DE69102467T2

DE69102467T2 - Physiologisch aktive Verbindungen, Benastatine A und B, ihre Herstellung und Anwendung.

Info

Publication number: DE69102467T2
Application number: DE69102467T
Authority: DE
Inventors: Takaaki Aoyagi; Takayuki Aoyama; Masa Hamada; Yasuhiko Muraoka; Hiroshi Naganawa; Tomio Takeuchi
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-15
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2011-03-16
Also published as: DE69102467D1; EP0449051B1; US5117052A; EP0449051A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht auf Benastatine A und B, die neue, physiologisch aktive Substanzen mit einer Anti- Glutathion-Transferase-Aktivität, einer Immunmodifizierungs-Aktivität und einer Mikroorganismen-Bekämpfungs-Aktivität haben, sowie auf die Herstellung und die Verwendung derselben.

Verwandter Stand der Technik

Glutathion-Transferase ist ein Enzym, das lokal in Zellmembranen und Cytoplasmen vorkommt.
Es ist bekannt, daß Zellmembran-Enzym-Inhibitoren eine Immunmodifizierungs-Aktivität haben (T. Aoyagi, "Protease inhibitor and biological control" in "Bioactive Metabolites from Microorganisms", herausgegeben von M.E. Bushell und U. Gäfe, S. 403-418, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1989)). Es war daher zu erwarten, daß ein Glutathion-Transferase-Inhibitor auch eine Immunmodifizierungs-Aktivität haben würde.
Es ist außerdem bekannt, daß Membran-verbindende Glutathion-Transferasen eine Aktivität als Leukotrien C&sub4;-Synthese-Enzyme aufweisen und in enger Beziehung zu Inflammations- und allergischen Reaktionen stehen ("Tanpakushitsu, Kakusan, Kouso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes)"), 33, 1564-1573 (1988)).
Es wurde ferner darüber berichtet, daß Cytoplasma- Glutathion-Transferasen in enger Beziehung stehen zu dem Resistenz-Mechanismus von Antikrebsmittel-resistenten Tumor-Zellen ("Gan-to Kagaku Ryoho (Cancers and Chemotherapies)"), 16, 592-598 (1989)).
Zu bekannten Glutathion-Transferase-Inhibitoren gehören beispielsweise Indomethacin, Meclofenamidsäure und dgl. ("Biochemical and Biophysical Research Communications", 112, 980-985 (1983)).
Die bekannten Glutathion-Transferase-Inhibitoren, wie Indomethacin und Meclofenamidsäure und dgl., weisen eine geringe Spezifität für Glutathion-Transferasen auf. Es ist daher erwünscht, eine Inhibitor-Substanz bereitzustellen, die für Glutathion-Transferasen hochspezifisch ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, physiologisch aktive Substanzen mit einer hohen spezifischen Glutathion-Transferase-Inhibierungs-Aktivität sowie ferner mit einer Immunmodifizierungs-Aktivität und einer Mikroorganismen-Bekämpfungsaktivität bereitzustellen und ein Verfahren zur Herstellung der Substanzen und zur Verwendung der Substanzen zu schaffen.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher Benastatine A und B, die neue, physiologisch aktive Substanzen darstellen und die Formel (I) haben
worin R für -CH&sub2;-CH&sub2;- oder -CH=CH- steht, und ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Benastatin A oder B, das die folgenden Stufen umfaßt:
Kultivierung (Züchtung) von Benastatin-bildenden Bakterien, die zu den Streptomyces gehören, und Abtrennung des so gebildeten Benastatins A oder B von dem Kulturmedium.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Inhibierung der Glutathion-Transferase, für die Immunmodifizierung oder für die Kontrolle (Bekämpfung) von Mikroorganismen, die als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) Benastatin A oder B oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung von Glutathion-Transferase, zur Immunmodifizierung oder zur Kontrolle (Bekämpfung) von Mikroorganismen, das umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von Benastatin A oder B oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an einen Warmblüter.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Immunsuppression, das umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von Benastatin A oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an einen Warmblüter.
Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Immunpotenzierung, das umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von Benastatin B oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an einen Warmblüter.

Detaillierte Erläuterung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Ultraviolett-Absorptions-Spektrogramm einer Lösung von 10 µg/ml Benastatin A in Ethanol.
Fig. 2 zeigt ein Infrarot-Absorptions-Spektrogramm von Benastatin A, das in einer Kaliumbromid-Tablette enthalten ist.
Fig. 3 zeigt ein ¹H-NMR-Spektrogramm (400 MHz) von Benastatin A, das in Deuterium enthaltendem Methanol bestimmt wurde.
Fig. 4 zeigt ein ¹³C-NMR-Spektrogramm (100 MHz) von Benastatin A, das in Deuterium enthaltendem Methanol bestimmt wurde.
Fig. 5 zeigt ein Ultraviolett-Absorptions-Spektrogramm einer Lösung von 10 µg/ml Benastatin B in Ethanol.
Fig. 6 zeigt ein Infrarot-Absorptions-Spektrogramm von Benastatin B, das in einer Kaliumbromid-Tablette enthalten ist.
Fig. 7 zeigt ein ¹H-NMR-Spektrogramm (400 MHz) von Benastatin B, das in Deuterium enthaltendem Methanol bestimmt wurde.
Fig. 8 zeigt ein ¹³C-NMR-Spektrogramm (100 MHz) von Benastatin B, das in Deuterium enthaltendem Methanol bestimmt wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Unter den Verbindungen der Formel (I) hat Benastatin A, worin R für -CH=CH- steht, die Formel:
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Benastatin A sind folgende:
1) Farbe und Gestalt: gelbes Pulver
2) Summenformel: C&sub3;&sub0;H&sub2;&sub8;O&sub7;
3) Molekulargewicht: 500 (FAB-MS (negativ) m/z 499 (M- H)&supmin;)
4) Schmelzpunkt: 170-173ºC (Zers.)
5) UV-Absorptionsspektrum: Fig. 1
6) IR-Absorptionsspektrum: Fig. 2
7) ¹H-NMR-Spektrum Fig. 3
8) ¹³C-NMR-Spektrum: Fig. 4
9) Löslichkeit: löslich in Dimethylsulfoxid, Methanol, Aceton und Ethylacetat und unlöslich in Wasser.
10) Dünnschichtchromatographie (Silicagel "Art. 5715" der Firma Merck Company; Eluierungsmittel: Chloroform/Methanol (4/1)): Rf = 0,37.
Unter den Verbindungen der Formel (I) hat Benastatin B, worin R für -CH&sub2;CH&sub2;- steht, die Formel:
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Benastatin B sind folgende:
1) Farbe und Gestalt: gelbes Pulver
2) Summenformel C&sub3;&sub0;H&sub3;&sub0;O&sub7;
3) Molekulargewicht: 502 (FAB-MS (negativ) m/z 501 (M- H)&supmin;)
4) Schmelzpunkt: 210-212ºC (Zers.)
5) UV-Absorptionsspektrum: Fig. 5
6) IR-Absorptionsspektrum: Fig. 6
7) ¹H-NMR-Spektrum: Fig. 7
8) ¹³C-NMR-Spektrum: Fig. 8
9) Löslichkeit: löslich in Dimethylsulfoxid, Methanol, Aceton und Ethylacetat und unlöslich in Wasser.
10) Dünnschichtchroinatographie (Silicagel "Art. 5715" der Firma Merck Company; Eluierungsmittel: Chloroform/Methanol (4/1)): Rf = 0,44.
Benastatin A und B können auch in Form ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze vorliegen. Zu Beispielen für diese Salze gehören die Salze von Alkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Lithium und dgl., und die Salze von Erdalkalimetallen, wie Calcium und dgl.
Gemäß dem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Benastatin A oder B, das die folgenden Stufen umfaßt:
Kultivieren (Züchten) von Benastatin-bildenden Bakterien, die zu den Streptomyces gehören; und
Abtrennung des so gebildeten Benastatins A oder B von dem Kulturmedium.
Als ein Beispiel für die Benastatin-bildenden Mikroorganismen kann der Streptomyces-Stamm MI384-DF12 genannt werden, der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung im Erdboden in Suginami-Ku, Tokyo, Japan, gefunden wurde. Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes M1384-DF12 sind folgende:

1. Gestalt

Unter dem Mikroskop wurde beobachtet, daß Mikroorganismen vom Stamm M1384-DF12 verzweigte primäre Hyphen aufweisen und daß Lufthyphen von den primären Hyphen ausgehen. Die Lufthyphen erstrecken sich in der Regel geradeaus und sie weisen spiralige Sporenketten mit mindestens 20 Sporen auf. Ein charakteristisches Merkmal der Mikroorganismen besteht darin, daß sie ein Pseudosporangium mit einem Durchmesser von 1,5 bis 6 µm aufweisen. Es wurden keine Verticillat-Verzweigungen und keine Sporangien beobachtet. Die Sporen haben eine Größe von 0,5 bis 0,6 x 0,7 bis 0,8 µm und die Sporenoberfläche ist glatt.

2. Wachstum in Kulturmedien

Für die Identifizierung von Farben wurde das "Color Harmony Manual" der Firma Container Corporation of America verwendet.

1) Saccharose-Nitratsalz-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine Farbe von Hellbraun (4 ng, Lt Brown) bis Dunkelbraun (3 pn, Dk Brown). Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer blaßbraunen Farbtönung vorhanden.

2) Glucose-Asparagin-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine Farbe von Hellbraun (3 ie, Camel) bis Rötlichbraun (5 ui, Rosewood Brown). Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer blaß-pinkfarbenen Farbtönung vorhanden.

3) Glycerin-Asparagin-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 5 Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine Farbe von Bräunlich-Grau (gray 94 ni, Spice Brown) bis Dunkeloliv-Grau (1 po, Ebony) und sie weisen weiße sporadisch darauf aufgewachsene Lufthyphen auf. Es sind lösliche Pigmente mit einer blaß-pinkfarbenen Farbe vorhanden. Wenn eine 0,05 N NaOH zugegeben wird, ändern die Mikroorganismen und die löslichen Pigmente die Farbe, so daß sie eine grünliche Farbtönung haben. Wenn andererseits eine 0,05 N HCl zugegeben wird, tritt keine Farbänderung auf.

4) Stärke-anoranisches Salz-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 4, Kultivierung bei 27ºC):

Es wurden Mikroorganismen mit einer bräunlich-grauen (4 ni, Spice Brown) bis dunkelbraunen (4 pn, Dk Brown) Farbe beobachtet mit aufgewachsenen baumwollartigen weißen Lufthyphen. Es treten lösliche Pigmente mit einer blaßbaunen Farbe auf. Wenn eine 0,05 N NaOH zugegeben wird, ändern die Mikroorganismen und die löslichen Pigmente ihre Farbe, so daß sie eine grünliche Farbtönung haben. Wenn eine 0,05 N HCl zugegeben wird, tritt keine Farbänderung auf.

5) Tyrosin-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 7, Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine gräulich-braune (3 ni, Clove Brown) bis dunkelbraune (4 nl, Dk Brown) Farbe. Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer bräunlichen Farbtönung vorhanden.

6) Agar-Nährstoff-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine hellbraune (3 ng, Yellow Maple) bis gräulich-braune (3 ni, Clove Brown) Farbe. Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer braunen Farbtönung vorhanden.

7) Hefe-Malz-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 2, Kultivierung bei 27ºC):

Es wurden Mikroorganismen mit einer hellgelb-braunen (2 pg, Mustard Gold) bis hellbraunen (2 ni, Mustard Brown) Farbe beobachtet, mit aufgewachsenen baumwollartigen weißen Lufthyphen. Es sind keine löslichen Pigmente vorhanden.

8) Hafermehl-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 3, Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine hellrosa (5 ba, Shell Pink) bis hellgelb-braune (2 lg, Mustard Tan) Farbe mit einigen wenigen aufgewachsenen Lufthyphen mit einer hellgrauen Farbe (13 cb, Pearl Gray). Es sind keine löslichen Pigmente mit einer hell-pinkfarbenen Farbtönung vorhanden.

9) Glycerin-Nitratsalz-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine hellrosa Farbe (6 lg, Dk Redwood). Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer schwach-rosafarbenen Farbtönung vorhanden.

10) Stärke-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine hellbraune (3 ng, Yellow Maple) bis dunkelbraune (4 pn, Dk Brown) Farbe. Es wurde keine Anhaftung von Lufthyphen beobachtet. Es gibt lösliche Pigmente mit einer blaß-pinkfarbenen Farbtönung.

11) Calciummalat-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC):

Die Mikroorganismen haben eine hell-olivfarbene Farbe (1 le, Olive Yellow). Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind keine löslichen Pigmente vorhanden.

12) Cellulose-Kulturmedium (mit Filterpapier versetzte synthetische Lösung, Kultivierung bei 27ºC):

Es wurde kein Wachstum von Mikroorganismen beobachtet, wenn die Kultivierung drei Wochen lang durchgeführt wurde.

13) Gelatine-Kultivierung (einfaches Gelatinekulturmedium, 15 % Gelatine, Kultivierung bei 20ºC; und Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmedium, Kultivierung bei 24ºC):

Im Falle des einfachen Gelatine-Kulturmediums haben die Mikroorganismen eine hellbraune Farbe. Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer braunen Farbtönung vorhanden.
Im Falle des Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmediums haben die Mikroorganismen eine hellgelbe Farbe. Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer braunen Farbtönung vorhanden.

14) Magermilch-Kultur-Medium (Kultivierung bei 37ºC):

Die Mikroorganismen haben eine hellbraune Farbe. Es wurde kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet. Es sind lösliche Pigmente mit einer braunen Farbtönung vorhanden.

3. Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturen

Es wurde ein Test wie folgt durchgeführt: eine Kultivierung (Züchtung) wurde in einem Hefe-Stärke-Agar-Kulturmedium (1,0 % lösliche Stärke, 0,2 % Hefeextrakt und 3,0 % Agar, pH 7,0) bei einer Temperatur von 20ºC, 24ºC, 27ºC, 30ºC oder 50ºC durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 20ºC, 24ºC, 27ºC, 30ºC oder 37ºC wuchsen. Bei 20ºC wurde ein geringes Wachstum beobachtet. Bei 50ºC wurde kein Wachstum beobachtet. Es wird daher angenommen, daß eine Temperatur von etwa 27 bis 30ºC die optimale Wachstumstemperatur ist.

2) Verflüssigung eines Gelatine-Kulturmediums (eines 15 %igen einfachen Gelatine-Kulturmediums, Kultivierung bei 20ºC; oder eines Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmediums. Kultivierung bei 27ºC)

Im Falle des 15 %igen einfachen Gelatine-Kulturmediums wurde keine Verflüssigung beobachtet. Im Falle des Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmediums wurde eine geringe Verflüssigung nach 21 Tagen ab Beginn der Kultivierung beobachtet. Die Stärke der Verflüssigung ist eher gering.

3) Hydrolyse von Stärke (Stärke-anorganisches Salz-Agar- Kulturmedium oder Stärke-Agar-Kulturmedium, Kultivierung in jedem Falle bei 27ºC)

Sowohl in dem Stärke-anorganisches Salz-Agar-Kulturmedium als auch in dem Stärke-Agar-Kulturmedium wurde nach etwa 3 Tagen ab Beginn der Kultivierung eine Hydrolyse beobachtet. Die Hydrolyse war eine solche mittlerer Stärke.

4) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch (Magermilch, Kultivierung bei 37ºC)

Eine Peptonisierung begann nach etwa 6 Tagen und sie hört nach etwa 13 Tagen ab Beginn der Kultivierung auf. Diese Peptonisierung war eine solche von mittlerer oder relativ hoher Stärke. Es wurde keine Koagulation festgestellt.

5) Bildung von Melanin-artigen Pigmenten (Trypton-Hefe- Brühe-Kulturmedium, ISF-Kulturmedium 1; Pepton-Hefe- Fe-Agar-Kulturmedium, ISP-Kulturmedium 6; und Tyrosin-Agar-Kulturmedium, ISP-Kulturmedium 7; Kultivierung in allen Fällen bei 27ºC)

Die Testergebnisse sind positiv im Falle des Trypton-Hefe- Brühe-Kulturmediums (ISP-Kulturmediums 1) und des Pepton- Hefe-Fe-Agar-Kulturmediums (ISP-Kulturmedium 6). In dem Tyrosin-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 7) wurde eine sehr geringe Menge von Melanin-artigen Pigmenten gebildet.

6) Verwertung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gottlieb- Agar-Kulturmedium, ISP-Kulturmedium 9, Kultivierung bei 27ºC)

Die Mikroorganismen wachsen bei Verwendung von L-Arabinose, D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, Inosit und D-Mannit. Wahrscheinlich kann auch D-Xylose verwendet (verwertet) werden.
Andererseits können Rhamnose, Raffinose und Lactose nicht verwendet (verwertet) werden.

7) Auflösung von Calciummalat (Calciummalat-Agar-Kulturmedium, Kultivierung bei 27ºC)

Die Testergebnisse waren negativ.

8) Nitrat-reduzierende Reaktionen (wäßrige Pepton-Lösung, die 0,1 % Kaliumnitrat enthielt, ISP-Kulturmedium 8, Kultivierung bei 27ºC)

Die Testergebnisse waren positiv.

9) Zersetzung von Cellulose (synthetische Lösung, zu der Filterpapierstücke zugegeben wurden, Kultivierung bei 27 ºC)

Es wurde kein Wachstum der Mikroorganismen festgestellt.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Mikroorganismen des Stammes MI384-DF12 langgestreckte (längliche) Lufthyphen und spiralige Sporenketten sowie charakteristische Pseudosporangien aufweisen. Diese Sporenketten enthalten jeweils mindestens 20 Sporen und die Sporenoberfläche ist glatt. In einer Reihe von Kulturmedien haben die Mikroorganismen eine hellbraune bis dunkelbraune Farbe, obgleich in bestimmten Kulturmedien die Mikroorganismen pinkfarben sind.
Es gibt viele Fälle, in denen kein Anhaften von Lufthyphen beobachtet wird, obgleich in den ISP-Kulturmedien 2, 3, 4 und 5 Lufthyphen beobachtet wurden. Je nach den Kulturmedien haben die löslichen Pigmente entweder eine pinkfarbene oder eine braune Farbtönung. Die Bildung von Melaninartigen Pigmenten ist positiv, die Protein-Zersetzungswirkung ist von mittlerer Stärke und die Stärkehydrolyse ist eine solche eines mittleren Grades. Die Zellwände enthalten LL-2,6-Diaminopimelinsäure.
Im Hinblick auf die vorstehend angegebenen Testdaten ist zu berücksichtigen, daß die Mikroorganismen des Stammes MI384-DF12 zu den Streptomyces gehören. Aus Vorveröffentlichungen ist bekannt, daß es die beiden folgenden Arten von bekannten Mikroorganismen gibt, die Pseudosporangien aufweisen, die als eines der charakteristichen Merkmale des Stammes MI384-DF12 angesehen werden.

Streptomyces paradocus

"International Journal of Systematic Bacteriology", 36, 573-576 (1986); und "Systematic and Applied Microbiology", 8, 61-64 (1986), und

Streptomyces vitaminophillus

"International Journal of Systematic Bacteriology", 36, 573-576 (1986); und "Systematic and Applied Microbiology", 8, 61-64 (1986), und "International Journal of Systematic Bacteriology" 33, 557-564 (1983).
Streptomyces vitaminophillus unterscheidet sich von dem Stamm MI384-DF12 im Hinblick auf den Vitamin-Bedarf.
Unter Berücksichtigung der obengenannten Merkmale wurde der Stamm MI384-DF12 als Streptomyces sp. MI384-DF12 identifiziert.
Eine Probe des Stammes MI384-DF12 wurde bei dem Institute of Applied Microbiology, Tokyo, Japan, am 8. Februar 1990 unter der Hinterlegungsnummer 11270 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde am 18. Januar 1991 in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag mit der neuen Hinterlegungsnummer FERM BP-3228 umgewandelt.
Die Natur des Stammes MI384-DF12 ist im Falle anderer Streptomyces-Mikroorganismen leicht veränderbar. So gibt es beispielsweise natürliche oder künstlich induzierte Mutanten-Mikroorganismen, die von dem Stamm MI384-DF12 oder Homologen davon abgeleitet sind. Es ist möglich, in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Benastatinen alle Arten von Streptomyces-Mikroorganismen einschließlich derjenigen zu verwenden, die Transduktionen oder Gen-Rekombinationen unterworfen worden sind, soweit diese Mikroorganismen Benastatin bildende Mikroorganismen sind.
Erfindungsgemäß werden die obengenannten Mikroorganismen in einem Kulturmedium gezüchtet, das die für Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Hirse-Gelee, Dextrin, Saccharose, Stärke, Molassen, tierische und pflanzliche Öle und Fette und dgl. verwendet werden. Beispiele für Stickstoff enthaltende Nährstoffe sind Sojabohnenpulver, Keimknospen von Weizen, Maisquellwasser, Baumwollsamenkuchen, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Harnstoff und dgl. Als optimale(optionale)Nährstoffe ist es im allgemeinen bevorzugt, anorganische Salze zu verwenden, die Natrium-, Kobalt-, Chlorid-, Phosphat-, Sulfat-Ionen und dgl. bilden können. Es ist auch möglich, verschiedene organische und anorganische Substanzen zu verwenden, die das Wachstum der Mikroorganismen unterstützen können und die Bildung von Benastatinen fördern können, bei denen es sich um physiologisch aktive Substanzen handelt.
Für das Wachstum der Mikroorganismen ist es zweckmäßig, ein Kultivierungsverfahren, insbesondere ein Tiefkultivierungsverfahren, unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 37ºC, insbesondere bei einer Temperatur von etwa 26 bis 30ºC, durchgeführt. Die Bildung von Benastatinen, physiologisch aktiven Substanzen, kann von den Kulturmedien und den Kultivierungsbedingungen abhängen. Im Falle einer Schüttel- und Tankkultivierung kann es im allgemeinen so sein, daß die Menge der angereicherten Benastatine nach etwa 1 bis 10 Tagen ab Beginn der Kultivierung einen Maximalwert erreicht. Wenn die Menge an Benastatinen in der Kultur einen Maximalwert erreicht hat, dann wird die Kultivierung gestoppt und das Kulturmedium wird einer Reinigung unterzogen, um das gewünschte Produkt zu isolieren.
Wenn ein Benastatin enthaltendes, erfindungsgemäß hergestelltes Kulturmedium gereinigt wird, um das gewünschte Produkt zu erhalten, ist es möglich, eine Kombination von konventionellen Abtrennverfahren unter Berücksichtigung der Art des Kulturmediums anzuwenden. Die Benastatine A und B sind nicht nur in dem Filtrat des Kulturmediums, sondern auch in den Mikroorganismen-Körpern vorhanden. Das Filtrat kann einer Extraktionsbehandlung mit damit nichtmischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Ethylacetat und dgl., unterzogen werden. Der Mikroorganismen enthaltende Teil kann einer Extraktionsbehandlung unterworfen werden, die mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton und dgl., durchgeführt wird, wobei man einen Extrakt erhält, der dann unter vermindertem Druck eingeengt und danach einer weiteren Extraktion mit Lösungsmitteln auf ähnliche Weise wie sie bei der Extraktion des Filtrats angewendet worden ist, unterworfen wird. Es ist auch möglich, Benastatin A oder B in reiner Form nach irgendeinem der bekannten Verfahren zur Abtrennung von fettlöslichen Substanzen, beispielsweise durch Adsorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Dünnschichtchromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie und dgl. oder eine geeignete Kombination davon zu isolieren. Erforderlichenfalls können diese Arbeitsgänge wiederholt durchgeführt werden.
Pharmazeutisch akzeptable Salze von Benastatin A oder B können auf konventionelle Weise hergestellt werden. So kann beispielsweise Benastatin A oder B mit einer Lösung von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Calciumhydroxid oder dgl. behandelt werden zur Herstellung eines geeigneten Benastatinsalzes.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Inhibierung der Glutathion-Transferase, für die Immunmodifizierung und für die Kontrolle (Bekämpfung) von Mikroorganismen, die als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) Benastatin A oder B oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können ohne jede Beschränkungen beliebige konventionelle Träger verwendet werden.
Die Menge des aktiven Bestandteils (Wirkstoffes) in der Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit beispielsweise von der Dosierungsform der Zusammensetzung und sie kann im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,05 bis 99 % liegen. Bei einer Formulierung für die Injektion kann die Menge des aktiven Bestandteils (Wirkstoffes) in dem Bereich von etwa 0,1 bis 50 % liegen. Eine Formulierung für die Verabreichung auf einem anderen Wege als durch Injektion kann etwa 1 bis 60 % des aktiven Bestandteils (Wirkstoffes) enthalten. In den Formulierungen können die restlichen Komponenten konventionelle Träger sein.
Wie aus den nachstehend angegebenen Testdaten hervorgeht, weisen die Benastatine A und B eine signifikante Aktivität in bezug auf die Inhibierung von Glutathion-Transferasen auf, bei denen es sich um Enzyme handelt, die lokal auf Zellmembranen und auch in Cytoplasmen vorhanden sind. Außerdem weisen Benastatine eine Immunmodifizierungs-Aktivität und eine Aktivität als Antibiotika auf. Benastatine sind nicht toxisch. Deshalb sind die Benastatine A und B sehr geeignet als Glutathion-Transferase-Inhibitoren, als Immunmodifizierungsmittel und als Antibiotika. Die Benastatine A und B können in der Regel an Warmblüter einschließlich des Menschen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung einschließlich der intravenösen, hypodermalen und intramuskulären Verabreichung verabreicht werden zur Inhibierung der in dem Tierkörper vorhandenen Glutathion-Transferasen, zur Immunmodifizierung und zur Kontrolle (Bekämpfung) von Mikroorganismen.
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zur Inhibierung von Glutathion-Transferasen, zur Immunmodifizierung und zur Kontrolle(Bekämpfung) von Mikroorganismen, das umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von Benastatin A oder B oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an einen Warmblüter.
Benastatin A weist insbesondere eine ausgezeichnete Immunsuppressions-Aktivität auf und Benastatin B weist insbesondere eine ausgezeichnete Immunmpotenzierungsaktivität auf.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Immunsuppression, das umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von Benastatin A oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an einen Warmblüter.
Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Immunmpotenzierung, das umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge von Benastatin B oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an einen Warmblüter.
Die Dosis variiert in Abhängigkeit vom Zustand der Patienten, von der Art der Verabreichung und dgl. In der Regel beträgt die Dosis 0,05 bis 150 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,5 bis 100 mg/kg/Tag, insbesondere 1 bis 50 mg/kg/Tag.
Der erfindungsgemäße aktive Bestandteil (Wirkstoff) kann in Form von konventionellen Formulierungen verabreicht werden. Im Falle der oralen Verabreichung können Tabletten, Granulate, Kapseln und dgl. verwendet werden, die hergestellt worden sind unter Verwendung konventioneller Träger, wie z.B. bekannter Exzipienten, wie Dextrin und dgl. Im Falle der parenteralen Verabreichung können beispielsweise Formulierungen für Injektionen verwendet werden, die in der Regel hergestellt werden mit Adjuvantien einschließlich einer physiologischen Salzlösung, Solubilisierungsmitteln und dgl.
Wie oben erläutert, werden durch die Erfindung die Benastatine A und B zur Verfügung gestellt, die neue, physiologisch aktive Substanzen darstellen und die signifikante Aktivitäten in bezug auf die Inhibierung von Glutathion-Transferasen, die Immunmodifizierung und die Kontrolle (Bekämpfung) von Mikroorganismen aufweisen. Die Benastatine A und B sind daher sehr nützlich (geeignet) für die Inhibierung von Glutathion-Transferasen, für die Immunmodifizierung und für die Kontrolle (Bekämpfung) von Mikroorganismen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näehr erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von Benastatin A

Für die anfängliche Kultivierung wurde ein Kulturmedium verwendet, das 2,0 % Galactose, 2,0 % Dextrin, 1,0 % Bactosoyton (hergestellt von der Firma Difco Co., Ltd.), 0,5 % Maisquellwasser (hergestellt von der Firma Iwaki Co., Ltd.), 0,2 % Ammoniumnitrat, 0,2 % Calciumcarbonat und 0,05 % einer Mischung aus Silicone KM-70 (Warenzeichen) als Schaumbildner (hergestellt von der Firma Shin-etsu Kagaku co., Ltd.) und Sojabohnenöl (J.P.) (Mischungsverhältnis 1:1) enthielt. Das anfängliche Kulturmedium wurde vor der Sterilisierung auf pH 7 eingestellt.
110 ml des anfänglichen Kulturmediums wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingeführt und 20 min lang bei 120ºC sterilisiert. Das Kulturmedium wurde mit einer oder zwei Platinösenfüllungen von Streptomyces sp. MI384-DF12, die durch Schrägkultivierung gezüchtet worden waren, inokuliert. Es wurde 3 Tage lang bei 30ºC eine Schüttelkultivierung durchgeführt unter Verwendung eines Rotationsvibrators bei 180 UpM.
Für die anschließende Kultivierung wurde ein Kulturmedium verwendet, das 2,0 % Glycerin, 1,5 % "Esusanmito" (hergestellt von der Firma Ajinomoto Co., Ltd.), 0,1 % Dikaliumhydrogenphosphat und 0,0005 % Kobaltchloridhexahydrat enthielt. Nachdem das Kulturmedium mit 1 M Monokaliumphosphat auf pH 6,2 eingestellt worden war, wurden 110 ml des Kulturmediums in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingeführt und 20 min lang bei 120ºC sterilisiert. 2 ml des anfänglichen Kulturmediums wurden dem Kulturmedium zugesetzt und die Kultivierung wurde 4 Tage lang bei 27ºC in Art einer Schüttelkultivierung durchgeführt. Nach der Kultivierung wurden das resultierende Kulturmedium filtriert, um es in ein Kultivierungsfiltrat und in einen Mikroorganismen enthaltenden Teil aufzutrennen.
9,8 ml des obengenannten Kultivierungsfiltrats wurden mit 10 l Ethylacetat gemischt und dann ausreichend gerührt, um die gewünschte Komponente daraus zu extrahieren. Der resultierende Extrakt wurde eingeengt, wobei man 3,52 g eines Rohprodukts mit einer roten Farbe erhielt. Das Rohprodukt wurde in 20 ml Methanol gelöst, mit 20 g eines silanierten Siliciumdioxid-Gels ("Art. 7719", hergestellt von der Firma Merck Company) gemischt und dann zur Trockne eingeengt. Das trockene Produkt wurde in 40 %igem Methanol suspendiert und die resultierende Suspension wurde einer Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine mit einem silanierten Siliciumdioxid-Gel und 40 %igem Methanol gefüllte 400 ml-Säule verwendet wurde, und die gewünschte Komponente wurde abgetrennt durch Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 100 % Methanol. Die die gewünschte Komponente enthaltenden Fraktionen wurden zur Trocken eingeengt, wobei man 878,7 mg eines roten Produkts erhielt, das dann in 10 ml Methanol gelöst wurde. Die Methanollösung wurde mit 10 g eines Siliciumdioxid-Gels ("YMC-GEL ODS-A60-200/60", hergestellt von der Firma Yamamura Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.) gemischt und zur Trockne eingeengt. Das resultierende Produkt wurde in 40 %igem Methanol suspendiert und dann einer Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine mit "YMC-GEL" und 40 %igem Methanol gefüllte 200 ml-Säule verwendet wurde, und die gewünschte Komponente wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 100 % Methanol abgetrennt. Das so erhaltene Produkt wurde zur Trockne eingeengt, wobei man 329,2 mg eines braunen Pulvers erhielt, das dann in 10 ml Methanol gelöst wurde, danach wurde es mit 10 g Silicagel 60 ("Art. 7734", hergestellt von der Firma Merck Company) gemischt und zur Trockne eingeengt.
Das so erhaltene trockene Produkt wurde in einem Gemisch von Chloroform und Methanol (90:10) suspendiert und die resultierende Suspension wurde einer Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine mit Silicagel 60 und dem gleichen Lösungsmittelgemisch gefüllte 200 ml-Säule verwendet wurde, und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch gewaschen. Dann wurde die gewünschte Komponente abgetrennt unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (85:15) als Eluierungsmittel und zur Trockne eingeengt, wobei man 115,1 mg hochgereinigtes Benastatin A in Form eines gelben Pulvers erhielt. Die UV-Absorptions-Spektraldaten, die IR-Absorptions-Spektraldaten, die ¹H-NMR-Spektraldaten und die ¹³C-NMR-Spektraldaten des gereinigten Benastatins A sind in Fig. 1, 2, 3 bzw. 4 jeweils dargestellt.
In den Kultivierungsstufen und in den Reinigungsstufen erfolgte der Nachweis des Benastatin A durch Messung der Glutathion-Transferase-Inhibierungsaktivität. Diese Messung wurde unter Anwendung eines Verfahrens duchgeführt, das ähnlich demjenigen war, wie es für die Messung der lutathion-Transferase-Inhibierungsaktivität, wie in dem weiter unten beschriebenen pharmakologischen Test 1 angegeben, angewendet wurde.

Beispiel 2

Herstellung von Benastatin B

Die Schüttelkultivierung wurde wie im Falle des Beispiels 1 durchgeführt. Nach der Kultivierung wurde das resultierende Kultivierungsmedium filtriert, um es in ein Kultivierungsfiltrat und in einen den Mikroorganismus enthaltenden Teil aufzutrennen. 30 l des Kultivierungsfiltrats wurde mit 30 l Ethylacetat gemischt und ausreichend gerührt, um die gewünschte Komponente zu extrahieren, die dann eingeengt wurde, wobei man 12,32 g eines Rohprodukts mit einer roten Farbe erhielt.
Das so erhaltene rote Rohprodukt wurde in 40 ml Methanol gelöst, dann mit 40 g eines silanierten Siliciumdioxidgels ("Art. 7719", hergestellt von der Firma Merck Company) gemischt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Das resultierende trockene Produkt wurde in 40 %igem Methanol suspendiert und die so erhaltene Suspension wurde einer Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine mit einem silanierten Siliciumdioxid-Gel und 40 %igem Methanol gefüllte 500 ml-Säule verwendet wurde, und die gewünschte Komponente wurde abgetrennt unter Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 100 % Methanol und zur Trockne eingeengt, wobei man 6,36 g eines Produkts mit einer roten Farbe erhielt.
Das so erhaltene rote Produkt wurde in 20 ml Methanol gelöst, mit 20 g Silicagel ("YMC-GEL ODS-A60-200/60", hergestellt von der Firma Yamamura Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.) gemischt und dann zur Trockne eingeengt. Das resultierende trockene Produkt wurde in 40 %igem Methanol suspendiert und einer Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine mit "YMC-GEL" und 40 %igem Methanol gefüllte 500 ml-Säule verwendet wurde. Die gewünschte Komponente wurde abgetrennt durch Verwendung eines linearen Gradienten von 40 bis 100 % Methanol und zur Trockne eingeengt, wobei man 3,29 g eines braunen pulverförmigen Produkts erhielt.
Das braune Produkt wurde in 20 ml Methanol gelöst, mit 20 g Silicagel 60 ("Art. 7734", hergestellt von der Firma Merck Company) gemischt und dann zur Trockne eingeengt. Das resultierende trockene Produkt wurde in Chloroform suspendiert, einer Säulenchromatographie unterworfen, wobei eine mit Silicagel 60 und Chloroform gefüllte 400 ml- Säule verwendet wurde, und mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen. Die gewünschte Komponente wurde mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (95:5) abgetrennt und dann zur Trockne eingeengt, wobei man 1,35 g eines gelben pulverförmigen Produkts erhielt.
Das gelbe pulverförmige Produkt wurde einer Hochleistungs- Flüssigchromatographie unterworfen, wobei eine HPL-Säule (Capcell Pak C&sub1;&sub8;, 20 φ x 250 mm, hergestellt von der Firma Shiseido Co., Ltd.; Durchf lußrate 8 ml/min) verwendet wurde, die vorher mit 78 %igem Acetonitril, das 1 % Essigsäure enthielt, äquilibriert worden war. Das Eluieren wurde durchgeführt unter Verwendung der obengenannten Äquilibrierungsflüssigkeit, wobei man eine aktive Fraktion erhielt, die dann zur Trockne eingeengt wurde, wobei man 92,7 mg hochgereinigtes Benastatin B in Form eines gelben Pulvers erhielt. Die UV-Absorptions-Spektraldaten, die IR- Absorptions-Spektraldaten, die ¹H-NMR-Spektraldaten und die ¹³C-NMR-Spektraldaten des reinen Benastatins B sind in den jeweiligen Figuren 5, 6, 7 und 8 angegeben.
Der Nachweis des Benastatins B in den Kultivierungs- und Reinigungsstufen erfolgte wie im Falle des Beispiels 1.

Beispiel 3

Herstellung von Benastatin-Tabellen

30 Gew.-Teile Benastatin A oder B, 120 Gew.-Teile kristalline Lactose, 147 Gew.-Teile kristalline Cellulose und 3 Gew.-Teile Magnesiumstearat wurden in einem V-förmigen Mixer miteinander gemischt und die resultierende Mischung wurde zu Tabletten geformt, von denen jede 300 mg Benastatin A oder B enthielt.
Die nachstehend angegebenen pharmakologischen Testdaten sollen zeigen, daß die Benastatine A und B eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Glutathion-Transferasen, in bezug auf die Immunmodifizierung und in bezug auf die Bekämpfung von Mikroorganismen aufweisen und nicht toxisch sind.

Pharmakologischer Test 1

Glutathion-Transferase-Inhibierungsaktivität der Benastatine A und B

Die Glutathion-Transferase-Inhibierungsaktivität wurde bestimmt unter Anwendung eines modifizierten Verfahrens auf der Basis des bekannten Verfahrens, wie es in "Biochemical and Biophysical Research Communications", 112, 980-985 (1983), beschrieben ist.
Ein Teströhrchen wurde mit einem Lösungsgemisch beschickt, das bestand aus (a) 0,1 ml 90 mM Glutathion (Reduktions- Typ), (b) 0,05 ml 20 mM 3,4-Dichloronitrobenzol, (c) 1,7 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,4) und (d) 0,1 ml einer die Testverbindung enthaltenden wäßrigen Lösung. Das Lösungsgemisch wurde 3 min lang auf 37ºC erhitzt und mit 0,05 ml einer Glutathion-Transferase-Lösung gemischt, um eine 30-minütige Reaktion bei 37ºC herbeizuführen. Die verwendete Glutathion-Transferase-Lösung war eine solche, die aus einem Rattenleberhomogenat erhalten worden war und mittels einer DEAE-Cellulose-Säule und durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat teilweise gereinigt worden war.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lichtabsorption (a) der Produkt bei 345 nm bestimmt. Gleichzeitig wurde bei einer Vergleichsprobe, die frei von der Testverbindung war und nur die Pufferlösung enthielt, die Lichtabsorption (b) bei 345 nm bestimmt.
Die Glutathion-Transferase-Inhibierungsaktivität wurde nach der folgenden Formel ermittelt:
[(b - a)/b] x 100
Die IC&sub5;&sub0;, bei der es sich um die Konzentration einer Testverbindung handelt, die für eine 50 %ige Inhibierung erforderlich war, wurde aufgezeichnet. Bei dieser Bestimmungsmethode wurde gefunden, daß die IC&sub5;&sub0; von gereinigtem Benastatin A 2,50 µg/ml beträgt, während die IC&sub5;&sub0; von Benastatin B 0,92 µg/ml beträgt.

Pharmakologischer Test 2

Immunsuppressions-Aktivität von Benastatin A

Es wurde ein pharmakologischer Test durchgeführt in bezug auf die Suppressionsaktivität der Benastatine gegenüber der Lymphozyten-Blastzellen-Bildungsreaktion.
In diesem Test wurde ein RPMI 1640-Kulturmedium verwendet, das ergänzt worden war durch 20 % Rinder-Fetal-Serum, 25 mM Hepes-Puffer, 100 µg/ml Streptomycin und 100 Einheiten/ml Penicillin G. Die Kultivierung wurde durchgeführt unter Verwendung einer Mikroplatte (COSTAR) mit einem ebenen Boden und mit 96 Vertiefungen. Als Mitogene wurden Lipopolysaccharid (LPS) und Concanavalin A (Con A) in Konzentrationen von 100 bzw. 5 µg/ml verwendet.
Nachdem Milzzellen einer BALB/c-maus (weiblich, 25 Wochen alt) entnommen worden waren, wurde eine unizelluläre Suspension der Milzzellen hergestellt und dann einer Hyperschockbehandlung unterworfen, um die Erythrozyten daraus zu entfernen.
Jede Vertiefung wurde beschickt mit 0,2 ml einer Probe, die 2 x 10&sup5; Milzzellen und die Testverbindung in einer vorgegebenen Konzentration enthielt. Die Kultivierung wurde 72 h lang durchgeführt. 8 h vor Beendigung der Kultivierung wurde ferner jede Vertiefung mit 37 KBq [³H]- Thymidin versetzt, um die von den Zellen aufgenommene Thymidin-Menge zu bestimmen.
Der Effekt der Testverbindung wurde ermittelt durch Vergleich der die Testverbindung enthaltenden Probe mit der Kontrollprobe in bezug auf die Menge des von den Zellen aufgenommenen [³H]-Thymidins ("Men-eki Jikken Sousa-ho (Guidebook of Immunological Experiments)", herausgegeben von der Japanese Immunological Society, S. 2267-2276).
Sowohl bei den mit LPS versetzten Proben als auch bei den mit Con A versetzten Proben wurde festgestellt, daß das Benastatin A eine Suppressionsaktivität auf die Lymphozyten-Blastzellen-Bildungsreaktion ausübte, während die Stärke der Aktivität variierte in Abhängigkeit von der Konzentration der Benastatine. Die Aktivität wurde aufgezeichnet als IC&sub5;&sub0;, bei der es sich um die Konzentration der Benastatine handelt, die für eine 50 %ige Suppression erforderlich war, d.h. die zu einer 50 %igen Abnahme der Menge an von den Zellen aufgenommenem [³H]-Thymidin führt. Die IC&sub5;&sub0; von Benastatin A im Falle von LPS betrug 7,7 µg/ml und die IC&sub5;&sub0; im Falle von Can A betrug 7,3 µg/ml.

Pharmakologischer Test 3

Aktivität der Benastatine A und B als Antibiotika

Das Minimum der Mikroorganismenwachstums - Inhibierungskonzentrationen der Benastatine A und B wurde für verschiedene Bakterien, Hefen und Fungi unter Anwendung eines konventionellen Agar-Verdünnungs-Assayverfahrens bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Aus der Tabelle 1 ist zu ersehen, daß die Benastatine A und B eine zufriedenstellende antimikrobielle Aktivität, insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien und dgl., aufweisen. Mikroorganismus Minimale Wachstumsinhibierungskonzentration (mg/ml) Staphylococcus aureus Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus cereus Corynebacterium bovis Escheria coli Shigella dysenteriae Salmonella typhi Proteus rettgeri Pseudomonas aeroginosa Klebsiella pneumoniae Mycobacterium smegmatis Candida tropicalis Saccharomyces cerevisiae Cryptococcus neoformans Cochliobolus miyabeanus Pyricularia oryzae Aspergillus niger *MRSA: Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus

Pharmakologischer Test 4

Immodifizierungs-Aktivität von Benastatin B

1) Testverbindung

In der Lymphozyten-Blastzellen-Bildungs-Reaktion wurde Benastatin B in Form einer Lösung verwendet, die in der Weise hergestellt wurde, daß Benastatin B in Methanol gelöst und mit PBS(-) gemischt wurde, mit der Maßgabe, daß die Methanolkonzentration in der fertigen Lösung 0,5 % betrug.
In der Transplantat-versus-Wirt-Reaktion (GvH) wurde Benastatin B verwendet, das in einer physiologischen Salzlösung gelöst war.

2) Verfahren

a) Effekt auf die Lymphozyten-Blastzellen-Bildungsreaktion

Für die Kultivierung wurde ein RPMI 1640-Kulturmedium verwendet, das ergänzt worden war durch 20 % Rinder-Fetus-Serum, 25 mM Hepes-Puffer, 100 µg/ml Stretpomycin und 100 Einheiten/ml Penicillin G. Die Kultivierung wurde in einer Mikroplatte (COSTAR) mit einem ebenen Boden und mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Als Mitogene wurden Lipopolysaccharid (LPS) und Concanavalin A (Con A) in den Endkonzentrtionen von 100 µg/ml bzw. 5 µg/ml verwendet.
Aus einer BALB/c-Maus (weiblich, höchstens 20 Wochen alt) wurden Milzzellen entnommen zur Herstellung einer unizellulären Milzzellendispersion. Diese Dispersion wurde einer Hyperschockbehandlung unterworfen, um die Erythrozyten daraus zu entfernen. Die resultierende Milzzellenprobe wurde direkt in dem Test, in dem LPS verwendet wurde, verwendet. Alternativ wurde die Milzzellenprobe durch eine Nylon-Faser (hergestellt von der Firma Wako Jun-yaku Co., Ltd.) filtriert, um die T-Zellen daraus zu entfernen, und dann wurde die Zellenprobe in dem Test verwendet, in dem Con A verwendet wurde.
Jede Vertiefung wurde mit 0,2 ml einer Testprobe beschickt, die 2 x 10&sup5; Maus-Milzzellen und die Testverbindung in einer vorgegebenen Konzentration enthielt. Die Kultivierung wurde 72 h lang durchgeführt. 8 h vor Beendigung der Kultivierung wurden die Vertiefungen jeweils mit 37 KBq [³H]-Thymidin versetzt, um die Menge des von den Zellen aufgenommenen Thymidins zu bestimmen. Der Effekt der Testverbindung wurde ermittelt durch Vergleich der Testproben mit den Kontrollproben in bezug auf die Menge des von den Zellen aufgenommenen [³H]-Thymidins.

b) Effekt auf die Transtlantat-versus-Wirt-Reaktion (GvH)

Der Effekt auf die GvH wurde ermittelt nach einem modifizierten Verfahren auf der Basis des von N. Simonsen et al. in "A study of the graft versus host reaction in transplantation to embryos, F1 hybrids, and irradiated animals" in "Ann. N.Y. Acad. Sci." 73 834-841 (1978), beschriebenen Verfahrens.
Es wurden Milzzellen aus einer C57BL/6-Maus (weiblich, 10 Wochen alt) entnommen zur Herstellung einer Milzzellenprobe, die 5 x 10&sup6; Milzzellen enthielt, nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren. Die Milzzellenprobe wurde in den Abdominal-Hohlraum einer BDF1-Maus (7 Tage alt) als F1-Akzeptor transplantiert. Die Testverbindung wurde in einer vorgegebenen Konzentration über einen Zeitraum von 3 Tagen einschließlich des Tags der Transplantation subkutan injiziert. Nach 7 Tagen ab der Transplantation wurden Messungen in bezug auf das Körpergewicht und das Milzgewicht der BDF1-Maus durchgeführt, um das Verhältnis (mg/g) zwischen dem Milzgewicht (mg) und der Körpergewicht (g) zu errechnen.

3) Ergebnisse

In der Tabelle 2 sind die Testdaten angegeben, die sich auf den Effekt des Benastatins B auf die Lymphozytenlastzellen-Bildungsreaktion beziehen. Aus der Tabelle 2 ist zu ersehen, daß Benastatin B, wenn es in einer niedrdigen Konzentration verwendet wird, die durch LPS induzierte Lymphozyten-Blastzellen-Bildungsreaktion potenziert, obgleich das Benastatin B, wenn es in einer höheren Konzentration von mindestens 12,5 µg/ml verwendet wird, diese Reaktion signifikant unterdrückt.
Im Falle der durch Con A induzierten Lymphozyten-Blastzellen-Bildungsreaktion wurde festgestellt, daß das Benastatin B, wenn es in einer Konzentration von mindestens 6,25 µg/ml verwendet wird, diese Reaktion signifikant unterdrückt.
Die Tabelle 3 enthält die Testdaten, die sich auf den Effekt von Benastatin B auf GvH beziehen. Es wurde festgestellt, daß Benastatin B, wenn es in variierenden Mengen verwendet wird, die GvH signifikant fördert, während Benastatin B, wenn es in einer geringeren Menge verwendet wird, diese Reaktion stark potenziert. Tabelle 2 Effekt von Benastatin B auf die durch LPS oder Con A induzierte Maus-Lymphozyten-Blastogenese in vitro Stimulierungsindex (%) Probe Konzentration (µg/ml) Kontrolle Benastatin B * p < 0.05 vs Kontrolle Tabelle 3 Effekt von Benastatin B auf die GvH in vivo Probe Dosis (mg/kg) Anzahl der Mäuse Milz/Körpergewicht (mg/kg) Index nicht-induziert induziert Benastatin B * p < 0.05 vs Kontrolle

Pharmakologischer Test 5

Toxizität der Benastatine A und B

Die Benastatine A und B wurden jeweils in den Abdominal- Hohlraum einer Maus verabreicht, um ihre Toxizität zu überprüfen. Es wurde auch dann keine Toxizität festgestellt, wenn die Benastatlne A und B jeweils in einer großen Menge von 100 mg/kg verabreicht wurden.

Claims

1. Benastatine A und B, die physiologisch aktive Substanzen darstellen und die Formel (I) haben

worin R steht für -CH&sub2;-CH&sub2;- oder -CH=CH- oder pharmazeutisch akzeptable Salz davon.

2. Verfahren zur Herstellung von Benastatin A oder B, das die folgenden Stufen umfaßt:

Kultivieren (Züchten) von Benastatin-bildenden Bakterien, die zu den Streptomyces gehören, und

Abtrennen des auf diese Weise gebildeten Benastatins A oder B von dem Kulturmedium.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung für die Glutathionransferase-Inhibierung, für die Immunmodifizierung oder für die Kontrolle(Bekämpfung) von Mikroorganismen, die Benastatin A oder B oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.

4. Benastatine A und B für die Verwendung als Medikament.

5. Benastatine A und B für die Verwendung als Antimikroben-Agens.

6. Benastatine A und B für die Verwendung als immunsuppressives Agens.

7. Benastatine A und B für die Verwendung als Immunpotentiator.

8. Benastatine A und B für die Verwendung als Glutathion-Transferase-Inhibitor.

9. Benastatine A und B für die Verwendung als Immunmodifikator.

10. Verwendung der Benastatine A und B zur Herstellung eines Medikaments für die Immunmodifizierung.

11. Verwendung der Benastatine A und B zur Herstellung eines Medikaments für die Immunsuppression.

12. Verwendung der Benastatine A und B zur Herstellung eines Medikaments für die Immunpotenzierung.

13. Verwendung der Benastatine A und B zur Herstellung eines Medikaments für die Kontrolle(Bekämpfung) von Mikroorganismen.

14. Verwendung der Benastatine A und B zur Herstellung eines Medikaments für die Inhibierung der Glutathion- Transferase.