DE1617915A1 - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kalamycin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums KalamycinInfo
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- DE1617915A1 DE1617915A1 DE19671617915 DE1617915A DE1617915A1 DE 1617915 A1 DE1617915 A1 DE 1617915A1 DE 19671617915 DE19671617915 DE 19671617915 DE 1617915 A DE1617915 A DE 1617915A DE 1617915 A1 DE1617915 A1 DE 1617915A1
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- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
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Description
Dr, Walter BsH
Vu'A'iis
Frankfurt a, M.-Höchst
Unsere i\ir. 13 688
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kalamycin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
des neuen Antibiotikums Kalamycin (U-19, 718).
Kalamycin ist eine chemische Verbindung, die durch "
Kultivierung von kalamycinproduzierenden Actinomyceten in einem wässrigen Nährmedium hergestellt werden kann. Es ist
eine saure Verbindung, welche die Eigenschaft hat, das Wachstum von graspositiven und gramnegativen Bakterien, z.B.
Dr.Ti.-af
21.3.1967 - 1 - 11204
!09815/2071
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus
faecalis, Streptococcus hemolyticus, Diplococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella schottmuelleri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas phaseolicola, Xanthomonas pruni und Erwinia amylovora, ungünstig
zu beeinflussen. Kalamycin hat ausserdem hemmende Wirksamkeit gegen verschiedene Pilze, z.B. Blastomyces der-
^ matitidis, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum,
Trichophyton violaceum, Trichophyton asteroides, Trichophyton mentagrophytes, Pusarium oxysporum f. cubense und Alternaria
solani. Dementsprechend kann Kalamycin allein oder in Verbindung mit anderen antibiotischen Substanzen zur Verhinderung
des Wachstums, bzw. zur Verminderung der Zahl von Bakterien und Pilzen, wie oben beschrieben, in verschiedenen Umgebungen
verwendet werden. Es kann beispielsweise als Desinfektionsmittel für verschiedene zahntechnische und medizinische Ausrüstungsgegenstände,
die mit Staphylococcus aureus infiziert sind, verwendet werden. Es ist ausserdem als Pilzbekämpfungsmittel
in industriellen Konservierungsmitteln nützlich, z.B.
als ein fungizides Spülmittel für gereinigte Kleider und zur
Imprägnierung von Papieren und Geweben; Ausserdem ist es nützlich zur Unterdrückung des Pilzwachstums empflindlicher
Organismen bei Platten-BeStimmungsmethoden und anderen biologischen
Medien. Kalamycin kann ausserdem als Futterzusatz
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zur Förderung des Wachstums von Tieren, z.B. Säugetieren,
Vögeln, Fischen oder Reptilien, verwendet werden.
Kristallines Kalamycin hat die folgenden
chemischen und physikalischen Eigenschaften:
chemischen und physikalischen Eigenschaften:
Farbe: orange
Elementaranalyses C 63,80? H 4,07? 0 31»8l. %
Summenformel: C1^EL0O,-
J.O Xd O
Molekulargewicht: 288 (Titration)
300 (Massenspektrometer)
Schmelzpunkt: 163 - 166 C Ultraviolett Absorptionsspektrum:
Methanol: max. bei 212 mu, a = 138,58 max. bei 256 mu, a = 36,72
sho bei 268 mu, a = 35?19
max. bei 425 mu, a = 14,84
»01 η HOl in Methanols ™
max. bei 212 mu, a = 133,04
laaxo bei 256 mu, a - 36,66
sho bei 268 a|aP a = 34,81
max, bei 425 m^8 a - 14F86
U f I
Wasseri max. bei 213 πιμ, a = 124,42
sh. bei 260 ;nu, a = 37,41
max. bei 265 mu, a = 37,55
max. bei 428 mu, a = 13,67
.01 η KOH: max. bei 219 mu, a = 110,46
max. bei 275 mp, a = 35,97
max. bei 525 mji, a = 16,58
Infrarotspektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum des Kalamycins
suspendiert in Mineralöl, wird in Figur 1 der Zeichnungen wiedergegeben. Kalamycin zeigt
Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in reziproken Zentimetern:
3640 (W) 1458 (M) OeI 1237 (M)
3550 (W) 1452 (S) 1211 (S)
2950 (S) (OeI) 1416 (W) 1200 (M)
^ 2920 (S) (OeI) 1406 (W) 1195 (M)
2850 (S) (OeI) 1399 (W) 1185 (W)
1837 (W) 1376 (M) (OeI) 1158 (S)
1807 (W) 1365 (M) 1110 (M)
1772 (S) 1355 (M) 1096 (M)
1760 (S) 1340 (M) 1076 (M)
1728 (W) 1315 (S) 1063 (M)
-A-
10 981 S/20.71
1666 | (S) |
1653 | (S) |
1648 | (S) |
1625 | (S) |
1595 | (W) |
1575 | (W) |
1478 | (W) |
864 | (M) |
845 | (W) |
837 | (M) |
802 | (W) |
5 | 1617915 |
1306 (M) | 1056 (M) |
1298 (M) | 1030 (M) |
1285 (S) | 1019 (W) |
1281 (M) | 993 (M) |
1265 (M) | 972 (W) |
1258 (M) | 928 (W) |
1246 (S) | 903 (M) |
890 (W) | |
796 (W) | 708 (S)" |
783 (S) | 698 (M) |
753 (S) | 778 (M) |
737 (M) | 776 (M). |
Die Bandenintensitäten werden als "S", 11M", bzw.
"W" bezeichnet und werden annähernd in Beziehung zum Hintergrund in der Nähe der Banden ausgedrückt. Eine "S"-Bande zeigt
dieselbe GrössenordnVung an Intensität wie die stärkste Bande ,
des Spektrums? "!"-Banden sind zwischen einem Drittel und
zwei Dritteln der Intensität der stärkstem Bande und "Wls-Banden
zeigen weniger als ein Drittel an Intensität wie die stärkste Bande. Siege Bsurteilungen. erfolgen auf der Basis einer
prozentualen Sransmissioxissfe&l&e
Ealamycin zeigt ein charakteristisches Papierchromatowie
In Figur 2 der Zeichnungen ggstigt, wenn die
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folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet werden:
I. 1-Butanol, Wasser (84:16); 16 Stunden II. 1-Butanol, Wasser (84il6) plus 0,25 #
p-Toluolsulfonsäure; 16 Stunden
III. 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:1:1); 16 Stunden
IV. 2 $> Piperidin {Vol./Vol.) in 1-Butanol, Wasser
(84:16); 16 Stunden
V. 1-Butanol, Wasser (4:96); 5 Stunden VI. 1-Butanol, Wasser (4:96) plus 0,25 fi
p-Toluolsulfonsäure; 5 Stunden
Die für die Herstellung von Ealamycin erfindungsgemäss
verwendeten Actinomyceten sind ein neu isolierter Stamm des bekannten Mikroorganismus Streptomyces tanashiensis. Dieser
neu isolierte Stamm wurde als Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa bezeichnet. Eine der charakteristischen Eigenschaften
dieses Stammes ist die Produktion von Kalamycin unter den nachfolgend beschriebenen Fermentationsbedingungen. Eine Kultur
von Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa kann von der Sammlung der Northern Utilization Research and Development Division,
Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. bezogen werden. Seine Registrierungsnummer in dieser Sammlung ist NRRL 3215.
109815/207!
Die Aehnlichkeit von Streptomyces tanashiensis
Stamm KaIa mit der berichteten Beschreibung von Streptomyces
tanashiensis (vgl. Waksman, The Actinomycetes, Band 29 1961,
Seite 279) veranlasste den Vergleich der beiden Mikroorganismen unter den nachfolgend beschriebenen Fermentationsbedingungen.
Diese Untersuchung zeigte, dass S. tanashiensis, KBRL B-1692
Kalamycin in Mengen produzierte, die ausreichten, um papierchromatographisch
nachgewiesen werden au können. Die Produktion von Kalamycin durch irgendeinen Stamm von Streptomyces tanashiensis,
NRRL (B-1692) eingeschlossen^ ist jedoch nie zuvor berichtet
worden.
S. tanashiensis Stamm EaIa ist melaninpositiv, hat graues bis grau-rotes atmosphärisches Wachstum und hat gerade
bis gebogene Sporophoren, die bei gerader-Durchsieht in der
Mitte durchsichtig und an den Polen dunkel erscheinen. Das beste Wachstum zeigt .er bei 18 bis 280O.
Die neue Verbindung wird erfindungsgemäss liergestellt,
wenn der bearbeitete Organismus' in eine® wässrigen Nährmedium unter submerges,, aerobes Bedingungen g©stJefetet wird.
Es versteht sich awsserdesij, dass für die Herstellung begrenzter
Mengen Qberfläelienlsul türen in Piasehen angewendet werden
können. Der Organismus wird ia ©iaem HUänsgcLiism gesüsMtet,
das eine KoWLenstoffquell® soBo sia ©ssiailierfearss Eohlenfejfdrat,
und eiae Stielsstoff quell© 9 SoBo eise assiBiliertore Stickstoff-
verbindung oder eiweissartiges Material, enthält. Bevorzugte
Kohlenstoffquellen sind unter anderem Glucose, Rohzucker,
Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und ähnliche. Bevorzugte Stickstoffquellen sind unter
anderen Maisweichwasser, Hefe, autolysierte Bierhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl,
Milchfeststoffe, Pancreas-Enzym-Hydrolysat von Kasein, Schlempe, tierische Eiweissflüssigkeiten, Fleisch- und
Knochenabfälle und ähnliches. Vorteilhafterweise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden. Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan,
Kobalt, Eisen und ähnliche brauchen den Fermentationsmedien nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und ungereinigte
Ingredientien als Bestandteile der Medien verwendet werden. Die erfindungsgemässe Produktion der Verbindung kann bei jeder
beliebigen Temperatur, die ausreichendes Wachstum des Mikroorganismus, z.B. zwischen ca. 18° und 4O0C, und vorzugsweise
zwischen ca. 20° und 320C, bewirkt, durchgeführt werden. Für
gewöhnlich wird optimale Produktion der Verbindung in ca. 2 bis 10 Tagen erreicht. Das Medium bleibt während der Fermentation
normalerweise ziemlich dicht am Neutralpunkt oder auf der
alkalisehen Seite * Den End-pH-Wert hängt sum Teil von den
eventuell vorhandenen Puffern ab und zum Teil von dem AnfangspH-Wert
Sea Kulturmediums, welcher VOrteilfeafterweise vor der
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Sterilisation auf einen pH-Wert von ca. 7,2 eingestellt wird.
Wenn die Züchtung in grossen Gefässen und Tanks durchgeführt wird, dann wird vorzugsweise anstelle der Sporenform
die vegetative Form zur Beimpfung verwendet, um eine deutlich ausgeprägte Verzögerung in der Produktion der neuen
Verbindung und die damit verbundene? ungenügende; Ausnützung
der Apparatur zu vermeiden. Dementsprechend ist es wünschenswert, ein· vegetatives ■" Inoculum in einer Nährbrühenkultur zu *
züchten, indem die Brühenkultur mit einer aliquoten Menge aus
oder
einer Boden- Schrägkultur beimpft wird. Wenn auf diese Weise ein junges, aktives, vegetatives Inoculum bereit gestellt ist, dann wird es aseptisch in grosse Gefässe oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche sein, das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird, oder es kann verschieden davon sein, solange es nur so beschaffen ist, dass gutes Wachstum des Mikroorganismus* erreicht wird. ''j|
einer Boden- Schrägkultur beimpft wird. Wenn auf diese Weise ein junges, aktives, vegetatives Inoculum bereit gestellt ist, dann wird es aseptisch in grosse Gefässe oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche sein, das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird, oder es kann verschieden davon sein, solange es nur so beschaffen ist, dass gutes Wachstum des Mikroorganismus* erreicht wird. ''j|
Die neue erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist eine saure, chemische Verbindung, die die Summenformel C-IgH12Og
hat. Sie ist löslich in den folgenden lösungsmitteln: Aethylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnlichen aliphatischen
Estern? Aceton, Methyläthylketon, Jsopropylbutylketon, und
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ähnlichen niedrigen Alkanonen; Chloroform, Methylenchlorid
und ähnlichen halogenieren Kohlenwasserstoffen und Dimethylsulfoxyd.
Kalamycin hat ausserdem einen beträchtlichen Löslichkeitsgrad in niedrigen Alkanolen, z.B. Methanol,
Aethanol, Isopropanol, den Butanolen und ähnlichen Verbindungen. Es ist relativ unlöslich in Wasser, Cyclohexan und Aether.
Eine Vielzahl von Verfahren kann zur Isolierung und
* Reinigung von Kalamycin angewendet werden, z.B. Lösungsmittelextraktion,
Silikagelchromatographie, Flüssig-Flüssig-Verteilung in einer Crdg-Apparatur und Kristallisation aus Lösungsmitteln.
Lösungsmittelextraktion-Verfahren sind für gewerbliche Gewinnung bevorzugt, da sie weniger Zeit in Anspruch nehmen und
weniger teuer sind. Silikagelchromatographie ist die bevorzugte Reinigungsmethode.
Bei einem bevorzugten Gewinnungsverfahren wird Kalamycin aus dem Kulturmedium durch Abtrennung des Mycels und
* der ungelösten Feststoffe durch herkömmliche Mittel, wie z.B.
Filtration oder Zentrifugation, isoliert. Bas Antibiotikum
wird dann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe durch Extraktion gewonnen. Für die Extraktion des Kalamycins aus der
filtrierten Brühe, können Lösungsmittel, in denen es löslich ist, wie oben beschrieben, verwendet werden. Methylenchlorid
ist das bevorzugte Extraktionsmittel. Der durch Methylenchlorid-
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extraktion erhaltene Extrakt kann im Vakuum zu einer wässrigen Lösung eingedampft werden^ die ihrerseits gefriergetrocknet
.werden kann, um das rohe Antibiotikum direkt zu ergeben. Dieses
Präparat kann für Zwecke, bei denen ein höherer Reinheitsgrad des Antibiotikums nicht erforderlich ist, verwendet werden.
Kalamycin kann aus filtrierten Permentationsbrühen
bed pH-Werten von ca. 5,0 bis T5O extrahiert werden. Bei
wässrigen pH-Werten von ca. 10,0 und höher, wird Kalamycin nicht merklich durch die obigen Lösungsmittel, in denen es
löslich ist, extrahiert» Unter Ausnutzung dieser Eigenschaften kann Kalamycin bei einem pH-Wert von weniger als 99O in eines
der obigen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, extrahiert
werden. Es kann dann bei einem pH-Wert von mehr als 10,0 mit Wasser ruckextrahiert wgrdea und dann bei einem pH-Wert vosi
weniger als 9^0 t7ie&@? in ©in Lösungsmittel, in dem es löslich
ist, extrahiert werden«, 3D@r Eaäextrakt kann dass zur Trockne
eingedampft vter&&n9 um @in rohes !Präparat von lalasayein au
■ Ws&lweis© 3sam B&lamysia. aus i@m
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88 und 9? wsa Iwraisij, I@a ÄMst&iasöli©2°Ms^g ΰ 2O Mflag© (1958)
Sohn Wiley aaä S©ass 1$i©oV vex=a©tstp falls g^iviasehti, salt Di
vinylbenzol, hergestellt nach dem Verfahren, das auf Seite
84 des oben erwähnten Werkes von Kunin angegeben ist, quaternisiert, mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin nach
dem auf Seite 97 des oben erwähnten Werkes von Kunin angegebenen Verfahren. Anionenaustauscherharze dieses Typs werden
unter den Handelsnahmen Dowex 1, Dowex 2, Dowex 3» Amberlite IRA-400, Duolite A-102 und Permutit S-I in den Handel ge-
^ bracht.
Als weitere Alternative kann Kalamycin aus dem filtrierten Kulturmedium oder dem organischen Extrakt nach
Absorptionsmethoden unter Verwendung solcher Adsorbentien wie Kieselsäure, Entfärbungskohle oder Entfärbungsharz, ein geeignetes
Entfärbungsharz ist Permutit DR, U.S, Patentschrift 2 702 263, Tonerde oder Plorisil (ein synthetisches Silikat
der Art wie in U.S. Patentschrift 2 393 625 beschrieben und von der Ploridin Co. vertrieben) isoliert werden. Das adsorr
bierte Antibiotikum kann von dem Adsorbens in verhältnismässig reiner Form durch Elution mit einem geeigneten organischen
Lösungsmittel, z.B. einem der oben erwähnten, in dem : Kalamycin löslich ist; wiedergewonnen werden.
Hochreines Kalamycin kann dadurch gewonnen werden, dass eines der oben beschriebenen unreinen, trockenen Präparate
von Kalamycin der Silikagelohromatogüsphie und Kristallisation
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unterworfen wird, unter Verwendung von Lösungsmitteln
wie Aethylacetat und Cyclohexan zur Entwicklung der Säule.
Die von der Silikagelchromatographie gewonnen Fraktionen
können eingedampft werden, um kristallines Kalamycin zu erhalten.
Salze des Kaiamyeins werden erhalten, indem die
freie Säure des Kalamycins und eine anorganische oder organische Base verwendet werden. Die Kalamycinsalze können beispiels- (J
weise hergestellt werden, indem die freie Säure Kalamycin in
Wasser gelöst wird, indem eine verdünnte Base zugegeben wird, bis der pH-Wert der Lösung etwa 10,0 bis 11,0 beträgt und indem
die Lösung gefriergetrocknet wird, um einen trocknen Rückstand zu ergeben, der aus dem Kalamycinsalz besteht. Kalamycinsalze,
die hergestellt werden können, sind unter anderen, die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze. Andere Salze des Kalamycins,
darunter solch© mit organischen Basen, wie primären, sekundären und tertiären Monoaminen, sowie solchen mit Polyaminen, können J
ebenfalls nach den oben beschriebenen oder nach anderen allgemein angewendeten Verfahren hergestellt werden. Andere wertvolle
Salze werden mit therapeutisch wirksamen Basen, welche den Salzen zusätzliche therapeutische Wirksamkeit vermitteln, gewonnen.
Solche Basen sind beispielsweise die Ririnbasen, wie
Theophyllin» Sheobromin, Ooffein. oder Derivate solcher Purinbasanj
AiitihiataminbassLi, welche in Stand© einä, Salze mit
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schwachen Säuren zu bilden; Firidinverbindungen, wie Nikotinsäureamide,
Isonikotinsäurehydrazide und ähnliche; Phenylalkylamine, wie Adrenalin, Ephedrin und ähnlichej Cholin
und andere. Salze des Kalamycins können für dieselben biologischen
Zwecke wie die freie Säure verwendet werden.
Kalamycin hat ein breites antibakterielles Spektrum
wie in Tabelle 1 gezeigt wird. Die antibakterielle Wirkungsfc breite wurde nach einer Röhrchen-Verdünnungs-Bestimmungs-'
Metode ermittelt, wobei das Untersuchungsmedium BHI war (Brain Heart Infusion Broth, Difco, Detroit, Michigan). Bestimmungsröhrchen
(18 χ 150 mm) wurden in üblicher Weise hergestellt, wie von Snell, E.E., Vitamin Methods, Vol. I, Academic
Press, Inc., New York 1950, S. 327, beschrieben. Testorganismen, die 18 Stunden lang bei 370C gezüchtet worden
waren, wurden zur Beimpfung des Testmediums verwendet. Die Beurteilung erfolgte nach 20 Stunden.
Tabelle I
Antibakterielle Wirkung von Kalamycin
Antibakterielle Wirkung von Kalamycin
Test-Organismus Minimale Inhibitions-
_________ Konaentration in ug/ml
Staphylococcus aureus 2
Streptococcus hemolyticua 16 Streptococcus faecalis 4
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Escherichia coli 250
Proteus vulgaris 125
Klebsieila pneumoniae 250
Salmonella schottmuelleri 125
Pseudomonas aeruginosa 125
Bacillus subtilis 1
Diplococcus pneumoniae 1
Saccharomyces pastorianus 8
Kalamycin hat fungizide Wirksamkeit, die in Tabelle II
gezeigt wird. Das fungizide Spektrum wurde durch Agar-Platten-Verdünnungsmethode
bestimmt.
Tabelle II Fungizide Wirksamkeit von Kalamyein
lest-Organismus Minimale Inhibitions-
Konzentration in Mg/ml
Noc*-ardia aeteroides | 1 |
Coccidiodes iausitis | 1 |
Blastomyces dermatitidis | 1 |
Geotrichum spe | 10 |
HormodendruM compaetim | 1 |
Phialcphora "vernseoaa | 10 |
Histoplasma eapeulatiim | 1 |
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Cryptococcus neoformans 1
Sporotrichüm schenckii 10
Monosporium apiospermum 10
Trichophyton rubrum 1
Candida albicans ABBOTT 10
Trichophyton violaceum 10
^ Trichophyton interdigitale 10
Trichophyton asteroides 10
Trichophyton mentagrophytes 10
Kalamycin zeigt ausserdem Aktivität gegen Protozoen,
indem es die Protozoen 0chromo.nas danica und Tetrahymena
pyriformis bei in-vitro-Tests inhibiert. Kalamycin wurde auf 12,7-mm-Papierscheiben aufgetragen, diese wurden dann auf
Agar-Platten, die vorher mit dem Test«Organismus besät worden
waren, gelegt. Die Platten wurden dann bei Zimmertemperatur P bebriltet und die Kontrolle erfolgte nach 24 Stunden.
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Die neue erfindungsgemäss hergestellte Verbindung, Kalamycin, ist.gegen Bacillus subtilis wirksam
und kann zur Verringerung oder Verhinderung des Geruches von Fisch und Fischkörben, der durch diesen Organismus verursacht
wird, verwendet werden. Es kann ausserdem zur Behandlung der Brutplätze von Seidenwürmern (silk worms) zur
Verhinderung oder Verringerung von Infektionen, die durch
diesen Organismus verursacht werden, verwendet werden. Da %
Kalamycin ausserdem gegen Crytococeus neoformans wirksam ist, kann es zur Behandlung von Taubenschlägen zur Bekämpfung dieses
Pilzes, der in Taubenmist gefunden worden ist, verwendet werden. (Journal of American Medical Association, VoI 191,
Nr. 4, 25. Januar 1965» Seiten 269 - 274). Die neue erfindungs- *
gemäss hergestellte Verbindung kann ausserdem als fungizides
Mittel für Schuhoberleder verwendet werden (U.S. Patentschrift 3 130 505). Darübei^iinaus kann das neue erfindungsgemäss hergestellte
Antibiotikum zum Aufwischen von Laboratoriumstischen M in einem pilzkundlichen Laboratorium verwendet werden* Kalamycin
kann zur Bekämpfung und Ausrottung verschiedener pathogener Pilze und Bakterien auf Pflanzen und ihren Früchten verwendet
werden. Beispielsweise kann Kalamycin zur Bekämpfung und Ausrottung des Mehltaus von Kartoffeln, der durch Alternaria solani
verursacht wird; verwendet werden. Krankheiten von Hosen und Mehltau von Birnen und AepfelnP verursacht durch Erwinia
amylovora; schwarze Flecken auf Pflaumen, Aprikosen und Pfirsichen, verursacht durch Xanthomonas prunij Mehltau
von Bohnen, verursacht durch Pseudomonas phaseolicola und die Panamakrankheit von Bananen (Bananenwelke, "banana wilt'·)»
verursacht durch Fusarium oxysporum f. cubense, verwendet werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben bevorzugte Ausführungsformen
des erfindungsgemässen Verfahrens. Alle Prozentangaben sind Gewichtsangaben und alle Lösungsmittelmischungsverhältnisse
sind Volumenverhältnisse, wenn nicht anders angegeben·
A· Fermentation
Ein Boden-Stamm von Streptomyces tanashiensis, Stamm EaIa, NBBL 3215, wurde zur Beimpfung einer Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben
verwendet, von denen jeder 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das die folgenden Bestandteile enthielt:
Glttkosemonohydrat 25 g/Liter
Hjarmamedia* 25 g/Liter
Leitungswasser qu.s. Rest
*Pharsiamedia ist ein technisch reines Baumwollsamenmehl, hergestellt
von Trader's Oil Mill Company, Port Worth, Texas USA.
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Die Kolben wurden 3 Tage lang bei 280C auf einer
Gump-Rotations-Schüttelmaschine mit 250 tlpm bebrütet.
Das oben beschriebene Inokulum wurde zur Beimpf ung einer Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, von denen
jeder 100 ml eines sterilen Fermentationmediums enthielt. ■ Die Beimpfungsmenge war 5 ml eines Inokulums pro 100 ml Fermentationsmedium«
Das Fermentationsmedium bestand aus den folgenden Bestandteilen:
Glukosemonohydrat 25 g/Liter
Wilson·s Eiweissflüssigkeit
Nr. 159* 5 g/Liter
•Kalziumkarbonat 5 g/Liter
Leitungswasser qu.s. Rest
»Wilson's Eiweissflüssigkeit Nr. 159 ist ein hydrolysiertes
Eiweisspräparat tierischen Ursprungs» Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxyd
auf einen pH-Wert von 7»2 eingestellt.
Die oben beschriebenen beimpften Fermentationskolben wurden 5 Tage lang bei einer Temperatur von 320C auf einer
Gump-Rotations-Schüttelmaschine mit 250 Upm bebrütet.
Der antibiotisehe Titer der Gärbrühen wurde mittels
einer Scheiben-Platten-Besümmungsiaethode tanter Verwendung des
Mikroorganismus Sacciiaromyces cerevisiae überwacht. Ein ühtersuöhungsagar
der folgenden Zusammensetzung ward© mit Saechharomyces
cerevisiae beimpfts
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Dextrose 30 g/Liter
Hefe-Extrakt (Difco) 7 g/Liter
KH2PO4 ' 5 g/Liter
Agar-Agar 20 g/Liter
Destilliertes Wasser q.s. Rest.
Petrischalen werden gegossen und eine 12,7 mm Papierscheibe wird auf den festgewordenen Agar-Agar gelegt. Eine
fc Menge von 0,08 ml des Kalamycinpräparates wird zugegeben und
die Zone der Wachstumshemmung wird nach einer Inkubationszeit von 18 Stunden bei 280C bestimmt. Die Aktivität wird in Bioeinheiten
ausgedrückt. Eine Bioeinheit (BE) ist definiert als die Konzentration des Antibiotikums, die eine Wachstums-Hemmungs-Zone
von 20 mm unter Standard-Bestimmungs-Bedingungen ergibt.
Wenn beispielsweise eine Fermentationbrühe im Verhältnis 1 : verdünnt werden muss, um eine Wachstums-Hemmungs-Zone von 20 mm
zu ergeben, dann ist die Stärke einer solchen Brühe = 100 BE k pro ml.
Die obige Bestimmungsmethode kann auch mit den Mikro-. Organismen Saccharomyces pastorianus anstelle von Saccharomyces
cerevisiae durchgeführt werden.
Eine Schüttelkolben-Fermentation von Kalamycin, wie oben beschrieben, ergibt 5,7 Bioeinheiten gegenüber,Saccharomyces
cerevisiae.
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B. Gewinnung
Die gesamte Brühe (100 ml) einer Kalamycin-Fermentation,
wie oben beschrieben, wurde mit 5 i° ihres Gewichtes an Kieselgur
versetzt und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einem
Zentel Volumen Wasser gewaschen und das Waschwasser wurde zu der filtrierten Brühe gegeben. Die filtrierte Brühe und das
Waschwasser wurden mit Aethylacetat extrahiert. Der Aethylacetatextrakt
wurde zu einer wässrigen Mischung eingedampft und gefriergetrocknet und ergab ein unreines Präparat von
Kalamycin. Das Gewinnungsverfahren, wie oben beschrieben, lieferte das folgende Ergebnis:
Stufen | Menge | Gehalt (S. cerevisiae) |
Gesamtbrühe | 100 ml | 1,0 Bioeinheiten/ml |
Klare Brühe | 100 ml | 0,95 Bioeinheiten/ml |
Aethylacetatextrakt | 95 ml | 1,10 Bioeinheiten/ml |
Gefriergetrockneter
Extrakt von Kalamycin 16 mg 5»2 Bioeinheiten/mg
G. Reinigung
(1) Silikagel-Chromatographie.
Ein unreines Präparat von Kalamycin, das nach einem
der oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurde, wurde an einer Silikagel-Chromatographie-Säule gereinigt. Die Säule wurde auf
" 21 " ORIGINAL INSPECTED
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folgende Weise hergestellt:
5 kg Silikagel (Silikagel Nr. 7734, E. Merck AG, Darmstadt, 0,05 - 0,20 mm für Chromatographie) wurden mit 4,0 Litern einer
wässrigen Lösung, die 136,0 g KH2PO4 und 142,0 g Na3HPO4 enthielt,
gemischt. Der Ueberschuss an Wasser wurde durch Verdampfung
entfernt, und das gepufferte Gel wurde bei einer Geltemperatur von 120 - 1300C etwa 2 Stunden lang aktiviert und
auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das abgekühlte, gepufferte Gel wurde mit einer genügenden Menge Hexan verrührt, um eine giessfähige
Mischung zu erhalten, die genügend dünnflüssig war, um Luftblasen entweichen zu lassen. Diese Mischung wurde in eine
lO-cm-0-Glassäule gegossen und bis zu einer Höhe von 115 cm
gefüllt unter Anwendung eines Drucks von 0,21 - 0,28 kg/cm .
564,5 g eiuba unreinen Präparates von Kalamycin wurdt. α
in einem Liter Aceton gelöst. Die Aceton-Lösung des Antibiotikums wurde dann mit 1 kg gepuffertem und aktiviertem Silikagel,
fc wie oben hergestellt, vermischt. Das Aceton wurde durch Verdampfen
bei Zimmtertemperatür entfernt und die getrocknete Silikagel-Mischung
wurde gleichmässig in das Cyclohexan oben auf die Chromatographie-Säule eingetragen. Das Niveau des Cyclohexane
wurde bis auf wenige Zentimeter des Ausgangsmaterials abfliessen gelassen. Ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus
Aethylacetat und Cyclohexan (10 : 90), wurde sorgfältig oben
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über das Cyclohexan geschichtet. Der Durchfluss begann und
20 Liter dieser Mischung wurden durch die Säule gegeben und verworfen. Die Waschflüssigkeit wurde durch die Entwicklungsflüssigkeit ersetzt, die aus Aethylacetat und Cyclohexan
(1 : 3) bestand und 102 Liter dieses Lösungsmittelgemisches wurden durch die Säule gegeben. Vom Beginn der Entwicklung an
wurden Fraktionen aufgefangen und in Abhängigkeit" von der Durchflussmenge gekennzeichnet. Jede Fraktion wurde durch
Sättigung von 12,7-mm-Bestimmungsscheiben mit Flüssigkeit aus jeder Fraktion, Trocknung der Scheiben und Auflegen auf eine
Agarschale, die mindern Mikroorganismus S. pastorianus besät
worden war, auf Kalamycin untersucht. Die Fraktionen, die das Wachstum des Organismus hemmten enthielten Kalamycin.
Kalamycin war in den Fraktionen 43 - 98 vorhanden. Fraktionen 47- 58 wurden gesammelt und gekühlt. Kalamycinkristalle, die
sich beim Abkühlen spontan abschieden, wurden durch Filtration gesammelt, mit Cyclohexan gewaschen und im Vakuum bis zu einem
konstanten Gewicht von 21,7 g getrocknet. Dieses kristalline Präparat von Kalamycin hatte gegenüber S. pastorianus 143 BE/mg
und hatte ein ÜV-Maximum in Methanol bei 258 mu; a = 34,0.
Die Mutterlaugen der obigen Kristallisation wurden mit den Fraktionen 43 - 46 und 59 - 86 der Silikagel-Chromatographie
vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von ca. 750 ml eingedampft. Zu dem Konzentrat wurden 2 Liter Aethylacetat gegeben,
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um ausgefällte Stoffe aufzulösen, und die Lösung wurde durch Filtration geklärt. 3 Liter Cyclohexan wurden zugegeben, und
die Lösung wurde im Vakuum auf ein Volumen von 2,0 Litern eingedampft und über Nacht bei 5 C aufbewahrt. Kristalle von
Kalamycin, die sich gebildet hatten, wurden durch Filtration abgetrennt, mit Cyclohexan gewaschen und im Vakuum bis zu einem
konstanten Gewicht von 55,5 g getrocknet. Dieses Präparat von Kalamycin zeigte 150 BE/mg (S. pastorianus-Bioeinheiten) und
P hatte ein UV-Maximum im Methanol bei 258 ιημ·, a = 37,0. Die
Mutterlaugen, dieser letztgenannten Kristallisation, wurden im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml eingedampft und über Nacht bei
50C aufbewahrt. Die Kristalle, die sich gebildet hatten,
wurden durch Filtration gesammelt und bis zu einem konstanten Gewicht von 6,8 g getrocknet. Dieses Präparat von Kalamycin
hatte 160 BE/mg (S. pastorianus-Bioeinheiten) und hatte ein UV-Maximum in Methanol bei 258 mu('a=35>5·
h Beispiel 2
Das Natriumsalz des Kalamycins.
Eine Lösung von Kalamycin wird mit einem Kationenaustauscherharz in der Natriumform eingedampft. Das entstandene
Salz wird dann aus der konzentrierten Lösung kristallisiert. Wahlweise kann das Salz zu einem amorphen Pulver gefriergetrocknet
werden.
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Claims (1)
- •tP a t e η t a η s ρ r u c h .c"1/1 Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, das mindestens eine Bio-Einheit pro Milliliter Kalamycin enthält, eine Verbindung, die(a) das Wachstum verschiedener gramnegativer und grampositiver Bakterien und Pilze hemmt und in im wesentlichen reiner kristallinen Form.(b) inAe.thylacetat, Amylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Methyläthylketdn-löslich ist und in Wasser verhältnismässig unlöslich ist;(c) die folgende Elementaranalyse hat: C 63,80} H 4,07ϊ Ο 31,81;(d) ein Molekulargewicht von 300 hat, wie mit Massenspektrometer bestimmt wurde;(e) ein charakteristisches Infrarotspektrum hat, wie es in Fig. 1 der Zeichnungen abgebildet ist und(f) ein charakteristisches Papierchromatogramm zeigt, wie es in Fig. 2 der Zeichnungen abgebildet ist,dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus, der Kalamycin produziert, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungc· 'iehtet wird, bis dem Nährmedium durch die Produk-- 25 10 9815/2071tion von Kalamycin eine beträchtliche Wirksamkeit' ist ι und dass Kalamycin aus dem Nährmedium isoliert wird»2e Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet! das Streptomyces tanashienses Stamm KaIa in einem wässrigen Mhrmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis dem Nährmedium durch die Produktion von Kalamycin eine beträchtliche Wirksamkeit verliehen wird«,% Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa in einem wässrigen Nährmedium, das eine Quelle von assimilerbarem Kohlehydrat und assimilierbarem Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis dem Nährmedium durch die Produktion von Kalamycin eine beträchtliche Wirksamkeit verliehen ist, · —.d dass das so hergestellte Kalamycin. isoliert wird·4·β Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,w dass das Nährmedium filtriert wird, dass das erhaltene Filtrat mit einem Lösungsmittel für Kalaayoin, das mit Wasser nicht mischbar ist, extrahiert wird, und dass Kalamycin aus den Lösungsmittelextrakten gewonnen wird·Fürt The Upjohn CompanyoRlGlNAL msPECT®Leerseite
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