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Verfahren zur. Herstellung einer neuen antibakteriellen Verbindung
Desideus Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
neuen, Desideus genannten Verbindung.
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Desideus ist ein biosynthetisches, aus einem Desideus erzeugenden
Actinomycet erhaltenes Produkt. Es ist eine neutrale Verbindung, die die Eigenschaft
hat, das Wachstum gewisser Organismen, besonders von Bakterien, z. B. Bacillus subtilis,
Bacillus cereus und Streptococcus lactis, und Tumorzellen, zu stören oder zu behindern.
D,esideus kann allein oder gemeinsam mit anderen antibakteriellen Mitteln oder Antitumorstoffen
verwendet werden, um das Wachstum dieser Organismen oder Zellen zu verhindern oder
ihre Zahl zu verringern.
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Das zur Herstellung von Desideus erfindungsgemäß verwendete Actinomycet
wurde als Streptomyces griseus var. desideus bezeichnet. Eine seiner Haupteigenschaften
ist die Erzeugung von Desideus. Eine Sekundärkultur von ihm kann aus der Sammlung
der Northern Utilization and Research Division Agricultural Research Service, US.
Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA., unter der Nr. NRRL 2971 bezogen
werden.
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Streptomyces griseus var. desideus zeigt ein gelblichgraues Luft-Wachstum
und eine gelblichgraue oder leicht bis mäßig olivfarbene Unterseite auf den meisten
Nährmitteln. Im Lichtmikroskop ist zu erkennen, daß dieser Organismus gerade bis
gebogene Sporenketten besitzt, während das Elektronenmikroskop zeigt, daß die Oberfläche
der Sporen glatt ist. Seine Wachstumscharakteristik auf biologischen Normalnährmitteln
und sein Kohlenstoffassimilationsbild sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt.
| Tabelle I |
| Aussehen auf Ektachrome* |
| Agar-Nährmittel Oberfläche Rückseite |
| 1. Bennetscher Nährboden ............... Graurosa Gelbbraun |
| 2. Czapeksche Sukrose .................. Weiß farblos |
| 3. Maltosetrypton ...................... Graurosa Bräunlich |
| 4. Peptoneisen .......................... farblos farblos |
| 5. 0,10/, Tyrosin . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . Spuren |
| Graurosa Rotbraun |
| 6. Kaseinstärke ......................... Graurosa Graurosa |
| * Vergleiche A. D i e t z, Ektachrome transparencies as aids
in actinomycete classification, Annals of the N.Y. Academy |
| of Science, 60, S. 152 bis 154, 1954. |
| Tabelle 11 |
| Assimilation von Kohlenstoffverbindungen im synthetischen Nährmittel* |
| Vergleichsversuch . . . . . . . . . . .... . . . . . (-) Lösliche
Stärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . + |
| d-Xylose ........................... - Glycerin ........................ |
| 1-Arabinose ........................ () Dulcitol ...........................
(-) |
| Rhamnose.......................... (-) d-Mannitol .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ('-) |
| d-Fruktose ......................... (-@-) d-Sorbitol .........................
(-@) |
| d-Galaktose ........................(-f-) Inositol............................
(-) |
| ( ) |
| d-Glukose ......................... + Salicin ................
. ........... |
| d-Mannose ........................ + Na-Formiat ........................
(-) |
| Maltose ........................... Na-Oxalat .........................
- |
| Sukrose ........................... (-) Na-Tartrat .........................
(-) |
| Laktose ........................... (-) Na-Salicylat........................
- |
| Cellobiose ......................... + Na-Acetat .........................
+ |
| Raffinose........................... (-) Na-Zitrat ..........................
+. |
| Dextrin ............................ + Na-Succinat ........................
-, |
| Inulin................ .............. (-) |
| - Positive Assimilation. (-) Geringes Wachstum -keine Assimilation. |
| - Negative Assimilation. (=-) Positive Assimilation - nur geringes
Wachstum. |
| * Vergleiche T. G. P r i d h a m, und D. G o t t 1 i e b, #Assimilation
of Carbon Compounds in Synthetic Medium<, |
| J. Bact., 56, S. 107 bis 114, 1948. |
| Tabelle 111 |
| Wachstumscharakteristik |
| Nährmittel Luftwachstum Vegetatives Sonstige |
| Wachstum Beobachtungen |
| Reine Gelatine Spuren Weiß farblos Vollständige Verflüssigung |
| Nährgelatine Spuren Weiß farblos Vollständige Verflüssigung |
| Nitratnährbrühe Cremefarben Gelb Ringförmige Oberfläche, gelbes
Pig- |
| ment, keine Reduktion |
| Synthetische Nitratbrühe Cremefarben grünliche Hautbildung
auf der Oberfläche. |
| Tönung Spuren eines gelben Pigments. Keine |
| Reduktion |
| Lackmusmilch Spuren Cremefarben Blau Ringförmige Oberfläche,
Peptoni- |
| sierung pH-Wert 7,8 |
| Pepton-Eisen-Agar Hellrosa Gelbbraun Keine HZS-Dunkelung |
| Calcium -Malat-Agar Cremefarben Cremefarben Malat löslich geworden |
| Magermilch-Agar Spuren Rosa Gelbbraun Gelbbraunes Pigment,
Kasein hydroly- |
| siert |
| Glukose-Asparagin-Agar Cremerosa Cremefarben Keine |
| Kaseinstärke-Agar Cremefarben Cremerosa Stärke hydrolysiert |
| Nährstärke-Agar Cremefarben Gelb Stärke hydrolysiert |
| Tyrosin-Agar Cremefarben Gelbbraun Gelbbraunes Pigment, Tyrosin
löslich |
| geworden |
| Xanthin-Agar Cremefarben Gelb Xanthin teilweise löslich geworden |
| Maltose-trypton-Agar Olivgrau Olivbraun Gelbbraunes Pigment |
| Bennetscher-Agar Olivgrau Oliv Keine |
| Czapekscher Sukrose-Agar Olivgrau Cremefarben Keine |
Die neue erfindungsgemäße Verbindung wird dadurch erhalten, daß das genannte Actinomycet
in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird.
Zur Herstellung kleinerer Mengen können auch Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet
werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle,
z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, z. B. eine assimilierbare
Stickstoffverbindung oder einen proteinhaltigen Stoff, enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen
sind z. B. Glukose, brauner Zucker, Sukrose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose,
Dextrin und Melasse. Bevorzugte Stickstoffquellen sind z. B. Maisquellwasser, Hefe,
autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl,
Milchfeststoffe, pankreatische Kaseinprodukte, lösliche Brennereirückstände, tierische
Peptonflüssigkeiten und Fleisch- und Knochenstückchen. Vorteilhaft ist auch die
Verwendung einer Kombination aus Kohlenstoff
und Stickstoffquellen.
Spurenmetalle, wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen u. dgl., brauchen den
Gärmedia nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und nicht gereinigte Ingredienzien
als Bestandteile der Media verwendet werden.
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Die Herstellung der neuen Verbindung kann bei jeder Temperatur durchgeführt
werden, die ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus bewirkt, z. B.
bei Temperaturen von etwa 18 bis 40°C, vorzugsweise etwa 26 bis 30°C. Gewöhnlich
dauert die optimale Herstellung der Verbindung etwa 2 bis 10 Tage. Während der Gärung
bleibt daS Nährmittel ziemlich neutral oder wird leicht alkalisch. Der pH-Endwert
hängt teilweise von den gegebenenfalls anwesenden Puffermitteln und teilweise von
dem ursprünglichen pH-Wert des Nährmittels ab, der vor der Sterilisierung zweckmäßig
auf einen pH-Wert von etwa 6 bis 8 eingestellt wird.
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Wird die Kultur in großen Gefäßen und Tanks durchgeführt, so wird
vorzugsweise die vegetative Form und nicht die Sporenform des Mikroorganismus zum
Impfen verwendet, um eine wesentliche Verzögerung in der Bildung der neuen Verbindung
und eine damit verbundene unwirksame Nutzung der Anlage zu vermeiden. Es wird daher
zweckmäßig ein vegetativer Impfstoff in einer Nährbrühenkultur hergestellt, indem
man diese mit einem Teil einer Boden-oder Schrägnährbodenkultur impft. Wenn derart
ein junger, aktiver, vegetativer Impfstoff sichergestellt ist, wird dieser unter
aseptischen Bedingungen in die großen Gefäße oder Tanks gebracht. Das Nährmittel,
in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wird, kann das gleiche sein oder auch ein
anderes als jenes, das zur Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird, vorausgesetzt,
daß es ein gutes Wachstum des Mikroorganismus bewirkt.
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Die neue Verbindung ist löslich in polaren organischen Lösungsmitteln,
die mit Wasser nicht mischbar sind, z. B. in Äthylacetat, Amylacetat, Butylacetat
und ähnlichen aliphatischen Estern, 1-Butanol, 2-Butanol und ähnlichen aliphatischen
Alkoholen; Methyläthylketon, Methyl-iso-butylketon und ähnlichen Alkanonen; Chloroform,
Methylenchlorid und ähnlichen halogenierten Kohlenwasserstoffen. Sie ist auch löslich
in wassermischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol und ähnlichen
Alkoholen; und Kohlenwasserstoffen, wie Benzol und Toluol. Die neue Verbindung ist
in Wasser verhältnismäßig unlöslich.
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Zur Isolierung und Reinigung von Desideus können die verschiedensten
Verfahren angewendet werden, z. B. die Lösungsmittelextraktion, die Flüssigkeit-Flüssigkeits-Verteilung
in einer Craigschen Apparatur, die Verwendung von Adsorptionsmitteln und die Umkristallisation
aus Lösungsmitteln. Nach einem bevorzugten Verfahren wird Desideus aus seinem Kulturmedium
derart gewonnen, daß man das Mycel von Filtrat trennt, das Mycel dann mit einem
wassermischbaren organischen Lösungsmittel für Desideus extrahiert und den Stoff
darauf durch fraktionelle Flüssigkeit-Flüssigkeits-Extraktion in einem Craigschen
Gegenstromverteilungsapparat reinigt, wobei als Lösungsmittelsystem z. B. ein Gemisch
aus Skellysolve B (isomere Hexane), Aceton und Puffermittel (pH-Wert 7,5) im Verhältnis
von 175: 400: 75 Teilen verwendet wird.
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Eine weitere Reinigung zur Entfernung anwesender organischer Säuren
kann durch die Verwendung stark basischer Anionenaustauscherharze erfolgen. Hierfür
geeignete Anionenaustauscherharze werden erhalten, wenn man nach dem Verfahren,
das K u n i n in »Ion Exchange Resins«, 2. Auflage, 1958, John Wiley and Sons, Inc.,
S. 88 und 97, beschreibt, Polystyrol, das gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetzt
ist und nach dem von K u n i n (a. a. O., S. 84) beschriebenen Verfahren hergestellt
ist, chlormethyliert und nach dem von K u n i n (a. a. O., S. 97) beschriebenen
Verfahren mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin quaternisiert. Anionenaustauscherharze
dieser Art sind unter der Handelsbezeichnung »Dowex 2«, »Dowex 2-X8«, »Dowex 8«,
»Amberlite IRS-400«, »Duolite A-102« und »Permutit S-1 «bekannt.
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Nach einem bevorzugten Verfahren zur Gewinnung der neuen Verbindung
wird die gesamte Gärlösung, falls erforderlich, auf einen nahezu neutralen oder
einen etwas darunter liegenden pH-Wert eingestellt und filtriert. Hierbei kann eine
Filterhilfe, z. B. Diatomit, verwendet werden. Die geklärte Gärlösung wird verworfen,
und der gewaschene Mycelkuchen wird mit einem wesentlich wassermischbaren organischen
Lösungsmittel, z. B. Methanol, behandelt, um den Desideusstoff daraus zu extrahieren.
Das flüchtige Lösungsmittel wird im Vakuum vom Extrakt entfernt, und der wäßrige
Rückstand wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel,
z. B. n-Hexan, Toluol und Äthylacetat, extrahiert. Der Extrakt .wird durch eine
chromatographische Säule geleitet, z. B. eine »Florisil«-Säule (ein Gemisch aus
Magnesium und Natriumtrisilikat), wobei der antibiotische Stoff adsorbiert wird.
Die Säule kann mit Kombinationen von Lösungsmittelgemischen entwickelt werden, z.
B. n-Hexan : Aceton, Aceton: Methanol und Methanol. Die der Säule entnommenen Fraktionen
werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein Rückstand entsteht,
der darauf mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid,
verrührt und dann gefiltert wird. Die Filtrate werden vereinigt und mit einer Filtrierhilfe,
z. B. Diatomeenerde, gefiltert und darauf im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der
Rückstand wird in einem gleichen Volumen eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels,
z. B. n-Hexan, gelöst, und die Lösung wird bei niederen Temperaturen, z. B. -10
bis -20°C, kaltgestellt, bis sich Kristalle bilden. Nach beendeter Kristallisation
können die Kristalle mit einer geringen Menge n-Hexan bei niederer Temperatur gewaschen
und an der Luft getrocknet werden.
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Wie die nachfolgende Tabelle IV zeigt, besitzt die neue Verbindung
Desideus ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum.
| Tabelle IV |
| Antibakterielle Wirksamkeit von Desideus |
| bei Versuchen mit Agarböden |
| Versuchsorganismus erreich |
| in mm |
| Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 |
| Bacillus cereus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 |
| Sarcina lutea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 |
| Staphylococcus aureus ............. 11 |
| Streptococcus faecalis . . . . . . . . . . . . . . 10 |
| Streptococcuslactis ................ 11 |
| Mycobacterium phlei . . . . . . . . . . . . . . . 14 |
| Lactobacillus casei . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 |
Die neue Verbindung ist wirksam gegen den Bacillus subtilis und
kann zur Behandlung der Brutstätten der Seidenraupen verwendet werden, um durch
diesen Organismus verursachte Infektionen zu verhindern oder zu verringern. Sie
kann auch dazu verwendet werden, um den durch diesen Organismus bei Fischen und
Fischkisten hervorgerufenen Geruch zu verringern oder zu verhüten. Ferner kann die
neue Verbindung als Desinfektionsmittel für verschiedene zahnmedizinische und medizinische
Geräte, die mit dem Staphylococcus aureus verunreinigt sind, verwendet werden; sie
kann auch als Desinfektionsmittel für gewaschene und gestapelte Eßgeräte verwendet
werden, die mit diesem Organismus und dem Streptococcus faecalis verunreinigt sind.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren,
ohne es einzuschränken. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich alle Prozentsätze
auf das Gewicht und alle Mengenangaben bei den Lösungsmittelgemischen auf das Volumen.
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Beispiel l A. Gärung Ein Bodenstamm des Streptomyces griseus var.
desideus (NRRL 2971) wurde zum Impfen einer Reihe von 500 ccm fassenden Erlenmeyerkolben
verwendet, die jeweils 100 ccm eines sterilen Nährmittels der folgenden Zusammensetzung
enthielten: Glukosemonohydrat ............... 28 g Gemahlenes Baumwollsamenmehl
.. .. 40 g Leitungswasser, aufgefüllt zu. . . . . . . . . 1 1 Den Impfstoff ließ
man 3 Tage bei 28'C auf einer Gumpschen Rotierschüttelvorrichtung bei 250 U/min
wachsen.
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Einer dieser geschüttelten Kolben mit 100 ccm Impfstoff wurde zum
Impfen eines 401 fassenden Tanks verwendet, der 201 eines sterilen Nährmittels folgender
Zusammensetzung enthielt: Glukosemonohydrat ......... 10 g/1 Pharmamedia* . . .
. . . . . . . . . . 2 g/1 Maisquellwasser. . . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Wilsonsche
Pepton-Flüssigkeit Nr. 159** . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Specköl ....................
2 ccm/1 Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . restliche Menge * Pharmamedia
ist ein technisches Baumwollsamenmehl das von der Traders Oil Mill Co., Fort Worth,
Texas hergestellt wird.
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** Wilsonsche Pepton-Flüssigkeit Nr. 159 ist ein Präparat aus hydrolysierten
Proteinen tierischen Ursprungs.
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Der pH-Wert des Nährmittels im Tank lag vor der Sterilisierung bei
7,2. Das Wachstum im Tank erfolgte 24 Stunden bei einer Temperatur von 28'C und
einer Belüftung mit 10 Normalliter je Minute unter Rührung mit 400 U/min.
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12,51 des Tankinhalts wurden dann zum Impfen eines 3801 fassenden
Gärtanks verwendet, der 2501 eines sterilen Nährmittels folgender Zusammensetzung
enthielt: Glukosemonohydrat ......... 20 g/I Hefe ........................ 2,5 g/1
Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . 3 g/1 Calciumkarbonat . . . . . . . .
. . . . 4 g/1 Ammoniumsulfat............. 5 g/1 Kaysoy* .......... . .........
10 g/1 Specköl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 ccm/1 Leitungswasser .
. . . . . . . . . . . . . restliche Menge * Kaysoy ist ein Fett extrahiertes, feingemahlenes
Sojabohnenmehl. Der pH-Wert des Gärtank-Nährmittels lag vor der Sterilisation bei
6,4. Der Gärzyklus betrug 4 Tage. Während dieser Zeit wurde die Temperatur auf 28'C
gehalten, gefilterte Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 100 Normalliter je
Minute zugeführt, und das Rührwerk lief mit einer Geschwindigkeit von 280 U/min.
Von Zeit zu Zeit wurde steriles Specköl zugefügt, um die Schaumbildung während der
gesamten Vergärung zu regeln.
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B. Extraktion Die beschriebene Vergärung wurde in zwei Parallelansätzen
durchgeführt. Darauf wurde die gesamte Brühe aus beiden Gärtanks vereinigt, mit
4°/oiger Diatomeenerde aufgeschlämmt und filtriert. Die gefilterte Lösung wurde
verworfen. Der Mycelkuchen wurde viermal mit Methanol extrahiert und die Extrakte
im Vakuum zu einem wäßrigen Konzentrat (201) eingeengt. Darauf wurde das wäßrige
Konzentrat zweimal mit 1/4 Volumen Skellysolve B (im wesentlichen n-Hexan, Siedepunkt
60 bis 68'C), viermal mit '/,Volumen Toluol und zweimal mit 1/4 Volumen Äthylacetat
extrahiert. Diese organischen Extrakte wurden jeder für sich zu einem Öl eingeengt,
und das zurückbleibende wäßrige Konzentrat wurde einer Gefriertrocknung unterworfen.
Diese Lösungsmittelextraktionen ergaben die folgenden Produktmengen
| Produkt |
| Herkunft Gewicht |
| 1 Skellysolve-B-Extraktion 323,4 g |
| 2 Toluolextraktion 179,8 g |
| 3 Äthylacetatextraktion 78,9 g |
| 4 Wäßriges Konzentrat, getrocknet 855 g |
C. Reinigung Das Produkt 1 (323,4 g) enthielt den Hauptteil des aktiven Stoffs und
wurde in folgender Weise gereinigt. 10 g des Produkts wurden in dem 1000 Röhrchen
enthaltenden Craigschen Gegenstromapparat (CCD) verteilt, wobei ein Lösungsmittelgemisch
aus Skellysolve B, Aceton und Triäthylamin-Puffermittel (pH-Wert 7,5) im Mengenverhältnis
von 175: 400: 75 verwendet wurde. Nach 1500 Durchgängen wurden die wäßrigen und
organischen Phasen abgetrennt. Darauf wurden die Fraktionen der Phasen gesammelt
und zur Trockne eingedampft. Folgende Feststoff
Behalte und Probenwerte
wurden bei diesen Fraktionen
festgestellt
| Feststoff- Probe- |
| Fraktionen Durchgänge Behalt KBU/mg* |
| g |
| 1 a (wäßrig) 1130 bis 1360 3,27 238 |
| 1 b (Lösungs- 1130 bis 1360 0,55 172 |
| mittel) |
| 2a (wäßrig) 1360 bis 1460 1,81 27 |
| 2b (Lösungs- 1360 bis 1460 0,17 152 |
| mittel) |
| * Diese Gewebewachstumsprobe ist ein Maß für die Ver- |
| hütung einer Proteinsynthese in einem Gewebewachstum |
| bei Verwendung von KB-Zellen. |
| KBU/Stoffeinheit = die Verdünnung von 1 Stoffeinheit, |
| (mg oder ccm) die eine 500 @ige Verhütung einer |
| Proteinsynthese |
| 1000 |
| bewirkt. |
1 g der Fraktion 1 a wurde in 10 ccm Methanol gelöst und durch eine Säule geleitet,
die 30 g eines nach der USA.-Patentschrift
2 591 573 hergestellten Anionenaustauscherharzes
enthielt, das aus mit 8 °/0 Divinylbenzol, vernetztem Polystyrol und Dimethyläthanolbenzylammonium
erhalten war und eine Teilchengröße hatte, die ein deutsches Prüfsieb Nr.20-40 passierte.
Die Säule wurde auf folgende Weise hergestellt. 30 g des Anionenaustauscherharzes
wurden in Methanol aufgeschlämmt und in eine 50-ccm-Bürette gegeben. Das Substrat
wurde dann in den oberen Teil der Säule gebracht, und die Säule wurde mit 75 ccm
Methanol entwickelt. Das Methanol wurde eingeengt, wobei 0,34 g eines hellbraunen
viskosen Stoffes zurückblieben. Dieser Stoff wurde in 0,35 ccm Skellysolve B gelöst
und gekühlt. Die dabei entstehenden Kristalle des antibiotischen Desideus wurden
mit 0,5 ccm kaltem Skellysolve B gewaschen und getrocknet, wobei 0,16 g Substanz
(Ansatz PFW-109,1) mit einem Schmelzpunkt von etwa 47°C und einer Wirksamkeit von
4,75 B.-subtiles-Einheiten je Milligramm gewonnen wurden.
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Unter Verwendung einer Florisilsäule wurden weitere Desideuskristalle
gewonnen. 450 g Florisil wurden in Skellysolve B aufgeschlämmt und in eine Glassäule
mit einer lichten Weite von 5,1 cm gefüllt. 15 g des im Teil B genannten Produktes
1 wurden in Methylenchlorid gelöst und in die Säule gegeben. Die Säule wurde mit
jeweils etwa 500 ccm der folgenden Lösungsmittelkombinationen eluiert:
| Fraktion Nr. Zugefügtes Lösungsmittel Eluat ( Gewicht |
| 1 Skellysolve B (SSB) SSB - |
| 2 SSB-Aceton (8: 2) SSB - |
| 3 SSB-Aceton (6: 4) SSB-Aceton (8: 2) 6,82 g |
| 4 SSB-Aceton (4: 6) SSB-Aceton (6: 4) 0,37 g |
| 5 SSB-Aceton (2: 8) SSB-Aceton (4: 6) - |
| 6 Aceton SSB-Aceton (2: 8) - |
| 7 Aceton-Methanol (8: 2) Aceton - |
| 8 Aceton-Methanol (6: 4) Aceton-Methanol (8:
2) 0,52 g |
| 9 Aceton-Methanol (4: 6) Aceton-Methanol (6: 4) 0,52
g |
| 10 Aceton-Methanol (2: 8) Aceton-Methanol (4: 6) 1,98 g |
| 11 Methanol Aceton-Methanol (2: 8) 1,70 g |
| 12 Methanol Methanol 0,58 g |
Die Fraktionen 10, 11 und 12 wurden vereinigt und dreimal mit jeweils 50 ccm Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden durch Celit gefiltert,
über wasserf reiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu einem Rückstand (660
mg) verdampft. Dieser Rückstand wurde in 0,7 ccm Skellysolve B gelöst, worauf Kristallbildung
erfolgte. Die Kristalle des antiviotischen Desideus wurden gesammelt und mit kaltem
Skellysolve B gewaschen und getrocknet, wobei 0,41 g Substanz mit einem Schmelzpunkt
von 53 bis
61'C und einer Wirksamkeit von 5,0 B. subtilis-Einheiten je Milligramm
erhalten wurden.
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Das beschriebene Florisilverfahren wurde noch zweimal wiederholt,
wobei aus den drei Ansätzen insgesamt 0,84 g Substanz gewonnen wurden.
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Die 0,16 g Desideuskristalle, die unter Verwendung der Craigschen
Apparatur und des Ionenaustauscherharzes erhalten worden waren und die 0,84 g Desideuskristalle,
die unter Verwendung der Florisilsäule erhalten worden waren, wurden vereinigt und
umkristallisiert. Hierzu wurden die Kristalle zuerst in Skellysolve B mit einer
Konzentration von etwa 1 g/2 ccm gelöst. Die Lösung wurde durch Celitwatte gefiltert
und auf
-15'C gekühlt. Darauf wurden die erhaltenen Kristalle abfiltriert
und mit kaltem Skellysolve B gewaschen, wobei 0,32 g Desideus mit einem Schmelzpunkt
von 51 bis 63°C gewonnen wurden. Die Kristalle zeigten kein ausgeprägtes Ultraviolett-Absorptionsspektrum
im Bereich von 220 bis 420 mp.. Ein Papierdiagramm mit Rf-Werten ist in Tabelle
V und in der A b b . 1 gezeigt.
| Tabelle V |
| Lösungsmittelsysteme I RF-Werte |
| I 0,95 |
| II 0,95 |
| III 0,95 |
| IV 0,95 |
| V 0 |
| VI 0 |
| I 1-Butanol, Wasser (84: 16), 16 Stunden. |
| II 1-Butanol, Wasser (84: 16) plus 0,25 % p-Toluolsulfo- |
| säure, 16 Stunden. |
| IR 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:1:1), 16 Stunden. |
| IV 2% Piperidin (v/v) in 1-Butanol, Wasser (84:16), |
| 16 Stunden. |
| V 1-Butanol, Wasser (4:96), 5 Stunden. |
| VI 1-Butanol, Wasser (4:96) plus 0,25% p-Toluolsulfo- |
| säure, 5 Stunden. |
Die Ab b. 2 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum in cm-'.
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2920* S (Öl)** ..... . ........ 1060S
2860S ......................
1020M 1730 S (C = O).............. 970 W 1690 W . ................... 943 W 1460
S (Öl) ................. 936 W 1372 S (Öl) . ........ . ...... 928
W 1328 M ..................... 908 W 1260 M ..................... 891 W 1188S
...................... 866 W 1165 M ..................... 848 W 1150 M .....................
811 W 1130 M ..................... 747 W 1115S ...................... 718 W (Öl)
1092M * Die Frequenztoleranzen betragen t 20 cm 1 im 3800-bis-2000-cm '-Bereich,
10 cm- ' im 2000-bis1700-cm '-Bereich und -- 5 cm 1 im 1700-bis700-cm---'-Intervall.
Der Abstand zwischen benachbarten Banden soll den in der Tabelle angegebenen Wert
aufweisen, wobei die Toleranz ein Fünftel der Frequenztoleranz beträgt.
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** Die Bandenintensitäten sind mit »S«, »M« bzw. »W« bezeichnet. Sie
sind dem Hintergrund in der Nähe der Banden angenähert. Eine »S«-Bande hat den gleichen
Intensitätsgrad wie die stärkste Bande im Spektrum; »M«-Banden sind etwa ein Drittel
bis zwei Drittel so intensiv wie die stärkste Bande, und die Intensität der »W«-Banden
beträgt weniger als ein Drittel der stärksten Bande. Die Grundlage dieser Schätzungen
bildet eine prozentuale Transmissionsskala.
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Die Elementaranalyse des neuen Stoffes ergab folgende Werte: Berechnet
für C4oH"0" C 65,21, H 8,70, O 26,09; gefunden ... C 65,42, H 8,64,O 25,85.
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Desideus ist weiterhin durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet:
Biologische Wirksamkeit Kristallines Desideus ist sehr aktiv gegen KB-Zellen in
der Gewebekulturprobe. Die Wirksamkeit liegt zwischen 50000 und 100000 KBU/mg.
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Diese Gewebekulturprobe ist ein Maß für die Verhütung einer Proteinsynthese
in einer Gewebe- , kultur bei Verwendung von KB-Zellen.
bewirkt. Kristallographie Das Röntgenstrahlen-Beugungsbild des kristallinen Desideus
zeigt die folgenden Punkte in den interplanaren Abständen, ausgedrückt in Ängströmeinheiten
| 9,40 4,29 |
| 7,43 3,93 |
| 6,70 3,45 |
| 6,06 3,28 |
| 5,40 2,79 |
| 4,72 |
Nuklearmagnetische Resonanz Desideus hat ein charakteristisches NMR-Spektrum, wie
die Abb.3 zeigt. Das NMR-Spektrum wurde mittels eines »Varian-A-60«-Spektrometers
und einer Desideuslösung (etwa 0,5 ccm, etwa 0,3molar) in schweren Wasserstoff enthaltendem
Chloroform erhalten. Das Spektrum wurde gegen eine 1 bis 2 Tropfen Tetramethylsilan
enthaltende Lösung geeicht; die Genauigkeit von d v betrug > ± 1 c. p. s. (Schwingungen
je Sekunde). Die Frequenzen wurden in c. p. s. feldabwärts von Tetramethylsilan
aufgezeichnet.
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D. Desideusperchlorat 500 mg des in der angegebenen Weise hergestellten
Desideus wurden in 10 ccm Methanol gelöst, und 0,5 ccm 70°/oige Perchlorsäure wurden
zugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht eingefroren. Um die Kristallbildung anzuregen,
wurden dem Gemisch 10 ccm Äther zugefügt. Nach dem Kristallisieren wurde filtriert,
wobei 310 mg Desideusperchloratkristalle mit einem Schmelzpunkt von 153°C erhalten
wurden. Dieses Produkt wurde zweimal aus Methanol umkristallisiert, worauf der Schmelzpunkt
der Kristalle bei 164°C lag.
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Elementaranalyse für C4oHe4012 - HC104: Berechnet ... C 57,37,H
7,87, O 30,60, Cl 4,23; (Molekulargewicht = 837,4); gefunden ... C 56,52,
H 8,04,O 30,78, Cl 4,20; [Molekulargewicht = 844 (berechnet auf Grund des CI-Gehaltes)].