DE3136675A1 - Neues peptid und dessen herstellung - Google Patents
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Description
NEUES PEPTID UND DESSEN HERSTELLUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid • B-52653, das eine biologisch aktive Verbindung ist,
ι und ein Verfahren zu dessen Herstellung,
5 Es ist wohlbekannt,, daß Boden-Mikroorganismen, die aus einer
I Bodenprobe isoliert wurden, verschiedenartige biologisch i aktive Verbindungen, darunter Antibiotika, erzeugen.
Auf der Suche nach neuen biologisch wirksamen Verbindungen ; sind bei der Anmelderin eine große'Zahl von Bodenproben
j -jo gesammelt, die aus den Proben isolierten Mikroorganismen
kultiviert und die Kulturen auf eine Hemmwirkung gegenüber
\ der Zellwandsynthese und der Collagen-Prolin-Hydroxylase
in der Kulturbrühe untersucht worden. Dabei wurde in der : Kulturbrühe eines Mikroorganismus ein neues,biologisch
1 15 wirksames Peptid aufgefunden. Es wurde gefunden, daß diese
I Verbindung nicht nur das Wachstum von gram-positiven und ; gram-negativen Bakterien in Folge ihrer Hemmwirkung auf die
Zellwand-Synthese hemmt, sondern auch eine Hemmwirkung gegenüber Collagen-Prolin-Hydroxidase besitzt, daß der
20 betreffende Mikroorganismus zu der Gattung Streptomyces
: gehört, daß das betreffende Peptid durch Kultivieren des
Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium unter geeigneten
Kulturbedingungen in der Kulturbrühe erzeugt und angereichert werden kann, und daß das Peptid als L-Alanyl-L-/(3R) 25
5-hydroxy-2-oxopyrrolidin-3-yl_7glycin geschrieben werden kann. Die vorliegende Erfindung beruht auf den genannnten
! Befunden. Das neue Peptid wurde als B-52653 bezeichnet.
: Die vorliegende Erfindung richtet sich demgemäß auf (1)
ein neues Peptid B-52653, das die Formel
—S
NH2 HO2C Η c2^
H0C-CH-CONH-CH-C " CH-OH
C-N
• 0* H
; besitzt und (2) ein Verfahren zur Herstellung dieses Peptids
B-52653, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein B-52653-erzeugender
Stamm der Gattung Streptomyces kultiviert und
; 5 dadurch veranlaßt wird., B-52653 in der Kulturbrühe zu
entwickeln und anzureichern, und daß das B-52653 aus der Kulturbrühe geerntet wird.
Die vorliegende Erfindung wird praktisch durchgeführt, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces verwendet,
der zur Entwicklung des neuen Peptids B-52653 befähigt ist. Als Beispiel für solche B-52653^erzeugenden Mikroorganismen
sei der Streptomyces sp.-Stamm Nr. B-52653 erwähnt, der ein aus einer Bodenprobe isolierter Stamm ist, die in Akashi
City, Hyogo Prefecture, Japan, entnommen wurde.
In der vorliegenden Beschreibung wird das vorerwähnte neue
Peptid B-52653 manchmal kurz als B-52653 bezeichnet, und der erwähnte Streptomyces.sp.-Stamm Nr. B-52653 als Stamm Nr.
B-52653.
A) Mikrobiologische Charakterisierung des Stammes Nr. B-52653 .
: Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. B-52653
wurden nach dem Verfahren von Schirling und Gottlieb /International
Journal of Systematic Bacteriology _1_6, 313—340,
1966_7untersucht. Im folgenden werden die Ergebnisse einer
21-tägigen Kultivierung des Stammes bei 28°C angegeben.
» * te
1) Morphologische Eigenschaften
1 Im allgemeinen bildet er auf Agarmedium ein vegetatives
Mycel, das gut verzweigt und langgestreckt ist, wobei sein
Luftmycel itionopodial verzweigt ist. Viele der Sporenketten
5 bilden Spiralen oder Schleifen, und einige sind gewellt.
j In vielen Fällen ist jede Sporenkette aus mehr als 10 Sporen zusammengesetzt. Die Sporen sind oval oder elliptisch, im
; Bereich von 0,8 - 1,2/im χ 1,0 - 1,5 /im, mit stachliger
i Oberfläche. Weder Geißeln- noch Sporenkapseln wurden i 10 beobachtet.
; 2) Kultur-Eigenschaften
j
j
Der vorliegende Stamm wächst gut auf verschiedenen Medien
und erzeugt dabei reichlich Sporen, und das Luftmycel ist hellgrau bis bräunlichgrau. Die Farbe der Rückseite reicht
' 15 von blaßgelb bis braun, und auf manchen Medien können he 1.1-i
gelbe bis hellbraune lösliche Pigmente gebildet werden.
Kulturmerkmale* Färbung / Color** / Color Code **
a) | Saccharose-Nitrat-Agar | • | - | aschfarben | s über grau | light brownish | - 5ec) | |
G: mäßig | leicht bräunlich | hell lohfarben | gray to Dusty | |||||
AM: mäßig | grau bis staubig- | ' Glycerin-Asparagin-Agar | Peach (5cb | |||||
.pfirsxchfarben | G: mäßig | |||||||
5 | AM: reichlich | silbergrau | (5fe) | |||||
SP: keines | ' Glucose-Asparagin-Agar | SP: | ||||||
b) | G: ' mäßig | Stärke-Agar | Ashes | |||||
AM: reichlich | G: mäßig | |||||||
SP: keines | AM: reichlich | hell elfenbein | (3fe) | |||||
10 | SP: keines | (3gc) | ||||||
c) | Tyrosin-Agar | Silver Gray | ||||||
G: mäßig | Lt Tan | |||||||
AM: mäßig | (3fe) | |||||||
15 | d) | Silver Gray | ||||||
(2ca) | ||||||||
e) | Lt Ivory to | |||||||
20 | ||||||||
bis weidenkätzchengrau
■ SP: rosa-maulwurffarb.
f) Nähr-Agar
G: mäßig
AM: mäßig
SP: keines
G: mäßig
AM: mäßig
SP: keines
g) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
G: reichlich
AM: reichlich bibergrau bis
bleigrau SP: keines oder blaß gelbbraun
Pussywillow
Gray to (5 dc)
Rose Taupe (5ig)
weiß bis perlfarb. White to Pearl (3ba)
Beaver to (4Ii) Lead Gray (5in)
pale yellow-brown
Kulturmerkmale* Färbung / Color** / Color Code**
h) Hafermehl-Agar
G: reichlich
, AM: reichlich ' silbergrau Silver Gray (3fe)
G: reichlich
, AM: reichlich ' silbergrau Silver Gray (3fe)
! 5 SP: honig-goldfarben Honey Gold (2ic)
i) Calcium-Malat-Agar
G: mäßig
AM: mäßig rohporzellanfarb. Bisque to (3ec)
bis weiß White
10 SP: hell rehbraun Lt Fawn (4ge)
* G = Wachstum; AM = Luftmycel; SP = Lösliches Pigment.
** Die englischsprachigen Farbbezeichnungen und Color Codes entsprechen "The Color Harmony Manual", 4.Auflage,
Container Corporation of America> 1958.
'15 3) Physiologische Eigenschaften
a) Temperaturbereich für das Wachstum: 9 - 400C
-. b) Verflüssigung von Gelatine (Glucose-
j Pepton-Gelatine): positiv (schwach)
; c) Hydrolyse von Stärke: positiv
;20 d) Koagulierung von entrahmter Milch: peptonisiert
; e) Erzeugung melanoider Pigmente:
; Tyrosin-Agar: falsch positiv
Pepton-Hefe-Agar: negativ
4) Verwertung von Kohlenstoff-Quellen
\ L-Arabinose +
; D-Glucose
: Sucrose
j 5 L-Rhamnose "*■
D-Mannit
' D-Xylose
' D-Xylose
D-Fructose
! Inosit
! Inosit
! 10 Raffinose +
Kontrollversuch +
Anmerkung: +++ : Reichliches Wachstum
++ : Gutes Wachstum
+ : Wachstum
15 + : Geringes Wachstum
Im Hinblick auf die vorerwähnten Eigenschaften des Stammes Nr. B-52653 wurde Bezug genommen auf S.A. Waksman, The
Actinomycetes, Band 2, 1961, erschienen bei The Williams and Wilkins Co.; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons (Hrsg.),
Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage,
1974; International Journal of Systematic Bacteriology, VoI 18, Nr. 2, Seiten 69-189, und Nr. 4, Seiten 279-392
(1968), ibid. Vol. 19, Nr. 4, Seiten 391 - 512 (1969), und ibid. Vol. 22, Nr. 4, Seiten 265 - 394 (1972), sowie
andere Literatur.
Die taxonomische Stellung dieses Stammes auf der Grundlage
seiner vorerwähnten Eigenschaften ist derart, daß er offenbar zu der Untergruppe5pirales oder Retinacuriapelti und
der Gray-Reihe gehört, wie von Pridham et al (Applied Microbiology J5, 52 - 79, 1958) vorgeschlagen wurde. Als
eine bekannte Species, die dem vorliegenden Stamm am nächsten verwandt zu sein scheint, sei Streptomyces albulus
erwähnt. Dementsprechend wurde ein Vergleich des Stammes Nr. B^-52653 mit Streptomyces albulus IPO 13410 (ISP 5492)
durchgeführt. Stamm Nr. B-52653 erzeugt ein hellbraungraues Luftmycel auf Sacharose-Nitrat-Agar und ein
hellgelb-graues Luftmycel auf Glukose-Nitrat-Agar. Wenn
derselbe Stamm auf Calcium-Malat-Agar gezogen wird, bildet
er ein hellbraunes lösliches Pigment. Überdies wächst er bei Verwendung von;L-Rhamnose und Sucrose. Andererseits
bildet Streptomyces albulus ein weißes Luftmycel auf Sacharose-Nitrat-Agar und Glukose-Nitrat-Agar und bildet kein
lösliches Pigment auf Calcium-Malat-Agar. Darüber hinaus assimiliert der letztere Stamm L-Rhamnose oder Sucrose
nicht und wächst deshalb nicht auf diesen Kohlenstoff-Quellen.
Die vorgenannten Ergebnisse legten nahe, daß Stamm Nr.
B-52653 eine neue Subspecies von Streptomyces albulus war, und dementsprechend wurde für diesen Stamm der Name
Streptomyces albulus subsp. ochragerus subsp. nov. vorgeschlagen.
Dieser Stamm Nr. B-52653 wurde bei dem Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology
(FERM), Ibaragi, Japan, unter der Registriernummer FERM-P Nr. 5677, bei dem Institute for Fermentation, Osaka (IFO),
Japan, unter der Eingangsnummer IFO 14072, und bei The American Type Culture Collection (ATCC), USA, unter der
Eingangsnummer ATCC 31713 hinterlegt.
Wenngleich der Stamm Nr. B-52653 wie oben erwähnt, ein neuer
Stamm der Gattung Streptomyces ist, kann er, entsprechend einer allgemeinen Eigenheit von Mikroorganismen, Veränderungen
und Mutationen erleiden, und zwar entweder spontan oder unter dem Einfluß von Mutagenen. Beispielsweise können
Mutanten des Stammes mit Hilfe von Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, ultraviolettem Licht oder anderer Strahlung,
it ι
I IK
• «
■ Monosporentrennung, Behandlung mit verschiedenen Chemikalien,
Kultivierung auf solche Chemikalien enthaltenden Medien und so weiter erhalten werden. Diese Mutanten können ebenso
wie spontane Mutanten für die Zwecke der vorliegenden
5 Erfindung eingesetzt werden, soweit sie nicht im wesentlichen als neue Spezies im Hinblick auf die vorbeschriebenen und
; nachstehend erwähnten mikrobiologischen Eigenschaften zu
betrachten sind, und. soweit sie zur Entwicklung von B-52653 befähigt sind. Wenn beispielsweise der Stamm Nr. B-52653
verschiedenen mutagenen Behandlungen unterzogen wird, werden
Mutanten erhalten, die gelbe oder blaue Luftmycele erzeugen.
Das für die Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendete Kulturmedium kann entweder flüssig oder fest
sein, sofern es nur diejenigen Nährstoffe enthält, die der benutzte Stamm verwerten kann. Wenn jedoch die Herstellung
einer größeren Menge betrachtet wird, ist ein flüssiges Medium vorteilhafter. In das Medium sind solche Kohlenstoff-
und Stickstoff-Quellen eingearbeitet, die der Stamm assimilieren
und verdauen kann, anorganische Materialien und Spurennährstoffe. Zu den Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose, Dextrin, Stärke,
Glycerin, Mannit, Sorbit, öle und Fette (z.B. Sojabohnenöl, Schmalzöl, Hühneröl etc.) gehören, und zu den Stickstoff-Quellen
können, unter anderem, Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisstärkebrühe, Peptone,
Baumwollsamenmehl, ausgelaugte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat etc.) usw. gehören. Weiterhin werden eingearbeitet geeignete Mengen von Salzen, von Natrium,
Kalium, Calcium, Magnesium etc.; Salzen von Eisen, Mangan, Zink, Cobalt, Nickel etc., Salze der Phosphorsäure,
Borsäure etc., und Salze von organischen Säuren wie Essigsäure, Priop ionsäure etc. Ebenfalls zugesetzt werden können
Aminosäuren (z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Lysin, Valin, Methionin, Prolin, etc.), Peptide (z.B.
Dipeptide, Tripeptide etc.), Vitamine (z.B. B1, B2, Nikotinsäure
B12/ C etc.), Nucleinsäure und verwandte Verbindungen
(z.B. Purin- oder Pyrimidin-Derivate). Naturgemäß können zum Zwecke der pH-Einstellung des Mediums anorganische oder
organische Säuren, Alkalien, Puffer etc. zu dem Medium hinzugefügt
werden. Geeignete Mengen von Ölen, oberflächen*-
aktiven Mitteln etc. können ebenfalls zu Entschäumungszwecken
zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann durch Stationärkultur, Schüttelkultur, Submers-Kultur oder mittels anderer bekannter Kultivierungsverfahren
erfolgen. Für eine Fermentation großer Mengen ist naturgemäß die Verfahrensweise einer sogenannten Submerskultur
vorteilhaft. Wenngleich die Kulturbedingungen vom Zustand und der Zusammensetzung des Mediums, dem verwendeten speziellen
Stamm, dem Verfahren der Kultivierung etc. abhängen, wird die Kultivierung für gewöhnlich bei einer Temperatur von 20°C
bis 35°C und mit einem Anfangs-pH im Bereich von pH 5-8 durchgeführt. Bevorzugte Bedingungen sind 23°C - 32Oc und ph 5,5
bis 7,0 (zu Anfang). Wiewohl die Dauer der Kultivierung ebenfalls/äen
oben erwähnten Bedingungen abhängt, wird die Kultivierung vorzugsweise so lange fortgesetzt, bis die Menge des
hergestellten vorliegenden Peptids den größtmöglichen Wert erreicht. Die für das Erreichen einer solchen maximalen Konzentration
erforderliche Zeit liegt normalerweise im Falle von Schüttelkulturen ode,r unter Belüftung gerührten Kulturen in
flüssigem Medium bei etwa 2-8 Tagen.
Der für die Herstellung des vorliegenden Peptids geeignete
pH ist schwach sauer, wobei der günstigste Bereich bei ph 5,5 bis 7,0 liegt, und die Ausbeute an der Substanz kann dadurch
erhöht werden, daß der pH des Mediums mit einer Säure oder einem Alkali beeinflußt wird. So kann die Ausbeute an der
Substanz dadurch beträchtlich erhöht werden, daß man anorganische Phosphate in einer Konzentration von 50 - 1000 ppm zu
»·■* se .«
■a-
dem Medium hinzufügt, oder daß man Sacharide wie Glucose,
Stärke oder/und Sucrose als Kohlenstoff-Quellen zusammen mit ausgewählten Stickstoff-Quellen und anorganischen Salzen
verwendet.
Während sein Anteil mit den Kulturbedingungen variiert, wird B-52653 gewöhnlich extracellular angereichert, wobei
etwa 10 % der Gesamtausbeute manchmal innerhalb der Zellen gefunden werden. .
Das auf diese Weise in der Kulturbrühe erzeugte Peptid kann
mittels der Agar-Schacht-Methode oder der Papierscheiben-Methode unter Verwendung einer Arzneimittel-resistenten
Mutante von Staphylococcus aureus als Test-Organismus und B-52653 als Bezuigsstaridard analysiert werden. Medium A
/"Glucose 3 %, Natriumglutamat 0,5 %, K2IiPO4 0,05 %, MgSO4-7H2O
0,05 %, KCL 0,05 %, Hefeextrakt (Difco) 0,05 %,
Casaminoacid (Difco) 0,02 %, Agar (Difco)_7·
Das vorliegende Peptid wird hauptsächlich im Filtrat der
Kulturbrühe erzeugt. Das auf diese Weise hergestellte B-52653 kann nach den Verfahrensweisen isoliert werden, die üblicherweise
für die Ernte mikrobieller Metaboliten aus Kulturbrühen angewandt werden, und zwar entweder für sich allein, oder in
Kombination, oder durch wiederholte Anwendung. Demgemäß können beispielsweise solche Verfahren zur Anwendung gelangen,
wie Filtrieren, Zentrifugieren, Dialyse, Konzentrierung, Trocknen, Gefriertrocknen, Adsorption und Desorption, Mittel,
die sich Löslichkeitsunterschiede in verschiedenen Lösungsmitteln zunutze machen (z.B. Ausfällung, Kristallisation,
Umkristaliisation, Extraktion, Gegenstromverteilung etc.),
Chromatographie etc.
Im einzelnen wird B-52653 r da es zum größten Teil extracellular
gebildet und angereichert wird, vorzugsweise aus der flüssigen Fraktion der Kulturbrühe nach dem Entfernen der
Zellfraktionen gewonnen. Da weiterhin dieses Peptid eine
amphotere, wasserlösliche Verbindung mit Carboxyl- und Amino-Funktionen ist, kann es aus der flüssigen Fraktion der Kulturbrühe
vorteilhaft dadurch isoliert und gereinigt werden, daß man sich diese Eigenschaft zunutze macht.
Die oben erwähnte Chromatographie kann vorteilhafterweise durchgeführt werden unter Verwendung von Kationen- und
Anionen-Austausehern (z.B.Ionenaustauschharzen, Sephadex-Ionenaustauschern,
Ionenaustausch-Cellulose etc.), GeI-permeationsträger /_ z.B. Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals,
Schweden), Biogel (Bio-Rad Laboratories, U.S.A.),vorzugsweise Sephadex LH-20, Pharmacia Fine Chemicals, Schweden_7,
Aktivkohle, hochporösen Polymeren /_ z.B. vorzugsweise
Amberlite XAD-2 (Röhm and Haas Co., U.S.A.), Diaion HP-10
(Mitsubishi Kasei Kogyo, Japan)_7, Aluminiumoxid, Florisil, Silicagel, Cellulose usw.
Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nach den vorgenannten Verfahren isoliert und gereinigt; aufgrund
der Untersuchung ihrer physicochemischen Eigenschaften und auch aufgrund unabhängiger Untersuchungen wurde gefunden,
daß es sich um L-alanyl-L- /_ (3R) -S-hydroxy^-oxopyrrolidin-3-yl_7glycin
handelt, eine neue Verbindung der folgenden Strukturformel:
H2
H ■ " H C-N
0 0* H
B-52653 kann auf die vorbeschriebene Weise hergestellt werden. Seine physicochemischen'Eigenschaften, die an Proben,
die gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellt wurden, bestimmt worden sind die folgenden:
(1) Weißes Pulver.
(2) Elementaranalyse:
für C, | 3H1 | 5N3 | °5* | 2H2O | 6 | ,81; | N, | 1 | 4, | 94; |
ber. : | C: | 38 | ,43 | ; H: | 6 | ,34; | N: | 1 | 4, | 87. |
gef. : | C: | 38 | ,44 | ; H: | ||||||
(3) Moleculargewicht (Neutralisationsäquivalent) und pKa1:
Das aus der Dissoziationskurve (Titration in einer wässrigen 0,1 N-HCL enthaltenden Lösung mit 0,1 N-NaOH) bestimmte
Neutralisationsäquivalent ist 140 -· 10, und der pH der Lösung an dem aus der Dissoziationskurve bestimmten Punkt der HaIbäquivalenz
liegt bei pH 8,3 - 0,5. Diese Dissoziationskurve wird als eine zusammengesetzte Kurve aus den Dissoziationskurven zweier dissoziierbarer Gruppen mit pKa'-Werten, die
dicht beieinander liegen (vermutlich bei etwa 7,6 und etwa 8,8, obwohl genaue pKa'-Werte nicht gemessen werden konnten,
da ein Wendepunkt nicht vorhanden war), betrachtet. Deshalb
wurde das Molekulargewicht des vorliegenden Peptids zu 280-20
angenommen (281,3 für C9H15N3O5^H2O), Nach Zugabe von
1 N-HCL zu einer wässrigen Lösung dieser Substanz und Titration mit 1 N-NaOH wie oben angegeben, wurde außerdem
eine dissoziierbare Gruppe mit einem pKa'-Wert bei etwa 3,15 nachgewiesen.
(4) Optische Drehung
(4) Optische Drehung
[a]^5 + 50° ±5° (c =1.0, H2O) t
[α]25 + 62° +5° (c = 1.0, 0.1N HCl)
[α]25 + 50° +5° (c = 1.0, 0.IN NaOH)
(5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum.
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der vorliegenden Substanz
in wässriger Lösung zeigt zwischen 220 und 360 ran, abgesehen von Endabsorptionen, kein charakteristisches Absorptionsmaximum.
(6) Infrarot-Absorptionsspektrum.
Die Wellenzahlen (cm ) der Hauptabsorptionsbanden im Infrarotspektrum (KBr) sind folgende:
3400, 1690, 1610, 1395, 1265, 1205, 1080. (7) Kernmagnetisches ResonanzSpektrum.
Das nachstehende kernmagnetische ResonanzSpektrum wurde in
Deuteriumoxid unter Benutzung eines Varian EM-390 (90 MHz)-Spektrometers
beobachtet.
6: 1.70 (3H, d, J = 7); 1.75 (m), 2.26 (m), 2.78 (m)
(total 2H); 3.24 (IH, m), 4.26 (IH, q, J= 7), 4.71 (IH, d,
J = 4.5), 5.38 (IH, m).
(8) Farbreaktionen
Ninhydrinreaktion: positiv
Greig-Leaback-Peptidreaktion: positiv Sakaguchi-Reaktion: negativ
Ninhydrinreaktion: positiv
Greig-Leaback-Peptidreaktion: positiv Sakaguchi-Reaktion: negativ
Antron-Schwefelsäure-Reaktion: negativ.
Orcin-Schwefelsäure-Reaktion: negativ.
(9) Löslichkeit
Leicht löslich in Wasser, jedoch entweder nur spärlich löslich· oder unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Methanol,
Ethanol, Aceton, Chloroform, Ethylacetat, Benzol, Ethylather,
Petroläther, Pyridin, Eisessig, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid
etc.
(10) Dünnschicht-Chromatographie
(Merck's vorbeschichtete TLC-Platte, Silicagel 6OF-254)
Τ » » ·»
"♦·■»■
"♦·■»■
! Lösungsmittel-Systeme RF
1-Butanol-Essigsäure-Wasser
(3:1:1) · 0,15
1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(4:1:1:2) ' 0,08
1-Propanol-Wasser
: (7:3) 0,13
: (7:3) 0,13
2-Propanol-Diisopropyläther-
'. 60 % Ameisensäure
'. 60 % Ameisensäure
ι . - ■
(4:3:3) 0,16
Chloroform-Methanol-17% wäßr. . " ■
Ammoniak .
(2:2:1) ■ 0,17
'■
Antimikrobielle Wirksamkeit
Bei den Untersuchungen unter Verwendung von Bakterien als
Testorganismen wurde eine Schleifenfüllung von 10 CFü/ml
(CFU = zellbildende Einheiten) als Impfmaterial verwendet,
und die minimalen Hemmkonzentrationen ( MIC) wurden nach 18-20-stündiger Inkubation bei 37°C bestimmt. Im Falle von
Pilzen und Hefen wurde eine Schleifenfüllung des betreffenden Mikroorganismus gründlich zerkleinert, eine Schleifenfüllung
der entstandenen Suspension wurde zur Impfung benutzt, und die MIC wurde nach 2- oder 3-tägiger Inkubation bei 28°C
bestimmt. Die Messung der MIC wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode unter Verwendung der in der Tabelle angegebenen
Medien durchgeführt.
Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß B-52653 eine starke
Wirkung gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien entfaltet,und daß diese Substanz ebenso gegen verschiedene
antibiotika-resistente Mikroorganismen wie gegen die entsprechenden
anfälligen Stämme wirksam ist. Es wird ebenfalls gezeigt,daß die vorliegende Substanz eine starke Aktivität
gegen gewisse phytopathogene Bakterien entfaltet.
- 4-5—
! Test-Organismus
' Staphylococcus aureus IFO 13276 ' Staphylococcus epidermidis FS 5010
• Bacillus subtilis PCI 219
j 5 Bacillus cereus IFO 3001
I Bacillus megaterium IFO 3970
Escherichia coli NIHJ JC-2 Escherichia coli 0-111
Escherichia coli K-12 W3110 j 10 Escherichia coli TN 647
: Proteus vulgaris IFO 3988 1 Proteus mirabilis IFO 3847
j Proteus morganii IFO 316 8 ι · Klebsiella pneumoniae IFO 3512
' 15 Klebsiella pneumoniae GN 384 8
: Citrobacter freundii TN 457 i Citrobacter freundii TN 564 j Enterobacter cloacas IFO 12937
Enterobacter aerogenes TN 582 20 Salmonella typhimurium LT-2
Salmonella enteri-tidis IFO 3313
Serratia marcescens IFO 12648 Serratia marcescens TN 24 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080
25 Pseudomonas aeruginosa J-31
Alternaria kikuchiana IFO 7515 Pyricularia oryzae KHG-I
Cochlioborus miyabeanus IFO 5277 Botrytis cinerea TKF-12
30 Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395 Pellicularia sasakii KHG-2
Penicillium chrysogenum IFO 4626 Aspergillus niger IFO 4066 Saccharomyces cerevisiae IFO 0209
35 Candida albicans IFO 0538
Medium | MlC (ug/rnl) |
I | 0.39 |
I | 0.39 |
II | 6.25 |
II | 3.13 |
II | 0.1 |
II | 3.13 |
II | 6.25 |
II | 3.13 |
■ Ii | 3.13 |
II | 1.56 |
II | 1.56 |
II | 3.13 |
II | 12.5 |
II | 6.25 |
II | 1.56 |
II | 3.13 |
II | 25 |
II | 6.25 |
II | 0.78 |
II | 0.2 |
II | 0.78 |
II | 0.2 |
II | >100 |
II | >100 |
in | >100 |
m | 10 |
m | 100 |
m | 50 |
m | 1 |
m | 20 |
IV | >100 |
IV | >100 |
IV | 12.5 |
IV | >100 |
Medium I: 3 % Glukose, 0,5 % Natriumglutamat, 0,05 % K2HPO4, 0,05 % MgSO4- 7H2O, 0,05 % KCl, 0,05 % Hefeextrakt
(Difco) , 0,02 % Casaminoacid, 1",5 % Agar (pH 7,0).
Medium II: 0,5 % Glukose, 0,01 % Hefeextrakt, 0,1 %43
SO4, 0,01 % MgSO4-7H2O, 0,05 % Natriumeitrat, 0,2 %
KH3PO4, 0,7 % K3HPO4, 1,5 % Agar (pH 7,0) /~F.R. Atherton
et al. Antimicrobial Agent and Chemotherapy 15, Nr. 5,
677-683 (1979)_7
Medium III: Kartoffel-Sucrose-Agar. Medium IV: Modifiziertes Agar-Medium nach Peffer: 3,0 %
Sucrose, 0,2 % L-Asparagin , 0,3 % NH4NO3, 0,1 % KH3PO4, 0,1:
MgSO4-7H2O, 0,001 % Versenol* Agar 1,5 % (pH 7,0) /?Eisen-Natrium-Ethanolethylen-Diamintriacetat
50 %_/
Das Medium IV wurde vor der Verwendung durch die folgenden Substanzen (pro 100 ml) ergänzt: 100 μg Vitamin B1-Hydrochloride
100 ug Vitamin B3, 100 μg Calcium-Pantothenat,
100 μg Nikotinsäureamid, 0,5 ug Biotin, 50 μ-g Folsäure,
200 μg Vitamin Bg-Hydrochlorid, 50 μg p-aminobenzoe-Säure
0,2 μg Vitamin B^2-
Infektionsbekämpfende Wirkungen bei Mäusen
des
Männliche, 4 Wochen alte Mäuse/ICR/SLC-Stammes wurden intraperitoneal mit 2 χ 10^ CFU-Zellen aus einer über Nacht gebildeten Kultur von Staphyloccus aureus E-97 in Gehirn-Herz-Infusions-Brühe (Difco) infiziert. Unmittelbar anschließend wurde eine wässrige Lösung von B-52653 in einer einzigen Dosis intraperitoneal verabreicht. Wie nachstehend gezeigt wird, hatte die vorgenannte Behandlung eine' prophylaktische Wirkung gegen Infektion.
Männliche, 4 Wochen alte Mäuse/ICR/SLC-Stammes wurden intraperitoneal mit 2 χ 10^ CFU-Zellen aus einer über Nacht gebildeten Kultur von Staphyloccus aureus E-97 in Gehirn-Herz-Infusions-Brühe (Difco) infiziert. Unmittelbar anschließend wurde eine wässrige Lösung von B-52653 in einer einzigen Dosis intraperitoneal verabreicht. Wie nachstehend gezeigt wird, hatte die vorgenannte Behandlung eine' prophylaktische Wirkung gegen Infektion.
6,25 | 12,5 | 25 | 50 | 100 |
2/5 | 2/5 | 3/5 | 3/5 | 5/5 |
- -W—
Dosierung (mg/kg:) 3,13
S/T* 1/5
S/T* 1/5
ED50 =17,7 mg/kg
S*= Anzahl der überlebenden Tiere,
T= Anzahl der dem Test unterzogenen Mäuse.
T= Anzahl der dem Test unterzogenen Mäuse.
Organ-Fibrose einschließlich Lebercirrhose und Lungenfibrose,
wird als eine Erkrankung betrachtet, die durch ein pathologisches Überwachstum von Collagen verursacht wird, und es
wird angenommen, daß ein Inhibitor des vorgenannten Enzyms für die Unterdrückung solcher Fibrösen wertvoll ist.
Die Kollagen-Prolyl-Hydroxylase-Hemmwirkung von B-52653
wurde nach der Methode von R.E. Rhoads et al. /_ Methods
in Enzymology XVII B, 306 (1971)_7 untersucht. Die Untersuchung
ergab, daß diese Substanz bei der Konzentration von 270/ig/ml eine 50%ige Hemmung bewirkt. Sodann wurde die
Hemmwirkung von B-52653 auf die Collagen-Biosynthese in Ratten nach der Methode B von Ishimaru et al (T. Ishimaru,
T. Kanamaru und H.okazaki, the Proceedings of the 1979 Congress of the Japanese Society of Agricultural Chemistry,
S. 373) untersucht. Die Ergebnisse waren derart, daß die Werte
für die Hemmung der Collagen-Synthese bei Ratten, denen 50mg/kg, 100 mg/kg bzw. 200 mg/kg verabreicht worden war,
30 %, 43 % bzw. 55 % betrugen.
Dadurch wird die Möglichkeit der Verwendung der vorliegenden Substanz als antifibrotisches Mittel nahegelegt.
Toxizität
Bei den Prüfungen auf akute Toxizität, bei denen B-52653 Mäusen auf intravenösem oder intraperxtonealem Wege verabreicht
wurde, trat sogar bei der hohen Dosis von 1000 mg/kg kein Todesfall auf, noch wurde irgendeine besondere Abnormi-
tat während einer 7-tägigen Beobachtungsperiode im Anschluß
an die Verabreichung oder 'bei der Autopsie beobachtet. Es wird aus diesem Grunde angenommen, daß B-52653 eine in
sehr geringem Umfang toxische Substanz ist.
Wie oben im einzelnen beschrieben wurde, besitzt die vorliegende
Substanz B-52653 biologische Aktivitäten wie antimikrobielle Wirkung und Aktivität zur Unterdrückung
von Fibröse tierischer Gewebe.
Die vorliegende Substanz kann in Form einer wässrigen Lösung von etwa 10 - etwa 100/ig/ml als Desinfektionsmittel für
Vogelkäfige, Laborgerätschäften, oder der menschlichen
Hände etc. verwendet werden.
Da die vorliegende Substanz eine Hemmwirkung gegenüber der Collagen-Prolyl-Hydroxylase-Aktivität besitzt, ist sie als
Ϊ5 ein Reagenz für die Untersuchung des Mechanismus der Collagen-Biosynthese
von Wert. Eine weitere vielversprechende Anwendungsform der vorliegenden Substanz besteht, darin, daß
die Substanz in steriler physiologischer Kochsalzlösung aseptisch aufgelöst und in einer Menge von 2-10 g pro 20 - 100 ml/Tag
i-n Form dieser Lösung menschlichen Patienten durch intravenöse
Tropfinfusion zur Hemmung des Fortschreitens der Leberfibrose
verabreicht wird.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
— *
— *
Stamm-Nr. B-52653 (IFO 14072, ATCC 31713) wurde auf Glucose-Asparagin-Agar
aufgeimpft und 10 Tage bei 24°C inkubiert.
Die gewachsenen Sporen wurden zur Herstellung einer Sporensuspension
(lebensfähige Zellen: 3 χ 10 /ml) in steriles Wasser abgestreift, die zur Verwendung als Impfgut im Kühlschrank
aufbewahrt wurde. Ein Milliliter des Impfmaterials
■i*
wurde in einen 2-Liter Sakaguchi-Kolben eingeimpft, der 500 ml eines sterilisierten Vorkulturmediums (35 g Maisquell-Flüssigkeit,
10 g Proflo, 1 g K2HPO4, 15 g CaCO3,
20 g Glucose, 1 1 Leitungswasser; ph 6,5), enthielt, und der Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung
40 Stunden bei 28°C inkubiert. Ein Anteil von 500 ml der erhaltenen Kultur wurde in einen 200-Liter
Fermentor aus nichtrostendem Stahl überführt, der 100 1 eines sterilisierten Vorkulturmediums ähnlich dem vorgenannten
enthielt, und die Kultivierung wurde 24 Stunden bei 28°C unter Belüftung (50 l/min) und Rühren (200 UpM,
1/2 DT) und bei einem Innendruck von 1,03 bar (1 kg/cm^)
durchgeführt. Die erhaltene Impfkultur (100 1) wurde anschließend
in einen Fermentor aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2000 Litern überführt, der 900
eines sterilisierten Hauptfermentationsmedium enthielt, das aus 500 g DL-Alanin, 1 kg DL-Methionin, 1 kg FeSO4, 500 g
ZnSO4, 200 g MgSO4-TH3O, 100 g MnSO4, 1,3 kg KH3PO4, 25 kg
Proflo, 5 kg Sojabohnenmehl, 5 kg NH4CL, 12,5 kg CaCO3 und
100 kg Glucose (getrennt sterilisiert) bestand. Die Fermen-'
tierung wurde 54 Stunden bei 28°C unter Belüftung (1000 l/min.) und Rühren (200 UpM, 1/3 DT-2 Stufen), und bei einem
Innendruck von 1,03 bar (1 kg/cmr) durchgeführt. Als Ergebnis
wurden 254 Ajg/ml B-52653 in der Brühe erhalten.
Zu 980 1 der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe wurden 30 kg Topcolite Nr. 34 (Toko Perlite Kogyo, Japan) als Filtrierhilf
sstoff zugesetzt, und die Mischung wurde unter Benutzung eines kontinuierlichen Saugfilters filtriert.
Zu 1350 1 des erhaltenen Filtrats wurden 1,4 kg Oxalsäure hinzugefügt, und nach 30-minütigem Rühren wurden 5 kg Topcolite
zugesetzt, wonach Filtration erfolgte. Das erhaltene Filtrat (1450 1) wurde an einer Säule (350 1) aus Amberlite 200
(H -form) adsorbiert, und nach dem Waschen mit Wasser
erfolgte die Elution mit 0,5 N-wässrigem Ammoniak. Die
■ aktiven Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem
Druck eingeengt. Das Konzentrat' (20 1) wurde an einer Säule
■ (.200 1) aus Aktivkohle . (Shirasagi for Chromatography, Takeda
Chemical Industries,Ltd., Japan) adsorbiert, und die Elution
; wurde mit Wasser durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden
vereinigt und auf 1,5 1 konzentriert.
■ " .
: Ein Anteil von 750 ml des'Konzentrats wurde an einer Säule
j (3 1) aus Aluminiumoxid (Merck, BRD, aktiviertes Aluminium-
j io oxid 90, neutral, Aktivität I) adsorbiert, und nach dem
! Waschen mit Wasser wurde die Elution mit 0,2 N-wässrigem
: Ammoniak durchgeführt» Die aktiven Fraktionen wurden ge-
• sammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Der Rückstand (etwa 30 g) wurde in 60 ml Wasser aufgelöst, die Lösung wurde an Aktivkohle (1 1) chromatographiert,
und die Elution erfolgte mit Wasser. Die aktiven Fraktionen ; wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt,
j Das Konzentrat wurde weiterhin an einer Säule (700 ml) aus
Amberlite IRA 68 (Röhm und Haas Co. USA), adsorbiert, und nach dem Waschen mit Wasser und mit 0,1 M Essigsäure erfolgte
die Elution mit 0,2 M Essigsäure. Die aktiven Fraktionen : wurden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert.
Das Konzentrat wurde an einer Säule (500 ml) aus Aktivkohle
adsorbiert und mit Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert,
wobei 3,9 g eines weißen Pulvers (Reinheit etwa 93 %) erhalten wurden.
Das vorgenannte weiße Pulver (1,0 g) wurde in 4 ml 50%igem
wässrigen Methanol aufgelöst, mit 4 ml 70%igem Methanol verdünnt und der Säulenchromatographie an Sephadex LH-20
(Pharmacia Fine Chemicals, Schweden ;mit 70%igem wässrigen Methanol gequollen) unterzogen.
Die Elution wurde mit 70%igem wässrigen Methanol durchgeführt
. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, und das Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert.
Die erhaltene wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 0,9 g des gewünschten B-52653 erhalten wurden.
Claims (5)
- VON KREISLER SCHi&NAtfALV -EISHOL-ß· FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNERPATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler+ 1973Dr.-Ing. K. Schönwald, KölnDr.-Ing. K.W. Eishold, Bad SodenDr. J. F. Fues, KölnDipl.-Chem. Alek von Kreisler, KölnDipl.-Chem. Carola Keller, KölnDipl.-Ing. G. Selting, KölnDr. H.-K. Werner, KölnDEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOFD-5000 KÖLN 1 15.Sept.1981AvK/BeTakeda Chemical Industries, Ltd.
27, Doshomachi 2-choitie, Higashi-ku, J-OsakaPatentansprüchePeptid B-52653 der FormelH2
NH0 HO0C „ . C^H3C-CH-CONH-CH-C ' CH-OHC— NoX/ H - 2. Verfahren zur Herstellung des Peptids B-52653, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden und zur Erzeugung des Peptids B-52653 befähigten Mikroorganismus in einem Kulturmedium kultiviert, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und verdaulichen Stickstoff enthält, bis das Peptid B-52653 in der Kulturbrühe beträchtlich angereichert ist, und daß man dieses erntet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces albulus ist,
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces albulus subsp. ochragerus Telefon: (0221) 131041 · Telex: 8882307 dopa d · Telegramm: Dompatent Keinsubsp. nov. (IFO 14072) ist.
- 5. Biologisch reine Kultur des zu der Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus mit Eigenschaften, die mit denjenigen von IFA 14072 identifizierbar sind, wobei die Kultur befähigt ist, in einem mit Quellen für assimilierbaren
Kohlenstoff und verdaulichen Stickstoff enthaltenden Kulturmedium eine gewinnbare Menge des Peptids B-52653 zu erzeugen.
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