DE60006690T2 - Antibiotische caprazamycine und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Antibiotische caprazamycine und verfahren zu deren herstellung Download PDF

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Description

  • Technischer Bereich
  • Diese Erfindung betrifft neue Antibiotika, nämlich Caprazamycine A, B, C, E und F oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon, die ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten aufweisen. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Caprazamycins. Weiterhin betrifft diese Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere eine antibakterielle Zusammensetzung, umfassend ein Caprazamycin oder ein Salz davon als einen aktiven Inhaltsstoff. Noch weiter betrifft diese Erfindung Streptomyces sp. MK730-62F2 als einen neuen Mikroorganismus, der eine charakteristische Natur aufweist, der in der Lage ist, ein Caprazamycin herzustellen.
  • Begleitender Stand der Technik
  • Bei der Chemotherapie von bakteriellen Infektionen, insbesondere der Chemotherapie von Infektionen von Säure-festen Bakterien, wurden bisher Rifampicin, Kanamycin, Streptomycin, Viomycin, Capreomycin, Cycloserin und ähnliches als antibakterielle Wirkstoffe verwendet.
  • Ein ernstes Problem für die Chemotherapie von bakteriellen Infektionen ist, daß die die Infektion verursachenden Bakterien Wirkstoff-resistent werden. Insbesondere hat das Auftreten von Säure-festen Bakterien, die gegen Rifampicin, Kanamycin, Streptomycin, Viomycin, Capreomycin, Cycloserin und ähnliches resistent sind, ein soziales Problem im Hinblick auf die Chemotherapie dieser bakteriellen Infektionen hervorgerufen. Daher besteht nun ein dringendes Bedürfnis an einem Zur-Verfügung-Stellen eines neuen chemotherapeutischen Mittels, das gegen die bakteriellen Infektionen, wie durch die Säure-festen Bakterien induziert die gegen antibakterielle Wirkstoffe resistent sind, effektiv ist. Sehr gesucht ist auch ein neuer chemotherapeutischer Wirkstoff, der gegen die bakteriellen Infektionen effektiv ist, die durch atypische Säure-feste Bakterien induziert werden und für die bisher keine chemotherapeutische Behandlung etabliert wurde. Um diese Erfordernisse zu erfüllen, besteht daher eine starke Nachfrage, neue Verbindungen herauszufinden oder zu erzeugen, die neuartige chemische Strukturen aufweisen und gute Eigenschaften, wie zum Beispiel ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten, auf eine unterschiedliche Weise zu denjenigen von bekannten Antibiotika, wie bis heute verwendet, zeigen können. Die Aufgabe dieser Erfindung ist es daher, neue Antibiotika zur Verfügung zu stellen, die ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten aufweisen und in der Lage sind, die oben genannten Erfordernisse zu erfüllen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Wir, die Erfinder dieser Erfindung, haben unsere Untersuchungen mit der Intention durchgeführt, neue brauchbare Antibiotika zu finden. Als ein Ergebnis haben wir nun gefunden, daß ein neuer mikrobieller Stamm, der zu dem Genus Streptomyces gehört und durch uns isoliert wurde, mehrere Antibiotika induzieren kann, die eine neue Skelettstruktur aufweisen. Wir haben nun eine Klasse dieser mehreren Antibiotika kollektiv als ein Caprazamycin bezeichnet. Wir haben weiter gefunden, daß ein Caprazamycin starke antibakterielle Aktivitäten gegen eine Vielzahl von Säure-festen Bakterien und Gram-positiven Bakterien sowie deren Wirkstoff-resistente Stämme zeigt. Wir haben unsere Untersuchungen weiter vorangetrieben und haben nun aus der Analyse der Caprazamycine gefunden, daß die Caprazamycine, wie nun durch uns erhalten, fünf Verbindungen einschließen. Wir haben diese fünf Verbindungen jeweils als Caprazamycine A, B, C, E und F bezeichnet und haben ihre chemischen Strukturen ermittelt. Weiterhin haben wir nun gefunden und bestätigt, daß Caprazamycine A, B, C, E und F neue Verbindungen sind und daß sie durch eine allgemeine Formel (I), wie unten angegeben, allgemein dargestellt werden. Nebenbei bemerkt, weisen diese Caprazamycine eine allgemeine und Basis-Skelettstruktur wie in der allgemeinen Formel (I) auf, wobei die Seitenkettengruppe R eine geradekettige oder verzweigte Kettenalkylgruppe von 11 bis 13 Kohlenstoffatomen ist, die jeweils unterschiedlich voneinander ist.
  • Gemäß eines ersten Aspekts dieser Erfindung wird daher ein Antibiotikum, Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E oder Caprazamycin F zur Verfügung gestellt, das eine durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellte Verbindung ist
    Figure 00030001
    worin R eine Tridecylgruppe für Caparazamycin A; eine 11-Methyldodecylgruppe für Caprazamycin B; eine Dodecylgruppe für Caprazamycin C; eine Undecylgruppe für Caprazamycin E und eine 9-Methyldecylgruppe für Caprazamycin F ist oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
  • Das neue Antibiotikum, ein Caprazamycin, wie nun gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung zur Verfügung gestellt, schließt Caprazamycin A der Formel (Ia), Caprazamycin B der Formel (Ib), Caprazamycin C der Formel (Ic), Caprazamycin E der Formel (Ie) und Caprazamycin F der Formel (If), wie unten gezeigt, ein. (1) Caprazamycin A der folgenden Formel (Ia)
    Figure 00040001
    [Verbindung der allgemeinen Formel (n worin R eine Tridecylgruppe -(CH2)12-CH3 ist]
  • (2) Caprazamycin B der folgenden Formel (Ib)
    Figure 00040002
    gemeint ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (n, worin R eine 11-Methyldodecylgruppe ist.
    Figure 00050001
    (3) Caprazamycin C der folgenden Formel (Ic)
    Figure 00050002
    [Verbindung der allgemeinen Formel (n, worin R eine Dodecylgruppe -(CH2)11-CH3 ist]. (4) Caprazamyin E der folgenden Formel (Ie)
    Figure 00050003
    [Verbindung der allgemeinen Formel (n, worin R eine Undecylgruppe -(CH2)10-CH3 ist] und (5) Caprazamycin F der folgenden Formel (If)
    Figure 00060001
    gemeint ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), worin R eine 9-Methyl-Decylgruppe ist
    Figure 00060002
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Caprazamycin A der Formel (Ia) gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung sind wie folgt:
    • (1) Aussehen Farbloses Pulver
    • (2) Molekulare Formel C53H87N5O22
    • (3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationmodus) Gefunden: 1146,5933 (M + H)+ Berechnet: 1146,5921
    • (4) Spezifische Rotation [α]D 23 –1,4° (c 0,83, DMSO)
    • (5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λmax nm (ε): 261 (7.400) Das UV-Spektrum ist in 1 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (6) Infrarotabsorptionsspektrum Wie in 2 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (7) Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum Das Protonen-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 3 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (8) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum Das 13C-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 4 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (9) Löslichkeit Löslich in Methanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Wasser, jedoch unlöslich in Aceton und Ethylacetat.
    • (10) TLC Wenn es einer Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel 60F254 (ein Produkt von Merck & Co.) unterzogen wurde, wie in einem Lösungsmittel, bestehend aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) entwickelt, beträgt der Rf-Wert 0,44.
  • Caprazamycin A gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen beispielhaft dargestellt werden, wie zum Beispiel quartärnere Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedenen Metallen, zum Beispiel seine Salze mit Alkalimetallen, wie zum Beispiel Natriumsalz oder seine Säureadditionssalze mit organischen Salzen, wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischer Säure, wie zum Beispiel Hydrochlorsäure.
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Carprazamycin B der Formel (Ib) gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung sind wie folgt.
    • (1) Aussehen Farbloses Pulver
    • (2) Molekulare Formel C53H87N5O22
    • (3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Anionmodus) Gefunden: 1144,5750 (M – H)– Berechnet: 1144,5764
    • (4) Spezifische Rotation [α]D 23 –2,6° (c 0,91, DMSO)
    • (5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λmax nm (ε): 261 (8.000) Das UV-Spektrum ist in 5 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (6) Infrarotabsorptionsspektrum Wie in 6 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (7) Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrwn Protonen-MNR Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch von DMSO-d 6-D2O (10 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur, wird in 7 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (8) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum 13C-NMR Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch von DMSO-d 6-D2O (10 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur, ist in 8 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, jedoch unlöslich in Aceton und Ethylacetat.
    • (10) TLC Wenn es einer Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel 60F254 (ein Produkt von Merck & Co.) unterzogen wird, wie entwickelt mit einem Lösungsgemisch bestehend aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2), ist der Rf-Wert 0,44.
  • Caprazamycin B gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen beispielhaft dargestellt sein, wie zum Beispiel quartärnere Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedenen Metallen, wie zum Beispiel seine Salze mit Alkalimetallen, wie zum Beispiel einem Natriumsalz oder seiner Säureadditionssalze mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Hydrochlorsäure.
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Caprazamycin C der Formel (Ic) gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung sind wie folgt.
    • (1) Aussehen Farbloses Pulver
    • (2) Molekulare Formel C52H85N5O22
    • (3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1132,5747 (M + H)+ Berechnet: 1132,5764
    • (4) Spezifische Rotation [α]D 25 –1,1° (c 1,33, DMSO)
    • (5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λmax nm (ε): 261 (8.300) Das UV-Spektrum ist in 9 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (6) Infrarotabsorptionsspektrum Wie gezeigt in 10 der beigefügten Zeichnungen.
    • (7) Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum Das Protonen-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 11 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (8) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum 13C-NMR-Spektrum, wie gemessen in DMSO-d 6 bei 125 MHz bei Raumtemperatur, ist in 12 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, jedoch unlöslich in Aceton und Ethylacetat.
    • (10) TLC Wenn es einer Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel 60F254 (ein Produkt von Merck & Co.) unterzogen wird, wie entwickelt mit einem Lösungsmittel bestehend aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2), ist der Rf-Wert 0,44.
  • Caprazamycin C gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon können beispielhaft dargestellt werden durch seine Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel quartärnere Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedenen Metallen, zum Beispiel seine Salze mit Alkalimetallen, wie zum Beispiel Natriumsalz oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischer Säure, wie zum Beispiel Hydrochlorsäure.
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Caprazamycin E der Formel (Ie) gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung sind wie folgt.
    • (1) Aussehen Farbloses Pulver
    • (2) Molekulare Formel C51H83N5O22
    • (3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationmodus) Gefunden: 1118,5613 (M + H)+ Berechnet: 1118,5608
    • (4) Spezifische Rotation [α]D 25 –5,1° (c 0,83, DMSO)
    • (5) Ultraviolettes Absorbtionsspektrum (in Methanol) λmax nm (ε): 262 (7.700) Das UV-Spektrum ist in 13 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (6) Infrarotabsorptionsspektrum Wie gezeigt in 14 der beigefügten Zeichnungen.
    • (7) Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum Das Protonen-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 15 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (8) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum 13C-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 16 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, jedoch unlöslich in Aceton und Ethylacetat.
    • (10) TLC Wenn es einer Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel 60F254 (ein Produkt von Merck & Co.) unterzogen wird, wie entwickelt mit einem Lösungsmittel bestehend aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2), ist der Rf-Wert 0,44.
  • Caprazamycin E gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon können beispielhaft dargestellt werden durch seine Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel quartärnere Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedenen Metallen, zum Beispiel seine Salze mit Alkalimetallen, wie zum Beispiel Natriumsalz oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischer Säure, wie zum Beispiel Hydrochlorsäure.
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Caprazamycin F der Formel (If) gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung sind wie folgt.
    • (1) Aussehen Farbloses Pulver
    • (2) Molekulare Formel C51H83N5O22
    • (3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1118,5615 (M + H)+ Berechnet: 1118,5608
    • (4) Spezifische Rotation [α]D 25 –4,7° (c 0,90, DMSO)
    • (5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λmax nm (ε): 262 (7.600) Das UV-Spektrum ist in 17 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (6) Infrarotabsorptionsspektrum Wie gezeigt in 18 der beigefügten Zeichnungen.
    • (7) Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum Das Protonen-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 19 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (8) 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum 13C-NMR-Spektrum, wie in DMSO-d 6 bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen, ist in 20 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
    • (9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, jedoch unlöslich in Aceton und Ethylacetat.
    • (10) TLC Wenn es einer Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel 60F254 (ein Produkt von Merck & Co.) unterzogen wird, wie entwickelt mit einem Lösungsmittel bestehend aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2), ist der Rf-Wert 0,44.
  • Caprazamycin F gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon können beispielhaft dargestellt werden durch seine Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel quartärnere Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedenen Metallen, zum Beispiel seine Salze mit Alkalimetallen, wie zum Beispiel Natriumsalz oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischer Säure, wie zum Beispiel Hydrochlorsäure.
  • Es ist zu bemerken, daß der Ausdruck „ ein Caprazamycin" der einfach in der Beschreibung angegeben ist, manchmal jedes von Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E und Caprazamycin F oder ein Gemisch von zwei oder mehreren oder ein Gemisch von allen diesen bedeutet.
  • Caprazamycine, die die allgemeine Formel (I) wie oben angegeben aufweisen, weisen gemäß dieser Erfindung biologische Eigenschaften auf, die hier im folgenden angegeben sind.
  • So zeigen Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E und Caprazamycin F jedes eine antibakterielle Aktivitäten gegen solche Bakterien, die Säure-feste Bakterien einschließen, einschließlich ihrer Wirkstoff-resistenten Stämme, sowie Gram-positiven Bakterien, einschließlich ihrer Wirkstoff-resistenten Stämme (Methicillin-resistente Stämme und andere). Die antibakteriellen Aktivitäten eines Caprazamycins gegen diese Bakterien werden durch die folgenden Verfahren getestet.
  • Testbeispiel 1
  • Das antimikrobielle Spektrum von Caprazamycin A gegen eine Auswahl von Mikroorganismen wurde auf einem 1% Glyzerin-ergänzten Nährstoff-Agar-Medium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß dem Standardverfahren, wie durch die Japanese Society of Chemotherapy zur Verfügung gestellt, gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00140001
  • Testbeispiel 2
  • Das antibakterielle Spektrum von Caprazamycin B gegen eine Auswahl von Mikroorganismen wurde auf einem 1% Glyzerin-ergänzten Nährstoff-Agar-Medium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß dem wie durch die Japanese Society of Chemotherapy zur Verfügung gestellten Standardverfahren gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00150001
  • Testbeispiel 3
  • Das antibakterielle Spektrum von Caprazamycin B gegen eine Auswahl von Mikroorganismen, die anders waren als die in Tabelle 2 angegebenen Mikroorganismen, wurde auf Müller-Hinton-Agar-Medium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß dem wie durch die Japanese Society of Chemotherapy zur Verfügung gestellten Standardverfahren gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00160001
  • Testbeispiel 4
  • Das antibakterielle Spektrum von Caprazamycin C gegen eine Auswahl von Mikroorganismen wurde auf einem 1% Glyzerin-ergänzten Nährstoff-Agar-Medium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß dem wie durch die Japanes Society of Chemotherapy zur Verfügung gestellten Standardverfahren gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00170001
  • Testbeispiel 5
  • Das antibakterielle Spektrum von Caprazamycin E gegen eine Auswahl von Mikroorganismen wurde auf einem 1% Glyzerin-ergänzten Nährstoff-Agar-Medium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß dem durch die Japanese Society of Chemotherapy zur Verfügung gestellten Standardverfahren gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
  • Tabelle 5
    Figure 00180001
  • Testbeispiel 6
  • Das antibakterielle Spektrum von Caprazamycin F gegen eine Auswahl von Mikroorganismen wurde auf einem 1% Glyzerin-ergänzten Nährstoff-Agar-Medium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß dem durch die Japanese Society of Chemotherapy zur Verfügung gestellten Standardverfahren gemessen. Die Testergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
  • Tabelle 6
    Figure 00190001
  • Testbeispiel 7
  • Das antibakterielle Spektrum jedes der Caprazamycine A, B, C, E und F gegen Mycobacterium tuberculosis und gegen atypische Säure-feste Bakterien, Mycobacterium avium -Kirchberg und Mycobacterium intracellulare wurden in einem Middlebrook 7H9-Flüssigmedium durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemessen. Zur selben Zeit wurden die antibakteriellen Spektren von Rifampicin (RMP) und Isonicotininsäurehydrazid (INH) (als Vergleichswirkstoffe) gegen die oben erwähnten Säure-festen Bakterien durch dasselbe serielle Verdünnungsverfahren gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 gezeigt.
  • Tabelle 7
    Figure 00200001
  • Weiterhin wird gemäß eines zweiten Aspekts dieser Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E und/oder Caprazamycin F, die die oben angegebene Formel (I) aufweisen, zur Verfügung gestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das Verfahren ein Kultivieren eines mikrobiellen Stammes umfaßt, der zum Genus Streptomyces gehört und der in der Lage ist mindestens eines von Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E und Caprazamycin F herzustellen, und Aufreinigen von mindestens einem der Caprazamycine A, B, C, E und F aus der sich ergebenden Kultur.
  • Der Mikroorganismus oder mikrobielle Stamm, der in der Lage ist, das Antibiotikum, ein Caprazamycin, herzustellen und im Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung brauchbar ist, kann jeder Stamm derjenigen Mikroorganismen sein, die die Fähigkeit aufweisen diese Antibiotika herzustellen, die die oben genannten physikochemischen Eigenschaften und biologischen Eigenschaften besitzen und dieser kann aus einer großen Auswahl von Mikroorganismen ausgewählt sein. Unter solchen brauchbaren Mikroorganismen kann ein Stamm von Actinomyceten erwähnt werden, dem die Stammnummer MK730-62F2 zugeordnet ist und der aus einer Bodenprobe von Oafu Island, Hawaii, durch unser Institute of Micro bial Chemistry im März 1997 isoliert wurde, als ein bevorzugtes konkretes Beispiel eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, die Antibiotika, Caprazamycine, herzustellen.
  • Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes MK730-62F2 werden nun im folgenden beschrieben.
  • 1. Morphologie
  • Der Stamm MK730-62F2 weist verzweigte Substratmycelien auf, von denen sich relativ lang Lufthyphen mit der Bildung von 5- bis 10-fach gedrehten Spiralen an den Spitzen der Lufthyphen erstrecken. Die Kette der reifen Sporen liegt in Form einer Kette vor, die von 10 bis 50 ovale Sporen umfaßt, und die Dimensionen der Sporen sind ungefähr 0,5 bis 0,6 × 0,8 bis 1,0 Mikron. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Wirbel, Synnemata, Sporangien und motile Sporen werden nicht beobachtet.
  • 2. Wachstumscharakteristika auf verschiedenen Kulturmedien
  • Die Standards der Farben, die in jeder der Klammern [] für die Beschreibungen der Farben angegeben sind, entsprechen dem „Color Harmony Manual" der Container Corporation of America.
    • (1) Sacharose-Nitrat-Agar-Medium (kultiviert bei 27°C) Lufthyphen weißer Farbe werden dünn auf dem blaßgelben Wachstum [2 ea, helles Weizen] gebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
    • (2) Glyzerin-Asparagin-Agar-Medium (ISP-Medium 5, kultiviert bei 27°C) Lufthyphen von gräulichem Weiß [3 dc, natürlich] bis leichtem Grau [d] werden auf dem Wachstum von blaßem Gelb [2 ea, leicht Weizen] bis blaßgelblichen Braun [2 ng, stumpfes Gold] gebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
    • (3) Anorganisches Salz-Stärke-Agar-Medium (ISP-Medium 4, kultiviert bei 27°C) Lufthyphen von Weiß bis leicht Grau [d] werden auf dem Wachstum von blaßem Gelb [2 ea, leichtes Weizen] bis blaßgelblichen Braun [2 lg, senffarben] gebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
    • (4) Tyrosin-Agar-Medium (ISP-Medium 7, kultiviert bei 27°C) Lufthyphen von gräulichem Weiß [b, Austernweiß bis 3 dc, natürlich] werden auf dem Wachstum von leicht gelblichem Braun [2 lg, Senf bis 2 ng, stumpfes Gold] gebildet, mit der Bildung von dunkelbraunem löslichem Pigment.
    • (5) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Medium (ISP-Medium 2, kultiviert bei 27°C) Lufthyphen von gräulichem Weiß [b, Austernweiß] zu leichtem Grau [d] werden auf dem Wachstum von blaßgelblichem Braun [2 ie, leicht senffarben bis 3 ic, leicht Bernstein] gebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
    • (6) Hafermehl-Agar-Medium (ISP-Medium 3, kultiviert bei 27°C) Lufthyphen von gräulichem Weiß [3 dc, natürlich] zu leichtem Grau [d] werden von dem Wachstum von blaßem Gelb [2 ea, leichtes Weizen] gebildet. Kein lösliches Pigment wird gebildet.
  • 3. Physiologische Eigenschaften
    • (1) Temperaturbereich für das Wachstum Dieser Stamm MK730-62F2 wurde in Glucose-Asparagin-Agar-Medium (enthaltend 1,0% Glucose, 0,05% Asparagin, 0,05% Dikaliumhydrogenphosphat und 2,5% Agar bei pH 7,0) bei verschiedenen Temperaturen von jeweils 10°C, 20°C, 24°C, 27°C, 30°C, 37°C, 45°C und 50°C inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, daß dieser Stamm im Temperaturbereich von 20°C bis 37°C wachsen konnte, was 10°C, 45°C und 50°C ausschloß. Die optimale Temperatur für das Wachstum liegt in der Nähe von 30°C bis 37°C.
    • (2) Stärkehydrolyse (in anorganischen Salze-Stärke-Agar-Medium, ISP-Medium 4, kultiviert bei 27°C) Die Stärkehydrolyse wurde seit ungefähr drei Tagen nach dem Start der Kultur beobachtet und das Ausmaß der hydrolytischen Aktivität ist moderat.
    • (3) Bildung von Melanoid-Pigment (in Trypton-Hefeextrakt-Medium, ISP-Medium 1; Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium, ISP-Medium 6; Tyrosin-Agar-Medium, ISP-Medium 7; kultiviert bei 27°C in jedem Medium) Positiv in allen verwendeten Medien.
    • (4) Verwendung von Kohlenstoffquellen (in Pridham-Gottlieb-Agar-Medium, ISP-Medium 9, kultiviert bei 27°C) D-Glucose, L-Arabinose, D-Fructose, Saccharose, Inositol, Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol sind für das Wachstum brauchbar. D-Xylose ist möglicherweise brauchbar.
    • (5) Verringerung von Nitrat (in wäßriger Peptonlösung, enthaltend 0,1% Kaliumnitrat, ISP-Medium 8, kultiviert bei 27°C) Negativ.
    • (6) Verflüssigung von Gelatine (in Gelatine-Medium, kultiviert bei 20°C und in Glucose-Pepton-Gelatine-Medium, kultiviert bei 27°C) In dem Gelatine-Medium wurde keine Verflüssigung während 40 Tagen nach dem Beginn der Kultivierung beobachtet; jedoch wurde in dem Glucose-Pepton-Gelatine-Medium eine schwache Verflüssigung bei ungefähr 40 Tagen nach dem Beginn der Kultivierung beobachtet.
    • (7) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch (in 10% Magermilch, kultiviert bei 37°C) Keine Koagulation wurde beobachtet. Bei ungefähr 7 Tagen nach dem Beginn der Kultivierung wurde der Beginn der Peptonisierung beobachtet, und die Peptonisierung war am 14. Tag vom Beginn der Kultur vollständig.
  • Unter Zusammenfassung der oben genannten Eigenschaften des Stammes MK730-62F2 wird dieser Stamm dadurch gekennzeichnet, daß er verzweigte Substrat-Mycelien aufweist, von denen sich Lufthyphen unter der Bildung von Spiralen erstrecken, daß die Oberfläche der Sporen glatt ist, daß auf verschiedenen Kulturmedien Lufthyphen von gräulichem Weiß bis leichtem Grau in der Farbe auf dem Wachstum von Blaßgelb bis blaßgelblichem Braun in der Farbe gebildet werden, daß kein lösliches Pigment beobachtet wird, außer der Bildung von Melanoid-Pigment, daß die optimale Temperatur zum Wachstum im Bereich von 30 bis 37°C liegt, daß die Bildung von Melanoid-Pigment positiv ist und daß die Hydrolyse von Stärke in einem mittleren Ausmaß stattfindet. Zusätzlich ist die in den Zellwänden dieses Stammes enthaltene 2,6-Diaminopimelinsäure von der LL-Form und das in der bakteriellen Zelle vorhandene vorherrschende Menachinon ist MK-9(H8) und MK-9(H6).
  • Im Hinblick auf diese Eigenschaften wird angenommen, daß der Stamm MK73D-62F2 zum Genus Streptomyces gehört. Als nach analogen bekannten Spezies unter Bezugnahme auf die Eigenschaften dieses Stammes MK730-62F2 gesucht wurde, wurden Streptomyces diastatochromogenes (Literatur: International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 22, S. 290, 1972), Streptomyces resistomycificus (Literatur: International Journal of Systemactic Bacteriology, Vol. 18, S.165, 1968), Streptomyces collinus (Literatur: International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 18, 5.100, 1968) und Streptomyces aurantiogriseus (Literatur: International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 18, S. 297, 1968) gefunden. Daher haben wir den Stamm MK730-62F2 im Vergleich zu den wie oben angegebenen Stämmen untersucht, die in unserem Institut konserviert waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 unten gezeigt.
  • Tabelle 8
    Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Tabelle 8 weitergeführt
    Figure 00260001
  • Tabelle 8 weitergeführt
    Figure 00270001
  • Wie aus Tabelle 8 oben klar wird, weist der Stamm MK730-62F2 Eigenschaften auf, die eng diejenigen der Stämme widerspiegeln, die in Tabelle 8 damit verglichen werden. Jedoch ist Streptomyces resistomycifrcus insofern von dem Stamm MK730-62F2 unterschiedlich, daß bei Streptomyces resistomycifrcus die Farbe des Wachstums blaßgelbliches Braun bis bräunliches Schwarz ist. Das lösliche Pigment ist braun-meliert und die Magermilch wird nicht peptonisiert. Streptomyces collinus ist insofern von dem Stamm MK730-62F2 unterschiedlich, daß bei der zuerst genannten Spezies die Form der Lufthyphen gerade bis schleifenförmig ist und Magermilch nicht peptonisiert wird. Streptomyces aurantiogriseus wird von dem Stamm MK730-62F2 dadurch unterschieden, daß bei der zuerst genannten Spezies das lösliche Pigment braun-meliert ist, die Gelatine verflüssigt wird und Nitrat reduziert wird. Auf der anderen Seite erscheint Streptomyces distatochromogenes als sehr eng mit dem Stamm MK730-62F2 verwandt, mit der Ausnahme, daß die Verflüssigung der Gelatine mit der zuerst genannten Spezies positiv ist. Zur jetzigen Zeit ist es jedoch unmöglich, daß der Stamm MK730-62F2 als ein Stamm identifiziert wird, der zu Streptomyces diastatochromogenes gehört. Daher haben wir den Stamm MK730-62F2 als Streptomyces sp MK730-62F2 benannt.
  • Der Stamm MK730-62F2 wurde in einer japanischen Hinterlegunsstelle „National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology" hinterlegt, die sich unter Nr.1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-City, Ibaraki-ken, Japan, unter der Hinterlegungsnummer „FERM P-17067" am 27. November 1998. Dieser Stamm wurde nun unter der Hinterlegungsnummer „FERM P-7218" in dem Nationalen Institut hinterlegt, wie im Hinblick auf den Budapester Vertrag übertragen.
  • Gemäß dem Verfahren des zweiten Aspekts dieser Erfindung kann die Produktion des Antibiotikums Caprazamycine wie unten beschrieben durchgeführt werden.
  • So wird die Produktion des Antibiotikums Caprazamycine durch Beimpfen eines mikrobiologischen Stammes, der in der Lage ist, mindestens eines des Antibiotikums Caprazamycine A, B, C, E und F herzustellen (Dieser Stamm wird hier im folgenden einfach als „ein Caprazamycin-produzierender Stamm" bezeichnet) in ein Nährstoffmedium, und Kultivieren des mikrobiellen Stammes bei einer geeigneten Temperatur, um das Antibiotikum, ein Caprazamycin, herzustellen, durchgeführt, wodurch die Kultur, die das Antibiotikum Caprazamycine enthält, erhalten wird. Als das zu diesem Zweck zu verwendende Nährstoffmedium kann jedes Nährstoffmedium verwendet werden, das für die Kultivierung von Actinomyceten brauchbar ist. Als Nährstoffquellen können Stickstoffquellen, zum Beispiel Sojabohnenmehl, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Flüssigkeit von eingeweichtem Mais, Am moniumsulfat und andere verwendet werden, die käuflich erhältlich sind. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate, wie zum Beispiel Tomatenpaste, Glyzerin, Stärke, Glucose, Galactose, Dextrin und andere, sowie Fette und ähnliches verwendet werden. Weiterhin können anorganische Salze, wie zum Beispiel Natriumchlorid, Kalziumcarbonat und ähnliches als Zusatzstoffe verwendet werden. Falls erforderlich können andere Zusatzstoffe, wie zum Beispiel Metallsalz, in sehr kleinen Mengen hinzugefügt werden. Diese zusätzlichen Substanzen können jedes derjenigen Materialien sein, die durch einen Caprazamycin-produzierenden Stamm verwendbar sind und für die Produktion des Antibiotikums Caprazamycine brauchbar sind, und die als in dem Kulturmedium für die Kultivierung von Actinomyceten verwendbar bekannt sind.
  • Für die Produktion des Antibiotikums Caprazamycine kann ein Mikroorganismus verwendet werden, der zu dem Genus Streptomyces gehört und der die Fähigkeit aufweist, das Antibiotikum Caprazamycine herzustellen. Spezifisch wurde von dem Streptomyces sp. MK730-62F2, wie durch uns isoliert, bestätigt, daß er das Antibiotikum Caprazamycine herstellt. Jeder andere Stamm, der in der Lage ist, diese Antibiotika herzustellen, kann durch Anwendung jegliches bekannten Isolierungsverfahrens, das zur Isolierung der Antibiotika-produzierenden Stämme erhältlich ist, aus der Natur isoliert werden. Es bleibt auch noch die Möglichkeit, daß die Fähigkeit eines Caprazamycin-produzierenden Stammes, einschließlich Streptomyces sp. MK730-62F2, das Antibiotika Caprazamycine herzustellen, durch Unterziehen eines solchen Stammes einer Mutationsbehandlung mit radioaktiver Bestrahlung oder anderem verbessert wird. Weiterhin kann das Antibiotikum Caprazamycine durch ein gentechnisches Verfahren hergestellt werden.
  • Als eine Stammkultur, die für die Produktion von Caprazamycinen verwendet wird, kann ein Wachstum verwendet werden, das aus einer Schrägagar-Kultur des Stammes MK730-62F2 auf einem Agar-Medium erhalten wird.
  • Bei der Produktion des Antibiotikums Caprazamycine ist es bevorzugt, daß ein Caprazamycin-produzierender Stamm, der zum Genus Streptomyces gehört, in einem geeignetem Kulturmedium unter aerobischen Bedingungen kultiviert wird. Die Aufreinigung des gewünschten Caprazamycins/der gewünschten Caprazamycine aus dem sich ergebenden Kulturmedium kann auf eine herkömmliche Weise durchgeführt werden. Die Kultivierungstemperatur ist nicht spezifisch begrenzt, insoweit als sie innerhalb des Bereichs von Temperatu ren liegt, bei denen die gewünschten Antibiotika hergestellt werden können, ohne das Wachstum des Caprazamycin-produzierenden Stammes, wie verwendet, wesentlich zu behindern. Die Kultivierungstemperatur kann in Abhängigkeit von der Natur eines wie verwendeten Caprazamycin-produzierenden Stammes ausgewählt werden und eine bevorzugte Kultivierungstemperatur liegt im Bereich von 25 bis 30°C.
  • Die Herstellung von Caprazamycinen durch den Stamm MK730-62F2 kann gewöhnlicherweise ein Maximum bei 3 bis 9 Tagen der Kultivierung des Stammes erreichen. Im allgemeinen wird jedoch die Kultivierung des Stammes fortgeführt, bis eine ausreichende antibakterielle Aktivität zu dem Kulturmedium verabreicht wird. Die zeitabhängige Veränderung im Potential der Caprazamycine in dem sich ergebenden Kulturmedium kann entweder durch ein HPLC-Verfahren oder durch ein Zylinder-Platten-Verfahren gemessen werden, in dem Mycobacterium smegmatis oder Mycobacterium vaccae als ein Teststamm verwendet wird.
  • Im zweiten Aspekt dieser Erfindung wird mindestens eines dieser Caprazamycine A, B, C, E und F aus dem Kulturmedium aufgereinigt, das wie oben erhalten wurde. Als das Verfahren zur Aufreinigung und Isolierung des gewünschten Caprazamycins/der gewünschten Caprazamycine kann jedes der herkömmlichen Verfahren, die für die Isolierung von Metaboliten geeignet sind, wie durch Mikroorganismen produziert, verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Verfahren zur Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das nicht mit Wasser mischbar ist und ein Verfahren zur Anwendung des Unterschieds in den Adsorptionsaffinitäten der Caprazamycine zu verschiedenen Adsorbtionsmitteln, wie zum Beispiel einem synthetischen adsorbierenden Harz, Silicagel, und ein Verfahren zur Gelfiltration und chromatographischer Verfahren mit gegenläufiger Verteilung, usw. verwendet werden, einzeln oder in Kombination, um Caprazamycine A, B, C, E und/oder F entweder einzeln oder in der Form eines Gemisches von zweien oder mehreren dieser aus dem Kulturmedium-Überstand aufzureinigen. Weiterhin kann es auch möglich sein, aus den mikrobiellen Zellen des Stammes, die so vom Kulturmedium abgetrennt wurden, Caprazamycine A, B, C, E und/oder F durch Unterziehen der mikrobiellen Zellen eines Lösungsmittel-Extraktionsverfahrens mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel oder durch ein Verfahren, umfassend Ausbrechen der Zellen und Eluieren der gewünschten Caprazamycine aus den aufgebrochenen Zellen durch Extraktion, aufzureinigen. Im übrigen können die Antibiotika Caprazamycine A, B, C, E und/oder F, getrennt oder in Kombination, geerntet werden. Im übrigen kann die Isolierung der Caprazamycine A, B, C, E und F voneinander durch eine High-Performance-Liquid-Chromatograhie (HPLC) mit einem geeigneten Entwicklungslösungsmittel erfolgen.
  • Weiterhin, gemäß einem dritten Aspekt dieser Erfindung, wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die als einen aktiven Inhaltsstoff mindestens eines der Caprazamycine A, B, C, E und F umfaßt, das die allgemeine Formel (I) aufweist oder ein Salz davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Trägern.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß des dritten Aspekts dieser Erfindung kann in der Form einer Zusammensetzung vorliegen, die als den aktiven Inhaltsstoff eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) im Gemisch mit einem herkömmlichen pharmazeutisch akzeptablen festen oder flüssigen Träger, zum Beispiel Ethanol, Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Stärke oder ähnliches, umfaßt.
  • Caprazamycine der allgemeinen Formel (I) oder ein Salz davon, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem dritten Aspekt dieser Erfindung verwendet wird oder dazu gedacht ist, kann oral oder parenteral durch intravenöse oder intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung usw. verabreicht werden.
  • Für die oralen Verabreichungen kann die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem dritten Aspekt dieser Erfindung in der Form von Präparationen formuliert sein, wie zum Beispiel Pulvern, Tabletten, Kapseln, Suspension, Sirup und ähnliches, durch Mischen des aktiven Inhaltsstoffes, nämlich einem Caprazamycin der allgemeinen Formel (I) oder einem Salz davon, mit einem herkömmlichen pharmazeutisch akzeptablen festen oder flüssigen Träger.
  • Der Anteil der Verbindung der allgemeine Formel (I), die als der aktive Inhaltsstoff in die pharmazeutische Zusammensetzung des dritten Aspekts dieser Erfindung inkorporiert wird, kann von dem Typ der Präparationen abhängig sein, jedoch kann ein bequemer Anteil eines Caprazamycins im Bereich von 2 bis 90%, basierend auf dem Gewicht der Dosierungseinheit der Zusammensetzung, vorliegen.
  • In Fällen, wo die Zusammensetzung des dritten Aspekts dieser Erfindung in eine Injektion formuliert wird, kann eine bevorzugte Form der injizierbaren Präpaxationen eine sterilisierte wäßrige Lösung oder eine sterilisierte und lyophilisierte Präparation einschließen, die die Verbindung der allgemeinen Formel (I) als aktiven Inhaltsstoff enthält. Als Beispiele der für diese Zwecke brauchbaren flüssigen Träger sind Wasser, wäßriges Ethanol, Glyzerin, Propylenglycol, Pflanzenöl und ähnliches bevorzugt.
  • Die Dosierung eines Caprazamycins der allgemeinen Formel (I) oder eines Salzes davon als ein aktiver Inhaltsstoff in der Zusammensetzung dieser Erfindung kann von der Natur der zu behandelnden bakteriellen Infektionen, einem Zweck der therapeutischen Behandlung, dem Ausmaß des Zustands des Patienten usw. abhängig sein. Jedoch kann eine optimale Dosierung eines Caprazamycins durch Experten durch geeignete vorhergehende Tests entschieden werden. Nebenbei bemerkt zeigte Caprazamycin B keine Toxizität in Mäusen (ICR-Typ, 4 Wochen alt, männlich), wenn intravenös bei einer Dosis von 75 mg/kg verabreicht.
  • Gemäß eines vierten Aspekts dieser Erfindung wird weiterhin als ein neuer Mikroorganismus Streptomyces sp. MK730-62F2 zur Verfügung gestellt, der als ein Charakteristikum aufweist, daß er in der Lage ist, Caprazamycine A, B, C, E und F der allgemeinen Formel (I) oben zu produzieren und der im „National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology" unter der Adresse Nr. 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-City, Ibaraki-Prefecture, Japan, unter der Hinterlegungsnummer „FERM BP-7218" hinterlegt wurde.
  • Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Caprazamycin A in einer methanolischen Lösung.
  • 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Caprazamycin A, wie durch ein KBr-tabelliertes Verfahren gemessen.
  • 3 ist ein Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin A, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 4 ist ein 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin A, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 5 ist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Caprazamycin B in einer methanolischen Lösung.
  • 6 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Caprazamycin B, wie durch ein KBr-tabelliertes Verfahren gemessen.
  • 7 ist ein Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin B, wie in einem gemischten Lösungsmittel von DMSO-d 6-D2O (10 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 8 ist ein 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin B, wie in gemischten Lösungsmittel von DMSO-d 6-D2O (10 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 9 ist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Caprazamycin C in einer methanolischen Lösung.
  • 10 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Caprazamycin C, wie durch ein KBr-tabelliertes Verfahren gemessen.
  • 11 ist ein Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin C, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 12 ist ein 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin C, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 13 ist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Caprazamycin E in einer methanolischen Lösung.
  • 14 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Caprazamycin E, wie durch ein KBr-tabelliertes Verfahren gemessen.
  • 15 ist ein Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin E, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 16 ist ein 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin E, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 17 ist ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Caprazamycin F in einer methanolischen Lösung.
  • 18 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Caprazamycin F, wie durch ein KBr-tabelliertes Verfahren gemessen.
  • 19 ist ein Protonen-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin F, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 500 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • 20 ist ein 13C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum von Caprazamycin F, wie in DMSO-d 6-Lösung bei 125 MHz bei Raumtemperatur gemessen.
  • Beste Art zur Durchführung der Erfindung
  • Diese Erfindung wird nun genauer unter Bezug auf die folgenden Beispiele verdeutlicht.
  • Beispiel 1
  • Herstellung des Antibiotikums Caprazamycine A, B, C, E und F.
  • Streptomyces sp. MK730-62F2 (hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7218) der auf einem Schrägagar-Kulturmedium kultiviert wurde, wurde in ein Kulturmedium beimpft. Das Kulturmedium, das hier verwendet wurde, wurde durch Plazieren in Erlenmeyer-Flaschen (von 500 ml Kapazität) von 110 ml Teilen eines flüssigen Kulturmediums, umfassend 2% Galactose, 2% Dextrin, 1% Glyzerin, 1% Bacto-Soyton (Produkt von Difco Co.), 0,5% Mais-Einweichflüssigkeit, 0,2% Ammoniumsulfat und 0,2% Kalziumcarbonat (eingestellt auf einen pH von 7,4) und Sterilisieren des Kulturmediums in den Flaschen bei 120°C für 20 Minuten auf herkömmliche Weise hergestellt, bevor die Beimpfung des Stammes MK730-62F2 durchgeführt wurde. Das so beimpfte flüssige Kulturmedium wurde dann einer Schüttelkultivierung mit Rotation bei 30°C für 2 Tage unterzogen, um so ein wie beabsichtigtes Stammkulturmedium zu erhalten.
  • In einem Tank-Fermenter (von 30 l Kapazität) wurden 15 l eines Kulturmediums hergestellt, umfassend 2,4% Tomatenpaste (Produkt von Kagome Co.), 2,4% Dextrin, 1,2% Hefeextrakt (Produkt von Oriental Co.) und 0,0006% Kobaltchlorid (eingestellt auf einen pH von 7,4), das dann sterilisiert wurde, um so das produktive Kulturmedium herzustellen. Zu diesem produktiven Kulturmedium wurde ein 2%-iger Anteil des oben genannten Stammkulturmediums beimpft. Die Kultivierung des Stammes MK730-62F2 wurde in dem Tank-Fermenter unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß die Kultivierung für 6 Tage bei einer Temperatur von 27°C mit Belüftung von 15 1 Luft pro Minute und Rühren bei 200 U/min bewirkt wurde.
  • Das sich ergebende Kulturmedium wurde zentrifugiert, um so in das Kulturmedium-Filtrat (12 l) und die kultivierten mikrobiellen Zellen getrennt zu werden. Anschließend wurde Methanol (6 l) zu den so abgetrennten mikrobiellen Zellen hinzugefügt, und das erhaltene Gemisch wurde gut gerührt um dann die Caprazamycine aus den Zellen in das Methanol zu extrahieren. Das wie erhaltene Kulturmedium-Filtrat und der methanolische Extrakt der Zellen (der Methanolextrakt) wurden miteinander kombiniert und das erhaltene Gemisch (18 l) wurde durch eine Säule hindurch passiert, die 750 ml eines synthetischen Adsorptionsharzes enthielt, das aus aromatischem Polymer hergestellt wurde, nämlich „Diaion HP-20"-Harz (ein Produkt von Mitsubishi Chemical Co., Japan), wodurch die Caprazamycine in dem Diaion HP-20-Harz adsorbiert wurden. Durch diese Diaion HP-20-Harz-Säule, die die adsorbierten Caprazamycine enthielt, wurden ein Volumen von deionisiertem Wasser, 50% wäßriges Methanol (ein Gemisch von 50% Methanol und 50% Wasser), 80% wäßriges Methanol (ein Gemisch von 80% Methanol und 20% Wasser), 80% wäßriges Aceton (ein Gemisch von 80% Aceton und 20% Wasser) und Aceton (jeweils 2,25 l) in dieser Reihenfolge hindurch passiert. Die Caprazamycine wurden hauptsächlich in der Eluat-Fraktion heraus eluiert, die durch Eluieren mit dem 80% wäßrigen Aceton erhalten wurde. Zusätzlich enthielten die Eluatfraktionen, wie mit dem 50%-igen wäßrigen Ethanol eluiert, und die Eluatfraktion, wie mit dem 80% wäßrigen Methanol eluiert, ebenfalls Caprazamycine. Diese zwei Eluatfraktionen, die Caprazamycine enthielten, wie mit dem 50% wäßrigen Methanol und dem 80% wäßrigen Methanol eluiert, wurden miteinander kombiniert. Das erhaltene Gemisch dieser Eluatfraktionen wurde nochmals durch eine Säule von Diaion HP-20-Harz (750 ml) hindurch passiert, wodurch die Caprazamycine in dem adsorbierenden Harz dieser Säule adsorbiert wurden.
  • Danach wurden 80% wäßriges Methanol (2,25 l) durch die Säule hindurch passiert. Dann wurden durch Passieren von 80% wäßrigem Aceton (2,25 l) durch die Säule hindurch die Elution bewirkt. Das wie zu dieser Zeit erhaltene Eluat eluiert mit dem 80%-igen wäßrigen Aceton wurde dann mit der zuerst erwähnten Eluatfraktion kombiniert, die durch Eluieren zu dem früheren Zeitpunkt mit dem 80%-igen wäßrigen Aceton erhalten wurde, kombiniert. Das erhaltene Gemisch wurde unter verringertem Drink zur Trocknung konzentriert, wodurch ein teilweise gereinigtes Produkt erhalten wurde, das Caprazamycine umfaßte (10,1 g).
  • Dies teilweise gereinigte Produkt, das Caprazamycine umfaßte (10,1 g), wurde dann in einem gemischten Lösungsmittel (50 ml) aus Chloroform-Methanol (= 1 : 2) gelöst, und die erhaltene Lösung wurde zu Kieselgur (Art. 10601, ein Produkt von Merck & Co.) (50 ml) hinzugefügt, und das Lösungsmittel wurde unter einem verringertem Druck bis zur Trocknung abgedampft. Die erhaltenen Kieselgur-Feststoffe, die die darin adsorbierten Caprazamycine enthielten, wurden oben auf eine Silicagel-Säule (54 mm innerer Durchmesser × 200 ml Höhe) plaziert, um einer Chromatographie unterzogen zu werden. Die für diesen chromatographischen Zweck verwendeten Entwicklungslösungsmittel waren Lösungsmittelgemische von Chloroform-Methanol-Wasser (= 4 : 1 : 0,1), Chloroform-Methanol-Wasser (= 2 : 1 : 0,2) und Chloroform-Methanol-Wasser (= 1 : 1 : 0,2), und 1,35 l des Lösungsmittelgemischs wurden jedes Mal verwendet. Die Entwicklungsbetriebsschritte wurden nacheinander mit diesen Lösungsmitteln durchgeführt. Die Eluate von der Silicagel-Säule wurden mittels eines Fraktionssammlers jeweils in Fraktionen gesammelt, so daß Fraktionen Nrn. 1 bis 53 jeweils in 20 g-Teilen gesammelt wurden und so daß Fraktionen Nrn. 54 bis 117 jeweils in 19 g-Teilen gesammelt wurden. Auf diese Weise wurden die aktiven Fraktionen, die Caprazamycine enthielten, in den Fraktionen Nrn. 66 bis 83 eluiert. Diese aktiven Fraktionen Nrn. 66 bis 83 wurden miteinander kombiniert und dann bis zur Trocknung unter einem verringertem Druck konzentriert, um so ein teilweise gereinigtes Produkt zu erhalten, das Caprazamycine umfaßte (625,3 mg).
  • Methanol (5 ml) wurde zu dem teilweise gereinigten so erhaltenen Produkt (625,3 mg) hinzugefügt. Der sich ergebenden Lösung wurde es ermöglicht, bei 5°C unter kalten und dunklen Bedingungen zu stehen, wodurch eine Präzipitatfraktion (537,3 mg) als ein Produkt wie abgesetzt, erhalten wurde, das Caprazamycine umfaßte.
  • Anschließend wurde das abgesetzte Präzipitat (537,3 mg), das Caprazamycine umfaßte, durch Unterziehen desselben einer HPLC (CAPCELL PAK C18, Durchmesser 20 mm × Höhe 250 mm, ein Produkt von Shiseido Co., Japan) gereinigt. Bei dieser HPLC wurde die Entwicklung mit 50% Acetonitril-Wasser-0,05% Ameisensäure als dem Entwicklungsmittel durchgeführt (bei einer Flußrate von 12,0 ml/min), wodurch Caprazamycin A nach 61 bis 68 Minuten eluiert wurde; Caprazamycin B wurde nach 52 bis 60 Minuten eluiert; Caprazamycin C wurde nach 39 bis 41 Minuten eluiert; Caprazamycin E wurde nach 25 bis 28 Minuten eluiert und Caprazamycin F wurde nach 22 bis 25 Minuten der Entwicklung eluiert. Diese aktiven Fraktionen wurden getrennt für jedes der gewünschten Caprazamycine gesammelt. Jede der getrennt gesammelten aktiven Fraktionen wurde durch Trocknung unter einem verringerten Druck konzentriert, um jeweils Caprazamycin A(56,9 mg), Caprazamycin B (90,3 mg), Caprazamycin C (19,7 mg), Caprazamycin E (30,3 mg) und Caprazamycin F (25,5 mg) zu ergeben.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Wie hier oben beschrieben, weisen Caprazamycine A, B, C, E und F, die die allgemeine Formel (I) aufweisen, die gemäß der Erfindung als neue Antibiotika zur Verfügung gestellt werden, jedes ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten gegen verschiedene Säure-feste Bakterien und verschiedene Bakterien sowie deren Wirkstoff-resistente Stämme auf. Daher ist ein Caprazamycin gemäß dieser Erfindung zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, wie durch Säure-feste Bakterien oder Bakterien verursacht, effektiv und brauchbar.

Claims (11)

  1. Antibiotikum Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E oder Caprazamycin F, das eine Verbindung ist, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird
    Figure 00380001
    worin R eine Tridecylgruppe für Caparazamycin A; eine 11-Methyldodecylgruppe für Caprazamycin B; eine Dodecylgruppe für Caprazamycin C; eine Undecylgruppe für Caprazamycin E und eine 9-Methyldecylgruppe für Caprazamycin F ist oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
  2. Antibiotikum, wie beansprucht in Anspruch 1, das Caprazamycin A ist, das durch die folgende Formel (Ia) dargestellt wird
    Figure 00390001
    d. h., die Verbindung der allgemeinen Formel (I) gezeigt in Anspruch 1, worin R eine Tridecylgruppe -(CH2)12-CH3 ist.
  3. Antibiotikum, wie beansprucht in Anspruch 1, das Caprazamycin B ist, das durch die folgende Formel (Ib) dargestellt wird
    Figure 00390002
    d. h., die Verbindung der allgemeinen Formel (I) gezeigt in Anspruch 1, worin R eine 11-Methyldodecylgruppe
    Figure 00400001
    ist.
  4. 4. Antibiotikum, wie beansprucht in Anspruch 1, das Caprazamycin C ist, das durch die folgende Formel (Ic) dargestellt wird.
    Figure 00400002
    d. h., die Verbindung der allgemeinen Formel (I) gezeigt in Anspruch 1, worin R eine Dodecylgruppe -(CH2)11-CH3 ist.
  5. Antibiotikum, wie beansprucht in Anspruch 1, das Caprazamycin E ist, das durch die folgende Formel (Ie) dargestellt wird
    Figure 00410001
    d. h., die Verbindung der allgemeinen Formel (I) gezeigt in Anspruch 1, worin R eine Undecylgruppe -(CH2)10-CH3 ist.
  6. Antibiotikum, wie beansprucht in Anspruch 1, das Caprazamycin F ist, das durch die folgende Formel (If) dargestellt wird.
    Figure 00410002
    d. h., die Verbindung der allgemeinen Formel (I) gezeigt in Anspruch 1, worin R eine 9-Methyldecylgruppe
    Figure 00420001
    ist.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E und/oder Caprazamycin F, dargestellt durch die in Anspruch 1 angegebene allgemeine Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren das Kultivieren eines mikrobiellen Stammes umfaßt, der zum Genus Streptomyces gehört und der in der Lage, ist, mindestens eines von Caprazamycin A, Caprazamycin B, Caprazamycin C, Caprazamycin E und Caprazamycin F herzustellen, und Zurückerhalten mindestens eines der Caprazamycine A, B, C, E und F aus der sich ergebenden Kultur.
  8. Verfahren, wie beansprucht in Anspruch 7, wobei als der mikrobielle Stamm, der in der Lage ist, mindestens eines der Caprazamycine A, B, C, E und F zu produzieren, Streptomyces sp. MK730-62F2 verwendet wird, der beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industiral Scinece and Technology unter der Hinterlegungsnummer „FERM BP-7218" gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt wurde.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als einen aktiven Inhaltsstoff mindestens eines der Caprazamycine A, B, C, E und F, das die in Anspruch 1 angegebene allgemeine Formel (I) aufweist, oder ein Salz davon, im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Trägem.
  10. Zusammensetzung, wie beansprucht in Anspruch 9, die eine antibakterielle Zusammensetzung ist.
  11. Als ein neuer Mikroorganismus, Streptomyces sp. MK730-62F2, der die kennzeichnende Eigenschaft aufweist in der Lage zu sein, Caprazamycine A, B, C, E und F zu produzieren, die die in Anspruch 1 angegebene allgemeine Formel (I) aufweisen, und der beim dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer „FERM BP-7218" hinterlegt wurde.
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