält:

Glucosemonohydrat	25 g/l
Baumwollsamenmehl	25 g/l
Leitungswasser	Rest
Vorsterilisierung	pH = U

Die Kolben werden 3 Tage auf einer Schüttelmaschine bei 28°C gehalten.

Das obige Impfinokulum wird zur Inokulierung einer Reihe von 500 ml Ei lenmeyerkolben verwendet, die jeweils 100 ml steriles Medium folgender Zusammensetzung enthalten:

*Sojabohnenmehl)**	35 g/l
Magermilch	10 g/l
Czapek-Dox-Brühe	10 g/l
CaCO₃	3 g/l

Folyalkylenglycr« als
flussiger Entschäumer
Vorsterilisiening
*) Feingemahlenes, einer
SojabohnenmehL

20mI/l
pH =7,2
Fettextraktion unterworfenes

10

15

Jeder Kolben wird mit 5 ml des Impfinokulums pro 100 ml Fermentationsmedium inokuliert Einige Kolben werden bei 28° C, andere bei 45° C auf einer rotierenden Schottelmaschine mit 250 Umdrehungen pro Minute und einer Exzentrizität von 6,3 cm inkubiert

Das am Beispiel von S. espinosus NRRL 5729 beschriebene Verfahren wird mit NRRL 5730 und 5731 wiederholt Die Ergebnisse dieser Fermentationen sind aus der vorstehenden Tabelle A ersichtlich.

Mögliche Aufarbeitung der Fermentationsbrühe

Die auf obige Weise erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (etwa 41) wird unter Verwendung von Diatomeen-Erde a5s Filterhilfsmittel filtriert Der Filterkuchen wird mit 1 Liter Wasser gewaschen und die wäßrige Waschlösung wird mit dem Filtrat vereinigt Die resultierende Lösung wird als »klare Brühe« zur Seite gestellt Der Filterkuchen wird zweimal mit je 700 ml Methanol verrieben, der Methanolextrakt wird als »MEOH-Extrakt« zur Seite gestellt Die klare Brühe wird dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/ Min. durch eine Säule geleitet, die 250 ml Ionenaustauscher enthält Die austretende Brühe wird als eine Fraktion (verbraucht) zur Seite gestellt Dann wird die Säule mit 500 ml Wasser gewaschen, die wäßrige Waschlösung wird als eine Fraktion aufbewahrt Sodann wird die Säule mit 95%igem -väßrigem Methanol eluiert, wobei 20 ml-Fraktionen aurgefa/ ^en werden. Die Ergebnisse (Test gegen S. lutea) lauteten wie folgt:

	Zone (mm)
klare Brühe	38
»Verbraucht«	19
Waschlösung	20
Fraktion Nr.
2	16
4	14

Fraktion Nr,	14,5
5	36
6	49
7	51
8	52
9	51
10	47
12	43
14	40
16	37
19	34
20	35
25	29
30	30
35	27
40	26
45	24
50	28
55	24
60	19
65	11
70	—
75	11,5
80	Spuren
85	Spuren
90	0
95	10
100

Die Fraktionen 6 bis 60 werden vereinigt, die Lösung wird zur Trockene eingeengt, wobei man 3,5 g eines Lincomycinpräparates mit 310 meg Lincomycin/mg erhält Dieses Material wird mit Methylenchlorid verrieben, der Methylenchloridextrakt wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird mit Aceton verrieben. Das Filtrat wird mit Äther vermischt, wobei ein Niederschlag entsteht, der abgetrennt wird. Das restliche Filtrat wird mit 1 n-methanolisclvai Chlorwasserstoff vermischt, wobei farbloses Lincomycinhydrochlorid ausfällt Dieser Niederschlag wird abfiltriert und aus Wasser/Aceton kristallisiert, wobei kristallines Lincomycin-hydrochlorid erhalten wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Lincomycin durch aerobes Züchten von Streptomyces espinosus bei einer Inkubationstemperatur von 44 bis 48° C in einem wäßrigen Nährmedium, bis das Medium durch Lincomycinproduktion eine wesentliche antibiotische Wirksamkeit erhalten hat, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme Streptomyces espinosus NRRL 5729, 5730 oder 5731 züchtet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei 45° C durchführt Biolyp

Temp. Tag pH

Licomycin μg/ml♦)