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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Enduracidin auf mikrobiologischem Wege. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces fungicidicus ATTC 21013 oder eine von dessen Mutanten oder Varianten unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren Stickstoff und andere an sich bekannte Nährbestandteile für das Wachstum des Mikroorganismus enthält, und das dabei gebildete Enduracidin aus der Kulturbrühe in freier Form oder in Form eines Salzes mit physiologisch verträglichen Säuren, insbesondere als Hydrochlorid, gewinnt.
Das neue Antibiotikum ist sehr wirksam gegen gram-positive und säurefeste Bakterien. Es wurde als "Enduracidin" bezeichnet.
Der Streptomyces-Stamm ATCC-21013 wurde aus dem Boden bei Nishinomiya, Japan, isoliert.
Die mikrobischen Eigenschaften von Streptomyces fungicidicus ATCC-21013 sind nachstehend aufgeführt. Hiebei basieren die mit"Rdg."gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf Ridgway's Color Standard and Nomenclature.
A) Morphologische Eigenschaften
Die Sporophoren bilden Spiralen. Die Sporen sind oval, 0, 9 x 1, 6 bis 1, 1/. l. Die Oberfläche der Sporen ist stachelig.
B) Merkmale der Kulturen :
1. Czapek-Agar :
Vegetatives Mycel (nachstehend als VM bezeichnet) :
Reichlich, sich ausbreitend, dringt in das Medium ein, farblos.
Luftmycel (nachstehend als LM bezeichnet) : Reichlich, pulverförmig, graubraun (Rdg. LI, l'"")
Rückseite (nachstehend als R bezeichnet) : Lebhaft braungelb (Rdg. XV, 17'-d).
Lösliches Pigment (nachstehend als LP abgekürzt) :
Nicht vorhanden.
2. Glucose-Czapek-Agar :
EMI1.1
3. Glycerin-Czapek-Agar : VM : Reichlich, faltig, farblos
LM : Reichlich, tief olivgrau (Rdg. LI, 23 "'''), wird
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EMI2.1
-b).R : Lebhaft braungelb
LP : Nicht vorhanden oder schwach gelb.
4. Glucose-Asparagin-Agar :
VM : Reichlich, sich ausbreitend, farblos.
LM : Reichlich, hell olivgrau (Rdg. LI 23'""-d) bis blass graubraun (Rdg. LI, 1'''''-d) oder zuweilen schmutzig weiss.
R : Cremefarbig (Rdg. XVI, 19'-f) oder farblos.
LP : Nicht vorhanden
5. Bouillon :
VM : Reichlich, schwimmt auf der Oberfläche des Mediums ; ein geringer Teil des Mycels sinkt zu Boden.
LM : Reichlich, weiss.
Durchsichtiges Medium, kein lösliches Pigment.
6. Bouillon-Agar :
VM : Reichlich, sich ausbreitend, farblos.
LM : Mässig, weiss bis blass graubraun.
R : Lebhaft braungelb (Rdg. XV, 17'-d)
LP : Nicht vorhanden
7. Glucosebouillon-Agar :
VM : Reichlich, faltig, sich ausbreitend, farblos.
LM : Reichlich, tief graubraun (Rdg. LI l'""-i).
R : Gelb-ocker (Rdg. XV, 17') LP : Schwachbraun oder nicht vorhanden.
8. Glycerinbouillon-Agar :
VM : Reichlich, sich ausbreitend, farblos.
LM : Reichlich, pulverförmig, graubraun bis tief graubraun.
R : Isabella-Farbe (Rdg. XXX, 19"-i)
LP : Nicht vorhanden oder schwach braun.
9. Stärke-Agar :
VM : Reichlich, sich ausbreitend, farblos.
LM : Reichlich, hell graubraun (Rdg. LI, 1''''-b), wird graubraun.
R : Hell braungelb (Rdg. XV, 17'-f)
LP : Nicht vorhanden.
10. Ei : VM : Reichlich, sich ausbreitend, faltig.
LM : Mässig, weiss bis weiss mit gelblichem Stich und zu- weilen schmutzig weiss. Die Farbe des Mediums wechselt nach gräulich-weiss bis braun.
11. Hefeextrakt-Agar :
VM : Reichlich, faltig, sich ausbreitend, farblos.
LM : Reichlich, pulverförmig, hell mausgrau (Rdg. LL 15'""-b) bis graubraun.
R : Isabella-Farbe LP : Nicht vorhanden.
12. Kartoffel :
VM : Reichlich, sich ausbreitend, erhöht, farblos.
LM : Reichlich, graubraun.
Die Farbe des Mediums wird nach 3 Wochen dunkel- braun.
13. Milch :
VM : Reichlich, faltig, schwimmt auf der Oberfläche des
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Mediums, farblos.
LM : Reichlich, weiss bis perlgrau (Rdg. LIL 35'"t-f)
Starke Peptonisierung ohne Koagulierung.
14. Möhrenbrei : VM : Reichlich, sich ausbreitend, erhöht, farblos.
LM : Reichlich, graubraun (Rdg. LI, 1''''). Die Farbe des Breies wird Buchthorn-braun (Rdg. XV, 17'-f).
15. Gelatine : VM : Spärlich LM : Spärlich, weiss, langsame Verflüssigung.
16. Nährgelatine : VM : Reichlich,
LM : Reichlich, weiss, schnelle Verflüssigung.
LP : Nicht vorhanden.
17. Nitratreduktion in Czapek-Lösung (enthaltend 0,1% NaHO3): Positiv.
18. Cellulose :
VM : Reichlich, sich ausbreitend, farblos.
LM : Reichlich, graubraun (Rdg. LI, l'""). Keine
Zersetzung.
19. Calciummaleat-Agar :
EMI3.1
(Rdg. LI, 15'""-f).
R : Fahlgelb (Rdg. XVI, 19'-d).
LP : Nicht vorhanden oder blassgelb 20. Tyrosin-Agar : VM : Spärlich, dünn, sich ausbreitend, farblos.
LM : Nicht vorhanden
R : Farblos LP : Nicht vorhanden 21. Pepton-Agar : VM : Reichlich, sich ausbreitend, flach, farblos.
LM : Spärlich, schmutzig grau. (Rdg. XLVI, 17"" -b)
R : Sehwach cremefarbig (Rdg. XVI, 19'-f) LP : Nicht vorhanden 22. Stärke-Casein-Agar : VM : Reichlich, sich ausbreitend, flach, farblos.
LM : Reichlich, samtartig, tief mausgrau (Rdg. LI, 15'"'-i)
R : Hell olivgrau (Rdg. LI, 23'""-d)
LP : Nicht vorhanden 23. Maltose-Trypton-Agar :
EMI3.2
graubraun (Rdg. LI, 1""')
R : Hell braungelb (Rdg. XV, 17'-f) LP : Nicht vorhanden oder schwach gelb 24. Bennett-Agar :
EMI3.3
farblos LM : Reichlich, graubraun bis tief graubraun (Rdg. LI, l'""-i) R : Farblos bis lebhaft braungelb (Rdg. XV, 17'-d) LP : Nicht vorhanden 25.
Hydrolyse von Stärke : Hydrolyse
Encymatische Zone/Wachstumszone = 30 mm/10 mm oder
28 mm/10 mm
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C) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der
Pridham-Gottlieb-Methode :
EMI4.1
<tb>
<tb> Erythrit <SEP> Melibiose
<tb> Adonit <SEP> Maltose
<tb> S-Sorbit <SEP> + <SEP> Saccharose <SEP> + <SEP>
<tb> L-Inosit <SEP> +++ <SEP> Lactose <SEP> +++ <SEP>
<tb> D-Mannit <SEP> +++ <SEP> Raffinose <SEP> + <SEP>
<tb> Dulcit <SEP> + <SEP> Trehalose <SEP> +++ <SEP>
<tb> D-Xylose <SEP> +++ <SEP> Salicin <SEP> +++ <SEP>
<tb> L-Arabinose <SEP> +++ <SEP> Aesculin <SEP> + <SEP>
<tb> L-Sorbose <SEP> Inulin
<tb> D-Galactose <SEP> +++ <SEP> Dextran <SEP> +++ <SEP>
<tb> D-Glucose <SEP> ++ <SEP> Natriumacetat <SEP> ++ <SEP>
<tb> D-Fructose <SEP> +++ <SEP> Natriumsuccinat <SEP> + <SEP>
<tb> D-Mannose <SEP> ++ <SEP> Natriumcitrat
<SEP> + <SEP>
<tb> Rhamnose <SEP> +++ <SEP> Kontiolle <SEP> t <SEP>
<tb>
Zeichenerklärung : +++ = starkes Wachstum ; ++ = gutes Wachstum ; + = mässiges Wachstum ; = schwaches Wachstum.
Ein Vergleich der vorstehend beschriebenen morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaf- ten mitdenBeschreibungenin"TheActinomyces"BandII, vonS. A. Waksman, Herausgeber The Williams and Wilikins Company [1961], zeigt, dass der für die Zwecke der Erfindung geeignete Stamm insofern ähnliche morphologische Eigenschaften wie Streptomyces fungicidicus hat, als die Sporophoren Spiralen bilden, die Oberfläche der Sporen stachelig ist, das Luftmycel grau ist, kein lösliches Pigment gebildet wird und der Stamm ein nichtehromogener Typ ist. Es sind jedoch einige Unterschiede in den Kultureigenschaften zwischen dem Stamm und Streptomyces fungicidicus vorhanden. Der letztere bildet nämlich ein rosafarbenes lösliches Pigment, wenn er auf Calciummaleat-Agar gezüchtet wird und bewirkt schwache Koagulierung und Peptonisierung von Milch auf einem Milchmedium.
Im Gegensatz hiezu bildet der erfindungsgemäss verwendete Stamm dieses lösliche Pigment nicht. Wenn er lösliches Pigment bildet, ist dieses blassgelb und koaguliert die Milch auf Milchmedium nicht, sondern peptonisiert die Milch so stark, dass die Peptonisierung innerhalb 1 Woche abgeschlossen ist. Ferner verwertet der erfindungsgemäss verwendete Stamm Fructose und Salicin, die von Streptomyces fungicidicus nicht verwertet werden.
Darüber hinaus bildet Streptomyces fungicidicus Fungicidin, eine fungicide Substanz, während der erfindungsgemäss verwendete Stamm diese fungicide Substanz weder in der Kulturflüssigkeit noch im Mycel bildet.
Nach den vorstehend genannten Eigenschaften des erfindungsgemäss verwendeten Stammes wurde er als Stamm von Streptomyces fungicidicus eingestuft und bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, unter der Nr. ATCC-21013 und beim Institute for Fermentation, Osaka, unter der Nr. IFO : 12439 hinterlegt.
Das nach der Strichmethode ermittelte antibakterielle Spektrum von Streptomyces fungicidicus ATCC 21013 auf Bouillon-Agar und Glycerin-Bouillon-Agar ist in Tabelle 1 genannt. Streptomyces fungicidicus ATCC 21013 wurde strichförmig auf Agarplatten geimpft und 4 Tage bei 280G bebrütet. Die Platten wurden dann senkrecht zum Strich ebenfalls strichförmig mit Testorganismen beimpft, die in Tabelle 1 genannt sind, worauf die Bebrütung bei 370 C 20 h für grampositive und gramnegative bzw. 40 h für säurefeste Bakterien fortgesetzt wurde.
Abschliessend wurde die Länge der Hemmzone für jeden Testorganismus gemessen.
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EMI5.1
EMI5.2
<tb>
<tb> - <SEP> Antibiotisches <SEP> Spektrum <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> fungicidicus <SEP> ATCC <SEP> 21013
<tb> nach <SEP> der <SEP> Strichmethode
<tb> Hemmzone,
<SEP> mm
<tb> Glycerin-BouillonBouillon-Agar <SEP> Agar
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Bacillus <SEP> subtillus <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> brevis <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Saccharomyces <SEP> lutea <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass Streptomyces fungicidicus ATCC 21013 antibiotische Substanzen bildet, die hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien wirksam sind.
Die mikrobischen Eigenschaften von Actinomyces, insbesondere der Gattung Streptomyces, liegen nicht allgemein fest, und dies gilt auch für die Eigenschaften der Stämme, die Enduracidin bilden. Es gibt somit zahlreiche Mutanten und Varianten von Streptomyces fungicidicus ATCC 21013. Von den Mutanten und Varianten von Streptomyces fungicidicus können ohne Rücksicht darauf, ob die Variation oder Mutation natürlich oder künstlich beispielsweise durch Behandlung mit Röntgenstrahlen. Ultraviolettlicht oder durch Einwirkung chemischer Reagentien hervorgebracht wurde, alle diejenigen, die Enduracidin bilden, für das Verfahren gemäss der Erfindung verwendet werden.
Beispielsweise kann die von Streptomyces fungicidicus ATCC 21013 abgeleitete Mutante ATCC-21014, die durch Behandlung mit Ultraviolettlicht, y-Strahlung oder durch Monosporenisolierung des Wildstammes erhalten werden kann, für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Die Mutante ATCC - 21014 (IFO-12440) von Streptomyces fungicidicus ATCC 21013 hat die folgenden mikrobischen Eigenschaften :
A) Morphologische Eigenschaften : Gleiche Eigenschaften wie der Wildstamm.
B) Merkmale der Kulturen
Die Mutante bildet farbloses oder gelbes vegetatives Mycel bei den verschiedenen Kulturen und ein Luftmycel mit der gelben Farbe von Bleimonoxyd (Rdg. XVI, 22'f) oder Senf (Rdg. XVI, 19'-b). Er bildet auf den meisten Kulturmedien kein lösliches Pigment und gelegentlich ein blassgelbes lösliches Pigment.
1. Czapek-Agar : Vegetatives Mycel reichlich, sich ausbreitend, dringt in das Medium ein, blassgelb ; Luftmycel reichlich, pulverförmig, cremefarben (Rdg. XVI 19'-f) bis Pale Ochraceous Buff (Rdg. XV, 15'-f), Rückseite cremefarben ; lösliches Pigment nicht vorhanden oder blassgelb.
2. Glucose-Czapek-Agar : VM reichlich, sich ausbreitend, farblos bis blassgelb ; LM mässig, pulverförmig, weiss bis Naples-gelb (Rdg. XVI, 19'-d) R = cremefarben bis senfgelb (Rdg. XVI, 19 b) LP : nicht vorhanden.
3. Glycerin-Czapek-Agar : VM = reichlich, sich ausbreitend, faltig, senfgelb ; LM = reichlich,
EMI5.3
cremefarben bis Naples-gelb ;wie Bleimonoxyd (Rdg. XVI, 21'-f) bis senfgelb ; R = gelb ; LP = nicht vorhanden.
5. Bouillon-Agar : VM = mässig, sich ausbreitend, farblos ; LM = mässig, pulverförmig, weiss ; R= farblos ; LP = nicht vorhanden.
6. Glucose-Bouillon-Agar : Vegetatives Mycel = reichlich, sich ausbreitend, farblos, faltig ; LM= nässig, pulverförmig, weiss bis cremefarben ; R = blassbraun ; LP = nicht vorhanden.
7. Glycerinbouillon-Agar : VM = reichlich, sich ausbreitend, farblos, faltig ; LM = mässig, pulver- förmig. weiss ; R = blassbraun ; LP = nicht vorhanden.
8. Stärke-Agar : VM= reichlich, sich ausbreitend, senfgelb, dringt in das Medium ein ; LM = reich-
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lich, weiss bis cremefarben, Farbe des Mediums ändert sich nicht.
10. Löffler-Medium : VM = reichlich, farblos, faltig : LM = nicht vorhanden ; LP = nicht vorhanden, starke Verflüssigung.
EMI6.2
: VM= reichlich, sich ausbreitend,Salmon ; LP = nicht vorhanden.
12. Kartoffel: VM=reichlich, sich ausbreitend, faltig, antimongelb (Rdg. XV, 17'-b) ; LM= reich- lich, pulverig, weiss bis Light Ochraceous-Buff. Das Medium färbt sich braun.
13. öhrenbrei: VM=reichlich, faltig. Ochraceous-Buff; LM= zuerst weiss, später Pale Ochraceous-
Buff bis Light Ochraceous-Salmon. Die Farbe des Mediums ändert sich nicht.
14. Bouillon : VM = spärlich, sinkt zu Boden, reichliches Wachstum, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, farblos bis blassbraun ; LM = mässig, pulverig, weiss ; LP = nicht vorhanden.
15. Glucosebouillon, Glycerinbouillon : Ebenso wie auf Bouillon, Wachstum jedochreichlicher und faltig.
16. Lackmusmilch : VM = reichliches Wachstum, senfgelb, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, ringförmiges Wachstum, faltig ; LM = spärlich, weiss, starke Peptonisierung ohne Koagulierung.
17. Nährgelatine; V-reichlich, ringförmig am Rand des Rohres, faltig, Ochraceous-Buff; LM = mä- ssig, weiss bis cremefarben ; kein lösliches Pigment ; starke Verflüssigung.
18. Czapeklösung mit 0, 21, 1 NaN0. : VM = mässig, schwimmt an der Oberfläche des Mediums, farblos ; LM = mässig, pulverig, weiss ; LP = nicht vorhanden. Schwache Nitratreduktion.
19. Cellulose : VM= mässig, farblos bis cremefarben, sich ausbreitend ; LM = mässig, pulverig, weiss bis blass Ochraecous-Salmon.
20. Calciummaleat-Agar : VM = mässig, farblos bis cremefarben bis Ochraceous-Buff, sich aus- breitend ; LM= mässig, pulverig, weiss bis blass Ochraceous-Salmon; R=cremefarben bis hell OchraceousSalmon ; LP = nicht vorhanden.
21. Tyrosn-Agar: VM = spärlich, dünn, Farblos; LM = nicht vorhanden; R = farblos, LP = nicht vorhanden.
22. Pepton-Agar : VM = mässig, sich ausbreitend, farblos ; LM = mässig, pulverig, weiss bis blass Ochraceous-Buff (Rdg. XV, 15'-f) : R = farblos bis cremefarben ; LP = nicht vorhanden; nichrchromogener Typ.
23. Hydrolyse von Stärke : Enzymatische Zone/Wachstumszone = 22 mm/11 mm oder 26 mm/13 mm.
C) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Gottlieb :
EMI6.3
<tb>
<tb> Erythrit <SEP> Rhamnose
<tb> Adnoit <SEP> ¯ <SEP> Melibiose <SEP> +
<tb> D-Sorbit <SEP> D-Maltose
<tb> i-Inosit <SEP> Saccharose
<tb> D-Mannit <SEP> +++ <SEP> Lactose <SEP> +++ <SEP>
<tb> Dulcit <SEP> Raffinose
<tb> D-Xylose <SEP> +++ <SEP> Salicin <SEP> +++
<tb> L-Arabinose <SEP> +++ <SEP> Aesculin <SEP> +
<tb> L-Sorbose <SEP> + <SEP> Inulin <SEP> t <SEP>
<tb> D-Galactose <SEP> +++ <SEP> Natriumacetat <SEP> ++ <SEP>
<tb> D-Glucose <SEP> ++ <SEP> Natriumsuccinat <SEP> ++
<tb> D-Mannose-t-n-Natriumcitrat <SEP> ++
<tb> Glycerin <SEP> +++ <SEP> Stärke <SEP> +++ <SEP>
<tb> D-Fructose.. <SEP> Kontrolle <SEP> : <SEP> t <SEP>
<tb>
= schwaches Wachstum ; + = Wachstum ;
EMI6.4
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Varianten in einem Medium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Stickstoffquellen und andere notwendige Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Stärke, Glucose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Dextrin, Glycerin oder Hirsebrei. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Pentose, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Ammoniumsalze, organische oder anorganische Stickstoffverbindungen. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, z. B. Chlorid, Phosphate, Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan und Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Falls erforderlich, können übliche Nährelemente oder ein Antischaummittel, z. B. tierisches Öl, Wachs, pflanzliches Öl oder Mineralöl, zugesetzt werden.
Für die Züchtung des Enduracidin bildenden Stammes ist die submerse Schüttelkultur oder die Verwendung eines flüssigen Mediums vorzuziehen. Gegebenenfalls kann jedoch auch die Züchtung in der
EMI7.1
merskultur ist die Bildung von Enduracidin im allgemeinen bei 25 bis 45 C, etwa neutralem PH-Wert und bei einer Dauer von etwa 3 bis 10 Tagen maximal.
Das hiebei gebildete Enduracidin ist zum grössten Teil im Mycel, jedoch auch im flüssigen Teil der
Kulturlösung enthalten. Das in der Kulturbrühe angereicherte Enduracidin wird isoliert und in gewünsch- ter Reinheit nach Methoden hergestellt, bei denen die Eigenschaften von Enduracidin, z. B. Unterschie- de zwischen Enduracidin und den Verunreinigungen hinsichtlich der Löslichkeit, im Verteilungsver- hältnis zwischen zwei Flüssigphasen, in der Adsorptionsfähigkeit oder in der Ionenkohärenz ausge- nutzt werden.
Da Enduracidin nicht nur im Mycel, sondern auch im flüssigen Teil der Kulturbrühe vorhanden ist, ist es für seine Isolierung zweckmässig, zuerst das Mycel von der Kulturlösung abzutren- nen und dann das Mycel und den flüssigen Teil der Kulturlösung einem Trenn- bzw. Reinigungsverfahren zu unterwerfen. In der Praxis wird die Abtrennung bzw. Reinigung von Enduracidin vorteilhaft durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel vorgenommen. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Extraktion vonEnduracidin mit n-Butanol unter basischen Bedingungen erfolgt und anschliessend eine erneute Extraktion mit einer wässerigen sauren Lösung vorgenommen wird.
Die Abtrennung oder Reinigung von Enduracidin kann unter Ausnutzung beispielsweise der folgenden Eigenschaften erfolgen : Es wird an Aktivkohle unter alkalischen Bedingungen (PH nicht unter etwa 8, 0) adsorbiert ; es kann mit organischen Lösungsmitteln (z. B. angesäuertem wässerigem Aceton und wässerigem Methanol) extrahiert werden und wird an Kationen oder Anionenaustauschharzen (z. B.
Amberlite IR-120 und Amberlite IR-45) nicht adsorbiert. Beispielsweise kann Enduracidin im allgemeinen nach dem folgenden bevorzugten Verfahren extrahiert werden :
Das aus der Kulturbrühe abgetrennte Mycel wird mit Wasser gewaschen und zweimal unter neutralen oder sauren Bedingungen mit einem organischen Lösungsmittel (z. B. 50 bis 70'l0igem wässerigem Aceton in der 3-bis 4fachen Volum-Menge des Mycels, 50 bis 700/oignes Methanol usw. ) 3 h bei Raumtemperatur extrahiert. Das so erhaltene Filtrat enthält eine reichliche Menge Enduracidin, das eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegen gram-positive Bakterien hat. Nach Einstellung auf PH 5 bis 6 wird das Filtrat im Vakuum durch Abdestillieren des Acetons eingeengt, worauf es mit Schwefelsäure auf PH 3 eingestellt wird.
Nach Zugabe von Äthylacetat in einer Volum-Menge von einem Drittel des Konzentrats wurde das ganze Gemisch geschüttelt, um den löslichen Teil in die Äthylacetatschicht zu überführen. Die wässerige Schicht (die eine gewisse Fällungsmenge enthält), diesich von der Äthylacetatschicht abscheidet, wird mit Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat auf PH 8 eingestellt und anschliessend mit n-Butanol in einer Menge von einem Drittel des Gesamtvolumens extrahiert. Nach Wiederholung der Extraktion mit n-Butanol wird die n-Butanolschicht mit Wasser in einer Menge von 1/2 des Gesamtvolumens gewaschen und dann mit einer wässerigen Säurelösung (z. B. PH 2, n/200 HCl oder n/200 HSO) gewaschen, wobei eine wässerige saure Lösung erhalten wird, die den Wirkstoff enthält.
Die wässerige Lösung wird der vorstehend beschriebenen Extraktion mit n-Butanol unterworfen. Die hiebei erhaltene n-Butanolschicht enthält das im Mycel gebildete Enduracidin in hoher Ausbeute. Die Extraktion mit wässeriger Salzsäurelösung und mit n-Butanol wird erneut wiederholt, wobei eine n-Uutanolschicht erhalten wird, die den Wirkstoff in einer viel höheren Konzentration enthält. Die so erhaltene n-Butanolschicht wird einer gewissen Einengung unterworfen, mit Wasser gewaschen und weiter unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt, wobei das n-Butanol abdestilliert, bis nur noch eine sehr geringe Menge n-Butanol im System vorhanden ist.
Zum kondensierten n-Butanol wird Äther in einer Menge gegeben, die 1/10 Volumen des n-Butanols entspricht, wobei eine gelblich-braune Fällung gebildet wird, die abfiltriert wird. Die Fällung wird mit
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Äther gewaschen, wobei der rohe Wirkstoff erhalten wird, der einen grösseren Teil des angereicherten Enduracidins darstellt.
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Die Reinigung der rohen Substanz kann vorzugsweise wie folgt vorgenommen werden : Die in einer wässerigen Säurelösung gelöste rohe Substanz wird durch eine Säule geleitet, die mit Aktivkohle, die einer Vorbehandlung mit Säure unterworfen worden ist, gefüllt ist, und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauschharz (z. B. Amberlite IR-4b, IR-45 usw., Hersteller Rohm & Haas Co., USA) zur Entfernung der Säure behandelt. Die so behandelte Säure wird eingeengt oder gefriergetrocknet, wobei der reine Wirkstoff erhalten wird.
Der Wirkstoff kann einer weiteren Reinigung unterworfen oder beispielsweise wie folgt in sein Hydrochlorid überführt werden : Der in methanolischer Salzsäure gelöste Wirkstoff wird durch eine Säule geleitet, die mit Aktivkohle, die einer Vorbehandlung mit Säure unterworfen worden ist, gefüllt ist.
Die so behandelte Lösung wird bei Raumtemperatur eingeengt. Das Konzentrat wird mit Aceton-Äther versetzt und anschliessend stehen gelassen, wobei ein farbloses kristallines Pulver von Enduracidinhydrochlorid gebildet wird. Dieses Pulver ist in Wasser und Methanol löslich und zeigt eine antibiotische Wirksamkeit von 10000 bis 15000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus und von 10000 bis 15000 Einheiten/mg gegen Bacillus subtilis.
Die 20 bis 50% igue Methanollösung dieses Pulvers wird durch ein schwach basisches Ionenaustauschharz geleitet. Die ablaufende Flüssigkeit wird mit n-Butanol versetzt, worauf das Wasser und Methanol abdestilliert werden und ein Konzentrat erhalten wird. Es ist auch möglich, die wässerige Lösung dieses Pulvers auf PH 8 bis 8,5 einzustellen, die Lösung mit n-Butanol zu extrahieren und anschliessend die Konzentration vorzunehmen. Das hiebei erhaltene Konzentrat wird mit Äther versetzt, wobei Enduracidin in seiner freien Form erhalten wird.
Das so gereinigte Enduracidin hat die folgenden physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften :
1. Elementaranalyse :
Enduracidin besteht aus C-, H-, N-, P- und Cl-Atomen.
EMI8.2
<tb>
<tb>
C, <SEP> % <SEP> H, <SEP> % <SEP> N, <SEP> % <SEP> Cl, <SEP> 0/0
<tb> Freie <SEP> Form <SEP> * <SEP> 53, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 540, <SEP> 3 <SEP> 14. <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> Hydrochlorid <SEP> ** <SEP> 49. <SEP> 7 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 6, <SEP> 290, <SEP> 3 <SEP> 13, <SEP> 51 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 9,42 <SEP> fui <SEP> 0, <SEP> 5
<tb>
Die freie Form wird nachstehend als (A) und das Hydrochlorid als (B) bezeichnet.
*
Die freie Form enthält noch 3,36 0, 5% Chlor in ihrem Molekül.
Es wird angenommen, dass der Chlorgehalt von etwa 3, 36 0, 5% auf starke lonenbindung oder kovalente Bindung zurückzuführen ist, obwohl dies noch nicht bestätigt ist.
**
Das Hydrochlorid enthält im Vergleich zur freien Form weitere 2 Mol Chlor.
2. Molekulargewicht und Struktureinheit.
Wenn Enduracidin mit 6n-Salzsäurelösung 6 bis 48 h bei 110 C hydrolysiert wird, werden ein Gemisch von Threonin, Serin, Glycin, Alanin und Asparaginsäure, eine gewisse Menge Substanzen, die in der Ninhydrin-Reaktion positiv sind, und unbestimmte Substanzen gebildet, die sich mit dem SakaguchiReagenz blau und violettblau färben. Zu diesen unbestimmten Substanzen gehören solche, die bei der Ninhydrin-Reaktion zunächst gelblich-braun, gelb oder violett sind, sich aber violett färben, wenn sie bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Ihre Mengen sind verschieden je nachdem Grad der Hydrolyse. Auf Grund dieser Eigenschaften wird Enduracidin als neues Antibiotikum vom Typ des basischen Peptids angesehen.
Anderseits ist einer Neutralisationstitrationskurve, die auf der Grundlage der Titration von Enduracidin in 500/0igem Methanol mit einer n/10 Salzsäurelösung gezeichnet wurde, zu entnehmen, dass Endura cidin einige basische Gruppen enthält, die in seinem Molekül zu dissoziieren vermögen. Aus der nachgewiesenen Chlormenge kann das Mindestmolekulargewicht von Enduracidin mit etwa 1055 berechnet werden, so dass das Molekulargewicht von Enduracidin mit (etwa 1000 bis 1100), wobei n eine ganze Zahl ist, angegeben werden kann.
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EMI9.1
4. Absorptionsspektrum :
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Enduracidin ist in Fig. 1 (freie Form) und Fig. 4 (Hydrochlorid) dargestellt.
Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Absorptionsmaxima :
EMI9.2
EMI9.3
= 220 + 15)inFig. 2 (freie Form, KBr-Methode) und 3 (freie Form, Nujol-Methode), 5 (Hydrochlorid, KBr-Methode) und 6 (Hydrochlorid, Nujol-Methode) dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in u (KBr-Methode) :
EMI9.4
<tb>
<tb> A <SEP> B
<tb> 3, <SEP> 05 <SEP> (stark) <SEP> 3,05 <SEP> (stark)
<tb> 3, <SEP> 25 <SEP> (Schulter) <SEP> 3,25 <SEP> (Schulter)
<tb> 3,38 <SEP> (Schulter) <SEP> 3,38 <SEP> (Schulter)
<tb> 5,75 <SEP> (Schulter) <SEP> 5,77 <SEP> (Schulter)
<tb> 5,95 <SEP> (Schulter) <SEP> 5, <SEP> 95 <SEP> (Schulter)
<tb> 6,09 <SEP> (stark) <SEP> 6,09 <SEP> (stark)
<tb> 6,24 <SEP> (Schulter) <SEP> 6,23 <SEP> (Schulter)
<tb> 6,47 <SEP> (Schulter) <SEP> 6,47 <SEP> (Schulter)
<tb> 6,55 <SEP> (Schulter) <SEP> 6,55 <SEP> (Schulter)
<tb> 6,61 <SEP> (stark) <SEP> 6,61 <SEP> (stark)
<tb> 6,90 <SEP> (mittel) <SEP> 6,95 <SEP> (mittel)
<tb> 7, <SEP> 23 <SEP> (mittel) <SEP> 7,25 <SEP> (mittel)
<tb> 7,63 <SEP> (mittel) <SEP> 7,48 <SEP> (Schulter)
<tb> 8,10 <SEP> (breit, <SEP> stark) <SEP> 8,16 <SEP> (breit, <SEP> stark)
<tb> 8,51 <SEP> (mittel) <SEP> 8,51 <SEP> (mittel)
<tb> 9,
90 <SEP> (mittel) <SEP> 9,89 <SEP> (mittel)
<tb> 10,40 <SEP> (schwach) <SEP> 10,40 <SEP> (schwach)
<tb> 11,92 <SEP> (mittel) <SEP> 11,93 <SEP> (mittel)
<tb> 12,30 <SEP> (schwach) <SEP> 12, <SEP> 30 <SEP> (schwach)
<tb> 12,75 <SEP> (sehr <SEP> schwach)
<tb>
5. Farbe
A : Farbloses Pulver
B : Farbloses kristallines Pulver
<Desc/Clms Page number 10>
6.
Farbreaktion
EMI10.1
<tb>
<tb> Reagens <SEP> Enduracidin <SEP> Ergebnis
<tb> Ninhydrin-Reagens <SEP> (A) <SEP> positiv <SEP> (blass <SEP> bräunlich-violett)
<tb> (B) <SEP> positiv <SEP> (blass <SEP> bräunlich-violett)
<tb> Bartonisches <SEP> Reagens <SEP> (A) <SEP> positiv <SEP> (blassblau)
<tb> (Gemisch <SEP> aus <SEP> gleichen
<tb> Raumteilen <SEP> 1'obigem
<tb> wässerigem <SEP> Eisen <SEP> (III)- <SEP>
<tb> chlorid <SEP> und <SEP> llolgem
<tb> wässerigem <SEP> Kaliumfern- <SEP> (B) <SEP> positiv <SEP> (blassblau)
<tb> cyanat
<tb> Dragendorffsches <SEP> Reagens <SEP> (A) <SEP> positiv <SEP> (orange-gelb)
<tb> (B) <SEP> positiv <SEP> (orange-gelb)
<tb> Alkalisches <SEP> Kaliumper- <SEP> (A) <SEP> Verfärbung <SEP> tritt <SEP> ein <SEP> (Reduktion)
<tb> manganat
<tb> (B) <SEP> Verfärbung <SEP> tritt <SEP> ein <SEP> (Reduktion)
<tb>
7.
Schmelzpunkt
A : 205 bis 2250 C (Sinterung) 225 bis 240 C (Zers.)
B : 215 bis 2200C (Sinterung) 235 bis 2450C (Zers.)
8. Löslichkeit
A) ist leicht löslich in Pyridin, N, N-Dimethylformamid, wässeriger 5%iger NIKKOL HCO-50-Lö- sung (NIKKO-SHOKAI-KABUSHIKI-KAISHA, Japan), verdünnter Säure, wässeriger alkalischer Lösung (unter Zersetzung) und löslich in wässerigem Methanol, wässerigem Äthanol, wässerigem Aceton und wässerigem Butanol, jedoch unlöslich oder schwerlöslich in Wasser, absolutem Äthanol, reinem Butanol, reinem Aceton und andern neutralen organischen Lösungsmitteln.
B) ist leicht löslich in Wasser, Methanol und löslich in Äthanol, jedoch unlöslich in Aceton, Äther und andern neutralen organischen Lösungsmitteln.
9. Rf-Wert (Papierverteilungschromatographie)
Bei der Papier verteilungschromatographie unter Anwendung der aufsteigenden Methode auf WhatmanFilterpapier Nr. 1 (B. and R. Balston Ltd., England) wurden folgende Ergebnisse erhalten :
EMI10.2
<tb>
<tb> Lösungsmittel <SEP> Rf-Wert <SEP> (A <SEP> = <SEP> B) <SEP> * <SEP>
<tb> **
<tb> Essigsäure-n-Butanol-Wasser <SEP> (1 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 5) <SEP> 0,45 <SEP> fui <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> n-Butanol, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> gesättigt <SEP> 0,0
<tb> Pyridin-n-Butanol-Wasser <SEP> (3 <SEP> : <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 7) <SEP> 0,80 <SEP> : <SEP> l
<tb>
*
Für A und B wird der gleiche Rf-Wert festgestellt.
**
Die Substanz wird unter neutralen Bedingungen leicht an
Filterpapier adsorbiert.
10. Stabilität
A) und B) sind ziemlich stabil in Methanol und saurer Lösung, aber die antibiotische Wirksamkeit verschlechtert sich auf 1/5 bis 1/10 bei 42stündiger Lagerung in alkalischer Lösung bei40 C.
11. Toxizität
Die mittlere lethale Dosis (LD) von (A) im Gegensatz zur akuten Toxizität beträgt bei Mäusen wenigstens 880 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Behandlung und wenigstens 66 mg/kgKörpergewicht bei intravenöser Verabfolgung. Bei Ratten beträgt die mittlere lethale Dosis (LD so) von
<Desc/Clms Page number 11>
(A) im Gegensatz zur akuten Toxizität wenigstens 300 mg/kg Körpergewicht bei intravenöser Ver- abfolgung.
12. Antibiotisches Spektrum
Die antibiotische Wirkung von Enduracidin gegen die verschiedenen Mikroorganismen wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode gemessen. D e als Testorganismen verwendeten grampositiven oder gramnegativen Bakterien wurden auf Bouillon-Agar 20 h bei 370C geztichtet. Bei säurefesten Bakterien wurde Glycerinbouillon-Agar verwendet. Die Bebrütung wurde 40 h bei 370 C durchgeführt.
Im Falle von Pilzen oder Hefe wurde Glucosebouillon-Agar als Nährmedium verwendet. Die Bebrütung wurde 40 h bei 280 C durchgeführt.
Das antimikrobische Spektrum von Enduracidin ist nachstehend in Tabelle 2 in der hemmenden Mindestkonzentration angegeben. Wie Tabelle 2 zeigt, besitzt Enduracidin starke antimikrobe Wirkungen gegen grampositive und säurefeste Bakterien.
Die hemmende Mindestkonzentration gegen Bakterien, bestimmt bei 370 C auf TSA-Kultur, die Rinderblutserum enthält, bei einer Bebrütungsdauer von 20 h ist in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
EMI11.1
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Mindestkonzentration
<tb> Testbakterien <SEP> (Mikrogramm/ml)
<tb> (A) <SEP> (B) <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> p <SEP> 2,5 <SEP> 0,78
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> E-14 <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenges <SEP> Dick <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 0,78
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> S-8 <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 0,78
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> Ni-5 <SEP> 2,5 <SEP> 1, <SEP> 56
<tb> Streptococcus-viridans <SEP> sp.
<SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 1, <SEP> 56
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> == <SEP> I <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 0,78
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> = <SEP> II <SEP> 0,625 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae-III <SEP> l, <SEP> 25 <SEP> 0,78
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheria <SEP> 0,625 <SEP> 0,78
<tb>
EMI11.2
EMI11.3
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Mindestkonzentration
<tb> Testbakterien <SEP> Mikrogramm/ml <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> > <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 0,5
<tb> Bacillus <SEP> brevis <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 0,05
<tb> i <SEP> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 5,
<SEP> 0 <SEP>
<tb> ; <SEP> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> (Streptomycin-resist.) <SEP> 5, <SEP> 0
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> (Neomycin-resist.) <SEP> 5,0
<tb> Mycobacterium <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 607 <SEP> 5, <SEP> 0
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 5,0
<tb> Mycobacterium <SEP> smegmatis <SEP> 2
<tb> Piricularia <SEP> oryzae <SEP> > <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> > <SEP> 100
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle 2 (Fortsetzung)
EMI12.1
<tb>
<tb> Hemmende <SEP> Mindestkonzentration
<tb> Testbakterien <SEP> Mikrogramm/ml
<tb> Penicillium <SEP> notatum <SEP> > <SEP> 100
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> > <SEP> 100
<tb> Saccharamyces <SEP> cerevisiae <SEP> > <SEP> 100
<tb>
Die physiologische Acidität oder Basizität von Enduracidin wurde nach der Strichmethode in einer Agarschale gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Wie aus diesen Werten ersichtlich ist, zeigt Enduracidin auf basischen Testmedien eine viel stärkere Wirksamkeit als auf neutralen oder sauren Medien. Dies bedeutet, dass Enduracidin zu den sogenannten physiologisch basischen Substanzen gehört.
Tabelle 3
EMI12.2
<tb>
<tb> Einfluss <SEP> von <SEP> PH-Änderungen <SEP> auf <SEP> die <SEP> antibiotische <SEP> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> Enduracidin
<tb> Testbakterien <SEP> PH <SEP> Hemmungszone, <SEP> mm
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 6 <SEP> 11 <SEP> 11,5
<tb> 8 <SEP> 13 <SEP> 12
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
In den folgenden Beispielen sind die zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung be- schrieben. Die Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.
Beispiel 1 : Streptomyces fungicidicus ATCC 21013 wird mit einer Platinöse von GlucoseAsparagin-Schrägagar auf je 500 ml von wässerigen Kulturmedien überimpft, die in 2 1-Kolben gehalten werden. Die wässerigen Medien enthalten 2% Glucose, 3% Stärke, 1% Maisquellwasser, l% Sojabohnenmehl, 0, 5% Pepton, 0, 3% Natriumchlorid und 0, 50/0 Calciumcarbonat. Sie sind vorher auf PH 7 eingestellt und 20 min bei 1200 C mit Hochdruckdampf sterilisiert worden. Die Kulturmedien werden unter Schütteln (120 Zyklen/min, 10 cm) 24 h bei 28 C bebrütet.
Von der erhaltenen Kulturbrühe wird 11 der Vorfermentation in 30 l Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung in einem 501-Tank 24h bei 28 OC unter Rühren (280 Umdr/min) und Belüftung (45 l/min) unterworfen. Die so erhaltene Vorkultur wird weiterhin 96 h bei 280 C in 500 l eines
EMI12.3
rend der ersten Hälfte der Fermentationsdauer und 500 l/min während der letzten Hälfte der Fermentation bebrütet, wobei etwa 1, 5 kg Siliconöl als Antischaummittel verwendet werden.
Änderungen des pH-Wertes und der antibiotischen Aktivität sind als Agar-Verdünnungseinheit nach verschiedenen Bebrütungszeiten in der folgenden Tabelle angegeben.
EMI12.4
<tb>
<tb>
Kulturfiltrat <SEP> Mycel
<tb> Behrütungszeit <SEP> pH <SEP> (Einheit) <SEP> (Einheit)
<tb> * <SEP> ** <SEP> * <SEP> **
<tb> St <SEP> B <SEP> St <SEP> B
<tb> Sakaguchi-Kolben
<tb> (Impfmaterial) <SEP> 6,15 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb>
<tb> Kulturfiltrat <SEP> Mycel
<tb> Bebrütungszeit <SEP> PH <SEP> (Einheit) <SEP> (Einheit)
<tb> * <SEP> ** <SEP> * <SEP> **
<tb> St <SEP> B <SEP> St <SEP> B
<tb> Vorkultur <SEP> (30 <SEP> l) <SEP> 7, <SEP> 05
<tb> 0 <SEP> 7, <SEP> 05
<tb> 18 <SEP> 6, <SEP> 28 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 24 <SEP> 6, <SEP> 70 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> Haupt-Kultur <SEP> (500 <SEP> 1) <SEP> 7, <SEP> 05
<tb> 0 <SEP> 7, <SEP> 05
<tb> 18 <SEP> 6, <SEP> 75
<tb> 30 <SEP> 7, <SEP> 16 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10
<tb> 42 <SEP> 7,
<SEP> 36 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> 54 <SEP> 7,55 <SEP> 35 <SEP> 35 <SEP> 350 <SEP> 350
<tb> 66 <SEP> 7, <SEP> 70 <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> 350 <SEP> 350
<tb> 78 <SEP> 8,05 <SEP> 75 <SEP> 75 <SEP> 750 <SEP> 750
<tb> 90 <SEP> 7,93 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 1000 <SEP> 1000
<tb>
EMI13.2
Staphylococcus aureus **
Bacillus subtilis
EMI13.3
2 :fermentiert, wobei Siliconöl als Antischaummittel verwendet wird.
Änderungen des pH-Wertes und der antimikrobischen Wirkung sind als Agar-Verdünungseinheit nach verschiedenen Bebrütungszeiten in der folgenden Tabelle angegeben.
EMI13.4
<tb>
<tb>
Kulturfiltrat <SEP> Mycel
<tb> Bebrütungszeit <SEP> PH <SEP> (Einheit) <SEP> (Einheit)
<tb> * <SEP> ** <SEP> * <SEP> **
<tb> St <SEP> B <SEP> St <SEP> B
<tb> 0 <SEP> 7, <SEP> 25
<tb> 18 <SEP> 6, <SEP> 95 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 30 <SEP> 6,81 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP>
<tb> 42 <SEP> 7,00 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 10 <SEP> > <SEP>
<tb> 54 <SEP> 7, <SEP> 30 <SEP> 35 <SEP> 20 <SEP> 150 <SEP> 150
<tb> 66 <SEP> 7,52 <SEP> 35 <SEP> 20 <SEP> 150 <SEP> 150
<tb> 78 <SEP> 7,62 <SEP> 35 <SEP> 35 <SEP> 350 <SEP> 350
<tb> 90 <SEP> 7,59 <SEP> 500 <SEP> 500 <SEP> 1500 <SEP> 1500
<tb> 102 <SEP> 7,70 <SEP> 500 <SEP> 500 <SEP> 2000 <SEP> 2000
<tb> 114 <SEP> 7,90 <SEP> 500 <SEP> 500 <SEP> 2000 <SEP> 2000
<tb>
* Staphylococcus aureus ** Bacillus subtilis
Beispiel 3 :
Durch Filtration von 500 l der gemäss Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe werden LOO kg nasses Mycel von 400 l Kulturfiltrat abgetrennt. Das nasse Mycel wird zweimal mit je 300 1 70'obigem wässerigem Aceton unter Rühren 3 h extrahiert. Die Acetonschichten werden vereinigt. Ihre mtibakterielle Wirkung entspricht 200 bis 350 Einheiten/ml gegen St. aureus. Nach Einstellung auf ) H 5 bis 6 mit 4 n-Schwefelsäure wird das Aceton unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 200 1
<Desc/Clms Page number 14>
wässerige Lösung zurückbleiben. Die wässerige Lösung wird mit 4 n-Schwefelsäure auf PH 3, 0 eingestellt.
Zur eingestellten sauren Lösung werden 70 l Äthylacetat gegeben.
Das Gemisch wird gerührt und stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die Äthylacetatschicht wird entfernt und die wässerige
Schicht (die eine gewisse Menge einer Fällung enthält) herausgenommen und mit 4n-Natriumhydroxyd auf PH 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf zweimal mit je 90 l n-Butanol extrahiert. Die n-Butanol- lösungen, die eine Wirkung von 120 bis 200 Einheiten/ml gegen Staphylococcus aureus zeigen, werden vereinigt und mit 90 1 destilliertem Wasser gewaschen. Die so behandelte Butanollösung wird zweimal mit je 50 l n/200 Salzsäure extrahiert. Die Salzsäurelösungen werden vereinigt und mit 4 n - Natrium- hydroxyd auf PH 8,0 eingestellt und unmittelbar darauf zweimal mit je 50 l n-Butanol extrahiert.
Die n-Butanolschichten werden vereinigt, mit 50 l destilliertem Wasser gewaschen und zweimal mit je 15 l n/200 Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Die salzsauren wässerigen Schichten werden vereinigt, mit4n-Na- triumhydroxyd auf PH 8,0 eingestellt und unmittelbar anschliessend zweimal mit je 15 l n-Butanol ex- trahiert. Die n-Butanolschichten werden vereinigt und zweimal mit je 10 l destilliertem Wasser ge- waschen. Zur so behandelten n-Butanolschicht wird destilliertes Wasser in einer Menge von 1/4 des
Volumens der Schicht gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Aussentempe- ratur von nicht mehr als 70 C eingeengt, bis das verbleibende Butanolvolumen 200 ml beträgt.
Wäh- rend der Einengung wird die Ausfällung des erfindungsgemässen Produktes festgestellt. Zum Konzentrat werden etwa 2 l Äther (peroxydfrei) gegeben. Die sich bildende Fällung wird zusammen mit der bereits vorhandenen Fällung abfiltriert und mit Äther gewaschen, wobei etwa 3,5 g einer rohen pulverförmigen
Substanz erhalten werden, die eine antibiotische Wirkung entsprechend 5000 Einheiten/mg gegen
Staphylococcus aureus hat.
Zu 400 1 des im erstenAbsatz dieses Beispiels genannten Kulturfiltrats werden 4n-Schwefelsäure zur
Einstellung des pH-Wertes auf 3, 0 und anschliessend 150 l Äthylacetat gegeben. Das Gemisch wird ge- rührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die wässerige Schicht wird entfernt und mit 4n-Natriumhydroxyd auf PH 8, 0 eingestellt und unmittelbar darauf mit 1001 n-Butanol versetzt. Das Gemisch wird gerührt und dann einige Zeit stehen gelassen, wobei sich zwei
Schichten bilden. Die n-Butanolschicht wird mit etwa 50 l destilliertem Wasser gewaschen und dann zweimal mit je 15 l n/200 Chlorwasserstoffsäure extrahiert.
Die Salzsäureschichten werden vereinigt, mit 4n-Natriumhydroxyd auf PH 8, 0 eingestellt und unmittelbar darauf mit 10 l n-Butanol versetzt. Das Gemisch wird zur weiteren Extraktion gerührt und dann stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die n-Butanolschicht wird abgezogen und zweimal mit destilliertem Wasser in einer Menge gewaschen, die 1/3 des Volumens der n-Butanolschicht entspricht.
Zu der gewaschenen n-Butanolschicht wird destilliertes Wasser in einer Menge von 1/4 des Volumens der Butanolschicht gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Aussentemperatur von nicht mehr als 700 C eingeengt. Das Konzentrat wird in der gleichen Weise wie das im ersten Absatz dieses Beispiels genannte Mycel aufgearbeitet, wobei etwa 0, 5 g einer rohen pulverförmigen Substanz erhalten werden, die eine antibiotische Wirkung von 5000 bis 7500 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus hat.
Beispiel 4 : Durch eine Säule, die mit 1 kgAktivkohle (TakedaChemical Industries) für Säulen- chromatographie gefüllt ist, die einer Vorbehandlung mit Salzsäure unterworfen worden ist, werden 100 I einer sauren Lösung geleitet, die den Wirkstoff enthält, der durch Extraktion mit n-Butanol gemäss Beispiel 3 erhalten wurde. Hiebei werden 70 1 einer fast farblosen Fraktion erhalten, die den Wirkstoff enthält. Die Fraktion wird durch eine Säule geleitet, die mit 2 1 Amberlite IR-45 bei S. V. 5 gefüllt ist, wobei eine leicht basische wässerige Lösung erhalten wird. Die wässerige Lösung wird bei verhältnismässig niedriger Temperatur unter vermindertem Druck eingeengt. Nach Zugabe von n-Butanol zum Konzentrat wird das Gemisch gerührt, um den Wirkstoff in die n-Butanolschicht zu überführen.
Zur n-Butanolschicht wird ebenso wie in Beispiel 3 peroxydfreier Äther gegeben, wodurch der Wirkstoff in freier Form ausgefällt wird, oder zur n-Butanolschicht wird l-normale Salzsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 4,5 gegeben. Auf diese Weise werden 1, 8 g einer pulverförmigen Substanz, deren antibiotische Wirkung 7500 bis 10 000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus entspricht bzw. 1, 9 g einer pulverförmigen Substanz mit einer antibiotischen Wirkung entsprechend 7500 bis 10 000 Einheiten/mg erhalten.
Beispiel 5 : In einem Gemisch von 500 ml Methanol und 1 ml l-normaler Salzsäure wird 1 g der gemäss Beispiel 3 bzw. Beispiel 4 hergestellten rohen pulverförmigen Substanz gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit 10 g Aktivkohle (Takeda Chemical Industries, Ltd.) für Säulenchromatographie gefüllt ist. Nach Behandlung mit einem Gemisch von 4 ml n/10 Salzsäure und 100 ml
<Desc/Clms Page number 15>
Methanol wird die Säule mit Methanol gewaschen, wobei 1, 5 1 Flüssigkeit ablaufen, die den Wirkstoff enthält. Die abgelaufene Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit Aceton- Äther bei verhältnismässig niedriger Temperatur versetzt, wobei eine weisse Fällung gebildet wird. Die
Fällung wird abfiltriert und mit Äther gewaschen, wobei 500 mg Produkt (Hydrochlorid) erhalten weri den.
Die antibiotische Wirkung der Fällung entspricht 15000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aureus.
In 100 ml ! obigem wässerigem Methanol werden 100 mg der Fällung (Hydrochlorid) gelöst. Die
Lösung wird durch eine Säule von 5 ml Amberlite IR-45 bei S. V. 3 geleitet. Die Säule wird mit Metha- nol gewaschen. Die ablaufende Flüssigkeit wird eingeengt. Der Rückstand wird gefriergetrocknet und anschliessend mit Aceton-Äther gewaschen, wobei 80 mg eines weissen Pulvers (freie Form) erhalten wer- den. Die Fällung zeigt eine antibiotische Wirkung entsprechend 15 000 Einheiten/mg gegen Staphylococ- cus aureus.
Beispiel 6 : Durch Filtration werden von 16 1 des gemäss Beispiel 7 erhaltenen Kulturfiltrats et- wa 4 kg nasses Mycel abgetrennt. Das Mycel wird mit dem vierfachen Volumen einer 70 igen wässe- rigenschwefelsauren Acetonlösung 4 h unter Rühren bei etwa PH 2 extrahiert. Nachdem 16 l wässeriger
Acetonextrakt (3500 Einheiten/ml gegen Staphylococcus aureus) mit Natriumhydroxyd auf PH 8 bis 8, 4 eingestellt worden sind, werden zum wässerigen Acetonextrakt 160 g Aktivkohle (SHIRASAGI-A, herge-
EMI15.1
geben. Das Gemisch wird 1 h gerührt. Nach Filtration wird die Aktivkohle mit Aceton in einer Menge, die dem 10fachen Volumen des Filtrats entspricht, und dann mit dem 10fachen Volumen Methanol gewaschen.
Die so behandelte Aktivkohle wird mit dem 20fachen Volumen einer sauren wässeri- gen Acetonlösung 3 h unter Rühren extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und auf PH 5 eingestellt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bleiben 1, 5 l wässerige Lösung zuruck. Die Lösung wird durch eine Kolonne, die mit 200 ml des lonenaustauschharzes Amberlite IR-120 (H) gefüllt ist, und dann durch eine Kolonne, die mit 200 ml Amberlite IR-45 gefüllt ist, geleitet und unter vermindertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Nach Vermischung mit 5 1 Wasser wird das Gemisch auf PH 8,5 eingestellt und dreimal mit 1/3 seines Volumens an n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolschicht wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck unter Zugabe von Wasser eingeengt, wobei 500 ml einer wässerigen n-Butanollösung zurückbleiben.
Zur Lösung werden 5 l Äther gegeben, wobei eine Fällung abgeschieden wird, die abfiltriert und getrocknet wird. Hiebei werden 4 g pulverförmiges rohes Enduracidin erhalten. Dieses Produkt zeigt eine Wirkung entsprechend 10000 Einheiten/mg gegen Staphylococcus aurcus.
Beispiel 7 : In zwei 2 1-Kolben werden je 500 ml eines Kulturmediums gegossen, das aus 2 11/0 Glucose, 3, 5% Maisquellwasser, 1, 5% Calciumcarbonat und Wasser besteht. Das Medium wird mit dem Mutanten Streptomyces fungicidicus ATCC-21014 (IFO-12440) geimpft und 2 Tage bei 280C unter Schütteln auf einer Schüttelmaschine bebrütet, wobei ein Vorimpfmedium erhalten wird. In einem 501-Tank werden 301 eines wässerigen Kulturmediums, das aus 2% Glucose, 3 löslicher Stärke, 1% Mais- quellwasser, l% Sojabohnenmehl, 0, 3% Natriumchlorid, 0, 5% Pepton, 0, 50/0 Calciumcarbonat und Wasser besteht und auf PH 7, 0 eingestellt ist, mit der erhaltenen Vorimpfkultur geimpft.
Das geimpfte Medium wird bei 28 C unter Bewegung und Belüftung (30 l/min) bebrütet. Der Fortschritt der Fermentation innerhalb von 90 h ergibt sich aus der folgenden Tabelle.
EMI15.2
<tb>
<tb>
Wirksamkeit <SEP> der <SEP> ganzen
<tb> Brühe <SEP> (Verd.-EinheiBebrütungzeit <SEP> pH-Wert <SEP> der <SEP> Brühe <SEP> ten/ml)
<tb> 0 <SEP> 7,05 <SEP> < <SEP> 10
<tb> 18 <SEP> 7, <SEP> 00 <SEP> < 10
<tb> 30 <SEP> 7, <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP>
<tb> 42 <SEP> 7, <SEP> 35 <SEP> 50 <SEP> I <SEP>
<tb> 54 <SEP> 7,82 <SEP> 350
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