DE69735099T2

DE69735099T2 - Antibiotika rk-1061 und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69735099T2
Application number: DE69735099T
Authority: DE
Inventors: Ken-ichi Utsunomiya-shi KIMURA; Yoshikazu Shimotsuga-gun IKEDA; Matsubara mansion 2A Shinobu Shimotsuga-gun KAGAMI; Hidetoshi Kawachi-gun TAKAHASHI; Kousaku Utsunomiya-shi TAKAHASHI; Makoto Utsunomiya-shi YOSHIHAMA; Makoto Imizu-gun UBUKATA; Kiyoshi Oomiya-shi ISONO
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-04-26
Also published as: WO1997041248A1; EP1001035B9; EP1001035A4; US6455694B1; EP1001035B1; CA2252483A1; US6844183B2; US20030050471A1; AU2408197A; EP1001035A1; DE69735099D1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Antibiotika RK-1061s mit der Bezeichnung Liposidomycine und pharmakologisch akzeptable Salze davon sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Stand der Technik
Bei der Entwicklung eines hochspezifischen antibakteriellen Mittels mit wenig Nebenwirkungen ist ein Mittel erwünscht, das einen spezifischen Ort targetieren kann, der in bakteriellen Prokaryoten, aber nicht in humanen Eukaryoten vorliegt. Ein solcher spezifischer Ort ist z.B. Peptidoglycan, eine der bakteriellen Zellwandkomponenten, und bekannte, auf dem Markt befindliche Antibiotika, die auf Peptidoglycan wirken, sind Penicilline, Cepheme, Carbapeneme, Monobactame, Cycloserin, Bacitracin, Vancomycin und Phosphomycin.
Offenbarung der Erfindung
Es ist allgemein bekannt, dass jedes gute Antibiotikum bei längerem Gebrauch resistente Bakterien hervorruft. Darüber hinaus haben einige Antibiotika Nebenwirkungen wie Neuropathie, Nephropathie und/oder Hepatophatie. In dem Arbeitsbereich beschäftigte man sich kürzlich mit MRSA(Methicillin-resistentes Staphylococcus aureus)-Infektionen in Krankenhäusern und Helicobacter pylori, das vermutlich eine ursächliche Rolle bei Magengeschwüren und/oder Magenkrebss spielt. Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines Antibiotikums mit einer neuartigen Struktur und einem neuartigen Wirkungsmechanismus erwünscht. Antibiotische Liposidomycine (RK-1061s) wurden durch die Verwendung eines Screening-Systems zur Inhibition der Peptidoglycansynthese gefunden. Dieses Antibiotikum inhibiert im Speziellen Phospho-N-acetylmuramyl-pentapeptid-transferase (E.C.2.7.8.13) (Phospho-MurNAc-pentapeptid-translocase, UDP-MurNAc-pentapeptid-phosphotransferase, (Trivialname) Translocase I) (Agri. Biol. Chem., 53(7), 1811–1815 (1989)) und ist strukturell als Fettsäureacylnucleosid-Antibiotikum mit Sulfatgruppe und einmaliger Aminozuckergruppe gekennzeichnet. Obwohl Tunicamycin („Tunicamycin", Japan Scientific Societies Press, 1982, Tokyo) und Mureidomycin (J. Antibiot., 42, 662–679 (1989)) gemäß den obigen Quellen bekanntlich die gleiche Wirkung wie Liposidomycine haben, so haben Liposidomycine ein antibakterielles Spektrum, das sich von dem der anderen beiden Antibiotika unterscheidet, sowie eine starke Inhibitionswirkung auf die Peptidoglycansynthese. Folglich kann Liposidomycin theoretisch gegen alle Bakterien mit Peptidoglycan wirksam sein, sofern es keine Probleme mit der Durchlässigkeit oder Stabilität gibt.
Liposidomycine haben eine starke antibakterielle Wirkung vor allem auf Mycobacterium, das zu den säurefesten Bakterien gehört (J. Antibiot., 38, 1617–1621 (1985)), und sind voraussichtlich gegen Mycobacterium tuberculosis wirksam, das gegen bekannte tuberkulosehemmende Mittel wie Rifanpicin usw. resistent ist und gegen das kein anderes Mittel wirkt. Ferner werden opportunistische Infektionskrankheiten wie Pneumocystis carinii zu einem großen Problem aufgrund der explosionsartigen Zunahme der Anzahl von Patienten mit AIDS, und man rechnet damit, dass Liposidomycine gegen das adventive säurefeste Bakterium Mycobacterium-avium-Komplex (MAC) wirksam ist, das die oben genannte opportunistische Infektionskrankheit hervorruft.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung produzierten im Rahmen von Untersuchungen hohe Ausbeuten von RK-1061s, bei denen es sich um Antibiotika handelt, die aus vielen Komponenten bestehen, isolierten neuartige Verbindungen daraus und fanden neuartige Substanzen, die sich von RK-1061A (Liposidomycine A), RK-1061B (Liposidomycine B), RK-1061C (Liposidomycine C) (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 282088/1986), RK-1061G (Liposidomycine G), RK-1061H (Liposidomycine H) (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 306992/1990), über die bereits berichtet wurde, unterschieden. Zwar können alle Substanzen, über die berichtet wurde, in die nachfolgend beschriebene allgemeine Formel (II) eingeordnet werden, doch sind Liposidomycine Verbindungen mit einer Struktur mit einer Gruppe an der R₁-Gruppe der Formel (II) und können in drei verschiedene Typen unterteilt werden, die zur Struktur (III), (IV) und (V) gehören. Ferner wiesen die mit der vorliegenden Erfindung erhaltenen neuartigen antibiotischen Liposidomycine (RK-1061s) eine wesentlich höhere antibakterielle Wirkung als die anderen Verbindungen auf. Somit wurde die vorliegende Erfindung erreicht.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige antibiotische Liposidomycine (RK-1061s), hochproduktive Zelllinien davon und Verfahren für ihre Herstellung bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Liposidomycine (RK-1061s), die durch die folgende allgemeine Formel (I) repräsentiert werden, oder pharmakologisch akzeptable Salze davon, zur Verwendung als Antibiotikum.
In der Formel repräsentiert A R₁ oder R₁CH (OR₂) CH₂-, R₂ repräsentiert den 3-Methylglutarsäurerest (-CO-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-COOH) und R₃ repräsentiert ein Wasserstoffatom.
Wenn A R₁CH (OR₂) CH₂- ist, dann ist R₁ C_nH_2n-1- (n ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 20), C_nH_2n-1- (n ist eine ganze Zahl zwischen 2 und 21) oder C_nH_2n-3- in ist eine ganze Zahl zwischen 3 und 22).
Wenn A R₁ ist, dann ist R₁ C_nH_2n-1- in ist eine ganze Zahl zwischen 2 und 22), C_nH_2ny- (n ist eine ganze Zahl zwischen 3 und 22) oder C_nH_2n-5- (n ist eine ganze Zahl zwischen 4 und 23).
Andere Liposidomycine sind durch die folgenden Formeln (II)–(V) repräsentiert:

R₁ repräsentiert das gleiche wie oben beschrieben.
Gemäß der Art der substituierten Gruppe A und R₃ können Liposidomycine RK-1061s in die folgenden Typen unterteilt werden. Das heißt, sie können in 2 Typen eingeteilt werden:
ein Typ, bei dem A R₁CH (OR₂) CH₂ ist (wobei R₂ ein 3-Methylglutarsäurerst ist), und ein anderer Typ, bei dem A R₁ ist (wobei R₂ nicht vorhanden ist, R₁ sich direkt an die Position 2a bindet). Sie können auch so eingestuft werden, dass R₃ eine Sulfatgruppe und ein Wasserstoffatom ist.
Pharmakologisch akzeptable Salze der RK-1061s der vorliegenden Erfindung sind z.B. Hydrochlorid, Sulfat, alkalisches Metallsalz wie Natrium oder Kalium usw., Erdalkalimetallsalz wie Magnesium oder Calcium usw., andere Metallsalze wie Aluminium usw. und organische Aminsalze wie Alkylaminsalz oder Pyridiniumsalz.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Liposidomycinen (RK-1061s), die durch die obige Formel repräsentiert sind.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Liposidomycinen (RK-1061s), das die folgenden Schritte umfasst:

1) Kultivieren eines Mikroorganismus, der zu Streptomyces gehört und die zuvor genannten Liposidomycine (RK-1061s) in Kulturmedium produzieren kann;
2) Produzieren der genannten Liposidomycine (RK-1061s); und
3) Aufnehmen der genannten Liposidomycine (RK-1061s) von den kultivierten Produkten.

Diese erfindungsgemäßen Verbindungen können durch die Nutzung der Differenz bei der Retentionszeit der jeweiligen Verbindungen durch HPLC usw. isoliert werden.
Darüber hinaus können diese Verbindungen wie Liposidomycine (RK-1061), deren R₃ ein Wasserstoffatom ist, selektiv hergestellt werden, indem eine Kohlenstoffquelle für das Kulturmedium ausgewählt wird. Liposidomycine (RK-1061s), bei denen R₃ ein Wasserstoffatom ist, können z.B. in großen Mengen produziert werden, indem wenigstens eine Kohlenstoffquelle, die aus der Gruppe bestehend aus Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose, Inositol und D-Mannitol ausgewählt wird, und Weizenkeim oder Malzextrakt als Stickstoffquelle verwendet wird.
Ein Aktinomycet, der Liposidomycine (RK-1061s) der vorliegenden Erfindung produziert, ist zum Beispiel das Bodenbakterium Streptomyces sp. RK-1061 (nachfolgend als RK-1061 Zelllinie bezeichnet), das von den Autoren der vorliegenden Erfindung in Erde bei Misaka-cho in der Präfektur Yamanashi gefunden wurde. Diese Zelllinie wurde beim National Institute of Bioscience, bei der Human Technology Agency of Industrial Science und beim Technology Ministry of International Trade and Industry mit der Hinterlegungs-Nr. FERM P-8278 hinterlegt. Eine diese FERM P-8278 Zelllinie beanspruchende Patentanmeldung wurde am B. Februar 1995 unter der Patentnummer JP1902732 bereits registriert, so dass diese Zelllinie der Öffentlichkeit über angemessene Verfahrensabläufe zur Verfügung steht.
Darüber hinaus ist die künstlich mutierte Streptomyces sp. SN-1061M (nachfolgend als SN-1061M Zelllinie bezeichnet) zu nennen, die durch UV-Bestrahlung der RK-1061 Zelllinie hergestellt wurde, um ihre geringe Produktivität und Uneignung zu verbessern. Diese Zelllinie wurde beim National Institute of Bioscience, bei der Human Technology Agency of Industrial Science und beim Technology Ministry of International Trade and Industry mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5800 hinterlegt.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum (KBR) von Liposidomycinen Z-(III).
2 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen Z, wobei x Peaks ohne Beziehung zu Liposidomycinen Z repräsentiert.
3 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen L, wobei x Peaks ohne Beziehung zu Liposidomycinen L repräsentiert.
4 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen M.
5 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen K.
6 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen N.
7 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen A-(II), wobei x Peaks ohne Beziehung zu Liposidomycinen A-(II) repräsentiert.
8 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen X-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
9 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen Y-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
10 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen Z-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
11 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen C-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
12 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen V-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
13 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen A-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
14 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen G-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
15 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen M-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
16 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen K-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
17 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen N-(III), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
18 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD₃OD) von Liposidomycinen A-(IV), wobei x Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
19 zeigt die DC von Liposidomycinen (RK-1061s) aus dem 2., 3. und 4 Beispiel. Kohlenstoffquelle des Kulturmediums: A: Maltose, B: Xylose, C: Lactose, D: D-Fructose, E: Saccharose, F: Inositol, G: L-Rhamnose, H: L-Arabinose, I: D-Mannitol, J: Raffinose, K: Salicin, L: L-Sorbose, M: D-Glucosamin.
20 zeigt die HPLC von Liposidomycinen (RK-1061s) aus dem 2. Beispiel.
21 zeigt die HPLC von Liposidomycinen (RK-1061s) aus dem 4. Beispiel.
Beste Art der Umsetzung der bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung
[In der Erfindung verwendete Mikroorganismen]
Zunächst werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen beschrieben. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen gehören zu Streptomyces sp. und Aktinomyceten, die die zuvor genannten Liposidomycine (RK-1061s) der vorliegenden Erfindung produzieren. Als ein Beispiel ist die zuvor erwähnte RK-1061 Zelllinie zu nennen. Dieser Mikroorganismus hat die obigen Merkmale, kann erfindungsgemäße antibiotische Liposidomycine produzieren und kann effektiv in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Es können nicht nur native und künstlich mutierte Zelllinien des obigen RK-1061, sondern jegliche Bakterien, die zu Streptomyces sp. gehören und antibiotische Liposidomycine produzieren, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vor allem die SN-1061M Zelllinie, die durch UV-Bestrahlung der RK-1061 Zelllinie mutiert wurde, um die Produktivität von Liposidomycinen zu verbessern, ist ein besonders nützlicher Mikroorganismus. Die zuvor genannten RK-1061s wurden mit einem gängigen Verfahren zur Isolierung von Bodenbakterien aus Erde bei Misaka-cho in der Präfektur Yamanashi gewonnen. Die mikrobiellen Eigenschaften dieser bakteriellen Zelllinie werden im Folgenden beschrieben. Ihre mikrobiellen Eigenschaften wurden bereits in der Publikation der ungeprüften japanischen Patentanmeldungen Nr. 282088/1986 und 306992/1990 beschrieben und sind der Öffentlichkeit bekannt.
1) Morphologische Eigenschaften
Die RK-1061 Zelllinie gehört zu Aktinomyceten, die aus Erde isoliert wurden, die bei Misaka-cho in der Präfektur Yamanashi gesammelt wurde. Nur LL-Diaminopimelinsäure wurde in Chlorwasserstoffsäurehydrolysat der ganzen Zelle nachgewiesen, meso-Diaminopimelinsäure wurde darin nicht nachgewiesen. Das Ergebnis von Wachstumstests in verschiedenen Agar-Kulturmedien war, dass sie in allen zehn Kulturmedienarten wuchs. Sie wies ein gutes Wachstum auf, und der Einbau von Lufthyphen und Sporen war nur im Stärke-Hefeextrakt-Agar-Kulturmedium verbreitet, wohingegen in anderen Agar-Kulturmedien der Einbau von Lufthyphen und Sporen nicht gut war. In einem Verbrauchstest mit 11 Saccharidarten als Kohlenstoffquelle verbrauchte die RK1061 Zelllinie alle Saccharide und wuchs. Die Lufthyphen der erfindungsgemäßen Zelllinie waren gräulich und ihre Rückseite war hellbräunlich, was nichts Besonderes ist. Beim Wachstum in entfetteter Milch erfolgte zuerst eine Aggregation, eine Peptonisierung erfolgte später, so dass eine hellbraune, transparente Lösung erhalten wurde. Sie hydrolysierte Stärke, aber nicht Gelatine. In der Kultur mit Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium und Tyrosin-Agar-Kulturmedium wurde die Produktion von Melaninpigment beobachtet, allerdings war die Farbe von löslichem Pigment hellbraun oder grau und es kam zu keiner speziellen Pigmentproduktion. Gemäß Beobachtungen mit einem Elektronenmikroskop waren die Lufthyphen davon rektiflexibel. Drei bis fünf Rollen dichter, spiralförmiger Hyphen wurden in Hafermehl/Nitrat-Agar-Kulturmedium beobachtet, wohingegen in Kartoffelextrakt/Hefeextrakt/Nitrat-Agar-Kulturmedium offene, spiralförmige Hyphen beobachtet wurden. In Hefeextrakt-Agar-Kulturmedium oder Malzextrakt-Agar-Kulturmedium wurden hingegen keine spiralförmigen Hyphen beobachtet. Sporen dieses Bakteriums waren in Linien an den Enden der Hyphen ausgebildet und spiralförmige Hyphen waren sporuliert. Die Oberfläche der Sporen war glatt aber zerfurcht. Die Länge der Sporen betrug 0,5–1,0 μm, die Breite betrug 0,5–0,7 μm.
Sporangien und bewegliche Sporen wurden nicht beobachtet.
2) Wachstumsstatus in verschiedenen Kulturmedienarten (27°C, 3 Wochen)

a) Saccharose/Nitrat-Agar-Kulturmedium

Wachstum: moderat

Luftmyzel: keins

Rückseite: 2ba (perlweiß)

Lösliches Pigment: keins

b) Glukose/Asparagin-Agar-Kulturmedium

Wachstum: moderat

Luftmyzel: keins

Rückseite: 2ba (pearlweiß)

Lösliches Pigment: keins

c) Glycerol/Asparagin-Agar-Kulturmedium

Wachstum: moderat

Luftmyzel: keins

Rückseite: 2ba (perlweiß)

Lösliches Pigment: keins

d) Stärke/anorganisches Salz-Agar-Kulturmedium

Wachstum: gut

Luftmyzel: keins

Rückseite: 2ba (perlweiß)

Lösliches Pigment: keins

e) Tyrosin-Agar-Kulturmedium

Wachstum: moderat

Luftmyzel: kaum b + 3ni + 4ni (austernweiß + kobaltbraun + haselnussbraun)

Rückseite: 3pn (dunkelbraun)

Lösliches Pigment: 3p1 (tiefbraun)

f) Nähragar-Kulturmedium

Wachstum: schlecht

Luftmyzel: keins

Rückseite: 3ng (ahorngelb)

Lösliches Pigment: 3ng (ahorngelb)

g) Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar-Kulturmedium

Wachstum: moderat

Luftmyzel: ausgezeichnet/grau

Rückseite: 3pi (goldbraun)

Lösliches Pigment: 3pn (dunkelbraun)

h) Hafermehl-Agar-Kulturmedium

Wachstum: moderat

Luftmyzel: moderat 5ge (rosenholz)

Rückseite: 4ge (rose-beige)

Lösliches Pigment: keins

i) Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium

Wachstum: schlecht

Luftmyzel: keins

Rückseite: 2ba (perlweiß)

Lösliches Pigment: 5pn (dunkelbraun)

j) Stärke/Hefeextrakt/Agar-Kulturmedium

Wachstum: gut

Luftmyzel: ausgezeichnet 4ge + 41i (rose-beige + biber)

Rückseite: 4ge (rosa-beige)

Lösliches Pigment: lih (olive-grau)

Der Farbcode entspricht der 4. Ausgabe des Descriptive Color Names Dictionary (descriptives Farbnamenverzeichnis). 3) Effizienz verschiedener Arten von Kohlenstoffquellen (Pridham/Gottlieb-Agar-Kulturmedium, 27°C Kultur)
4) Andere physiologische Eigenschaften (27°C Kultur)

1. Verflüssigung von Gelatine (Glucose/Pepton/Gelatine-Kulturmedium) – keine Verflüssigung
2. Hydrolyse von Stärke (Stärke/anorganisches Salz-Agar-Kulturmedium) – hydrolysiert
3. Aggregation von entfetteter Milch und Peptonisierung – aggregiert und peptonisiert
4. Produktion von Melaninpigment, Pigmentproduktion in Tyrosin-Agar-Kulturmedium und in Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium
5. Wachstumstemperatur: 20–35°C

Streptomyces sp. mit den obigen Eigenschaften, wie gräuliche spiralförmige Hyphen, Produktion von Melaninpigment, Sporen mit glatter Oberfläche, Verbrauch der zuvor genannten Saccharide, wurde unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, untersucht. Demzufolge wird schlussgefolgert, dass das vorliegende Bakterium als Streptomyces griseosporevs oder eine damit eng verwandte Spezies ist.
Nachfolgend wird ein Beispiel für ein Mutationsverfahren zur Erzeugung von Streptomyces sp. SN-1061M (FERM BP-5800) beschrieben, das große Mengen von erfindungsgemäßen antibiotischen RK-1061s und Salzen davon produzieren kann.
Von Stärke/Hefeextrakt-Schrägagarkulturmedium, in dem Streptomyces sp. RK-1061 (FERM P-8278) wuchs, die erfindungsgemäße antibiotische RK-1061s und Salze davon produzierte, wurden Sporen in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und in Schalen verteilt (1 × 10⁸ Zellen/ml). Unter Bedingungen, bei denen etwa 1% Zellen wachsen, fand eine Mutation davon durch UV-Bestrahlung statt und gewachsene Kolonien wurden in das gleiche Schrägkulturmedium inokuliert. Von 66 Zelllinien, die in K1-Kulturmedium (Kulturmedium mit 40 g Saccharose (Wako-junyaku), 30 g Sojabohnenpulver (Honen-seiyu), 20 g Weizenkeime (Sigma) oder 20 g Malzextrakt (Difco), 6 g Natriumchlorid (Wako-junyaku), eingestellt auf pH 7,0) kultiviert wurden, wurde eine Zelllinie mit einer hohen antibakteriellen Wirkung gegen Mycobacterium phlei ausgewählt und Streptomyces sp. SN-1061M (FERM BP-5800) genannt.
1) Morphologische Eigenschaften
Wachstumstests mit Streptomyces sp. SN-1061 in verschiedenen Arten von Agarkulturmedium ergaben, dass sie in allen Medien wuchs. In Verbrauchstests mit 10 Saccharidarten verbrauchte sie alle Saccharide und wuchs, mit Ausnahme von L-Rhamnose, wo der Verbrauch nicht gut war. Die Lufthyphen waren weißlich und die Rückseite war hellbräunlich, was nichts Besonderes war. In entfetteter Milch fand keine Aggregation statt und es wurde eine hellbraune, transparente Lösung nach einer späteren Peptonisierung davon erhalten. Es wurde weder eine Hydrolyse von Stärke noch eine Verflüssigung von Gelatine dadurch beobachtet. Eine Melaninpigmentproduktion wurde in Hefeextrakt/Malzextrakt-Kulturmedium (ISP Nr. 2), Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium (ISP Nr. 6) und Tyrosin-Agar-Kulturmedium beobachtet, allerdings war das lösliche Pigment hellbraun oder braun, was nichts Besonderes war. Im Rahmen von Beobachtungen mit einem Elektronenmikroskop stellte man fest, dass die Lufthyphen linear und weich waren, wobei sich 6 bis 10 Rollen von dichten, spiralförmigen Hyphen im Stärke/Hefeextrakt-Agar-Kulturmedium befanden. Die Sporen des vorliegenden Bakteriums waren in Linien an den Enden der Hyphen ausgebildet und spiralförmige Hyphen waren sporuliert. Die Sporenoberfläche war glatt aber zerfurcht. Die Länge der Sporen betrug 0,6–1,2 μm, die Breite betrug 0,6–0,7 μm. Sporangien und bewegliche Sporen wurden nicht beobachtet. 2) Wachstumstatus in verschiedenen Arten von Kulturmedien (27°C, 3 Wochen)
Die Beschreibung der Farben entspricht dem Farbcode (Farbpalette) des japanischen Normenverbands. 3) Nutzung verschiedener Arten von Kohlenstoffquellen (ISP Nr. 9, 27°C, 3 Wochen)
4) Andere physiologische Eigenschaften

1. Verflüssigung von Gelatine (Glucose/Pepton/Gelatine-Kulturmedium) keine Verflüssigung
2. Hydrolyse von Stärke nicht hydrolysiert
3. Aggregation von entfetteter Milch und Peptonisierung keine Aggregation und peptonisiert
4. Produktion von Melaninpigment Pigmentproduktion in Kulturmedium ISP Nr. 2, 6 und 7
5. Wachstumstemperatur: 27–37°C

Vergleichsdaten der Aktivitäten von Streptomyces sp. RK-1061 und Streptomyces sp. SN-1061M in K1 Kulturmedium im Rahmen einer Kolbenkultur sind nachfolgend dargestellt. Bei einem Vergleich der antibakteriellen Wirkung gegen Mycobacterium phlei von Kulturüberstand und Myzelextrakt davon am 5. und 7. Kultivierungstag wurde bei SN-1061M eine antibakterielle Wirkung gefunden und bei RK-1061 nicht. Demzufolge war Streptomyces sp. SN-1061M die nützlichere Zelllinie, die RK-1061 Substanzen stabil und in großen Mengen gegenüber Streptomyces sp. RK-1061 produzierte.
[Fermentations- und Reinigungsverfahren]
Das Verfahren zur Fermentation der bakteriellen Zelllinie, die zu Streptomyces sp. gehört und erfindungsgemäße antibiotische Liposidomycine produziert, und das Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Liposidomycinen, die durch Kultivierung gewonnen werden, werden nachfolgend beschrieben. Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen antibiotischen Liposidomycine (RK-1061s) können die obigen Antibiotika-produzierenden Bakterien, die zu Streptomyces sp. gehören, durch ein gängiges Antibiotikaproduktionsverfahren kultiviert werden. Es kann eine Flüssigkultur oder Feststoffkultur verwendet werden. Für eine Kultivierung im industriellen Maßstab können Sporensuspensionen oder Kulturmedien der obigen Bakterien inokuliert und durch Belüften und Rühren kultiviert werden.
Die Nährstoffquelle des Kulturmediums ist nicht speziell beschränkt und die Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und andere normalerweise in mikrobiellen Kulturen verwendete Bestandteile können im Kulturmedium enthalten sein. Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Dextrin, Glycerin, Glucose, Maltose, Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose, Inositol, L-Rhamnose, L-Arabinose, D-Mannitol, Raffinose, Salicin, L-Sorbose und/oder D-Glucosamin verwendet werden und als Stickstoffquelle können Weizenkeime, Malzextrakt, Pepton, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Reiskleie, Weizenkleie, Harnstoff, Maisquellwasser, Ammoniumsalz, Nitrat und andere organische und/oder anorganische Stickstoffverbindungen verwendet werden. Außerdem können anorganische Salze wie Tafelsalz, Phosphat, Metallsalze, einschließlich Natrium, Kalium, Zink, Mangan, Eisen usw. zugegeben werden, und bei Bedarf kann tierisches Öl, pflanzliches Öl und/oder mineralisches Öl als Antischaummittel zugegeben werden. Die Kultivierungsbedingungen wie Kultivierungstemperatur, Kultivierungsdauer usw. können so gewählt werden, dass ein angemessenes Bakterienwachstum und eine größtmögliche Liposidomycinproduktion erreicht wird. Ein geeigneter pH-Wert des Kulturmediums liegt z.B. bei 4–9, vorzugsweise bei 6–7, und eine geeignete Kultivierungstemperatur liegt vorzugsweise bei 25–35°C. Selbstverständlich sind diese Kultivierungsbedingungen wie Kulturzusammensetzungen, pH-Wert des Kulturmediums, Kultivierungstemperatur, Rührbedingungen je nach der verwendeten Spezies der Bakterienzelllinie, den Umgebungsbedingungen usw. einzustellen, um beste Ergebnisse zu erhalten.
Wie zuvor beschrieben, kann eine Substanz, bei der R₃ eine Sulfatgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, ferner selektiv produziert werden, wenn eine bestimmte Kohlenstoffquelle verwendet wird. Zur Erzeugung von Liposidomycinen von Kulturprodukten können Mittel, die normalerweise zur Erzeugung von Stoffwechselprodukten verwendet werden, entsprechend verwendet werden. Zum Beispiel kann ein oder eine Kombination von Mittel(n) zur Nutzung der Differenz zwischen Solubilität, Adsorptionsaffinität, relative Molekülmasse usw. von Liposidomycinen und von Kontaminanten einmalig oder wiederholt verwendet werden.
Im Speziellen liegen Liposidomycine sowohl im Kulturfiltrat als auch im Myzelkörper vor und eine aktive Fraktion in Myzel kann durch Extraktion mit Aceton, einschließlich Wasser, und anschließender Verdampfung von Aceton gewonnen werden. Nachdem diese mit dem obigen Kulturfiltrat kombiniert wurde, können Liposidomycine durch Reinigung, z.B. Lösungsmittelextraktion, Silikagelchromatographie, Gelfiltrationschromatographie usw., erhalten werden. Als Lösungsmittel für die Lösungsmittelextraktion ist Butanol geeignet und Sephadex LH-20 ist für die Gelfiltrationschromatographie geeignet. Gewonnene RK-1061s werden durch Hochleistungsflüssigchromatographie in viele Komponenten-Peaks getrennt. Vorzugsweise wird eine Umkehrphasenverteilungssäule verwendet. Die den jeweiligen Liposidomycinen entsprechenden Fraktionen können aufgefangen, kondensiert, entsalzt und gefriergetrocknet werden, um reine Liposidomycine zu erhalten.
[Physikochemische Eigenschaften]
Die Liposidomycine (RK-1061s) haben die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

(1) Aussehen: weißes Pulver (alle Komponenten)
(2) relative Molekülmasse und Molekülformel: die durch Massenspektrometrie (FAB-MS) und hochauflösende Massenspektrometrie (HRFAB-MS) bestimmte relative Molekülmasse und die Molekülformel sind in Tabelle 1 enthalten. Tabelle 1
(3) Schmelzpunkt: Die jeweiligen Komponenten haben keinen eindeutigen Schmelzpunkt und zersetzen bei 150–250°C.
(4) Spezifisches Drehvermögen: Liposidomycine A- (III):
(c 0,1, 50% Methanol) Liposidomycine Z- (III):
(c 0, 1, 50% Methanol)
(5) UV-Absorptionsspektrum: jede Komponente weist eine maximale Absorption bei 261–263 nm (50% Methanol) auf.
(6) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Tablette): das Infrarotabsorptionsspektrum von Liposidomycinen Z-(III) ist in 1 dargestellt.
(7) ¹H-NMR-Spektrum: 500 MHz, in deuteriertem Methanol, Raumtemperatur. Das Spektrum der jeweiligen Verbindungen ist wie folgt dargestellt: Liposidomycine Z (2), L (3), M (4), K (5), N (6), A-(II) (7), X-(III) (8), Y-(III) (9), Z-(III) (10), C-(III) (11), V-(III) (12), A-(III) (13), G-(III) (14), M-(III) (15), K-(III) (16), N-(III) (17), A-(IV) (18). Obwohl die Molekülformel C₄₂H₆₇N₅O₁₆ der Liposidomycine C-(III) ohne Sulfatgruppe die gleiche ist wie bei den Liposidomycinen B ohne Sulfatgruppe (CAS-registrierte Nummer: 113378-45-3), hat die erstere Verbindung eine Methylgruppe am Ende der aliphatischen Seitenkette gemäß dem ¹H-NMR-Spektrum aus 11 (t, 0,89 ppm, 3H), was ein Unterschied zu den Liposidomycinen B ohne Sulfatgruppe ist (2 Methylgruppen am Ende der Seitenkette, Isotyp).
(8) Solubilität: die jeweiligen Komponenten sind in Methanol, Dimethylsulfoxid und Wasser löslich, aber in Hexan und Chloroform unlöslich.
(9) Rf-Wert in DC: Rf-Wert bei einer DC (Silikagel Art. 5715 (Merk)), entwickelt mit Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:2). Verbindungen mit Sulfatgruppe (Typ (I), (II)): 0,35 Verbindungen ohne Sulfatgruppe (Typ (III), (IV)): 0,41
(10) Retentionszeit in HPLC: Die Retentionszeit der jeweiligen Komponenten unter zwei verschiedenen Bedingungen ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
(11) Struktur der aliphatischen Seitenkette R₁

Typ (I)

Z: Doppelbindung in Position 5–6
L: Isotyp
M: normaler Typ
K: Doppelbindungen in Position 9–10 und 12–13
N: Doppelbindung in Position 9–10

Typ (III)

Y-(III): Doppelbindungen in Position 5–6 und 8–9
Z-(III): Doppelbindung in Position 5–6
A-(III): Doppelbindungen in Position 7–8 und 10–11
G-(III): Doppelbindung in Position 7–8
M-(III): normaler Typ
K-(III): Doppelbindungen in Position 9–10 und 12–13
N-(III): Doppelbindung in Position 9–10

Beispiel
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von veranschaulichenden Beispielen beschrieben, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht begrenzen.
[1. Beispiel] – nicht im Rahmen der vorliegenden Erfindung

Produktion von RK-1061, dessen R₃-Gruppe eine Sulfatgruppe oder Wasserstoff ist (RK-1061 mit Sulfatgruppe und RK-1061 ohne Sulfatgruppe)

Die zuvor genannte, in Schrägagar-Kulturmedium kultivierte RK-1061 Zelllinie wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, der 70 ml flüssiges Medium (pH 6,8) aus 2% Glucose, 1% löslicher Stärke, 0,1% Fleischextrakt, 0,4% Hefeextrakt, 2,5% Sojabohnenpulver, 0,2% Natriumchlorid und 0,005% Kaliumsekundärphosphat enthielt, und 2 Tage lang bei 28°C kultiviert. Ein Milliliter des Kulturmediums wurde in einen anderen Kolben inokuliert, der das gleiche Kulturmedium wie oben enthielt, und 48–72 Stunden lang kultiviert. Des Weiteren wurden 140 ml dieses Kulturmediums in einen 30 Liter fassenden Gefäßfermenter inokuliert, der 18 Liter des gleichen Mediums wie oben enthielt, und durch Belüften und Rühren unter den folgenden Bedingungen bei 28°C 65–90 Stunden lang kultiviert, bis der pH-Wert über 8,4 lag:

Belüftungsgeschwindigkeit: 18 Liter/Minute und
Rührgeschwindigkeit: 350 rpm

Nach der Fermentation wurde der Kulturüberstand (pH 8,8, der Durchmesser der Wachstumsinhibition gegen Mycobacterium phlei betrug 20,2 mm) vom Myzel (2,9 kg, der Durchmesser der Wachstumsinhibition gegen Mycobacterium phlei betrug 24,3 mm) getrennt und das Myzel wurde mit 5 Liter Aceton über Nacht extrahiert. Die durch Verdampfen von Aceton aus der Extraktlösung unter Vakuum gewonnene wässrige Lösung wurde mit dem Kulturüberstand kombiniert und es wurde das gleiche Volumen an Butanol zugegeben, woraufhin eine dreimalige Extraktion folgte. Die Butanollage wurde unter Vakuum kondensiert, um etwa 60 g Rohextrakt zu gewinnen, der in 80 ml Methanol gelöst wurde. Anschließend wurden 240 ml Chloroform zugegeben, und dies wurde auf eine Silikagelsäule (8 × 12 cm, Merk, 70 × 230 mesh) aufgebracht, die mit Chloroform/Methanol (3:1) gesättigt war, und Kontaminanten wurden mit Chloroform/Methanol (2:1) und Chloroform/Methanol (1:1) ausgeschlossen. Anschließend wurden aktive Substanzen mit Chloroform/Methanol (1:2) und Chloroform/Methanol (1:3) eluiert.
Das Eluat wurde unter Vakuum kondensiert, um etwa 14 g Rohextrakt zu gewinnen, der in 20 ml Methanol gelöst und auf eine LH-20 Säule (3 × 79 cm, Pharmacia) aufgetragen und fraktioniert wurde, um 10,3 g aktive Substanz zu gewinnen. Ferner wurde dies auf eine Silikagelsäule (8 × 12 cm) aufgetragen, die mit Butanol/Methanol/Wasser (4:1:2) gesättigt war, und mit dem gleichen Lösungsmittel wie oben eluiert, um aktive Substanzen (6,5 g) zu gewinnen.
Dies wurde dann durch HPLC fraktioniert. Zunächst fand eine Trennung in 6 Fraktionen mit Senshu-pak ODS (20 ϕ × 250 mm, ODS-5251-SS, Senshukagaku) und Acetonitril-0,1% Diethylamin/Ameisensäure (pH 4) (40:60) als Elutionsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min statt und ferner wurden diese Fraktionen mit der gleichen Säule, der gleichen Fließgeschwindigkeit und Acetonitril-0,1% Diethylamin/Ameisensäure (pH 4,0) (60:40) in 6 Fraktionen fraktioniert. Diese Fraktionen wurden unter Vakuum kondensiert und mit Capcell pak ODS (20 ϕ × 250 mm, SG-120, Shiseido) jeweils unter den gleichen Bedingungen wie oben refraktioniert. Die wie oben erhaltenen jeweiligen Liposidomycinfraktionen wurden unter Vakuum kondensiert, um Acetonitril zu entfernen. Wasser wurde zu jeder Fraktion zum Entsalzen gegeben, dann wurde dies auf MCI GEL (1 × 5 cm, Mitsubishi kasei) gegeben, mit ausreichend Wasser gewaschen, mit 50% Aceton eluiert, unter Vakuum kondensiert und gefriergetrocknet, um ein weißes Pulver aus Liposidomycinen als aktive Substanz zu erhalten.
[2. Beispiel] – nicht im Rahmen der vorliegenden Erfindung

Die zuvor genannte, in Schrägagarkulturmedium kultivierte SN-1061M Zelllinie wurde in einem 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, der 70 ml flüssiges Medium (pH 6,7) (C4 Medium) aus 2% Glucose, 1% löslicher Stärke, 0,1% Fleischextrakt, 0,4% Hefeextrakt, 2,5% Sojabohnenpulver, 0,2% Natriumchlorid und 0,005% Kaliumsekundärphosphat enthielt, und 2 Tage lang bei 27°C kultiviert. Ein Milliliter dieses Mediums wurde in einen Kolben inokuliert, der das gleiche Medium wie oben enthielt, und 5 Tage lang kultiviert. Das Kulturmedium wurde in Kulturüberstand und Myzel durch Zentrifugieren getrennt, das Myzel wurde gewogen, der pH-Wert des Überstands wurde gemessen und die antibakterielle Wirkung des mit Aceton extrahierten Materials von Myzel wurde untersucht. Die antibakterielle Wirkung wurde geprüft, indem der Durchmesser der Inhibitionszone auf einer Papierscheibe (mit einem Durchmesser von 8 mm), die mit 40 μl des Kulturmediums getränkt wurde, nach der Kultivierung mit Mycobacterium phlei und Escherichia coli BE unter geeigneten Bedingungen gemessen wurde.
Ferner wurden Kulturüberstand und Myzelextrakt jeweils mit Butanol extrahiert, kondensiert und getrocknet, in 1/10 Volumen Methanol gelöst und dann durch HPLC und DC analysiert. Die HPLC-Analyse erfolgte mit Acetonitril/0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4,0) (45:55) als Elutionsmittel (Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min, nachgewiesen bei 254 nm) und einer Capell pak ODS-Säule (4,6 ϕ × 250 mm, Shiseido). Eine DC wurde mit Silikagel Art. 5715 (0,25 mm, Merk) und Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2) als Entwicklungslösungsmittel durchgeführt. Die Ergebnisse bezüglich antibakterieller Wirkungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und die Ergebnisse der DC und HPLC sind jeweils in 19 und 20 enthalten. Außerdem wurde eine Kultivierung wie oben durchgeführt, bei der Glucose im Kulturmedium durch Maltose ersetzt wurde.
[3. Beispiel]

Produktion von RK-1061, dessen R₃ ein Wasserstoffatom ist (RK-1061 ohne Sulfatgruppe)

Die in Schrägagarmedium kultivierte SN-1061 Zelllinie wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, der 70 ml flüssiges Medium enthielt, wobei Glucose als Kohlenstoffquelle in dem im 2. Beispiel beschriebenen Medium (C4 Medium) durch eine aus der Gruppe bestehend aus Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose, Inosito oder D-Mannitol ersetzt wurde, und 2 bis 4 Tage lang unter Rühren mit 200 rpm bei 28°C kultiviert. Zwei Milliliter des Kulturmediums wurden in einen Erlenmeyerkolben inokuliert, der das gleiche Medium wie oben enthielt, und unter den gleichen Bedingungen wie oben 5 Tage lang kultiviert; es wurde gefunden, dass im Speziellen eine aktive Komponente ohne Sulfatgruppe produziert wurde. Das Kulturmedium wurde zum Trennen von Kulturüberstand und Myzel zentrifugiert. Das Myzel wurde gewogen und der pH-Wert des Überstands wurde gemessen. Die antibakterielle Wirkung des Acetonextrakts des Myzels wurde untersucht. Die antibakterielle Wirkung wurde geprüft, indem der Durchmesser der Zellwachstums-Inhibitionszone auf einer Papierscheibe (mit einem Durchmesser von 8 mm), die mit 40 μl des Kulturmediums getränkt wurde, nach der Kultivierung mit Mycobacterium phlei und Escherichia coli BE unter geeigneten Bedingungen gemessen.
Ferner wurden Kulturüberstand und Myzelextrakt mit Butanol extrahiert, kondensiert und getrocknet und in 1/10 Volumen Methanol gelöst, und es erfolgte eine HPLC und DC Analyse. Die HPLC-Analyse erfolgte mit Acetonitril/.0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4,0) (45:55) als Elutionsmittel (Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min, nachgewiesen bei 254 nm) und einer Capcell pak ODS-Säule (4,6 ϕ × 250 mm, Shiseido). Eine DC fand mit Silikagel Art. 5715 (0,25 mm, Merk) und Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2) als Entwicklungslösungsmittel statt. Die Ergebnisse bezüglich antibakterieller Wirkungen sind in Tabelle 3, die Ergebnisse der DC in 19 aufgeführt.
[4. Beispiel]

Die in Schrägagarmedium kultivierte SN-1061 Zelllinie wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, der 70 ml Medium (K1 Medium) aus 40 g Saccharose (Wako-junyaku), 30 g Sojabohnenpulver (Honen-seiyu), 20 g Weizenkeimen (Sigma) oder Malzextrakt (Difco), 6 g Natriumchlorid (Wako-junyaku), pH 7,0, enthielt, und 2 bis 4 Tage lang unter Rühren mit 200 rpm bei 27°C kultiviert. Zwei Milliliter des Kulturmediums wurden in einen Erlenmeyer-Kolben inokuliert, der das gleiche Medium wie oben enthielt, und unter den gleichen Bedingungen wie oben 5 Tage lang kultiviert; es wurde gefunden, dass im Speziellen eine aktive Komponente ohne Sulfatgruppe produziert wurde. Das Kulturmedium wurde zum Trennen von Kulturüberstand und Myzel zentrifugiert. Das Myzel wurde gewogen und der pH-Wert des Überstands wurde gemessen. Die antibakterielle Wirkung des Acetonextrakts des Myzels wurde untersucht. Die antibakterielle Wirkung wurde geprüft, indem der Durchmesser der Zellwachstums-Inhibitionszone auf einer Papierscheibe (mit einem Durchmesser von 8 mm), die mit 40 μl des Kulturmediums getränkt wurde, nach der Kultivierung mit Mycobacterium phlei und Escherichia coli BE unter geeigneten Bedingungen gemessen wurde.
Ferner wurden Kulturüberstand und Myzelextrakt mit Butanol extrahiert, kondensiert und getrocknet und in 1/10 Volumen Methanol gelöst, und es erfolgte eine HPLC- und DC-Analyse. Die HPLC-Analyse erfolgte mit Acetonitril/0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4,0) (45:55) als Elutionsmittel (Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min, nachgewiesen bei 254 nm) und einer Capcell pak ODS-Säule (4,6 ϕ × 250 mm, Shiseido). Eine DC erfolgte mit Silikagel Art. 5715 (0,25 mm, Merk) und Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2) als Entwicklungslösungsmittel. Die Ergebnisse bezüglich antibakterieller Wirkungen sind in Tabelle 3, die der DC und HPLC jeweils in 19 und 21 aufgeführt. Tabelle 3
[5. Beispiel]

Produktion von RK-1061, dessen R₃-Gruppe ein Wasserstoffatom ist (RK-1061 ohne Sulfatgruppe)

Die zuvor genannte, in Schrägagarkulturmedium kultivierte SN-1061M Zelllinie (FERM BP-5800) wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert, der 70 ml KI enthielt, und 2 bis 3 Tage lang bei 28°C kultivier. Ein Milliliter des Kulturmediums wurde in einen anderen Kolben inokuliert, der das gleiche Kulturmedium wie oben enthielt, und 48 bis 72 Stunden lang kultiviert. Ferner wurden 140 ml dieses Kulturmediums in einen 30 Liter fassenden Gefäßfermenter inokuliert, der 18 Liter des gleichen Mediums wie oben enthielt, und durch Belüften und Rühren unter den folgenden Bedingungen bei 27°C 5 bis 8 Tage lang kultiviert:

Belüftungsgeschwindigkeit: 18 Liter/Minute und
Rührgeschwindigkeit: 350 rpm

Nach der Kultur wurde Myzel durch Zentrifugieren getrennt und über Nacht mit Aceton extrahiert. Zu der durch Verdampfen von Aceton von der Extraktlösung unter Vakuum erhaltenen wässrigen Lösung wurde das gleiche Volumen Butanol gegeben, woraufhin eine dreimalige Extraktion folgte. Die Butanollage wurde unter Vakuum kondensiert, um etwa 30,4 g Rohextrakt zu erhalten, der in 80 ml Methanol gelöst wurde. Anschließend wurden 240 ml Chloroform zugegeben und mit 50 g Silikagel vermischt; dies wurde auf eine Silikagelsäule (8 × 18 cm) aufgetragen, die mit Chloroform/Methanol (3:1) gesättigt war, und Kontaminanten wurden mit Chloroform/Methanol (2:1) und Chloroform/Methanol (1:1) entfernt. Anschließend wurde die aktive Substanz mit Chloroform/Methanol (1:2) und Chloroform/Methanol (1:3) eluiert. Die eluierte Lösung wurde unter Vakuum kondensiert, um etwa 7,73 g Rohextrakt zu gewinnen, der in Acetonitril/0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4) (40:60) gelöst wurde, so dass die Konzentration davon 100 mg/ml betrug, und zum Trennen des Kulturüberstands zentrifugiert. Dies wurde dann weiter durch HPLC fraktioniert. Zunächst erfolgte eine Trennung mit Senshu pak ODS (20 ϕ × 250 mm) und Acetonitril-0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4) (40:60), (50:50), (60:40) als Stufenelutionsmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min. Anschließend fand eine Refraktionierung mit Capcell pak ODS (20 ∅ × 250 mm) mit Acetonitril-0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4) (37,3:62,5), (42,5:57,5), (50:50) als Stufenelutionsmittel statt, um die einzelnen Komponenten zu erhalten. Jede wie oben gewonnene Liposidomycin-Fraktion wurde unter Vakuum kondensiert, um Acetonitril zu entfernen. Wasser wurde zu den jeweiligen Fraktionen zum Entsalzen gegeben; dies wurde auf MCI GEL (1 × 5 cm) aufgetragen, mit einer ausreichenden Wassermenge gewaschen, mit 70% Aceton eluiert, unter Vakuum kondensiert und gefriergetrocknet, um ein weißes Pulver von Liposidomycinen als aktive Substanz zu erhalten. Unter diesen Bedingungen wurden die Liposidomycine (C-(III) (51,8 mg) und M-(III) (34,1 mg) als Hauptkomponenten erhalten.
[Biologische Aktivität]
(1) Antibakterielle Wirkung
Eine Papierscheibe mit 8 mm Durchmesser (Thick, Toyoroshi) wurde mit Methanollösung der jeweiligen getesteten Substanzen in einer spezifischen Konzentration getränkt und getrocknet und auf eine Platte mit den jeweiligen Bakterien gegeben. Nach einer Kultivierung unter für die jeweiligen Bakterien geeigneten Bedingungen wurde der Durchmesser des Zellwachstums gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4, 5 und 6 enthalten. Tabelle 4
Tabelle 5

– steht für „nicht geprüft"

(2) Inhibitionswirkung gegen Peptidglycansynthese
Rohenzym und Substrat UDP-MurNAc-Pentapeptid wurden jeweils von Escherichia coli und Bacillus subtilis gemäß einer Referenz (J. Biol. Chem., 243, 3180 (1968)) hergestellt. Die enzymatische Reaktion erfolgte durch Vermischen von 5 μl 1M Tris-HCl (pH 7,5), 10 μl 0,1M MgCl₂, 5 μl 2 mM UDP-MurNAc-Pentapeptid, 5 μl Enzymlösung (15 mg/ml Proteinkonzentration), 5 μl Probe, 5 μl UDP-[U-³H]GlcNAc (10 μ Ci/ml, 25,8 Ci/mmol, Dupont) und 15 μl Wasser bei 37°C über einen Zeitraum von 60 Minuten, und 1 ml des Reaktionsgemischs wurde zu 5% TCA gegeben. Nach einer Eiskühlung wurde es auf einem GF/C Glasfilter (2,4 cm, Whatman) aufgefangen. Nach der Zugabe eines Szintillators wurde die Strahlung davon gezählt. Die prozentuale Inhibition wurde durch einen Vergleich mit der Zahl der Kontrolle berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 enthalten.
(3) Zytotoxizitätstest
BALB/3T3 Zellen (100 μl) wurden in mit 10% FBS ergänztem DMEM-Medium (Gibco) in einer 96-Well-Platte, um 1 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten, unter 5% CO₂ bei 37°C inokuliert und über Nacht kultiviert. Die in Methanol gelöste Testsubstanz wurde zugegeben und 3 weitere Tage kultiviert, und nach der Zugabe von 10 μl 2,5 mg/ml MTT-Reagens (Sigma) weitere 4 Stunden lang kultiviert. Nach dem Entfernen des Überstands wurden 100 μl DMSO zugegeben und über Nacht stehen gelassen. Die Absorbanz davon bei 540 nm wurde bestimmt, um lebensfähige Zellen nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 enthalten. Tabelle 7
Tabelle 8
Industrielle Nützlichkeit
Wie speziell beschrieben wurde, stellt die vorliegende Erfindung neuartige antibiotische Liposidomycine und Salze davon sowie ein Verfahren zur Herstellung von Liposidomycinen bereit. Antibiotische Liposidomycine der vorliegenden Erfindung haben eine recht geringe Zytotoxizität, aber eine starke antibakterielle Wirkung, indem sie die Peptidoglycansynthese inhibieren.
Verweis auf Mikroorganismen

1. Streptomyces sp. SN-1061M

Hinterlegungsstelle:	National Institue of Bioscience und Human Technology Agency of Industrial Science und Technology Ministry of International Trade and Industry
Adresse:	1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan
Hinterlegungsdatum:	28. Januar 1997
Hinterlegungs-Nr.:	FERM BP-5800

Claims

RK-1061s, repräsentiert durch die allgemeine Formel (I), und pharmazeutisch akzeptable Salze davon zur Verwendung als Antibiotikum,
wobei in der Formel (I) A R₁ oder R₁CH(OR₂)CH₂repräsentiert und R₂ den 3-Methylglutarsäurerest (-COCH₂CH(CH₃)-CH₂-COOH) repräsentiert, wenn A R₁CH (OR₂) CH₂- ist, dann ist R₁ C_nH_2n+1, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist, C_nH_2n-1, wobei n eine ganze Zahl zwischen 2 und 21 ist, C_nH_2n-3, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 22 ist, oder C_nH_2n-5, wobei n 13 ist, wenn A R₁ ist, dann ist R₁ C_nH_2n-1, wobei n eine ganze Zahl zwischen 2 und 21 ist, C_nH_2n-3, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 22 ist, oder C_nH_2n-5, wobei n eine ganze Zahl zwischen 4 und 23 ist.
RK-1061s und pharmazeutisch akzeptable Salze davon nach Anspruch 1 zur Verwendung als Antibiotikum, wobei, wenn A R₁CH (OR₂) CH₂- repräsentiert, dann ist R₁ C_nH_2n+1, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist, C_nH_2n-1, wobei n eine ganze Zahl zwischen 2 und 21 ist, C_nH_2n-3, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 22 ist, oder C_nH_2n-5, wobei n 13 ist.
RK-1061s wie repräsentiert und pharmazeutisch akzeptable Salze davon nach Anspruch 1 zur Verwendung als Antibiotikum, wobei A R₁ repräsentiert, wobei R₁ entweder C_nH_2n-1, wobei n eine ganze Zahl zwischen 2 und 21 ist, oder C_nH_2n-3, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 22 ist, oder C_nH_2n-5 bedeutet, wobei n eine ganze Zahl zwischen 9 und 13 ist.
Verfahren zur Herstellung von RK-1061s und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon nach den Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet durch Kultivieren von Streptomyces sp. SN-1061M (FERM BP-5800) in Kulturmedium, um Antibiotika RK-1061s und Salze davon zu produzieren, und Entnehmen dieser aus den Kulturprodukten.
Verfahren zur Herstellung von RK-1061s und pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon nach Anspruch 4, wobei wenigstens eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose, Inositol und D-Mannitol, als Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium verwendet wird, und Weizenkeim- oder Malzextrakt als Stickstoffquelle in dem Kulturmedium verwendet wird.
Streptomyces sp. SN-1061M (FERM BP-5800).