DE1617915A1 - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kalamycin - Google Patents

Description

Dr, Walter BsH

Vu'A'iis

Frankfurt a, M.-Höchst

Adelonstraße 58 - TeL 3126 49

Unsere i\ir. 13 688

The Upjohn Company, Kalamäzoo (Michigan, USA)

Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kalamycin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kalamycin (U-19, 718).

Kalamycin ist eine chemische Verbindung, die durch " Kultivierung von kalamycinproduzierenden Actinomyceten in einem wässrigen Nährmedium hergestellt werden kann. Es ist eine saure Verbindung, welche die Eigenschaft hat, das Wachstum von graspositiven und gramnegativen Bakterien, z.B.

Dr.Ti.-af

21.3.1967 - 1 - 11204

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Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis, Streptococcus hemolyticus, Diplococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Salmonella schottmuelleri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas phaseolicola, Xanthomonas pruni und Erwinia amylovora, ungünstig zu beeinflussen. Kalamycin hat ausserdem hemmende Wirksamkeit gegen verschiedene Pilze, z.B. Blastomyces der- ^ matitidis, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum, Trichophyton violaceum, Trichophyton asteroides, Trichophyton mentagrophytes, Pusarium oxysporum f. cubense und Alternaria solani. Dementsprechend kann Kalamycin allein oder in Verbindung mit anderen antibiotischen Substanzen zur Verhinderung des Wachstums, bzw. zur Verminderung der Zahl von Bakterien und Pilzen, wie oben beschrieben, in verschiedenen Umgebungen verwendet werden. Es kann beispielsweise als Desinfektionsmittel für verschiedene zahntechnische und medizinische Ausrüstungsgegenstände, die mit Staphylococcus aureus infiziert sind, verwendet werden. Es ist ausserdem als Pilzbekämpfungsmittel in industriellen Konservierungsmitteln nützlich, z.B.

als ein fungizides Spülmittel für gereinigte Kleider und zur Imprägnierung von Papieren und Geweben; Ausserdem ist es nützlich zur Unterdrückung des Pilzwachstums empflindlicher Organismen bei Platten-BeStimmungsmethoden und anderen biologischen Medien. Kalamycin kann ausserdem als Futterzusatz

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zur Förderung des Wachstums von Tieren, z.B. Säugetieren, Vögeln, Fischen oder Reptilien, verwendet werden.

Chemische und physikalische Eigenschaften von Kalamycin

Kristallines Kalamycin hat die folgenden
chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Farbe: orange

Elementaranalyses C 63,80? H 4,07? 0 31»8l. %

Summenformel: C₁^EL₀O,-

J.O Xd O

Molekulargewicht: 288 (Titration)

300 (Massenspektrometer)

Schmelzpunkt: 163 - 166 C Ultraviolett Absorptionsspektrum:

Methanol: max. bei 212 mu, a = 138,58 max. bei 256 mu, a = 36,72 sho bei 268 mu, a = 35_?19 max. bei 425 mu, a = 14,84

»01 η HOl in Methanols ™

max. bei 212 mu, a = 133,04

laaxo bei 256 mu, a - 36,66

sho bei 268 a|a_P a = 34,81

max, bei 425 m^₈ a - 14_F86

U f I

Wasseri max. bei 213 πιμ, a = 124,42

sh. bei 260 ;nu, a = 37,41

max. bei 265 mu, a = 37,55

max. bei 428 mu, a = 13,67

.01 η KOH: max. bei 219 mu, a = 110,46

max. bei 275 mp, a = 35,97

max. bei 525 mji, a = 16,58

Infrarotspektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum des Kalamycins

suspendiert in Mineralöl, wird in Figur 1 der Zeichnungen wiedergegeben. Kalamycin zeigt Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in reziproken Zentimetern:

3640 (W) 1458 (M) OeI 1237 (M)

3550 (W) 1452 (S) 1211 (S)

2950 (S) (OeI) 1416 (W) 1200 (M)

^ 2920 (S) (OeI) 1406 (W) 1195 (M)

2850 (S) (OeI) 1399 (W) 1185 (W)

1837 (W) 1376 (M) (OeI) 1158 (S)

1807 (W) 1365 (M) 1110 (M)

1772 (S) 1355 (M) 1096 (M)

1760 (S) 1340 (M) 1076 (M)

1728 (W) 1315 (S) 1063 (M)

-A-

10 981 S/20.71

1666	(S)
1653	(S)
1648	(S)
1625	(S)
1595	(W)
1575	(W)
1478	(W)
864	(M)
845	(W)
837	(M)
802	(W)

5	1617915
1306 (M)	1056 (M)
1298 (M)	1030 (M)
1285 (S)	1019 (W)
1281 (M)	993 (M)
1265 (M)	972 (W)
1258 (M)	928 (W)
1246 (S)	903 (M)
	890 (W)
796 (W)	708 (S)"
783 (S)	698 (M)
753 (S)	778 (M)
737 (M)	776 (M).

Die Bandenintensitäten werden als "S", ¹¹M", bzw. "W" bezeichnet und werden annähernd in Beziehung zum Hintergrund in der Nähe der Banden ausgedrückt. Eine "S"-Bande zeigt dieselbe GrössenordnVung an Intensität wie die stärkste Bande , des Spektrums? "!"-Banden sind zwischen einem Drittel und zwei Dritteln der Intensität der stärkstem Bande und "W^ls-Banden zeigen weniger als ein Drittel an Intensität wie die stärkste Bande. Siege Bsurteilungen. erfolgen auf der Basis einer prozentualen Sransmissioxissfe&l&e

Ealamycin zeigt ein charakteristisches Papierchromatowie In Figur 2 der Zeichnungen ggstigt, wenn die

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folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet werden:

I. 1-Butanol, Wasser (84:16); 16 Stunden II. 1-Butanol, Wasser (84il6) plus 0,25 #

p-Toluolsulfonsäure; 16 Stunden

III. 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:1:1); 16 Stunden IV. 2 $> Piperidin {Vol./Vol.) in 1-Butanol, Wasser

(84:16); 16 Stunden

V. 1-Butanol, Wasser (4:96); 5 Stunden VI. 1-Butanol, Wasser (4:96) plus 0,25 fi p-Toluolsulfonsäure; 5 Stunden

Die Mikroorganismen

Die für die Herstellung von Ealamycin erfindungsgemäss verwendeten Actinomyceten sind ein neu isolierter Stamm des bekannten Mikroorganismus Streptomyces tanashiensis. Dieser neu isolierte Stamm wurde als Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa bezeichnet. Eine der charakteristischen Eigenschaften dieses Stammes ist die Produktion von Kalamycin unter den nachfolgend beschriebenen Fermentationsbedingungen. Eine Kultur von Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa kann von der Sammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. bezogen werden. Seine Registrierungsnummer in dieser Sammlung ist NRRL 3215.

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Die Aehnlichkeit von Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa mit der berichteten Beschreibung von Streptomyces tanashiensis (vgl. Waksman, The Actinomycetes, Band 2₉ 1961, Seite 279) veranlasste den Vergleich der beiden Mikroorganismen unter den nachfolgend beschriebenen Fermentationsbedingungen. Diese Untersuchung zeigte, dass S. tanashiensis, KBRL B-1692 Kalamycin in Mengen produzierte, die ausreichten, um papierchromatographisch nachgewiesen werden au können. Die Produktion von Kalamycin durch irgendeinen Stamm von Streptomyces tanashiensis, NRRL (B-1692) eingeschlossen^ ist jedoch nie zuvor berichtet worden.

S. tanashiensis Stamm EaIa ist melaninpositiv, hat graues bis grau-rotes atmosphärisches Wachstum und hat gerade bis gebogene Sporophoren, die bei gerader-Durchsieht in der Mitte durchsichtig und an den Polen dunkel erscheinen. Das beste Wachstum zeigt .er bei 18 bis 28⁰O.

Die neue Verbindung wird erfindungsgemäss liergestellt, wenn der bearbeitete Organismus' in eine® wässrigen Nährmedium unter submerges,, aerobes Bedingungen g©stJefetet wird. Es versteht sich awsserdesij, dass für die Herstellung begrenzter Mengen Qberfläelienlsul türen in Piasehen angewendet werden können. Der Organismus wird ia ©iaem HUänsgcLiism gesüsMtet, das eine KoWLenstoffquell® s_oBo sia ©ssiailierfearss Eohlenfejfdrat, und eiae Stielsstoff quell© ₉ SoBo eise assiBiliertore Stickstoff-

verbindung oder eiweissartiges Material, enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind unter anderem Glucose, Rohzucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und ähnliche. Bevorzugte Stickstoffquellen sind unter anderen Maisweichwasser, Hefe, autolysierte Bierhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pancreas-Enzym-Hydrolysat von Kasein, Schlempe, tierische Eiweissflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und ähnliches. Vorteilhafterweise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden. Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und ähnliche brauchen den Fermentationsmedien nicht zugesetzt zu werden, da Leitungswasser und ungereinigte Ingredientien als Bestandteile der Medien verwendet werden. Die erfindungsgemässe Produktion der Verbindung kann bei jeder beliebigen Temperatur, die ausreichendes Wachstum des Mikroorganismus, z.B. zwischen ca. 18° und 4O⁰C, und vorzugsweise zwischen ca. 20° und 32⁰C, bewirkt, durchgeführt werden. Für gewöhnlich wird optimale Produktion der Verbindung in ca. 2 bis 10 Tagen erreicht. Das Medium bleibt während der Fermentation normalerweise ziemlich dicht am Neutralpunkt oder auf der alkalisehen Seite * Den End-pH-Wert hängt sum Teil von den eventuell vorhandenen Puffern ab und zum Teil von dem AnfangspH-Wert Sea Kulturmediums, welcher VOrteilfeafterweise vor der

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Sterilisation auf einen pH-Wert von ca. 7,2 eingestellt wird.

Wenn die Züchtung in grossen Gefässen und Tanks durchgeführt wird, dann wird vorzugsweise anstelle der Sporenform die vegetative Form zur Beimpfung verwendet, um eine deutlich ausgeprägte Verzögerung in der Produktion der neuen Verbindung und die damit verbundene? ungenügende; Ausnützung der Apparatur zu vermeiden. Dementsprechend ist es wünschenswert, ein· vegetatives ■" Inoculum in einer Nährbrühenkultur zu * züchten, indem die Brühenkultur mit einer aliquoten Menge aus

oder
einer Boden- Schrägkultur beimpft wird. Wenn auf diese Weise ein junges, aktives, vegetatives Inoculum bereit gestellt ist, dann wird es aseptisch in grosse Gefässe oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann das gleiche sein, das für die Herstellung der neuen Verbindung verwendet wird, oder es kann verschieden davon sein, solange es nur so beschaffen ist, dass gutes Wachstum des Mikroorganismus* erreicht wird. ''j|

Die neue erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist eine saure, chemische Verbindung, die die Summenformel C-IgH₁₂Og hat. Sie ist löslich in den folgenden lösungsmitteln: Aethylacetat, Amylacetat, Butylacetat und ähnlichen aliphatischen Estern? Aceton, Methyläthylketon, Jsopropylbutylketon, und

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ähnlichen niedrigen Alkanonen; Chloroform, Methylenchlorid und ähnlichen halogenieren Kohlenwasserstoffen und Dimethylsulfoxyd. Kalamycin hat ausserdem einen beträchtlichen Löslichkeitsgrad in niedrigen Alkanolen, z.B. Methanol, Aethanol, Isopropanol, den Butanolen und ähnlichen Verbindungen. Es ist relativ unlöslich in Wasser, Cyclohexan und Aether.

Eine Vielzahl von Verfahren kann zur Isolierung und

* Reinigung von Kalamycin angewendet werden, z.B. Lösungsmittelextraktion, Silikagelchromatographie, Flüssig-Flüssig-Verteilung in einer Crdg-Apparatur und Kristallisation aus Lösungsmitteln. Lösungsmittelextraktion-Verfahren sind für gewerbliche Gewinnung bevorzugt, da sie weniger Zeit in Anspruch nehmen und weniger teuer sind. Silikagelchromatographie ist die bevorzugte Reinigungsmethode.

Bei einem bevorzugten Gewinnungsverfahren wird Kalamycin aus dem Kulturmedium durch Abtrennung des Mycels und

* der ungelösten Feststoffe durch herkömmliche Mittel, wie z.B. Filtration oder Zentrifugation, isoliert. Bas Antibiotikum wird dann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe durch Extraktion gewonnen. Für die Extraktion des Kalamycins aus der filtrierten Brühe, können Lösungsmittel, in denen es löslich ist, wie oben beschrieben, verwendet werden. Methylenchlorid ist das bevorzugte Extraktionsmittel. Der durch Methylenchlorid-

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extraktion erhaltene Extrakt kann im Vakuum zu einer wässrigen Lösung eingedampft werden^ die ihrerseits gefriergetrocknet .werden kann, um das rohe Antibiotikum direkt zu ergeben. Dieses Präparat kann für Zwecke, bei denen ein höherer Reinheitsgrad des Antibiotikums nicht erforderlich ist, verwendet werden.

Kalamycin kann aus filtrierten Permentationsbrühen bed pH-Werten von ca. 5,0 bis T₅O extrahiert werden. Bei wässrigen pH-Werten von ca. 10,0 und höher, wird Kalamycin nicht merklich durch die obigen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, extrahiert» Unter Ausnutzung dieser Eigenschaften kann Kalamycin bei einem pH-Wert von weniger als 9₉O in eines der obigen Lösungsmittel, in denen es löslich ist, extrahiert werden. Es kann dann bei einem pH-Wert von mehr als 10,0 mit Wasser ruckextrahiert wgrdea und dann bei einem pH-Wert vosi weniger als 9^0 t7ie&@? in ©in Lösungsmittel, in dem es löslich ist, extrahiert werden«, 3D@r Eaäextrakt kann dass zur Trockne eingedampft vter&&n₉ um @in rohes !Präparat von lalasayein au

■ Ws&lweis© 3sam B&lamysia. aus i@m mit eine® starlsfeasisekesi teionesaaustsssagehsriisrg atog@tr©saat werden. Geeignet© Aaisaeaatfstamsoliiters© fite⁸
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88 und 9? wsa Iwraisij, I@a ÄMst&iasöli©2°Ms^g _ΰ 2_O Mflag© (1958) Sohn Wiley aaä S©as_s 1$i©o_V vex=a©tst_p falls g^iviasehti, salt Di

vinylbenzol, hergestellt nach dem Verfahren, das auf Seite 84 des oben erwähnten Werkes von Kunin angegeben ist, quaternisiert, mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin nach dem auf Seite 97 des oben erwähnten Werkes von Kunin angegebenen Verfahren. Anionenaustauscherharze dieses Typs werden unter den Handelsnahmen Dowex 1, Dowex 2, Dowex 3» Amberlite IRA-400, Duolite A-102 und Permutit S-I in den Handel ge- ^ bracht.

Als weitere Alternative kann Kalamycin aus dem filtrierten Kulturmedium oder dem organischen Extrakt nach Absorptionsmethoden unter Verwendung solcher Adsorbentien wie Kieselsäure, Entfärbungskohle oder Entfärbungsharz, ein geeignetes Entfärbungsharz ist Permutit DR, U.S, Patentschrift 2 702 263, Tonerde oder Plorisil (ein synthetisches Silikat der Art wie in U.S. Patentschrift 2 393 625 beschrieben und von der Ploridin Co. vertrieben) isoliert werden. Das adsorr bierte Antibiotikum kann von dem Adsorbens in verhältnismässig reiner Form durch Elution mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z.B. einem der oben erwähnten, in dem : Kalamycin löslich ist; wiedergewonnen werden.

Hochreines Kalamycin kann dadurch gewonnen werden, dass eines der oben beschriebenen unreinen, trockenen Präparate von Kalamycin der Silikagelohromatogüsphie und Kristallisation

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unterworfen wird, unter Verwendung von Lösungsmitteln wie Aethylacetat und Cyclohexan zur Entwicklung der Säule. Die von der Silikagelchromatographie gewonnen Fraktionen können eingedampft werden, um kristallines Kalamycin zu erhalten.

Salze des Kaiamyeins werden erhalten, indem die freie Säure des Kalamycins und eine anorganische oder organische Base verwendet werden. Die Kalamycinsalze können beispiels- (J

weise hergestellt werden, indem die freie Säure Kalamycin in Wasser gelöst wird, indem eine verdünnte Base zugegeben wird, bis der pH-Wert der Lösung etwa 10,0 bis 11,0 beträgt und indem die Lösung gefriergetrocknet wird, um einen trocknen Rückstand zu ergeben, der aus dem Kalamycinsalz besteht. Kalamycinsalze, die hergestellt werden können, sind unter anderen, die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze. Andere Salze des Kalamycins, darunter solch© mit organischen Basen, wie primären, sekundären und tertiären Monoaminen, sowie solchen mit Polyaminen, können J ebenfalls nach den oben beschriebenen oder nach anderen allgemein angewendeten Verfahren hergestellt werden. Andere wertvolle Salze werden mit therapeutisch wirksamen Basen, welche den Salzen zusätzliche therapeutische Wirksamkeit vermitteln, gewonnen. Solche Basen sind beispielsweise die Ririnbasen, wie Theophyllin» Sheobromin, Ooffein. oder Derivate solcher Purinbasanj AiitihiataminbassLi, welche in Stand© einä, Salze mit

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schwachen Säuren zu bilden; Firidinverbindungen, wie Nikotinsäureamide, Isonikotinsäurehydrazide und ähnliche; Phenylalkylamine, wie Adrenalin, Ephedrin und ähnlichej Cholin und andere. Salze des Kalamycins können für dieselben biologischen Zwecke wie die freie Säure verwendet werden.

Kalamycin hat ein breites antibakterielles Spektrum wie in Tabelle 1 gezeigt wird. Die antibakterielle Wirkungsfc breite wurde nach einer Röhrchen-Verdünnungs-Bestimmungs-' Metode ermittelt, wobei das Untersuchungsmedium BHI war (Brain Heart Infusion Broth, Difco, Detroit, Michigan). Bestimmungsröhrchen (18 χ 150 mm) wurden in üblicher Weise hergestellt, wie von Snell, E.E., Vitamin Methods, Vol. I, Academic Press, Inc., New York 1950, S. 327, beschrieben. Testorganismen, die 18 Stunden lang bei 37⁰C gezüchtet worden waren, wurden zur Beimpfung des Testmediums verwendet. Die Beurteilung erfolgte nach 20 Stunden.

Tabelle I
Antibakterielle Wirkung von Kalamycin

Test-Organismus Minimale Inhibitions-

_________ Konaentration in ug/ml

Staphylococcus aureus 2

Streptococcus hemolyticua 16 Streptococcus faecalis 4

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Portsetzung Tabelle I

Escherichia coli 250

Proteus vulgaris 125

Klebsieila pneumoniae 250

Salmonella schottmuelleri 125

Pseudomonas aeruginosa 125

Bacillus subtilis 1

Diplococcus pneumoniae 1

Saccharomyces pastorianus 8

Kalamycin hat fungizide Wirksamkeit, die in Tabelle II gezeigt wird. Das fungizide Spektrum wurde durch Agar-Platten-Verdünnungsmethode bestimmt.

Tabelle II Fungizide Wirksamkeit von Kalamyein

lest-Organismus Minimale Inhibitions-

Konzentration in Mg/ml

Noc*-ardia aeteroides	1
Coccidiodes iausitis	1
Blastomyces dermatitidis	1
Geotrichum spe	10
HormodendruM compaetim	1
Phialcphora "vernseoaa	10
Histoplasma eapeulatiim	1

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Fortsetzung Tabelle II

Cryptococcus neoformans 1

Sporotrichüm schenckii 10

Monosporium apiospermum 10

Trichophyton rubrum 1

Candida albicans ABBOTT 10

Trichophyton violaceum 10

^ Trichophyton interdigitale 10

Trichophyton asteroides 10

Trichophyton mentagrophytes 10

Kalamycin zeigt ausserdem Aktivität gegen Protozoen, indem es die Protozoen 0chromo.nas danica und Tetrahymena pyriformis bei in-vitro-Tests inhibiert. Kalamycin wurde auf 12,7-mm-Papierscheiben aufgetragen, diese wurden dann auf Agar-Platten, die vorher mit dem Test«Organismus besät worden waren, gelegt. Die Platten wurden dann bei Zimmertemperatur P bebriltet und die Kontrolle erfolgte nach 24 Stunden.

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Die neue erfindungsgemäss hergestellte Verbindung, Kalamycin, ist.gegen Bacillus subtilis wirksam und kann zur Verringerung oder Verhinderung des Geruches von Fisch und Fischkörben, der durch diesen Organismus verursacht wird, verwendet werden. Es kann ausserdem zur Behandlung der Brutplätze von Seidenwürmern (silk worms) zur Verhinderung oder Verringerung von Infektionen, die durch diesen Organismus verursacht werden, verwendet werden. Da %

Kalamycin ausserdem gegen Crytococeus neoformans wirksam ist, kann es zur Behandlung von Taubenschlägen zur Bekämpfung dieses Pilzes, der in Taubenmist gefunden worden ist, verwendet werden. (Journal of American Medical Association, VoI 191, Nr. 4, 25. Januar 1965» Seiten 269 - 274). Die neue erfindungs- * gemäss hergestellte Verbindung kann ausserdem als fungizides Mittel für Schuhoberleder verwendet werden (U.S. Patentschrift 3 130 505). Darübei^iinaus kann das neue erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum zum Aufwischen von Laboratoriumstischen M in einem pilzkundlichen Laboratorium verwendet werden* Kalamycin kann zur Bekämpfung und Ausrottung verschiedener pathogener Pilze und Bakterien auf Pflanzen und ihren Früchten verwendet werden. Beispielsweise kann Kalamycin zur Bekämpfung und Ausrottung des Mehltaus von Kartoffeln, der durch Alternaria solani verursacht wird; verwendet werden. Krankheiten von Hosen und Mehltau von Birnen und Aepfeln_P verursacht durch Erwinia

amylovora; schwarze Flecken auf Pflaumen, Aprikosen und Pfirsichen, verursacht durch Xanthomonas prunij Mehltau von Bohnen, verursacht durch Pseudomonas phaseolicola und die Panamakrankheit von Bananen (Bananenwelke, "banana wilt'·)» verursacht durch Fusarium oxysporum f. cubense, verwendet werden.

Die folgenden Beispiele beschreiben bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens. Alle Prozentangaben sind Gewichtsangaben und alle Lösungsmittelmischungsverhältnisse sind Volumenverhältnisse, wenn nicht anders angegeben·

Beispiel 1

A· Fermentation

Ein Boden-Stamm von Streptomyces tanashiensis, Stamm EaIa, NBBL 3215, wurde zur Beimpfung einer Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, von denen jeder 100 ml eines sterilen Mediums enthielt, das die folgenden Bestandteile enthielt:

Glttkosemonohydrat 25 g/Liter

Hjarmamedia* 25 g/Liter

Leitungswasser qu.s. Rest

*Pharsiamedia ist ein technisch reines Baumwollsamenmehl, hergestellt von Trader's Oil Mill Company, Port Worth, Texas USA.

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Die Kolben wurden 3 Tage lang bei 28⁰C auf einer Gump-Rotations-Schüttelmaschine mit 250 tlpm bebrütet.

Das oben beschriebene Inokulum wurde zur Beimpf ung einer Reihe von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, von denen jeder 100 ml eines sterilen Fermentationmediums enthielt. ■ Die Beimpfungsmenge war 5 ml eines Inokulums pro 100 ml Fermentationsmedium« Das Fermentationsmedium bestand aus den folgenden Bestandteilen:

Glukosemonohydrat 25 g/Liter

Wilson·s Eiweissflüssigkeit

Nr. 159* 5 g/Liter

•Kalziumkarbonat 5 g/Liter

Leitungswasser qu.s. Rest

»Wilson's Eiweissflüssigkeit Nr. 159 ist ein hydrolysiertes Eiweisspräparat tierischen Ursprungs» Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7»2 eingestellt.

Die oben beschriebenen beimpften Fermentationskolben wurden 5 Tage lang bei einer Temperatur von 32⁰C auf einer Gump-Rotations-Schüttelmaschine mit 250 Upm bebrütet.

Der antibiotisehe Titer der Gärbrühen wurde mittels einer Scheiben-Platten-Besümmungsiaethode tanter Verwendung des Mikroorganismus Sacciiaromyces cerevisiae überwacht. Ein ühtersuöhungsagar der folgenden Zusammensetzung ward© mit Saechharomyces cerevisiae beimpfts

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Dextrose 30 g/Liter

Hefe-Extrakt (Difco) 7 g/Liter

KH₂PO₄ ' 5 g/Liter

Agar-Agar 20 g/Liter

Destilliertes Wasser q.s. Rest.

Petrischalen werden gegossen und eine 12,7 mm Papierscheibe wird auf den festgewordenen Agar-Agar gelegt. Eine fc Menge von 0,08 ml des Kalamycinpräparates wird zugegeben und die Zone der Wachstumshemmung wird nach einer Inkubationszeit von 18 Stunden bei 28⁰C bestimmt. Die Aktivität wird in Bioeinheiten ausgedrückt. Eine Bioeinheit (BE) ist definiert als die Konzentration des Antibiotikums, die eine Wachstums-Hemmungs-Zone von 20 mm unter Standard-Bestimmungs-Bedingungen ergibt.

Wenn beispielsweise eine Fermentationbrühe im Verhältnis 1 : verdünnt werden muss, um eine Wachstums-Hemmungs-Zone von 20 mm zu ergeben, dann ist die Stärke einer solchen Brühe = 100 BE k pro ml.

Die obige Bestimmungsmethode kann auch mit den Mikro-. Organismen Saccharomyces pastorianus anstelle von Saccharomyces cerevisiae durchgeführt werden.

Eine Schüttelkolben-Fermentation von Kalamycin, wie oben beschrieben, ergibt 5,7 Bioeinheiten gegenüber,Saccharomyces cerevisiae.

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B. Gewinnung

Die gesamte Brühe (100 ml) einer Kalamycin-Fermentation, wie oben beschrieben, wurde mit 5 i° ihres Gewichtes an Kieselgur versetzt und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einem Zentel Volumen Wasser gewaschen und das Waschwasser wurde zu der filtrierten Brühe gegeben. Die filtrierte Brühe und das Waschwasser wurden mit Aethylacetat extrahiert. Der Aethylacetatextrakt wurde zu einer wässrigen Mischung eingedampft und gefriergetrocknet und ergab ein unreines Präparat von Kalamycin. Das Gewinnungsverfahren, wie oben beschrieben, lieferte das folgende Ergebnis:

Stufen	Menge	Gehalt (S. cerevisiae)
Gesamtbrühe	100 ml	1,0 Bioeinheiten/ml
Klare Brühe	100 ml	0,95 Bioeinheiten/ml
Aethylacetatextrakt	95 ml	1,10 Bioeinheiten/ml

Gefriergetrockneter

Extrakt von Kalamycin 16 mg 5»2 Bioeinheiten/mg

G. Reinigung

(1) Silikagel-Chromatographie.

Ein unreines Präparat von Kalamycin, das nach einem der oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurde, wurde an einer Silikagel-Chromatographie-Säule gereinigt. Die Säule wurde auf

" ²¹ " ORIGINAL INSPECTED

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folgende Weise hergestellt:

5 kg Silikagel (Silikagel Nr. 7734, E. Merck AG, Darmstadt, 0,05 - 0,20 mm für Chromatographie) wurden mit 4,0 Litern einer wässrigen Lösung, die 136,0 g KH₂PO₄ und 142,0 g Na₃HPO₄ enthielt, gemischt. Der Ueberschuss an Wasser wurde durch Verdampfung entfernt, und das gepufferte Gel wurde bei einer Geltemperatur von 120 - 130⁰C etwa 2 Stunden lang aktiviert und auf Zimmertemperatur abgekühlt. Das abgekühlte, gepufferte Gel wurde mit einer genügenden Menge Hexan verrührt, um eine giessfähige Mischung zu erhalten, die genügend dünnflüssig war, um Luftblasen entweichen zu lassen. Diese Mischung wurde in eine lO-cm-0-Glassäule gegossen und bis zu einer Höhe von 115 cm gefüllt unter Anwendung eines Drucks von 0,21 - 0,28 kg/cm .

564,5 g eiuba unreinen Präparates von Kalamycin wurdt. α in einem Liter Aceton gelöst. Die Aceton-Lösung des Antibiotikums wurde dann mit 1 kg gepuffertem und aktiviertem Silikagel, fc wie oben hergestellt, vermischt. Das Aceton wurde durch Verdampfen bei Zimmtertemperatür entfernt und die getrocknete Silikagel-Mischung wurde gleichmässig in das Cyclohexan oben auf die Chromatographie-Säule eingetragen. Das Niveau des Cyclohexane wurde bis auf wenige Zentimeter des Ausgangsmaterials abfliessen gelassen. Ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus Aethylacetat und Cyclohexan (10 : 90), wurde sorgfältig oben

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über das Cyclohexan geschichtet. Der Durchfluss begann und 20 Liter dieser Mischung wurden durch die Säule gegeben und verworfen. Die Waschflüssigkeit wurde durch die Entwicklungsflüssigkeit ersetzt, die aus Aethylacetat und Cyclohexan (1 : 3) bestand und 102 Liter dieses Lösungsmittelgemisches wurden durch die Säule gegeben. Vom Beginn der Entwicklung an wurden Fraktionen aufgefangen und in Abhängigkeit" von der Durchflussmenge gekennzeichnet. Jede Fraktion wurde durch Sättigung von 12,7-mm-Bestimmungsscheiben mit Flüssigkeit aus jeder Fraktion, Trocknung der Scheiben und Auflegen auf eine Agarschale, die mindern Mikroorganismus S. pastorianus besät worden war, auf Kalamycin untersucht. Die Fraktionen, die das Wachstum des Organismus hemmten enthielten Kalamycin. Kalamycin war in den Fraktionen 43 - 98 vorhanden. Fraktionen 47- 58 wurden gesammelt und gekühlt. Kalamycinkristalle, die sich beim Abkühlen spontan abschieden, wurden durch Filtration gesammelt, mit Cyclohexan gewaschen und im Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht von 21,7 g getrocknet. Dieses kristalline Präparat von Kalamycin hatte gegenüber S. pastorianus 143 BE/mg und hatte ein ÜV-Maximum in Methanol bei 258 mu; a = 34,0. Die Mutterlaugen der obigen Kristallisation wurden mit den Fraktionen 43 - 46 und 59 - 86 der Silikagel-Chromatographie vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von ca. 750 ml eingedampft. Zu dem Konzentrat wurden 2 Liter Aethylacetat gegeben,

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um ausgefällte Stoffe aufzulösen, und die Lösung wurde durch Filtration geklärt. 3 Liter Cyclohexan wurden zugegeben, und die Lösung wurde im Vakuum auf ein Volumen von 2,0 Litern eingedampft und über Nacht bei 5 C aufbewahrt. Kristalle von Kalamycin, die sich gebildet hatten, wurden durch Filtration abgetrennt, mit Cyclohexan gewaschen und im Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht von 55,5 g getrocknet. Dieses Präparat von Kalamycin zeigte 150 BE/mg (S. pastorianus-Bioeinheiten) und P hatte ein UV-Maximum im Methanol bei 258 ιημ·, a = 37,0. Die Mutterlaugen, dieser letztgenannten Kristallisation, wurden im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml eingedampft und über Nacht bei 5⁰C aufbewahrt. Die Kristalle, die sich gebildet hatten, wurden durch Filtration gesammelt und bis zu einem konstanten Gewicht von 6,8 g getrocknet. Dieses Präparat von Kalamycin hatte 160 BE/mg (S. pastorianus-Bioeinheiten) und hatte ein UV-Maximum in Methanol bei 258 mu₍'a=35>5·

h Beispiel 2

Das Natriumsalz des Kalamycins.

Eine Lösung von Kalamycin wird mit einem Kationenaustauscherharz in der Natriumform eingedampft. Das entstandene Salz wird dann aus der konzentrierten Lösung kristallisiert. Wahlweise kann das Salz zu einem amorphen Pulver gefriergetrocknet werden.

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Claims (1)

1. •t

   P a t e η t a η s ρ r u c h .c"

   ^1/1 Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses, das mindestens eine Bio-Einheit pro Milliliter Kalamycin enthält, eine Verbindung, die

   (a) das Wachstum verschiedener gramnegativer und grampositiver Bakterien und Pilze hemmt und in im wesentlichen reiner kristallinen Form.

   (b) inAe.thylacetat, Amylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Methyläthylketdn-löslich ist und in Wasser verhältnismässig unlöslich ist;

   (c) die folgende Elementaranalyse hat: C 63,80} H 4,07ϊ Ο 31,81;

   (d) ein Molekulargewicht von 300 hat, wie mit Massenspektrometer bestimmt wurde;

   (e) ein charakteristisches Infrarotspektrum hat, wie es in Fig. 1 der Zeichnungen abgebildet ist und

   (f) ein charakteristisches Papierchromatogramm zeigt, wie es in Fig. 2 der Zeichnungen abgebildet ist,

   dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus, der Kalamycin produziert, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungc· 'iehtet wird, bis dem Nährmedium durch die Produk-

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   tion von Kalamycin eine beträchtliche Wirksamkeit' ist ι und dass Kalamycin aus dem Nährmedium isoliert wird»

   2_e Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet! das Streptomyces tanashienses Stamm KaIa in einem wässrigen Mhrmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis dem Nährmedium durch die Produktion von Kalamycin eine beträchtliche Wirksamkeit verliehen wird«,

   % Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces tanashiensis Stamm KaIa in einem wässrigen Nährmedium, das eine Quelle von assimilerbarem Kohlehydrat und assimilierbarem Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis dem Nährmedium durch die Produktion von Kalamycin eine beträchtliche Wirksamkeit verliehen ist, · —.d dass das so hergestellte Kalamycin. isoliert wird·

   4·β Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

   ^w dass das Nährmedium filtriert wird, dass das erhaltene Filtrat mit einem Lösungsmittel für Kalaayoin, das mit Wasser nicht mischbar ist, extrahiert wird, und dass Kalamycin aus den Lösungsmittelextrakten gewonnen wird·

   Fürt The Upjohn Company

   _{oRlGlNAL msPECT}®

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