DE1617923A1 - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cremeomycin - Google Patents

Description

Dr. Walter Bei!

Alfred Eosppener

Dl Hs es Jeau im Wolff 16170-23

■Dr. KaDS Chr. BaÜ 15. Sep. 1967

•KecLlsai.wäite

Frankfurt a. M.-Höchst +

Adeionstraße 5S - TeL 31 26 49

Unsere Nr. 14' 087

The Up.john Company,. Kalamazoo. (Michigan, USA)

Verfahren'zur Herstellung des neuen Antibiotikums

Cremeomycin.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cremeomycin (U-23 643).

Erfindungsgemäss wird Cremeomycin hergestellt, indem Cremeomycin produzierende Actinomyeeten in einem wässrigen Ufährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden und indem die so gewonnene Verbindung aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Cremeomycin ist eine saure Verbindung, die das Wachstum grampositiver und gramnegativer Bakterien hemmt. Solche Bakterien siad zum Beispiel Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis₉ Bacillus

cereus, Sarcina lutea, Salmonella gallinarum, Proteus

vulgaris, Eseherichia coli, Salmonella sohottmuelleri und Peeudomonas fluoreseens. Cremeomycin hat ausserdem fungizide Wirkung gegenüber zahlreichen Pilzen, ZoB. Blastomyces derma-

*67

18 / 2 1 ? 9

titidis, Cryptococcus neoformans, Sricophyton rubrum, Iricophyton violaceum, Tricophyton asteroides, Iricophyton mentogrophytes, Nocardia asteroides, Ooceidioides immitis,. Hormodendrum compactum, Microsporum canis, Tricophyton interdigitale, Candida albicans, Sporotriehum schenckii, und Geotriehum sp. Demzufolge kann Cremeomycin allein oder in Kombination mit anderen Äntibiotica zur Verhinderung des Wachstums oder zur Verringerung der Zahl von Bakterien und Pilzen, wie oben beschrieben wurde, in verschiedenen Umgebungen verwendet werden. Beispielsweise kann es als Infektionsmittel für verschiedene zahnmeäizinische und medizinische Gegenstände, die mit Staphylococcus aureus verunreinigt sind, verwendet werden. Es ist ausserdem als fungizides Mittel für industrielle Konservierungsmittel nützlich, beispielsweise ala fungizides SpüVlmittel für gereinigte Kleider und zur Imprägnierung von Papieren und Geweben; ausserdem ist es zur Unterdrückung des Pilzwachstums empfindlicher Organismen auf Plattenkulturen und anderen biologischen Medien nützlich. Cremeomycin kann ausserdem als Putterzusatz zur Beschleunigung des Wachstums von Tieren z.B. Säugetieren, Vögeln, Pischen und Reptilien, · verwendet werden. Cremeomycin ist äusserst lichtempfindlich. Daher kann Cremeomycin in verschiedenen Umgebungen zur Hemmung des Wachstums empfindlicher Microorganismen verwendet werden und anschliessend kann @8 zerstört werden,

- 2 109816/21 ?9

indem es einfach einer für die Zerstörung ausreichenden Intensität an Licht ausgesetzt wird.

Chemische und physikalische Eigenschaften von Cremeomycin.

Kristallines Cremeomycin hat die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften! Farbe i Gelb

Elementar.analyse: 0,49,66; H, 3,42; O, 32,77}

Summenforme1:

Molekulargewicht s

Löslichkeit!

Schmelzpunkts

OT-Spektrums

Methanol

0,01 η HCl in Methanols

- 3 -109816/71

193 (!Titration);

194 (Massenspektrometer) Löslich in Wasser, Methanol, Aceton, Butanol, Aethylacetat, Methyläthylketon, Methylenchlorid; nicht löslich in Cyelohexan, Petroläther oder Hexan. 142-143°C

Max. bei 209 m/u ( a = 131,36),

Max. bei 264 m/U ( a = 43,11),

Max. bei 286 m/u ( a = 34,43) und

Max. bei 412 uyu ( a = 36,23);

Max. bei 212 m>u ( a = 111,30),

Max. bei 262,5 nyu ( a = 48,55), Max. bei 285 myu ( a =29,29) und Max. bei 412 nyu ( a « 29,42);

1817S23

0,01 η KOH in Wasser: Max. bei 20t myu (a = 36,71),

Max. bei 234 myu (a = 47,05), Max. bei 255 m/a ( a= 34,18), Max. bei 279 ayu (a = 29,96), Max. bei 320 m/a (a = 9.28), Max. bei 415 nyu (a = 21.15).

Infrarots -pektrumi

Das Infrarotspefctrum von Cremeomycin in Mineralöl ist in Figur 1 der Zeichnungen angegeben. Cremeomycin zeigt Banden bei den folgenden Wellenlängen (Angaben in re&Lprolcen Zentimetern^

3100 (W)	1587 (S)	1188 (M)
3050 (W)	1535 (S)	1167 (S)
3025 (W)	1490 (S)	1145 (W)
2950 (S) (OeI)	1483 (S)	1120 (W)
2920 (S) (OeI)	1465 (S)	1100 (S)
2850 (S) <0el)	1448 (S)	976 (W)
2630 (W)	1428 (S)	965 (M)
2420 (W)	1420 (S)	936 (M)
2320 (W)	1378 (W) (OeI)	911 (W)
2260 (W)	1363 (W)	820 (W)
2185 (S)	1335 (S) .	784 (S)
1820 (W)	1308 (M)	740 (W)
1811 (W)	1265 (M)	721 (W)
1718 (S)	1260 (S)	711 (W)
1662 (M)	1214 (S) «· 4 ·*·	677 (W).

In KBr zeigt Cremeomycin Banden "bei folgenden Wellenlängen (Angaben in reziproken Zentimetern):

3100 (W) 1535 (S)

3050 (W.) 1308 (M)

3025 (W) 1265 (M)

2950 (W) .1260 (S) .

2850 (W) 1214. (S)

2630 (W) 1188 (M)

2420 (W) · 1167 (S)

2320 (W) 1145 (W)

2260 (W) 1120 (W)

2185 (S) 1100 (S)

1820 (W) 9₇6 (W)

1811 (W) 965 (M)

1718 (S) 936 (_M)

1662 (M) 911 (ß)

1587 (S) 820 (W)

1535 (S) 7Q₄.

H90. (S) ₇₄₀

1483 (S) ·₇2ΐ (ψ)

1465 (S) _7U

1448 (S) " ' ₆₇₇

1428 (S)

1420 (S)

1363 (W)

■ ■ - ■ r-⁵ -

10 9 8 1 6 / 21? 9⁵

Die Bandenintensitäten sind als "S", "M",

bzw. "W" bezeichnet und werden im Verhältnis zur ITntergrundadsorption in der Nähe der Banden angegeben. Eine "S"-Bande zeigt eine Intensität von der gleichen Grössenordnung wie die kräftigste Bande im Spektrum; ^ttM^w-Banden zeigen eine Intensität zwischen einem und zwei Dritteln der kräftigsten Bande und ¹¹W"-Banden zeigen eine Intensität von weniger als einem Drittel der kräftigsten Bande. Diese Schätzungen wurden auf der Basis einer prozentualen Durchlässigkeitsskala gemacht.

Cremeomycin zeigt ein charakteristisches Papierchromatogramm, das in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt ist, wobei die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet wurden«

I. 1-Butanol, Wasser (84:16), 16 Ju

II. 1-Butanol, Wasser (84:16), plus 0,25 $> p-Toluolsulfonsäure, 16 h.

III. 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2il:l), 16 h. 17. 2 ^ Piperidin (v/v) in 1-Butanol, Wasser

(84:16), 16 Ju

T. 1-Butanol, Wasser (4:96), 5 h.

VI. 1-Butanol, Wasser (4:96), plus 0,25 # P-

loluolsulfonsäure, 5 h.

109816/21*9

Der Mikroorganismus

Der vorzugsweise verwendete Actinomyeet-« stamm ist Aetinomyees cremeus, zu dessen Merkmalen die Broduktion Cremeomycin gehört* line AblegerkuBär des lebenden Organismus kann von der Sammlung der Northern utilization and Research Division, Agricultural lesearch Service, IT.S. Department of Agriculture, Beoria, Illinois, U.S.A., "bezogen werden* Die Hinterlegungsnummer ist ITRRIi 3241· Die charakteristischen Merkmale von Actinomyces cremeus, KBBL 3241, werden in den folgenden Tabellen angegeben:

- Aussehen auf Sktachrom

- Mikroskopische Eigenschaften

- Züchtungseigenschaften

- Wachstum auf Kohlenstoffverbindungen in künstlichem Medium (*T. Bact, 36* 107 114, 1948).

Parbeigensehaften *· entsprechend dem Color Harmony Manual, 5rd Idition, 1948 und der ISCC-HBS-Methöd of Designating Colors and a Dictionary of Color Names, NBS Circular 555.

Tabelle I
Tabelle II
Tabelle III
Tabelle IV

Tabelle T

fabelte. ...I Aussehen v.ott Actinotayceg, eremeus auf Jjktachrofli *

Agar-flaTirbOden	Ofeerfläehe	Rückseite -
Bennett's	crefflerosa	gerb-brätm
Czapek♦s Saccharos e	weisslich	farblos
Malt ose-üfrypt on	- selir schwach weisslich	gelb-braun
feptcm-Eisen	k"ein Wachstum an der Luft	gelb-braun
0,1$ fyrosin	rötlich weiss	rot-braun
Casein-Stärke	weiöslich	blas s gelbbraun

*Diet2, A., "Ektachrome Transparencies as Aids in Actinomjrcete Classification,¹¹ Annals of the Few York Acadeaiy of Sciences, 6Oi 152-154, 1954.

Tabelle Il Mikroskotjisehe JSjgenschaften von Actinomvees ereaieus«

Mikroskop

Elektronenmifcros kop

Sporophoren gerade bis offenspiralförmig bis spiralförmig·

Durchstrahlutigsverfahrens Sporen länglich _f glatt»
Rückstrahlungsverfahreni Sporen gefurcht.

109816/2199

Tabelle III Kultureigenschaften von Actinomyces cremeus

Nährboden (Wachstum an der (Vegetatives Andere

luft,) Oberfläche Wachstum>Rückseite

Pepton-Eisenagar

Caleiummalatagar

GlukQS e-Aspara gin-Agar

Magermilch-A. gar

Tyrosin-Agar

Xanthin-Agar

Hefeextrakt-Malzextrakt-A gar

Casein-Stärke· Agar

Bennett's Agar

schwach grauweiss

schwäch grauweiss

cremeweiss

sehr schwach weissIich

creme

ziemlich creme

eträchtlich creme

iemlieh weiss

Einfache Gelati

eträchtlich crbme schwach cremeweiss

Czapek's Saccha rose-Agar

Maltose-Irypton- beträchtlich creme Ä-gar

gelbbraun farblos

orangegelb gelbbraun

rotbraun gelb

orangegelb gelb

gelbbraun crime

:elbbraun

ae

Melanin ·

Kein Bigment Malat nicht gölöst.

Braunes Pigment.

Gelbbraunes Pigment. Casein etwas gelöst.

rotbraun Tyrosin gelöst.

blassgelbes Pigment. Xanthin gelöst.

gelbbraunes !Pigment ♦

kein Pigment Stärke hydrous iert.

Kein Pigment. Kein Pigment

Kein Pigment,

Kein Pigment

Ί ^vf^rr issigt.

109816/2179

	40	Oberflächen	-	zu	Creme Luft-Wachs	Blaugrttner	zu
	Tabelle III .	ring. Spuren—	Kein Pigment. 1/2	Kein Pigment. Nitrat/	tum auf Oberflächen	Oberflächen	Kein Pigment. Nitrat/
	(Fortsetzung)		verflüssigt.	Nitrit reduziert.	ring.	ring.	Nitrit reduziert.
Nähr-Gelatine
		wachstum über	Tabelle 17	Aeusseisfc geringes
		all.		Anzeichen von Pepti-
Synthetische Nitrat- Schwacher		sation. Keine Koagu
Brühe	lation pH 7,0.
	Wachstum von Actinomyces cremeus auf Kohlenstoffverbindungen in
	synthetischen Nährlösungen.
Nähr-Nitrat-
Brühe
Lackmus-
milch

Kontrolle

l.D-Xylose . (+)

2.L-Arabino8 e _; +

3.Rhamnose (-)

5.£-(Jalaktose . ■ +

6.D-Grlukose +

7.D-Mannose . -: +

S.Maltoae · . (+)

1817923

C-)

Gutes f aeiiöttia
Mittelmässiges Waöhstutn

Tabelle Y ■
Farbeigenschaften von Actinbmyoes cremeus

Color Harmony Manual National Bureau of

3rd Ed., 1948 Standards Circular

553,1955 _

Bennett's Agar Oberfläche Rückseite Pigment

Czapek¹s Saccharose-Agar Oberfläche

Rückseite Pigment

Maltose-Irypton-Agar

Oberfläche

Rückseite Pigment 3ba(g)Perl-rMuschel-Tönung.

2ic(g) honiggold, hellgolden.

kein

2db(g) elfenbein

2db(g) elfenbein

Kein

2ca(m) hell elfenbein eierschalenfarbig

3pe(m) bernsteinfarbig Topas.

87 gm massig gelb,

89 gm blassgelb,

90 g graugelb.

89 gm blassgeIb,

90 g graugelb.

89 gm blassgelb.

72 m dunkelor-angegelb. 74 gm stark gelbbraun

- 12 -

1098 1 R/

Die neue erfindungsgemässe Verbindung wird produziert, wenn der sich entwickelnde Organismus in einem wässrigen Nahrmedium unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Es versteht sich ausserdem, dass für die Herstellung begrenzter Mengen Oberflächenkulturen in Flaschen angewendet werden können. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, und eine Stickstoffquelle z.B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder proteinartiges Material, enthält. -■·■'■ Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind unter anderem Glukose, Sandzucker, Saccharose, G-lyzerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und ähnliche. Bevorzugte Stickstoffquellen sind unter anderem Maisweichwasser, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Soyabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreashydrolisat aus Casein, Schlempe, tierische Eiweissflüssigkeiten, Fleisch und Knochenabfälle und ähnliche. Torteilhafterweise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden. Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und ähnliche, brauchen den Fermentationsmedien

zu
nicht zugesetzt/werden, da Leitungswasser und ungereinigte ·

Ingredienzien ,als Komponenten der Medien verwendet werden.

Die Produktion der erfindungsgemässen Verbindung kann bei jeder beliebigen Temperatur, die ein zu-

- 15 109816/21?9

friedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus bewirkt, vorzugsweise zwischen zirka 18° und 40⁰C, insbesondere ■ zwischen zirka 20° und 32⁰C, durchgeführt werden. Für gewöhnlich wird optimale Produktion der Verbindung in zirka 2 bis 10 Tagen erhalten. Normalerweise bleibt das Medium während der Fermentation annähernd neutral oder schwach alkalisch. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den eventuell vorhandenen .Puffersubstanzen und teilweise von dem Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab; letzteres wird vor der Sterilisation vorteilhafterweise auf ungefähr 7,2 eingestellt.

Wenn die Züchtung in grossen Gefässen und Tanks durchgeführt wird, ist es von Vorteil die vegetative Form des Mikroorganismus anstelle der Sporenform zur Beimpfung zu verwenden, um eine erhebliche Verzögerung bei der Produktion der neuen Verbindung und die daraus folgende ungenügende Ausnutzung der Apparatur zu verhüten. Demzufolge ist es wünschenswert ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühenkultur herzustellen, indem die Brühenkultur mit einer aliquoten Menge einer Boden- oder Schrägkultur geimpft wird. Wenn auf diese Weise ein junges, aktives, vegetatives Inoculum erhalten worden ist, wird es aseptisch in grosse Gefässe oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche sein, das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet

- 14 -

109816/71

wird, oder es kann verschieden davon sein, so lange es nur so beschaffen ist, dass ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erhielt wird.

Die neue erfindungsgemäss erhältliche Verbindung ist eine saure chemische "Verbindung, die die Summenformel CgHgN₂O₄ hat. Sie ist in Wasser, Aethylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnlichen aliphatischen Estern, Aceton, Methylethylketon, Isopropylbutylketon und ähnlichen niedrigen Alkanonen, Methanol, Butanol und ähnlichen niederen Alkanplen löslich. Sie ist in Cyclohexan, Petroläther und Hexan verhältnismässig .unlöslich. Zur Isolierung und Reinigung von Cremeomycin steht eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung, beispielsweise Solventextraktion, Silicagelchromatographie, Flüssig-flüssig-Verteilung in einer Craigapparatur, sowie Kristallisation -aus,lösungsmitteln. Solventextraktions verfahren werden für gewerbliche Isolierung bevorzugt, da sie weniger Zeit brauchen und billiger sind. Silicagelchromatographie ist ein bevorzugtes Reinigungsverfahren.

. Nach einem bevorzugten Gewinnungsprozess wird Cremeomycin durch Abtrennung des Myzels und ungelöster Feststoffe mit herkömmlichen Mitteln, wie z.B. Filtration oder Zentrifugieren, aus dem Züchtungsmedium gewonnen. Das Antibiotikum wird dann aus der filtrierten oder zentrifugieren Brühe durch Extraktion gewonnen. Für

109816/?1?9

die Extraktion des Cremeomycins aus der filtrierten Brühe können die oben beschriebenen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, verwendet werden. Methylenchlorid ist das bevorzugte Extraktionslösungsmittel. Der durch Extraktion mit Methylenchlorid erhaltene Extrakt kann in Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet werden, wobei ein Rohpräparat des Antibiotikums erhalten wird. Dieses Präparat kann in Umgebungen, in denen grössere Reinheit des Antibiotikums nicht erforderlich ist, verwendet werden.

Cremeomycin kann auch aus der filtrierten Fermentationsbrühe bei pH-Werten von ungefähr 4,0 oder weniger extrahiert werden. Bei pH-Werten von zirka 6,0 oder höher wird Cremeomycin nicht merkbar in die obigen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, extrahiert. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft kann Cremeomycin bei einem pH-Wert von weniger als 4,0 in eines der obigen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, extrahiert werden. Es kann dann bei einem pH-Wert, der grosser als 6,0 ist,in Wasser rückextrahiert werden und kann dann bei einem pH-Wert»der .niedriger als 4,0 ist in ein Lösungsmittel extrahiert werden, in dem es löslicher ist. Der Endextrakt kann dann zur Trockene eingedampft werden, um ein Rohpräparat von Cremeomycin zu liefern.

Y/ahlweise kann Cremeomycin aus der Kulturnährlösung durch Verwendung eines stark basischen Anionen-Austauschharzes abgetrennt werden. Für diesen Zweck ge-

- 16 -

109816/?1?9

eignete Anionenaustäuschharze können durch Chlormethylierung von Polystyrol nach dem auf den Seiten 88 und 97 von Kunin, _s Ion Exchange Besins, 2nd Ed., (1958), John Wiley and Sons, Inc., angegebenen Verfahren erhalten werden; falls gewünscht kann das Polystyrol mit Divinylbenzol, hergestellt nach dem auf Seite 84 von Kunin, vgl. oben, angegebenen Verfahren, vernetzt werden und mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin nach dem auf Seite 97 von Kunin, vgl. oben, angegebenen Verfahren quaternisiert werden. Anionenaustauschharze dieses Typs werden unter den Handelsnamen Dowex-1, Dowex-2, Dowex-3, Amberlite IRA-400, Duolite A-102, und Permatit S-I vertrieben.

Nach einer weiteren Alternative kann

Cremeomycin aus der Kulturnährlösung oder dem organischen Extrakt nach Adsorptionsmethoden isoliert werden, wobei Adsorbentien wie Kiesä-säure, Entfärbungskohle oder Entfärbungsharz (ein geeignetes Entfärbungsharz ist Permutit DR, U.S. Patentschrift 2 702 263), Tonerde oder Florisil (ein synthetisches Silikat des in U.S..Patentschrift 2 393 625 beschriebenen Typs, das von der Ploridin Co. verkauft wird) verwendet werden. Das adsorbierte Antibiotikum kann von dem Adsorbens in verhältnismässig reiner Porm durch Elution mit einem geeigneten organischen lösungsmittel, z.B. eines der oben erwähnten, in dem Cremeomycin löslich ist, isoliert werden. Hochreines Cremeomycin kann erhalten werden, indem •in unreines, trockenes Präparat von Crtmeomyoin, wie oben

■ - 17 -

109816/2129

I I V f~ \J

■beschrieben, an Silikagel chromatographiert und kristallisiert wird, wobei zur Entwicklung der Säule Lösungsmittel wie Methylenchlorid und Methanol verwendet werden. Die durch •Chromatographie an Silicagel erhaltenen Fraktionen können zu kristallinem Cremeomycin eingedampft werden.

Salze von Cremeomycin können hergestellt werden, indem die freie Säure des Cremeomycins und eine anorganische oder organische Base verwendet werden. Die Oremeomycin-salze können zum Beispiel hergestellt werden, indem die freie Säure des Cremeomyeins in Wasser gelöst wird, indem eine verdünnte Base zugegeben wirfy bis der pH-Wert der Lösung ungefähr 10,0 bis 11,0 ist und indem die Lösung gefriergetrocknet wird, wobei ein trockener Rückstand des Cremeomycinsalzes erhalten wird. Cremeomycinsalze, die hergestellt werden können, sind unter anderem die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze. Andere Salze des Cremeomycins sind unter anderem solche mit organischen Basen wie z.B. primären, sekundären oder tertiären Monoaminen, sowie mit Polyaminen, können ebenfalls unter Verwendung der oben beschriebenen oder anderer üblicherweise verwendeten Verfahren hergestellt werden. Andere wertvolle Salze werden mit therapeutisch wirksamen Basen, die zusätzliche therapeutische Wirkungen liefern, hergestellt. Solche Basen sind zum Beispiel die Purinbasen, wie z.B. Theophyllin, Theobromin, Coffein oder Derivate dieser Purin-

- 18 -

"basen, Antihistaminbasen, die imstande sind mit schwachen Säuren Salze zu "bilden,. Pyridinverbindungen, wie z.B. Nikotinsäureamid, Isonikotinsäurehydrazid und ähnliche, Phenylalkylamine wie z.B. Adrenalin, Ephedrin und ähnliehe, Cholin und andere. Salze des Cremeomyeins können für dieselben biologischen Zwecke verwendet werden wie die freie ■Säure. .

^Cremeomycin hat ein breites antibakterielles Spektrum, wie in Tabelle VI gezeigt wird. Das antibakterielle Spektrum wurde unter Verwendung einer Agardiffusionsmethode bestimmt, die im folgenden beschrieben ist: Es wurde eine Lösung von Cremeomycin (Konzentration 1 mg/ml) in einem Phosphatpuffer (0,1 molar; pH_rWert 6,0) unter Lichtschutz hergestellt. Agarplatten wurden mit dem geeigneten Testorganismus beimpft und getestet, indem eine Pilterpapierscheibe von 12,7 mm Durchmesser in die Testlösung getaucht wurde und auf die Oberfläche des Agars gebracht wurde. Nach 18 Stunden Inkubationszeit 'bei einer Temperatur von 37 C wurden die Inhibierungszonen gemessen.

- 19 109816/7179

Tabelle YI

Antibakterielle Wirksamkeit von Cremeomycin Agar-Dif fusions-Test

Test-Organismus Inhibierungszone Durchmesser in mm

Pseudomonas mildenbergii 39

Mycobacterium avium 25

Klebsiella pneumoniae 31

Bacillus subtilis 43

Sarcina lutea 48

Escherichia coli 36

Salmonella gallinarum 43

Salmonella schottmuelleri " 44

Staphylococcus aureus 42

Das antibakterielle Spektrum von

Cremeomycin würde auch unter Verwendung einer Rö'hrchen-Verdtinrmngs-Testmethode bestimmt, wobei die Nährbrtihe BHI (Hirn-Herz-Infusiönsbrühe, Difco, Detroit, Michigan USA)ist. Teströhrchen (13 mm χ 100 mm) wurden in der Üblichen bei Snell, E. E., Vitamin Methods, Volume 1, Academic Press, Inc., New York, 1950, Seite 327, beschriebenen Methode hergestellt. Testorganismen, die 18 Stunden lang bei 37⁰C gezüchtet waren, wurden zum Impfen des Testmediums verwendet. Das Ergebnis wurde nach 17 Stunden abgelesen.

- 20 -

109816/7179

Tabelle VII

Antibakterielle Wirksamkeit von Cremeomycin Röhrohen-Verdiinnungstest

Tesfr-Organismus Geringste Inhibierungs-

konzentration in mg/ml.

Salmonella gallinarum 7,8

Salmonella typhosa 7,8

Salmonella paratyphi 15,6

Klebsiella pneumoniae 31,2

Escherichia coli 15,6

Proteus vulgaris 15,6.

Pseudomonas aeruginosa 62,5

Pseudomonas fluorescens 7,8

Streptococcus hemolyticus 31,2

Streptococcus faecalis 62,5

Staphylococcus aureus · 15,6

Cremeomycin hatlfungizide Wirksamkeit wie

in Tabelle Till gezeigt wird. Das fungizide Spektrum wurde nach der Agar-Platten-Verdilnnungsmethode bestimmt.

- 21 -

109816/2179

VL

Tabelle VIII-Fungizide Wirksamkeit von Cremeomycin

Test-Organismus

Nocardia asteroidea Blast omyces dermatitidis Ooccidioides imraitis Geotrichum sp. Homiodendrum compactum Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Sporotrichum schenckii Monosporium apiospermum Trichophyton rubrum Microsporum canis Trichophyton interdigitale Candida albicans Trichophyton.violaceum Trichophyton asteroides Trichophyton metagrophytes Geringste Inhibierungskonzentration in mg/ml

100

100

1000

1000

100

100

iooo

1000 1000 1000 1000 1000 1000

100 1000

100

Bemerkung?

Da Cremeomycin äusserst lichtempfindlich ist, ist es wichtig, dass der- Test unter Lichtschutz ausgeführt wird.

- 22 -

109816/?1?9

Cremeomycin, die neue erfindungsgemäss

erhältliche Verbindung, ist gegenüber Bacillus subtilis wirksam und kann zur Verringerung oder Verhinderung von Geruch von Fischen und von Fisehkisten, der durch diesen Organismus verursacht wird, verwendet werden. Sie kann auch zur Behandlung der Brutplätze der Seidenraupe verwendet werden, um Infektionen,die durch diesen Organismus verursacht werden, ■zu verhindern oder zu verringern. Ba Cremeomycin auch gegenüber Cryptococcus neoformans wirksam ist, kann es zur Behandlung von Tauben-Ställen zur Bekämpfung dieses Pilzes ,_der in Taubenmist gefunden wurde, verwendet werden. (Journal of the American Medical Association, Volume 191» No. 4, January 25, 1965, Seiten 269-274). Die neue erfindungsgemäss erhältliche Verbindung kann auch als fungizides Mittel zur Behandlung von Schuhoberleder verwendet werden, wie in der US-Patentschrift 3 130 505 beschrieben wurde. Darüber hinaus kann das neue erfindungsgemäss erhältliche Antibiotikum zum Reinigen von Laboratoriumstischen und -geräten in mikrobiologischen Laboratorien verwendet werden. In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens besehrieben. Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente und alle Verhältnisangaben bei Lösungsmittelgemischen sind Volumenangaben, wenn nicht anders angegeben.

- 23 -

109816/71^9

If

Beispiel 1 A. Fermentation

Ein aus dem Boden gewonnener Stamm von

Actinomyces cremeus, NEEL 3241» wurde dazu verwendet, eine Eeihe von 500-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen; jeder dieser Kolben enthielt 100 ml Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

G-lukos emonohydrat 25 g

Pharmamedia * 25 g

Leitungswasser q..s. ad 1 Liter

Der pH-Wert vor der Sterilisation wird mit wässriger Natronlauge auf 7,2 eingestellt.

*Pharmamedia ist ein technisch reines Baumwollsamenmehl der Firma Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas, USA.

Die Kolben wurden 47 Stunden bei 28⁰C auf einer Gump-Schattelmaschine bei 260 Upm bebrütet.

Ein Schüttelkolben der oben beschriebenen

Vorkeimung (100 ml) wurde dazu verwendet einen 30-Liter-Keimungs-Tank mit 20 1 steriler Nährlösung zu beimpfen; die Nährlösung enthielt folgende Bestandteiles Glukosemonohydrat 10 g

Maisweichwasser 10 g

Pharmamedia '2g

Wilson's Peptonflüssigkeit No. 159* 10 g

Leitungswasser q.s. ad 1 Liter

- 24 -

*Wilson's Peptonflüssigkeit Nr. 159 ist ein Präparat aus hydroltfsierten Proteinen tierischen Ursprungs.

Der pH-Wert vor der Sterilisierung wird mit wässriger Natronlauge auf 7,2 eingestellt.

Der Keimtank wurde 47 Stunden bei einer

Temperatur von 28°C bebrütet, wobei die Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 10 Normallitern pro Miute erfolgte und mit 400 Upm. gerührt wurde.

Ein Teil der Keimung (12,5 Liter) wurde zur Beimpfung eines 300-Liter-Gärgefässes verwendet, der 250 1 der folgenden sterilen Nährlösung enthielt: Melasse 20 g

Pharmamedia 10 g

Kalziumkarbonat ' 5g

Specköl '5 ml

Leitungswasser q,.s. ad 1 Liter

Der pH-Wert vor der Sterilisation wurde mit wässriger Natronlauge auf 7,2 eingestellt.

Die Fermentation wurde 114 Stunden lang durchgeführtjwährend dieser Zeit wurde die Temperatur auf 25⁰C eingestellt, filtrierte Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 150 Normallitern pro Minute eingeleitet und mit einer Geschwindigkeit von 320 Upm« wurde gerührt. Nach 24 Stunden enthielt die Fermentationsbrühe 2,6 Bioeinheiten Cremeomycin. _ ?5 -

Nach 114 Stunden enthielt die Fermentationsbrühe 34,8 Bioeinheiten Cremeomycin. Die Bestimmungen wurden gegen den Mikroorganismus Proteus vulgaris auf dem Nähragar (Difeo) durchgeführt. Das Nährmedium wurde mit dem Testorganismus im Verhältnis 2ml/l beimpft. Die Platten wurden 18 Stunden bei 32⁰C bsbrütet. Alle Bestimmungen erfolgten unter Lichtschutζ. Eine Bioeinheit ist die Menge Antibiotikum, die bei Auflösung in 0,08 ml der Test lösung und Aufbringung auf eine 12,7 mm-Scheibe unter standardisierten mikrobiologischen Bedingungen eine Inhibierungszone von 20 ml ergibt. B. Gewinnung

Die gesamte Brühe(2250 ml) einer der oben beschriebenen Cremeomycinfermentationen wurde mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von zirka 4,0 eingestellt, und unter Zugabe von 3 i° Kieselgur als Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wurde mit l/lO Volumen Wasser ausgewaschen. Das Filtrat (filtrierte Brühe und Waschwasser) wurde mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von zirka 4,0 eingestellt und mit einem halben Volumen Skellysolve B (isomere Hexane) extrahiert. Die Skellysolve-B-Extrakte wurden verworfen. Das extrahierte Filtrat wurde dann mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und mit einem halben Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die erschöpfte Brühe wurde verworfen. Der Methylenchloridextrakt (1050 ml) wurde im Vakuum bei einer 30⁰C nicht übersteigenden Temperatur eingedampft und ergab 250 mg eines

- 26 -

1 0 9 8 1 6 / 7 1 ? 9

Präparats, dessen Cremeomyeingehalt nach dem Proteus-vulgaris-Test 31*0 './u/mg "betrug.

0, Reinigung - Silikagelchromatographie

Ein nach einem oben beschriebenen Yer-

fahren erhaltenes Methylenchloridkonzentrat wurde an einer Silicagelchromatographiesäule gereinigt. Die Säule wurde wie folgt hergestellt: Ein Gemisch von 217,6 g KH₂PO₄ und 2,16 g Na₂HPO. wurde in ungefähr 3,0 1 Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit 4,0kg Silicagel gemischt. Das Überschüssige Wasser wurde verdampft, und das gepufferte Gel wurde bei einer Geltemperatur von 120 bis 13O⁰C ungefähr 2 Stunden läng aktiviert und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt. Es wurde dann mit einer ausreichenden Menge an Skellysolve B verrührt, um eine giessfähige Mischung zu erhalten, die dünnflüssig genug war, um eingeschlossene Luft entweichen zu lassen. Diese Mischung wurde in ein Glasrohr von 10 cm innerem Durchmesser bis zu einer Schichthöhe von 104 cm gegossen. Wegen der Lichtempfindlichkeit des Cremeomycins wurden alle Operationen mit diesem Antibiotikum unter Lichtschutz durchgeführt.

Ein nach einem oben in Teil B beschriebenen

Verfahren erhaltenen Methylenchloridkonzentrat von Cremeomycin (6,0 1) wurde im Takuum auf ein Volumen von zirka 100 bis 200 ml eingedampft. Dieses Konzentrat wurde mit 120 g Silicagel, das wie oben gepuffert und aktiviert worden war, vermischt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und das getrocknete Silikagel-Antibiotikum-Präparat wurde gleichmässig in dem Skellysolve B

- 27 -

* 1

10981fi/?1?9

am Kopf der Säule verteilt. Das Niveau des Lösungsmittels wurde bis zur Oberfläche des Ausgangsmaterials abgesenkt. Ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus Methylenchlorid und Methanol (98,5 : 1,5) wurde sorgfältig auf den Kopf der Säule gegeben. Der Durchfluss wurde gestartet,, und 30 1 dieser Mischung wurden durch die Säule fliessen gelassen und verworfen. Die Entwicklung der Säule wurde fortgesetzt, und EinLiter-Fraktionen wurden abgenommen; aliquote Proben dieser Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft und die Rückstände wurden in Methanol wieder aufgenommen und durch Messung der UV-Adsorption analysiert. Das Cremeomycin wurde durch sein charakteristisches UV-Spektrum in den Fraktionen erkannt und durch seine Adsorption bei einer Wellenlänge von 285 bis 288 /u quantitativ bestimmt.

Fraktionen 1 bis 7 enthielten die Hauptmenge der Cremeomycinaktivität, sie wurden daher vereinigt und bei einer Temperatur von weniger als 4O⁰C im Vakuum bis auf ein Volumen von ungefähr 500 ml eingedampft. Das Konzentrat wurde durch Filtration geklärt und im Vakuum auf ein Volumen von 320 ml eingedampft. Zu diesem Konzentrat wurden unter Rühren 1200 ml Cyclohexan gegeben und die Mischung wurde über Nacht bei O⁰C aufbewahrt. Die Cremeomycinkristalle wurden durch Filtration abgetrennt, mit 5,0 ml Cyclohexan gewaschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht von 6,08 g getrocknet; bei der mikro-

- 28 10-9 816/2179

biologen Gehaltsbestimmung mit Proteus vulgaris wurde ein Gehalt von 198 -yu/mg ermittelt. Ein Teil dieses kristallinen Cremeomyoinpräparats wurde umkristallisiert, indem 2 g des Präparats in 40 ml Methylenchlorid gelöst wurden, indem die Lösung durch Filtration geklärt wurde und indem 160 ml Cyclohexan zugegeben wurden. Biese Mischung wurde über Wacht bei O⁰C aufbewahrt. Die Cremeomycinkristalle wurden durch Filtration abgetrennt und im"Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht von 2,0 g getrocknet; bei der mikrobiologischen Gehaltsbestimmung mit-Proteus vulgaris wurde ein Gehalt von 240 yu/mg ermittelt.

Beispiel 2 Kaliumsalz des Cremeomvcins

0,5 g wie in Beispiel 1 hergestelltes

Cremeomycin wurden in 5 ml absolutem Aethanol gelöst, und zu der Lösung wurden 260 mg in 2 ml Wasser gelöstes Kaliumbicarbonat zugegeben. Das Reaktionsgefäss wurde gekühlt, woraufhin das Kaliumsalz des Cremeomycins auskristallisierte. Die Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

- 29 -

10981B/?1

Claims (8)

1. Patentansprüche

   1t Pharmazeutisches Präparat, mindestens 2,6 Bioeinheiten Cremeomycin pro cm enthaltend, das das Wachstum verschiedner gram-negativer und gram-positiver Bakterien sowie Fungi hemmt und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es in seiner im wesentlichen reinen kristallinen Form in Äthylacetat, Amylacetat, Wasser, Methanol, Aceton, Butanol, Methyläthylketon und Methylenchlorid löslich ist, folgende Blementalanalyse aufweist:

   C 49.66; H 3.42; N 15.19; 0 32.77

   ein massenspektrometrisch bestimmtes Molekulargewicht von 194 aufweist, ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Figur 1 und ein charakteristisches Papferchromatogramm Figur 2 beiliegender Zeichnung besitzt.
2. 2. Präparat nach Anspruch 1, in trockner Form, dadurch gekennzeichnet, dass es bei der Prüfung gegen Proteus vulgaris eine Wirkung von mindestens 31,0/ymg. aufweist.
3. 3. Cremeomycin nach Anspruch 1, in seiner im wesentlichen reinen Form.
4. 4. Cremeomycin nach Anspruch 1, in seiner im wesentlichen reinen kristallinen Form.
5. 5. Cremeomycin nach Anspruch 1 und dessen Alkali-, Brdalkali- und Aminsalze.
6. 6. Kaliumsalz des Präparats nach Anspruch 1.
7. 7. Cremeomycin.

   109816/2129
8. 8. Verfahren zur Herstellung von Cremeomycin, dadurch gekennzeichnet, dass man den Actinomyces cremeus NRRL 3241 in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und das Cremeomycin aus der KuIturflüss.igkeit abtrennt.

   9-r Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die KuIturflUssigkeit filtriert, das Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für Cremeomycin extrahiert und das Cremeomycin von dem Lösungsmittelextrakt abgetrennt wird.

   Für: The Upjohn Company

   Recht s anwalt

   816/2^9

   Leerseite