DE1250598B - I Verfahren zur fermentatrven Her stellung von mit Al 16SO und Al 16SA bezeichneten antibiotisch, insbesondere fungicid wirkenden Peptiden - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Int. CL:

C12d

DEUTSCHES

PATENTAMT DeutscheKl.: 30h-6

AUSLEGESCHRIFT

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

E 23067IV a/30 h

20. Juni 1962

21. September 1967

R 0 AU 6J/0-I

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung neuer, antjbiotisch wirksamer Peptide, die mit A116SA und A116SO bezeichnet werden. Die beiden Peptide sind nahe miteinander verwandt und weisen ein ähnliches antimikrobisches Spektrum und ähnliche Eigenschaften auf, Sie werden durch das erfindungsgemäße Verfahren gleichzeitig hergestellt. Anscheinend enthalten die Peptide in ihrem Molekül die gleiche Anzahl gleicher Aminosäuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur fermentativen Herstellung der mit A116SO und A116SA bezeichneten antibiotisch wirkenden Peptide ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces endus NRRL 2763 in einem üblichen, Kohlehydrate, anorganische und organische Stickstoffverbindungen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium züchtet.

Die Peptide werden aus dem bei der Züchtung gebildeten Myzel durch Extraktion isoliert.

Das Peptid A116SO hat folgende Merkmale: Es liegt in reiner Form als eine weiße Festsubstanz vor und ist in einer Anzahl von Lösungsmitteln löslich. Es ist in den meisten polaren Lösungsmitteln, wie in niederen Alkoholen, z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, n-Butanol und Pentanol, in niederen Estern, wie Äthylacetat und Amylacetat, und in niederen Ketonen, wie Aceton, Methyläthylketon und Methylisobutylketon, löslich, jedoch unlöslich in Diisobutylketon. In Dimethylformamid, Acetonitril und Chloroform ist das Peptid A116 SO ebenfalls löslich, jedoch verhältnismäßig unlöslich in Tetrachlorkohlenstoff, Benzol und Diäthyläther und ferner in aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Hexan und Heptan. Verhältnismäßig unlöslich ist das Peptid A116SO in Wasser.

Das Peptid A116SO ist in Lösung über einem pH-Bereich von pH 2 bis etwa 8 verhältnismäßig stabil, jedoch im alkalischen pH-Bereich oberhalb pH 8 und in stark sauren Lösungen verhältnismäßig instabil.

Bei der üblichen elektrometrischen Titration in Dimethylformamid—Wasser (2:1 Volumteile) als Lösungsmittel zeigt A116 SO keine titrierbare Gruppe mit einem pK_ft-Wcrt im Bereich von pK_a 3,5 bis 14.

Das Molekulargewicht von A116SO beträgt etwa 1840, bestimmt durch elektrometrische Titration von A116SO in Eisessig unter Verwendung von Perchlorsäure als Titrationsmittel.

Ein Durchschnittswert mehrerer Elementaranalysen von A116SO-Präparaten, die im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat etwa 60 Stunden getrocknet wurden, ergab folgende Analysenwerte:

Verfahren zur fermentativen Herstellung von mjt
Al 16SO und Al 16SA bezeichneten antibiotisch,
insbesondere fungicid wirkenden Peptiden

Anmelder:

Eli Lilly and Company,

Indianapolis, Ind. (V. St A.)

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke, Patentanwalt,
München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:

Albert Carl Saeger, Grandview, Mo. (V. St. A.) - -

Kohlenstoff 55,40%

Wasserstoff 8,33%

Stickstoff 13,80%

Sauerstoff (durch Differenz) 22,47 %

Die vorstehenden Werte sprechen für die empirische Formel C₈₆H₁₆₈N₈₈Oj,, für die Verbindung A116SO. Es ist ersichtlich, daß diese Formel nur ein Annäherungswert ist und möglicherweise revidiert werden muß, sobald die vollständige molekulare Zusammensetzung des Peptids bekannt ist.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Peptids A116SO zeigt keine bemerkenswerten Maxima im Bereich von 205 bis 400 ηΐμ in wäßriger Lösung bei einer Konzentration von 0,03 mg/ml. Die einzige Absorption ist die Endabsorption im kurzwelligen Teil des oben angegebenen Spektralbereiches, die von 205 mjA an scharf abnimmt. Die Verbindung A116SO zeigt folgende Absorptionswerte:

Bei 220 πιμ Ei?» = 130 und bei 205 ΐημ Ej?. = 330.

Das Ultrarotabsorptionsspektrum von A116 SO in Chloroform ist in Fig. 1 der Zeichnungen wiedergegeben. Die unterscheidbaren Maxima im ultraroten Spektralbereich von 2,0 bis 15,0 ΐημ. sind folgende:

709 648/320

3 4

3,06, 3,41, 3,45, 3,50, 5,73, 6,05, 6,53, 6,65, 6,85, 7,06, n-Butanol, gesättigt mit Wasser; R_f = 0,90 in n-Bu-

7,22, 7,55, 7,72, 7,85, 825, 8,69, 9,17, 9,26, 9,41_; und tanol, gesättigt mit Wasser, das 2 Gewichtsprozent

11,0 ηΐμ,. p-Toluolsulfonsäure enthielt; Rt = 0,0 in einem

Der Durchschnittswert mehrerer spezifischer opti- Lösungsmittel aus 1 Volumteiln-Propanolund9Volum-

scher Drehwerte von Präparaten von A116SO, die S teilen Wasser; R₁ = 0,0 in Benzol, gesättigt mit

wie vorstehend beschrieben getrocknet wurden, ist Wasser. Bei der Bestimmung der vorstehenden Werte

[λ]2° = — 83,4°, c — l°/₀ in Äthanol (Gewicht pro wurde A116SÖ auf die Papierstreifen in Aceton

Volumen). gelöst aufgebracht.

Analysen der Produkte der sauren Hydrolyse von , Das Peptid A 116SA hat folgende spezielle physjka-

A116SO, die durch-.70- bzw.; 90stündiges Vorreifen io lische und chemische Eigenschaften: Es liegt in reiner

von Proben mit 5,7n-Salzsäure bei 107⁰C erhalten Form als eine weiße Festsubstanz vor und ist in

wurden, zeigen die Anwesenheit einer Anzahl von Lösung über einen pH-Bereich von pH 2 bis etwa 8

Aminosäureresten. Die Analysen wurden nach der stabil, jedoch im alkalischen Bereich oberhalb pH 8

von S. Moore und W. H. S t e i η in J. Biol. und in stark sauren Lösungen verhältnismäßig instabil.

Chem., 192, S. 663 (1951), beschriebenen Methode »s In den meisten polaren organischen Lösungsmitteln

durchgeführt. Unter der Annahme, daß A116SO ein ist A116SA löslich, jedoch im allgemeinen weniger

Molekulargewicht von etwa 1840 hat (bestimmt, wie löslich in polaren Lösungsmitteln als das Peptid

vorstehend besehrieben), zeigen die korrigierten Ana- A116 SO. Es ist löslich in niederen Alkoholen, wie

lysenwerte, daß mindestens eine der Aminosäure- Methanol, Äthanol, n-Propanol, n-Butanol und

gruppen des Threonins, Serins, Prolins, Glytokolls, ao Pentanol, in niederen Ketonen, wie Aceton und

Alanins, Valins undTsoleucins im Molekül des Peptide Methyläthylketon, doch verhältnismäßig unlöslich in

A116SO vorliegt. Methylisobutylketon und Diisobutylketon. A116SA

Chemische Untersuchungen an A 116SO haben ist auch in Dimethylformamid und Chloroform löslich, folgende Ergebnisse gebracht: Die Biuretprobe auf jedoch verhältnismäßig unlöslich in Acetonitril, Tetra-Protein war positiv. Die Proben nach M ο 1 i s c h 25 chlorkohlenstoff, Benzol, Diäthyläther und alipha- und Benedict auf die Anwesenheit von Kohle- tischen Kohlenwasserstoffen, wie Hexan und Heptan, hydrat waren negativ. A116SO entfärbt Permanganat- Tn Wasser ist A 116SA besser löslich als A116SO. lösungen nicht. Das Peptid ergab einen negativen Die elektrometrische Titration von A116 SA in Ninhydrin-Test auf die Anwesenheit von a-Amino- Dimethylformamid—Wasser (2:1 Volumteile) zeigt gruppen und einen negativen Ferrjchlorid-Test auf die 30 keine titrierbare Gruppe mit einem pK_a-Wert im Anwesenheit von phenolischen Gruppen. Ferner war , Bereich von pK_a 3,5 bis 14.

der Van-Slyke-Test für freie Aminogruppen negativ. Das Molekulargewicht von A116SA beträgt etwa

Außerdem ergab es einen negativen Xanthoprotejn-Test 2150 (bestimmt durch elektrometrische Titration in

auf die Anwesenheit von aromatischen Aminosäuren Eisessig unter Verwendung von Perchlorsäure als

und einen negativen Millon-Test auf die Anwesenheit 35 Titrationsmittel).

von phenolischen Aminosäuren. Die Schwefelanalyse Der Durchschnitt mehrerer Elementaranalysen von

und ein Maltol-Test waren ebenfalls negativ. A116SÄ-Präparaten, die im Vakuum über wasser-

Die Chromatographie von A116 SO an Whatman freiem Calciumsulfat etwa 60 Stunden getrocknet

Papier Nr. 1 ergab, folgende Rt-Werte: R_f = 0,8 in wurden, ergab folgende Analysen werte :

Kohlenstoff 54,52°/₀

Wasserstoff 8,26%

; Stickstoff 13,26%

Sauerstoff (durch Differenz) 23,96 %

Die vorstehenden Werte sprechen für die empirische wurden, ergaben, daß A116 SA die gleichen Amino-

Formel C₉₈H₁₇₅Nu₀Oj₂ für Ä116SA. Ebenso wie im säuregruppen enthält, die in A116SO vorkommen.

Fall von A116 SO ist diese Formel jedoch nur eine Die Analysen wurden auf die für A116 SO beschriebene

Annäherung. Sie kann Änderungen unterliegen, sobald Weise durchgeführt.

die vollständige molekulare Zusammensetzung des 50 A116SA zeigte praktisch das gleiche chemische und

Peptids A116SA bekannt ist. ■.-.-. chromatographische Verhalten wie A116SO.

A116SA weist im ultravioletten Spektralbereich von Die Peptide A116SO und A116SA sind durch ihre

205 bis 400 ηιμ in Wasser bei einer Konzentration von wachstumshemmende Wirkung bei Mikroben gekenn-

etwa 0,03 mg/ml keine bemerkenswerten Maxima auf. zeichnet. Sie besitzen eine hohe Aktivität gegenüber

Das Ultrarotabsorptionsspektrum von A116SA in 55 einer Anzahl von Pilzen einschließlich pathogener

,Chloroform ist in Fig. 2 der Zeichnungen wieder- Pflanzenpilze und Hauptpilze und Hefen. Sie haben

gegeben. Im ultraroten Spektralbereich von 2,0 bis jedoch im allgemeinen nur eine relativ mäßige Aktivität

15 ΐημ zeigen sich bei folgenden Wellenlängen Maxima: gegen grampositive Bakterien und eine verhältnismäßig

3,06, 3,41, 3,45, 3,50,, 5,73, 6,05, 6,53, 6,65, 6,85, 7,06, schwache oder vernachlässigbare Aktivität gegenüber

7,22, 7,45, 7,57, 7,73, 7,87, 8,31, 8,70, 9,18, 9,28, 9,42 60 gramnegativen Bakterien.

Der Durchschnittswert mehrerer spezifischer opti- Versuchsbericht

scher Drehwerte von getrockneten Präparaten von Die erfindungsgemäß erhältlichen Peptide zeichnen

A116SA ist [ä]|⁵° ="'— 92,4°, c = l% in Äthanol sich insbesondere auch durch ein besonders breites

(Gewicht pro Volumen). 65 Wirkungsspektrum aus. Hierin sind sie bekannten

Analysen der Produkte der sauren Hydrolyse von Antibiotica überlegen, wie die in der folgenden Tabelle

A116 SA, welche durch 70- bzw. 90stündiges Vorreifen dargestellten Ergebnisse von Vergleichsversuchen

von Proben mit 5,7ji-Salzsäure bei 107⁰C erhalten zeigen:

Plattenkulturen

Durchmesser der Hemmfläche (mm)

A116 SO I Streptomycin 2,5 ml/ml I 0,25ml/ml

Tetramycin 0,25 mg/ml

Endomycin 10 mg/ml

Griseofulvin 0,25 mg/ml

Actidione 2,5 mg/ml

S. aureus

B. subtilis i.

Sarcina lutea

Mycobacterium avium

S. Pastorianus

Neusospora sp

Candida tropical is

Fusarium moniliforme

Trichophyton mentogrophytes

Proteus vulgaris

Salmonella gallinarum

E.colj

15	19
12	23
14	18
—	26
20
18
15	—
22
22
	15
	19
	15

21
24
20
33

19

17

21
22
20

22
29
22
27
27

29

36

24

Spuren
Spuren

Histoplasma capsulatum ..
Blastomycoses dermatitides
Sporotrichum schenkii ....

Wachstumshemmkonzentration, mcg/ml A116 SO Endomycin

0,37

0,1

0,1

10
10
10

Die erfindungsgemäß erhältlichen Peptide sind also den Vergleichssubstanzen in der Breitspektrumswirkung deutlich überlegen, ausgenommen Endomycin. Dem Endomycin gegenüber besitzen sie aber eine bis zu zehnfach stärkere Wirksamkeit gegenüber bestimmten Mikroorganismen.

Die Peptide A116SO und A116SA werden durch. Kultivieren eines neu aufgefundenen und bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus gleichzeitig hergestellt. Der betreffende Mikroorganismus wurde in einer Bodenprobe aus Jackson County, Missouri, USA., gefunden und aus dieser durch Suspendieren von Portionen der Bodenprobe in sterilem, destilliertem Wasser und Ausstreichen der Suspension auf Nähragarplatten isoliert. Die beimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 25 bis 35° C bebrütet. Nach der Bebrütung wurden Kolonien des A116 SA und A116SO liefernden Mikroorganismus mit einer sterilen Platinschlinge auf Schrägagarröhrchen übertragen. Die beimpften Schrägagarröhrchen wurden zur Gewinnung größerer Mengen Impfmaterial zur Herstellung der Peptide bebrütet.

Der neue entdeckte Mikroorganismus, der die Peptide A116SA und A116SO produzieren kann, wurde unter der Nummer NRRL 2736 in der Agriculture Culture Collection, Northern Utilisation Research and Development Division des U. S.-Department of Agriculture in Peoria, Illinois, USA., hinterlegt.

Der neuentdeckte Mikroorganismus ist in vieler Hinsicht dem früher beschriebenen Mikroorganismus Streptomyces endus (NRRL 2339) ähnlich, der auf Seite 69 der Klassifikation von P r i d h a m et al., Applied Microbiology, 6, S. 52 (1958), aufgeführt ist. Obwohl der Klassifizierung solcher Mikroorganismen eine gewisse Unsicherheit anhaftet, bestehen Gründe zu der Annahme, den neuen Mikroorganismus NRRL 2736 als einen neuen Stamm der Specien Streptomyces endus anzusehen und Streptomyces endus (NRRL 2339), der von der vorstehend genannten Hinterlegungsstelle erhalten wurde, als den engst-

»5 verwandten, bisher bekannten Mikroorganismus zubetrachten. Im Gegensatz zum neuentdeckten Stamm verwertet Streptomyces endus (NRRL2339) D(-f)-Raffinose oder Sorbit nicht nennenswert. Der Organismus Streptomyces endus (NRRL 2339) sowie vier andere, sehr engverwandte Mikroorganismen, nämlich Streptomyces narbonensis (NRRLB-1680), Streptomyces arabicus (NRRLB-1733), Streptomyces naganishii (NRRLB-1816) und S. antimycoticus (die mit A158' bezeichnete und in Macologia, 44, S. 159 [1952], bezeichnete Species), wurden in den hier beschriebenen, bevorzugten Nährmedien kultiviert, doch wurden weder von dem Peptid A116SA noch von dem Peptid A116SO auch nur Spuren festgestellt. Auch wurdebereits durch Züchtung von Streptomyces endus Endomycin und die Antibiotica 9-20 F-ί und 9-20 B hergestellt. Gegenüber den erfindungsgemäß erhältlichen Produkten bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Während die Peptide der Erfindung einen Stickstoffgehalt von 13,8 bzw. 13,26% aufweisen,

♦5 enthält Endomycin 3,7°/₀N. Das bekannte Antibioticum 9-20 F-I hat ein ähnliches Spektrum wie. Endomycin und ist diesem nahe verwandt und zeigt keine Beziehung zu den antibiotischen Peptiden der Erfindung. 9-20 B ist gegen höhere Pilze unwirksam, wogegen die erfindungsgemäß hergestellten antibiotischen Peptide gegenüber höheren Pilzen, wie z. B. Aspergillus niger, CeratostomeHa ulma und Penicil-, Hum expansum, nochwirksam sind.
In den nachfolgenden Absätzen werden die Ergebnisse einer eingehenden taxonomischen Untersuchung der NRRL 2736-Kultur mitgeteilt. Die in der Beschreibung verwendeten Farben stimmen mit den von R i d g w a y , Culture Standards and Nomenclature (1912), angewandten Definition überein.

Mikroskopische Morphologie

Tomatenmark-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 3O⁰C): Sporenketten liegen in kompakten Spiralen vor,' Konidien sind subglobos.

Anorganische Salze-Stärke-Agar (14 Tage bei 3O⁰C): Mikroskopische Morphologie ähnlich der bei Verwendung von Tomatenmark-Hafermehl-Agar.

Kulturcharakteristiken

Czapeks Agar (14 Tage bei 30⁰C):

Mäßiges Wachstum. Spärliches Luftmyzel. Unterseite nahezu ledergelb (near buff).

Glukose-Asparagin-Agar (14 Tage bei 30⁰C):

Spärliches Wachstum, geringes Luftmycel, hellgrau; Unterseite hellgrau.

Anorganische Salze-Stärke-Agar (14 Tage bei 30⁰C): Mäßiges Wachstum. Luftmyzel mäßig, grau, vereinzelte Flächen beinahe schwarz. Unterseite blaß cremefarben (pale cream).

Tomaten-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 3O⁰C):

Mäßiges Wachstum. Luftmyzel mäßig, grau; vereinzelte Flächen, die schwarz werden.

Emersons Agar (14 Tage bei 3O⁰C):

Befriedigendes Wachstum, Luftmyzel spärlich, blaßgrau. Unterseite cremefarben.

Kartoffelschnitzel-Agar (14 Tage bei 30⁰C):

Befriedigendes Wachstum, Luftmyzel befriedigend, fast weiß.

Physiologie

Wirkung bei entrahmter Milch:

Koagulation; teilweise Peptonisierung. HgS-Prpduktion: keine.
Nitratreduktion: keine.
Gelatineverflüssigung: mäßig.

In der folgenden Tabelle sind die Versuchsergebnisse zur Bestimmung der Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch den Mikroorganismus NRRL 2736 zusammengestellt.

+ bedeutet Wachstum und Verwertung; — bedeutet kein Wachstum und keine Verwertung.

Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch den Mikroorganismus NRRL 2736

Verbindung

L(-j-)-Arabinose.
t(+)-Rhamnose

D-Ribose

D(+)-Xylose....
d(—)-Fructose .
d(-{-^-Glucose ..

Lactose

i>(-)-)-Melibiose .

Sucrose

D(+)-Trehalose .
D(+)-Raffinose

Cellulose...

Inulin

i-Inosit

Mannit

d-Sorbit.

Salicin

Wachstum

4-

Die erfindungsgemäße Herstellung der Peptide A116 SO und A116 SA unter Verwendung des neugefundenen Mikroorganismus NRRL 2736 wird im folgenden eingehend beschrieben. ·'■ Wie bereits erwähnt, werden die Peptide A116 SA und A116 SO durch Kultivieren des Mikroorganismus NRRL 2736 hergestellt. Als Nährmedien können zahlreiche Medien verwendet werden, da der Mikroorganismus viele Energiequellen verwerten kann, wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich ist. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, der Erzielung maximaler Ausbeuten der in Rede stehenden Peptide und der Leichtigkeit der Isolierung derselben werden bestimmte Nährmedien bevorzugt. Die zur Herstellung von A116SA und Al 16SO brauchbaren Medien enthalten eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff,

ίο wie Glucose, Saccharose, Fruktose, Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin, braunen Zucker, Maisquellwasserkonzentrat u. dgl. Die bevorzugten Quellen sind Glucose und Stärke. Verwendbare Medien enthalten zusätzlich eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie Leinsamenmehl, Schlachthausabfälle, Fischmehl, Baumwollsamenmehl, Hafermehl, geschroteten Weizen, Sojabohnenmehl, Rindfleischextrakt, Peptone (Fleisch oder Soja), Kasein, Aminosäuregemische u. dgl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl,

ao Kasein und Maisquellwasserkonzentrate. Mineralsalze, z. B. solche, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Kobalt-, Sulfat-, Chlorid-, Phosphat-, Carbonat-, Acetat- und Nitrationen liefern, und eine Quelle für Wuchsstoffe, wie lösliche Destillat-

as rückstände und Hefeextrakt, können den Medien mit guten Ergebnissen einverleibt werden.

Wie es zum Wachstum und zur Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, sollen essentielle Spurenelemente ebenfalls dem Nährmedium zum Kultivieren des erfindungsgemäß verwendeten Actinomyceten-Stammes zugegeben werden. Solche Spurenelemente werden üblicherweise bei der Zugabe der anderen Bestandteile des Mediums als Verunreinigungen zugeführt.

Der Anfangs-pH-Wert des Nährmediums kann in weiten Grenzen variiert werden. Es wurde jedoch als erwünscht festgestellt, daß der Anfangs-pH-Wert des Mediums zwischen etwa pH 5,5 und etwa 8,0 und vorzugsweise zwischen etwa pH 6,0 und etwa 7,0 liegt.

Wie bei anderen Actinomyceten beobachtet wurde, stimmt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus, während welcher A116SA und A116SO gebildet werden, allmählich zu und kann einen pH-Wert von etwa pH 7 bis etwa 8 oder darüber annehmen. Der End-pH-Wert hängt zumindest teilweise vom anfänglichen pH-Wert des Mediums, den im Medium vorhandenen Puffern und der Zeitdauer ab, während welcher man den Mikroorganismus wachsen läßt.

Aerobe Submersfermentationsbedingungen sind die Bedingungen der Wahl für die Herstellung der Peptide. Zur Herstellung verhältnismäßig geringer Mengen können Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden. Zur Herstellung großer Mengen zieht man jedoch das aerobe Tieftankverfahren in sterilen Behältern vor. Das Medium in dem sterilen Behälter kann mit einer Sporensuspension beimpft werden. Auf Grund des mangelnden Wachstums, das erfahrungsgemäß bei Verwendung einer Sporensuspension als Impfmaterial auftritt, zieht man die vegetative Form der Kultur vor. Hierdurch vermeidet man das mangelnde Wachstum, und die Fermentationsanlage wird wirkungsvoller ausgenutzt. Demgemäß ist es erwünscht, zunächst ein vegetatives Impfmaterial des

Mikroorganismus durch Beimpfen einer verhältnismäßig geringen Menge eines Nährmediums mit der Sporenform des Mikroorganismus herzustellen und nach Erhalt eines jungen, aktiven vegetativen Impf-

9 10

materials dieses aseptisch in den großen Behälter zu Flüssigkeit, in der sich der größte Teil der Aktivität

überimpfen. Das Medium, in welchem das vegetative befindet, zur Trockne eingedampft, wobei ein rötlich-

Impfmaterial hergestellt wird, kann das gleiche oder brauner und etwas viskoser Rückstand hinterbleibt,

ein anderes Medium sein als das, welches zur Groß- Der Rückstand kann mit einem Lösungsmittel, wie

produktion von A116SA und A116SO verwendet 5 Chloroform, zur Entfernung von A116SA und

wird. A116SO extrahiert werden. Der Chloroformextrakt

Der Mikroorganismus wächst am besten bei Brut- kann weiter gereinigt werden, indem man ihn durch

temperaturen im Bereich von etwa 25 bis etwa 32°C. eine mit einem Adsorptionsmittel gefüllte Chromato-

AnscheinenderfolgteineoptimaleBildungvonAllöSA graphiersäule leitet, wobei A116SA und A116SO vom

und A116SO bei einer Temperatur von etwa 26 bis io Adsorptionsmittel aufgenommen werden, jedoch be-

30⁰C. stimmte Verunreinigungen durch die Säule hindurch-

Wie bei Tief tankvei fahren üblich, wird durch das treten. Es wurde festgestellt, daß mit Säure gewa-

Kulturmedium sterile Luft hindurchgeblasen. Zu schenes Aluminiumoxyd ein sehr gutes Adsorptions-

einem leistungsfähigen Wachstum des Mikroorganis- mittel ist. Bei Verwendung eines mit Säure gewasche-

mus und der Produktion an A116SA und A116SO 15 nen Aluminiumoxyds kann das adsorbierte A116SA

beträgt das bei der Tankproduktion von A116SA und A 116SO aus der Säule durch Waschen mit einem

und A 116SO verwendete Luftvolumen vorzugsweise niederen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, oder

mehr als 0,1 Volumen Luft in der Minute je Volumen mit einem Lösungsmittel, das eine beträchtliche Menge

Kulturmedium. Ein leistungsfähiges Wachstum und eines niederen Alkohols enthält, eluiert werden. Ein

optimale Ausbeuten an A116SA und A116SO werden 20 festes, gereinigtes Präparat von A116SA und A116SO

erhalten, wenn das verwendete Luftvolumen min- kann durch Eindampfen des Eluats zur Trockne er-

destens 1 Volumen Luft in der Minute je Volumen des halten werden. Falls man eine weitere Reinigung

Kulturmediums beträgt. wünscht, kann die Säulenadsorption wiederholt wer-

Die gebildete Gesamtmenge von A 116SA und den. Andererseits kann das Eluat aus der Säule weiter

A116SO im Kulturmedium läßt sich während der 25 gereinigt werden, indem man es in Methanol auflöst

Vergärung leicht durch Untersuchung von Proben des und zur methanolischen Lösung des A116SA und

Mährmediums auf ihre wachstumshemmende Wirkung A116SO Aktivkohle zusetzt. Die Aktivkohle entfernt

gegenüber einem bekannten Mikroorganismus be- bestimmte Verunreinigungen, während AU6SA und

stimmen. Der Organismus Fusarium moniliforme A116SO in Lösung bleiben. Das A116SA und

eignet sich sehr befriedigend für diesen Zweck. Der 30 A116SO werden aus dem Gemisch durch Abtrennung

Test kann nach der bekannten Trübungsmessung oder der Aktivkohle, z.B. durch Filtration, und Eindamp-

Tassenplattenmethode durchgeführt werden. fen der klaren Methanol lösung zur Trockne wieder-

Im allgemeinen erfolgt maximale Produktion nach gewonnen.

Beimpfung des Kulturmediums innerhalb etwa 2 bis Gegebenenfalls kann ein gereinigtes Einkomponen-

5 Tagen bei Verwendung einer submersen, aeroben 35 tenpräparat von A116SA bzw. A116SO aus deren

Kultur oder Schüttelflaschenkultur und innerhalb etwa Gemischen, z.B. aus den mit Aktivkohle gereinigten

5 bis 10 Tagen bei einer Oberflächenkultur. Präparaten, durch Anwendung von Gegenstromver-

Das Myzel wird aus der Gärmaische in üblicher teilungsverfahren erhalten werden. Ein zur Zeit be-Weise, z.B. durch Filtration oder Zentrifugieren, ab- vorzugtes Lösungsmittelsystem für die Gegenstromgetrennt. Vorzugsweise säuert man die Gärmaische 40 verteilung zur Trennung von A116SA und A116SO vor der Abtrennung des Myzels z.B. durch Zugabe besteht aus einem 0,05molaren Natriumphosphateiner Mineralsäure, wie Salzsäure, an. Es wurde fest- puffer vom pH 6,0 als wäßrige Phase und aus Methylgestellt, daß eine Ansäuerung auf einen pH-Wert von isobutylketon als organische Phase. Es ist jedoch veretwa 2 bis etwa 3 befriedigend ist. Im allgemeinen ständlich, daß man andere Lösungsmittelsysteme zur enthält das abgetrennte Myzel praktisch das gesamte 45 Trennung der beiden Peptide verwenden kann. Bei entstandene A116SA und A 116SO. Aus diesem Grund Vei Wendung des Natriumphosphatpuffer-und Methylwird das Myzel routinemäßig zur Herstellung geteinig- isobutylketon-Lösungsmittelsystems ist das A116 SO ter A116SA- und A116SO-Präparate verwendet. sehr gut löslich in Methylisobutylketonphase, während A116SA und A 116SO können aus dem Myzel durch die A116SA-Komponente zum größten Teil in der Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel, z.B. 50 anfänglichen wäßrigen Phase verbleibt. Gewöhnlich einem niederen Alkohol, abgetrennt werden. Es wurde werden bei einer Sechs-bis-zehn-Röhren-Gegenstromfestgestellt, daß sich Äthanol befriedigend als Extrak- trennung unter Verwendung des bevorzugten Lösungstionsmittel zur Abtrennung wesentlicher Mengen der mittelsystems die beiden Peptide befriedigend gein Rede stehenden Peptide, die im Myzel enthalten trennt.

sind, eignet. Der alkoholische Extrakt der Peptide 55 Auf Grund ihres breiten Wirkungsspektrums gegen wird unter vermindertem Druck, vorzugsweise auf Pilze sind die beiden gemäß der Erfindung hergestellten etwa die Hälfte des Ausgangsvolumens, eingeengt. Peptide in vieler Hinsicht zur Bekämpfung von PiIz-Man läßt den konzentrierten Extrakt gewöhnlich bei erkrankungen brauchbar. So können A116 SA und Gefriertemperatur mindestens etwa 10 Stunden stehen. A116SO mit Erfolg zur Bekämpfung bestimmter Während dieser Zeit scheidet sich gewöhnlich eine 60 pathogener Pflanzenpilze, wie Alternaria solani, ver-Fällung aus. Im allgemeinen hat die Fällung nur einen wendet werden. Zur Bekämpfung solcher Pflanzengeringen Gehalt an A116SA und A116SO und wird schädlinge werden die Peptide vorzugsweise in Form aus diesem Grund gewöhnlich abgetrennt und vei- von Sprays, Stäubemitteln u.dgl., ähnlich wie bei der worfen. Da jedoch die alkoholischen Extrakte in ihrer Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, eingesetzt. Es chemischen Zusammensetzung variieren, können in 65 wurde festgestellt, daß man mit einem Spraymittel, das manchen Fällen die Fällungen einen verhältnismäßig etwa 0,2 bis etwa 2,0 mg/ml enthält, wirksam die Inbeträchtlichen Gehalt an A116SA und A116SO ent- fektion von Tomatenpflanzen mit Alternaria solani halten. Gewöhnlich jedoch wird die überstehende bekämpfen kann.

MaisqueUwasserkonzentrat-SojabohnenmehKIII)

medizin. Die Verbindungen können zur Behandlung Glucose 40 ka

befallener Flächen in Form eines Balsams angewandt Sojabohnenölmehi'['.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 15 kg

^W DieⁿErfindung wird durch das nachstehende spe- * ^SS^SSST^^ 5 ?

zielle Beispiel weiter erläutert. SSSSSSSSdU .!\'. \ \'.!!!!!!!!! 5 &

Auffüllen mit Wasser auf 10001

Beispiel

λ tr * Ii j η X-J .,!in. j , „,„_Λ Das Medium wird mit 363,41 des im Zwischen-

a)Heistelung der Peptide A116SA und A116SO, _{fermenter gezüchteten Impfm}'_ateriaIs ^_ίηιρΛ. _Die

deren Extraktion und Vorreinigung Fermentation wird 92 Stunden bei 3O⁰C durchgeführt.

Eine sporenbildende Kultur von NRRL 2736 wird ^{Durch Zusatz von} Antischaummittel wird das Schäu-

durch Kultivieren des Mikroorganismus auf einem ^ls men unterdruckt. Während der Fermentation wird das

Schrägagar folgender Zusammensetzung hergestellt: Medium ^du«* ^ten von steriler Luft in einer

Menge von 3,17 m³/min belüftet und mit zwei 55,9 cm Kreiselmischern mit 230 U/min gerührt.

Asparagin-Rindfleischextrakt (I) Ein Aliquod von 18,9 1 der Gärmische wird durch

Lösliche Maisstärke 20 g ^{ao tro}Pf^enwei^se Zugabe von 12n-Salzsäure unter Rühren

Asparagin ......... Ig auf pH2,5 eingestellt. Die angesäuerte Gärmaische

Rindfleischextrakt 3 g ^w'^{rd mit 4}^ ^g Diatomeenerde als Filtrierhilfe versetzt

^g₃₁. 20 g ^{und das} Gemisch abfiltriert. Der Filterkuchen wird

Auffüllen mit Wasser '.'.".'".'".' auf 11 gründlich mit Leitungswasser gewaschen. Das Filtrat

*5 und die Waschlaugen werden verworfen. 200 g des Filterkuchens werden dreimal nacheinander mit je

Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2736 700 ml Äthylalkohol extrahiert. Die Äthylalkoholbeimpft und der beimpfte Schrägagar 10 Tage bei etwa extrakte werden vereinigt und unter vermindertem 30°C bebrütet. Nach der Bebrütung wird die sporen- Druck auf 400 ml eingeengt. Man läßt den Äthylbildende Kultur auf dem Schrägagar mit Wasser 3» alkoholextrakt, der A116SA und A116SO enthält, bedeckt und die Oberfläche des Schrägagars zur Ent- im Kühlschrank 16 Stunden stehen. Danach wird der fernung der Sporen und zur Herstellung einer wäßrigen Äthylalkoholextrakt zentrifugiert und die geringe Sporensuspension vorsichtig abgeschabt. Fällung verworfen. Die Lösung, welche A116 SA und

Das aus einem 2,5 cm Schrägagar erhaltene Impf- A 116SO enthält, wird zur Trockne eingedampft. Es material wird unter aseptischen Bedingungen zur 35 bleibt ein rötlichbrauner viskoser Rückstand zurück, Beimpfung einer 500-ml-Portion eines sterilisierten der zweimal mit je 75 ml Chloroform extrahiert wird. Kulturmediums der nachstehenden Zusammensetzung Die Chloroformextrakte werden vereinigt,
verwendet, das in einem 2-1-Erlemneyerkolben ent- Man stellt eine mit Säure gewaschene, mit Alumi-

haltenist: niumoxyd gefüllte Chromatographiersäule mit einem

40 Durchmesser von 1 cm und einer Höhe von 18,5 cm

Maisquellwasserkonzentrat—Hefe (II) her und wäscht diese gründlich mit Chloroform. Die

Säule wird mit einem 25-ml-Aliquod der vereinigten

Glucose 15 g Chloroformlösungen beschickt. A116 SA und A116 SO

Maisquellwasserkonzentrat 5 g werden an Aluminiumoxyd adsorbiert, während beHefe 15 g 45 stimmte Verunreinigungen die Säule passieren, wenn

Calciumcarbonat 3 g man sie mit 50 ml Chloroform eluiert. Die mit Chloro-

Auffüllen mit Wasser auf 11 form eluierte Säule wird mit 50 ml Methanol eluiert.

Das Methanoleluat, das A 116SA und A 116SO ent-

Man bebrütet 48 Stunden bei 28 ⁰C und schüttelt auf hält, wird zur Trockne eingedampft. Man erhält eine einer Rotationsscbüttelmascbine mit 110 U/min bei 50 schwachgelbgefärbte Festsubstanz, welche Fusarium einem Ausschlag von 50 mm und erhält ein vegetatives moniliforme hemmt. Ausbeute 440 mg.
Impfmaterial.

Zur Herstellung einer größeren Menge vegetativen

Impfmaterials werden 0,941 eines vegetativen Ino- b) Weitere Reinigung des A116 SO und A116 SA

culums aus dem vorhergehenden Kolben aseptisch als 55 enthaltenden Gemisches

Impfmaterial zu 9461 des sterilen Maisquellwasser- ^durch Adsorption an Aktivkohle

konzentrat—Hefe (TI)-Mediums gegeben, das in einem

13251 fassenden Zwischenfermenter aus nichtrostend 300 mg eines gemäß a) hergestellten, geieinigten,

dem Stahl enthalten ist. 94 ml Entschäumungsmittel A116 SA und A116 SO enthaltenden Präparates werwerden dem Kulturmedium zur Verhinderung einer 60 den in 10 ml Methanol gelöst. Die Methanollösung zu starken Schaumbildung zugesetzt. Man läßt das wird mit 300 mg Aktivkohle versetzt und das Gemisch Inoculum 27 Stunden bei 3O⁰C wachsen. Während 30 Minuten gerührt und filtriert. Der Filterkuchen der Wachstumszeit wird das Medium mit steriler Luft wird mit 5 ml Methanol gewaschen und die Waschin einer Menge von 0,765 m³/irün belüftet und mit lauge mit dem Filtrat gereinigt. Das A116SA und zwei 40,6-cm-Kreiselmischern mit 160 U/min gerührt. 65 A116 SO enthaltende vereinigte Filtrat wird zur In einen 64351 fassenden Produktionsfermenter aus Trockne eingedampft. Man erhält 220 mg einer cremenichtrostendem Stahl werden 45421 eines Mediums farbenen Festsubstanz, die aus A116SA und A116SO folgender Zusammensetzung gegeben: besteht. Das Präparat hemmt Fusarium moniliforme.

Die Reinigungsstufe mit Aktivkohle kann gegebenenfalls wiederholt werden.

c) Auftrennung des A116SA und A116SO

enthaltenden Gemisches

in die reinen Peptide A116 SA und A116 SO

sowie deren weitere Reinigung

20 g eines A116SA und A116SO enthaltenden Präparates, wie es z.B. gemäß b) erhalten wird, werden zur Auftrennung in reines, einheitliches A116SA bzw. A116 SO mit Hilfe eines Gegenstromverteilungsverfahrens eingesetzt, bei dem als wäßrige Phase ein 0,05molarer Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0, der mit Methylisobutylketon gesättigt ist, und als organische Phase Methylisobutylketon, gesättigt mit dem Phosphatpuffer, verwendet wird. Es wird eine Gegenstromverteilung mit sieben Röhren durchgeführt, wobei das Volumen in beiden Phasen 200 ml beträgt.

Die Methylisobutylketonphasen, welche A116 SO enthalten, werden vereinigt und dreimal mit etwa 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand wird in 25 ml Aceton gelöst und die Acetonlösung filtriert. Die Fällung wird verworfen und die überstehende Lösung zur Trockne eingedampft. Man erhält 4,9 g einer hellcremefarbenen, amorphen Festsubstanz, die aus A116 SO besteht. Das Produkt hemmt Fusarium moniliforme. Das Produkt läßt sich weiter entfärben, indem man es in Methanol zu einer Mindestkonzentration von etwa 5% löst, die Lösung mit Aktivkohle entfärbt und das gereinigte A116 SO durch Eindamp. fen der entfärbten Lösung wiedergewinnt.

Die wäßrigen Phasen, welche A116 SA enthalten, werden vereinigt und dreimal mit 300-ml-Portionen eines Lösungsmittels extrahiert, das aus 7 Volumteilen Methyläthylketon und 3 Volumteilen n-Butanol besteht. Die wäßrige Phase wird verworfen, und die Extrakte werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand besteht aus A116SA. Der

ίο trockene Rückstand wird in 25 ml Aceton gelöst und zur Abtrennung einer geringen Menge einer Fällung filtriert. Die Fällung wird verworfen, und das Acetonfiltrat wird zur Trockne eingedampft. Man erhält 12,9 g hellcremefarbenes, amorphes, festes A116SA.

Das Produkt hemmt Fusarium moniliforme.

Das A116SA-Produkt kann durch Behandlung mit Aktivkohle nach dem für A116 SO beschriebenen Verfahren weiter gefärbt werden.

Claims (1)

1. Paten tansptuch:

   Verfahren zur fermentativen Herstellung der mit A116S0 und A116SA bezeichneten, antibiotisch, insbesondere fungicid wirkenden Peptide, d adurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces endus NRRL 2736 in einem üblichen, Kohlehydrate, anorganische und organische Stickstoffverbindungen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium züchtet.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Korzybski und Kurylowicz, »Antibiotica«, 1961, S. 641/642.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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