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Technischer Bereich
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neuartige Antibiotika RK-1061s mit
der Bezeichnung Liposidomycine und pharmakologisch akzeptable Salze
davon sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
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Stand der Technik
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Bei
der Entwicklung eines hochspezifischen antibakteriellen Mittels
mit wenig Nebenwirkungen ist ein Mittel erwünscht, das einen spezifischen
Ort targetieren kann, der in bakteriellen Prokaryoten, aber nicht
in humanen Eukaryoten vorliegt. Ein solcher spezifischer Ort ist
z.B. Peptidoglycan, eine der bakteriellen Zellwandkomponenten, und
bekannte, auf dem Markt befindliche Antibiotika, die auf Peptidoglycan
wirken, sind Penicilline, Cepheme, Carbapeneme, Monobactame, Cycloserin,
Bacitracin, Vancomycin und Phosphomycin.
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Offenbarung der Erfindung
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Es
ist allgemein bekannt, dass jedes gute Antibiotikum bei längerem Gebrauch
resistente Bakterien hervorruft. Darüber hinaus haben einige Antibiotika
Nebenwirkungen wie Neuropathie, Nephropathie und/oder Hepatophatie.
In dem Arbeitsbereich beschäftigte
man sich kürzlich
mit MRSA(Methicillin-resistentes Staphylococcus aureus)-Infektionen
in Krankenhäusern
und Helicobacter pylori, das vermutlich eine ursächliche Rolle bei Magengeschwüren und/oder
Magenkrebss spielt. Aus diesem Grund ist die Entwicklung eines Antibiotikums
mit einer neuartigen Struktur und einem neuartigen Wirkungsmechanismus
erwünscht.
Antibiotische Liposidomycine (RK-1061s) wurden durch die Verwendung
eines Screening-Systems zur Inhibition der Peptidoglycansynthese
gefunden. Dieses Antibiotikum inhibiert im Speziellen Phospho-N-acetylmuramyl-pentapeptid-transferase
(E.C.2.7.8.13) (Phospho-MurNAc-pentapeptid-translocase, UDP-MurNAc-pentapeptid-phosphotransferase,
(Trivialname) Translocase I) (Agri. Biol. Chem., 53(7), 1811–1815 (1989))
und ist strukturell als Fettsäureacylnucleosid-Antibiotikum
mit Sulfatgruppe und einmaliger Aminozuckergruppe gekennzeichnet. Obwohl
Tunicamycin („Tunicamycin", Japan Scientific
Societies Press, 1982, Tokyo) und Mureidomycin (J. Antibiot., 42,
662–679
(1989)) gemäß den obigen
Quellen bekanntlich die gleiche Wirkung wie Liposidomycine haben,
so haben Liposidomycine ein antibakterielles Spektrum, das sich
von dem der anderen beiden Antibiotika unterscheidet, sowie eine
starke Inhibitionswirkung auf die Peptidoglycansynthese. Folglich
kann Liposidomycin theoretisch gegen alle Bakterien mit Peptidoglycan
wirksam sein, sofern es keine Probleme mit der Durchlässigkeit
oder Stabilität
gibt.
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Liposidomycine
haben eine starke antibakterielle Wirkung vor allem auf Mycobacterium,
das zu den säurefesten
Bakterien gehört
(J. Antibiot., 38, 1617–1621
(1985)), und sind voraussichtlich gegen Mycobacterium tuberculosis
wirksam, das gegen bekannte tuberkulosehemmende Mittel wie Rifanpicin
usw. resistent ist und gegen das kein anderes Mittel wirkt. Ferner
werden opportunistische Infektionskrankheiten wie Pneumocystis carinii
zu einem großen
Problem aufgrund der explosionsartigen Zunahme der Anzahl von Patienten
mit AIDS, und man rechnet damit, dass Liposidomycine gegen das adventive
säurefeste
Bakterium Mycobacterium-avium-Komplex (MAC) wirksam ist, das die
oben genannte opportunistische Infektionskrankheit hervorruft.
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Die
Autoren der vorliegenden Erfindung produzierten im Rahmen von Untersuchungen
hohe Ausbeuten von RK-1061s, bei denen es sich um Antibiotika handelt,
die aus vielen Komponenten bestehen, isolierten neuartige Verbindungen daraus
und fanden neuartige Substanzen, die sich von RK-1061A (Liposidomycine A), RK-1061B (Liposidomycine
B), RK-1061C (Liposidomycine
C) (ungeprüfte
japanische Patentanmeldung Nr. 282088/1986), RK-1061G (Liposidomycine
G), RK-1061H (Liposidomycine H) (ungeprüfte japanische Patentanmeldung
Nr. 306992/1990), über
die bereits berichtet wurde, unterschieden. Zwar können alle
Substanzen, über
die berichtet wurde, in die nachfolgend beschriebene allgemeine
Formel (II) eingeordnet werden, doch sind Liposidomycine Verbindungen
mit einer Struktur mit einer Gruppe an der R1-Gruppe
der Formel (II) und können
in drei verschiedene Typen unterteilt werden, die zur Struktur (III),
(IV) und (V) gehören.
Ferner wiesen die mit der vorliegenden Erfindung erhaltenen neuartigen
antibiotischen Liposidomycine (RK-1061s) eine wesentlich höhere antibakterielle
Wirkung als die anderen Verbindungen auf. Somit wurde die vorliegende Erfindung
erreicht.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige antibiotische
Liposidomycine (RK-1061s), hochproduktive Zelllinien davon und Verfahren
für ihre
Herstellung bereitzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Liposidomycine (RK-1061s), die durch
die folgende allgemeine Formel (I) repräsentiert werden, oder pharmakologisch
akzeptable Salze davon, zur Verwendung als Antibiotikum.
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In
der Formel repräsentiert
A R1 oder R1CH (OR2) CH2-, R2 repräsentiert
den 3-Methylglutarsäurerest (-CO-CH2-CH(CH3)-CH2-COOH)
und R3 repräsentiert ein Wasserstoffatom.
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Wenn
A R1CH (OR2) CH2- ist, dann ist R1 CnH2n-1- (n ist eine
ganze Zahl zwischen 1 und 20), CnH2n-1- (n ist eine ganze Zahl zwischen 2 und
21) oder CnH2n-3-
in ist eine ganze Zahl zwischen 3 und 22).
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Wenn
A R1 ist, dann ist R1 CnH2n-1- in ist eine
ganze Zahl zwischen 2 und 22), CnH2ny- (n ist eine ganze Zahl zwischen 3 und
22) oder CnH2n-5-
(n ist eine ganze Zahl zwischen 4 und 23).
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Andere
Liposidomycine sind durch die folgenden Formeln (II)–(V) repräsentiert:
R
1 repräsentiert
das gleiche wie oben beschrieben.
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Gemäß der Art
der substituierten Gruppe A und R
3 können Liposidomycine
RK-1061s in die folgenden Typen unterteilt werden. Das heißt, sie
können
in 2 Typen eingeteilt werden:
ein Typ, bei dem A R
1CH
(OR
2) CH
2 ist (wobei
R
2 ein 3-Methylglutarsäurerst ist),
und ein anderer Typ, bei dem A R
1 ist (wobei
R
2 nicht vorhanden ist, R
1 sich
direkt an die Position 2a bindet). Sie können auch so eingestuft werden,
dass R
3 eine Sulfatgruppe und ein Wasserstoffatom
ist.
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Pharmakologisch
akzeptable Salze der RK-1061s der vorliegenden Erfindung sind z.B.
Hydrochlorid, Sulfat, alkalisches Metallsalz wie Natrium oder Kalium
usw., Erdalkalimetallsalz wie Magnesium oder Calcium usw., andere
Metallsalze wie Aluminium usw. und organische Aminsalze wie Alkylaminsalz
oder Pyridiniumsalz.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von Liposidomycinen (RK-1061s), die durch die obige Formel repräsentiert
sind.
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Das
erfindungsgemäße Herstellungsverfahren
ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Liposidomycinen (RK-1061s), das die folgenden
Schritte umfasst:
- 1) Kultivieren eines Mikroorganismus,
der zu Streptomyces gehört
und die zuvor genannten Liposidomycine (RK-1061s) in Kulturmedium
produzieren kann;
- 2) Produzieren der genannten Liposidomycine (RK-1061s); und
- 3) Aufnehmen der genannten Liposidomycine (RK-1061s) von den
kultivierten Produkten.
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Diese
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
durch die Nutzung der Differenz bei der Retentionszeit der jeweiligen
Verbindungen durch HPLC usw. isoliert werden.
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Darüber hinaus
können
diese Verbindungen wie Liposidomycine (RK-1061), deren R3 ein Wasserstoffatom ist, selektiv hergestellt
werden, indem eine Kohlenstoffquelle für das Kulturmedium ausgewählt wird.
Liposidomycine (RK-1061s),
bei denen R3 ein Wasserstoffatom ist, können z.B.
in großen
Mengen produziert werden, indem wenigstens eine Kohlenstoffquelle,
die aus der Gruppe bestehend aus Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose,
Inositol und D-Mannitol ausgewählt
wird, und Weizenkeim oder Malzextrakt als Stickstoffquelle verwendet
wird.
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Ein
Aktinomycet, der Liposidomycine (RK-1061s) der vorliegenden Erfindung
produziert, ist zum Beispiel das Bodenbakterium Streptomyces sp.
RK-1061 (nachfolgend als RK-1061 Zelllinie bezeichnet), das von den
Autoren der vorliegenden Erfindung in Erde bei Misaka-cho in der
Präfektur
Yamanashi gefunden wurde. Diese Zelllinie wurde beim National Institute
of Bioscience, bei der Human Technology Agency of Industrial Science
und beim Technology Ministry of International Trade and Industry
mit der Hinterlegungs-Nr. FERM P-8278 hinterlegt. Eine diese FERM
P-8278 Zelllinie beanspruchende Patentanmeldung wurde am B. Februar
1995 unter der Patentnummer
JP1902732 bereits
registriert, so dass diese Zelllinie der Öffentlichkeit über angemessene
Verfahrensabläufe
zur Verfügung
steht.
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Darüber hinaus
ist die künstlich
mutierte Streptomyces sp. SN-1061M (nachfolgend als SN-1061M Zelllinie
bezeichnet) zu nennen, die durch UV-Bestrahlung der RK-1061 Zelllinie
hergestellt wurde, um ihre geringe Produktivität und Uneignung zu verbessern.
Diese Zelllinie wurde beim National Institute of Bioscience, bei
der Human Technology Agency of Industrial Science und beim Technology
Ministry of International Trade and Industry mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5800
hinterlegt.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
das Infrarotabsorptionsspektrum (KBR) von Liposidomycinen Z-(III).
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2 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen Z, wobei x Peaks
ohne Beziehung zu Liposidomycinen Z repräsentiert.
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3 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen L, wobei x Peaks
ohne Beziehung zu Liposidomycinen L repräsentiert.
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4 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen M.
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5 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen K.
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6 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen N.
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7 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen A-(II), wobei x
Peaks ohne Beziehung zu Liposidomycinen A-(II) repräsentiert.
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8 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen X-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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9 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen Y-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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10 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen Z-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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11 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen C-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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12 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen V-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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13 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen A-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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14 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen G-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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15 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen M-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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16 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen K-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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17 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen N-(III), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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18 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, CD3OD) von Liposidomycinen A-(IV), wobei x
Peaks ohne Beziehung zur erfindungsgemäßen Substanz repräsentiert.
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19 zeigt
die DC von Liposidomycinen (RK-1061s) aus dem 2., 3. und 4 Beispiel.
Kohlenstoffquelle des Kulturmediums: A: Maltose, B: Xylose, C: Lactose,
D: D-Fructose, E:
Saccharose, F: Inositol, G: L-Rhamnose, H: L-Arabinose, I: D-Mannitol, J: Raffinose,
K: Salicin, L: L-Sorbose,
M: D-Glucosamin.
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20 zeigt
die HPLC von Liposidomycinen (RK-1061s) aus dem 2. Beispiel.
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21 zeigt
die HPLC von Liposidomycinen (RK-1061s) aus dem 4. Beispiel.
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Beste Art der Umsetzung
der bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung
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[In der Erfindung verwendete
Mikroorganismen]
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Zunächst werden
die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen beschrieben.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen gehören zu Streptomyces
sp. und Aktinomyceten, die die zuvor genannten Liposidomycine (RK-1061s)
der vorliegenden Erfindung produzieren. Als ein Beispiel ist die
zuvor erwähnte
RK-1061 Zelllinie zu nennen. Dieser Mikroorganismus hat die obigen
Merkmale, kann erfindungsgemäße antibiotische
Liposidomycine produzieren und kann effektiv in einem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden.
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Es
können
nicht nur native und künstlich
mutierte Zelllinien des obigen RK-1061, sondern jegliche Bakterien,
die zu Streptomyces sp. gehören
und antibiotische Liposidomycine produzieren, in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Vor allem die SN-1061M Zelllinie, die
durch UV-Bestrahlung der RK-1061 Zelllinie mutiert wurde, um die
Produktivität
von Liposidomycinen zu verbessern, ist ein besonders nützlicher
Mikroorganismus. Die zuvor genannten RK-1061s wurden mit einem gängigen Verfahren
zur Isolierung von Bodenbakterien aus Erde bei Misaka-cho in der
Präfektur
Yamanashi gewonnen. Die mikrobiellen Eigenschaften dieser bakteriellen
Zelllinie werden im Folgenden beschrieben. Ihre mikrobiellen Eigenschaften
wurden bereits in der Publikation der ungeprüften japanischen Patentanmeldungen
Nr. 282088/1986 und 306992/1990 beschrieben und sind der Öffentlichkeit
bekannt.
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1) Morphologische Eigenschaften
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Die
RK-1061 Zelllinie gehört
zu Aktinomyceten, die aus Erde isoliert wurden, die bei Misaka-cho
in der Präfektur
Yamanashi gesammelt wurde. Nur LL-Diaminopimelinsäure wurde
in Chlorwasserstoffsäurehydrolysat
der ganzen Zelle nachgewiesen, meso-Diaminopimelinsäure wurde
darin nicht nachgewiesen. Das Ergebnis von Wachstumstests in verschiedenen
Agar-Kulturmedien war, dass sie in allen zehn Kulturmedienarten wuchs.
Sie wies ein gutes Wachstum auf, und der Einbau von Lufthyphen und
Sporen war nur im Stärke-Hefeextrakt-Agar-Kulturmedium
verbreitet, wohingegen in anderen Agar-Kulturmedien der Einbau von
Lufthyphen und Sporen nicht gut war. In einem Verbrauchstest mit
11 Saccharidarten als Kohlenstoffquelle verbrauchte die RK1061 Zelllinie
alle Saccharide und wuchs. Die Lufthyphen der erfindungsgemäßen Zelllinie
waren gräulich
und ihre Rückseite
war hellbräunlich,
was nichts Besonderes ist. Beim Wachstum in entfetteter Milch erfolgte
zuerst eine Aggregation, eine Peptonisierung erfolgte später, so
dass eine hellbraune, transparente Lösung erhalten wurde. Sie hydrolysierte
Stärke,
aber nicht Gelatine. In der Kultur mit Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium
und Tyrosin-Agar-Kulturmedium
wurde die Produktion von Melaninpigment beobachtet, allerdings war
die Farbe von löslichem
Pigment hellbraun oder grau und es kam zu keiner speziellen Pigmentproduktion.
Gemäß Beobachtungen
mit einem Elektronenmikroskop waren die Lufthyphen davon rektiflexibel.
Drei bis fünf
Rollen dichter, spiralförmiger
Hyphen wurden in Hafermehl/Nitrat-Agar-Kulturmedium beobachtet,
wohingegen in Kartoffelextrakt/Hefeextrakt/Nitrat-Agar-Kulturmedium
offene, spiralförmige
Hyphen beobachtet wurden. In Hefeextrakt-Agar-Kulturmedium oder
Malzextrakt-Agar-Kulturmedium wurden hingegen keine spiralförmigen Hyphen
beobachtet. Sporen dieses Bakteriums waren in Linien an den Enden
der Hyphen ausgebildet und spiralförmige Hyphen waren sporuliert.
Die Oberfläche
der Sporen war glatt aber zerfurcht. Die Länge der Sporen betrug 0,5–1,0 μm, die Breite
betrug 0,5–0,7 μm.
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Sporangien
und bewegliche Sporen wurden nicht beobachtet.
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2) Wachstumsstatus in
verschiedenen Kulturmedienarten (27°C, 3 Wochen)
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- a)
Saccharose/Nitrat-Agar-Kulturmedium
Wachstum: | moderat |
Luftmyzel: | keins |
Rückseite: | 2ba
(perlweiß) |
Lösliches
Pigment: | keins |
b)
Glukose/Asparagin-Agar-Kulturmedium Wachstum: | moderat |
Luftmyzel: | keins |
Rückseite: | 2ba
(pearlweiß) |
Lösliches
Pigment: | keins |
c)
Glycerol/Asparagin-Agar-Kulturmedium Wachstum: | moderat |
Luftmyzel: | keins |
Rückseite: | 2ba
(perlweiß) |
Lösliches
Pigment: | keins |
d)
Stärke/anorganisches
Salz-Agar-Kulturmedium Wachstum: | gut |
Luftmyzel: | keins |
Rückseite: | 2ba
(perlweiß) |
Lösliches
Pigment: | keins |
e)
Tyrosin-Agar-Kulturmedium Wachstum: | moderat |
Luftmyzel: | kaum
b + 3ni + 4ni (austernweiß +
kobaltbraun + haselnussbraun) |
Rückseite: | 3pn
(dunkelbraun) |
Lösliches
Pigment: | 3p1
(tiefbraun) |
f)
Nähragar-Kulturmedium Wachstum: | schlecht |
Luftmyzel: | keins |
Rückseite: | 3ng
(ahorngelb) |
Lösliches
Pigment: | 3ng
(ahorngelb) |
g)
Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar-Kulturmedium Wachstum: | moderat |
Luftmyzel: | ausgezeichnet/grau |
Rückseite: | 3pi
(goldbraun) |
Lösliches
Pigment: | 3pn
(dunkelbraun) |
h)
Hafermehl-Agar-Kulturmedium Wachstum: | moderat |
Luftmyzel: | moderat
5ge (rosenholz) |
Rückseite: | 4ge
(rose-beige) |
Lösliches
Pigment: | keins |
i)
Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium Wachstum: | schlecht |
Luftmyzel: | keins |
Rückseite: | 2ba
(perlweiß) |
Lösliches
Pigment: | 5pn
(dunkelbraun) |
j)
Stärke/Hefeextrakt/Agar-Kulturmedium Wachstum: | gut |
Luftmyzel: | ausgezeichnet
4ge + 41i (rose-beige + biber) |
Rückseite: | 4ge
(rosa-beige) |
Lösliches
Pigment: | lih
(olive-grau) |
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Der
Farbcode entspricht der 4. Ausgabe des Descriptive Color Names Dictionary
(descriptives Farbnamenverzeichnis). 3)
Effizienz verschiedener Arten von Kohlenstoffquellen (Pridham/Gottlieb-Agar-Kulturmedium,
27°C Kultur)
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4) Andere physiologische
Eigenschaften (27°C
Kultur)
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- 1. Verflüssigung
von Gelatine (Glucose/Pepton/Gelatine-Kulturmedium) – keine Verflüssigung
- 2. Hydrolyse von Stärke
(Stärke/anorganisches
Salz-Agar-Kulturmedium) – hydrolysiert
- 3. Aggregation von entfetteter Milch und Peptonisierung – aggregiert
und peptonisiert
- 4. Produktion von Melaninpigment, Pigmentproduktion in Tyrosin-Agar-Kulturmedium
und in Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium
- 5. Wachstumstemperatur: 20–35°C
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Streptomyces
sp. mit den obigen Eigenschaften, wie gräuliche spiralförmige Hyphen,
Produktion von Melaninpigment, Sporen mit glatter Oberfläche, Verbrauch
der zuvor genannten Saccharide, wurde unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 8. Ausgabe, untersucht. Demzufolge wird schlussgefolgert,
dass das vorliegende Bakterium als Streptomyces griseosporevs oder
eine damit eng verwandte Spezies ist.
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Nachfolgend
wird ein Beispiel für
ein Mutationsverfahren zur Erzeugung von Streptomyces sp. SN-1061M (FERM BP-5800)
beschrieben, das große
Mengen von erfindungsgemäßen antibiotischen RK-1061s
und Salzen davon produzieren kann.
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Von
Stärke/Hefeextrakt-Schrägagarkulturmedium,
in dem Streptomyces sp. RK-1061 (FERM P-8278) wuchs, die erfindungsgemäße antibiotische
RK-1061s und Salze davon produzierte, wurden Sporen in 10 ml physiologischer
Kochsalzlösung
aufgenommen und in Schalen verteilt (1 × 108 Zellen/ml).
Unter Bedingungen, bei denen etwa 1% Zellen wachsen, fand eine Mutation
davon durch UV-Bestrahlung statt und gewachsene Kolonien wurden
in das gleiche Schrägkulturmedium
inokuliert. Von 66 Zelllinien, die in K1-Kulturmedium (Kulturmedium
mit 40 g Saccharose (Wako-junyaku),
30 g Sojabohnenpulver (Honen-seiyu), 20 g Weizenkeime (Sigma) oder
20 g Malzextrakt (Difco), 6 g Natriumchlorid (Wako-junyaku), eingestellt
auf pH 7,0) kultiviert wurden, wurde eine Zelllinie mit einer hohen
antibakteriellen Wirkung gegen Mycobacterium phlei ausgewählt und Streptomyces
sp. SN-1061M (FERM BP-5800) genannt.
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1) Morphologische Eigenschaften
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Wachstumstests
mit Streptomyces sp. SN-1061 in verschiedenen Arten von Agarkulturmedium
ergaben, dass sie in allen Medien wuchs. In Verbrauchstests mit
10 Saccharidarten verbrauchte sie alle Saccharide und wuchs, mit
Ausnahme von L-Rhamnose, wo der Verbrauch nicht gut war. Die Lufthyphen
waren weißlich und
die Rückseite
war hellbräunlich,
was nichts Besonderes war. In entfetteter Milch fand keine Aggregation statt
und es wurde eine hellbraune, transparente Lösung nach einer späteren Peptonisierung
davon erhalten. Es wurde weder eine Hydrolyse von Stärke noch
eine Verflüssigung
von Gelatine dadurch beobachtet. Eine Melaninpigmentproduktion wurde
in Hefeextrakt/Malzextrakt-Kulturmedium (ISP Nr. 2), Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Kulturmedium
(ISP Nr. 6) und Tyrosin-Agar-Kulturmedium beobachtet, allerdings
war das lösliche Pigment
hellbraun oder braun, was nichts Besonderes war. Im Rahmen von Beobachtungen
mit einem Elektronenmikroskop stellte man fest, dass die Lufthyphen
linear und weich waren, wobei sich 6 bis 10 Rollen von dichten,
spiralförmigen
Hyphen im Stärke/Hefeextrakt-Agar-Kulturmedium befanden.
Die Sporen des vorliegenden Bakteriums waren in Linien an den Enden
der Hyphen ausgebildet und spiralförmige Hyphen waren sporuliert.
Die Sporenoberfläche
war glatt aber zerfurcht. Die Länge
der Sporen betrug 0,6–1,2 μm, die Breite betrug
0,6–0,7 μm. Sporangien
und bewegliche Sporen wurden nicht beobachtet. 2)
Wachstumstatus in verschiedenen Arten von Kulturmedien (27°C, 3 Wochen)
![Figure 00160001](https://patentimages.storage.googleapis.com/49/c3/83/d6fe59bbbfbeb7/00160001.png)
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Die
Beschreibung der Farben entspricht dem Farbcode (Farbpalette) des
japanischen Normenverbands. 3)
Nutzung verschiedener Arten von Kohlenstoffquellen (ISP Nr. 9, 27°C, 3 Wochen)
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4) Andere physiologische
Eigenschaften
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- 1. Verflüssigung
von Gelatine (Glucose/Pepton/Gelatine-Kulturmedium) keine Verflüssigung
- 2. Hydrolyse von Stärke
nicht hydrolysiert
- 3. Aggregation von entfetteter Milch und Peptonisierung keine
Aggregation und peptonisiert
- 4. Produktion von Melaninpigment Pigmentproduktion in Kulturmedium
ISP Nr. 2, 6 und 7
- 5. Wachstumstemperatur: 27–37°C
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Vergleichsdaten
der Aktivitäten
von Streptomyces sp. RK-1061 und Streptomyces sp. SN-1061M in K1
Kulturmedium im Rahmen einer Kolbenkultur sind nachfolgend dargestellt.
Bei einem Vergleich der antibakteriellen Wirkung gegen Mycobacterium
phlei von Kulturüberstand
und Myzelextrakt davon am 5. und 7. Kultivierungstag wurde bei SN-1061M
eine antibakterielle Wirkung gefunden und bei RK-1061 nicht. Demzufolge
war Streptomyces sp. SN-1061M die nützlichere Zelllinie, die RK-1061
Substanzen stabil und in großen Mengen
gegenüber
Streptomyces sp. RK-1061 produzierte.
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[Fermentations- und Reinigungsverfahren]
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Das
Verfahren zur Fermentation der bakteriellen Zelllinie, die zu Streptomyces
sp. gehört
und erfindungsgemäße antibiotische
Liposidomycine produziert, und das Verfahren zur Isolierung und
Reinigung von Liposidomycinen, die durch Kultivierung gewonnen werden,
werden nachfolgend beschrieben. Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen antibiotischen
Liposidomycine (RK-1061s) können
die obigen Antibiotika-produzierenden Bakterien, die zu Streptomyces
sp. gehören,
durch ein gängiges
Antibiotikaproduktionsverfahren kultiviert werden. Es kann eine
Flüssigkultur
oder Feststoffkultur verwendet werden. Für eine Kultivierung im industriellen
Maßstab
können
Sporensuspensionen oder Kulturmedien der obigen Bakterien inokuliert
und durch Belüften
und Rühren
kultiviert werden.
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Die
Nährstoffquelle
des Kulturmediums ist nicht speziell beschränkt und die Kohlenstoffquelle,
Stickstoffquelle und andere normalerweise in mikrobiellen Kulturen
verwendete Bestandteile können
im Kulturmedium enthalten sein. Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Dextrin,
Glycerin, Glucose, Maltose, Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose, Inositol, L-Rhamnose,
L-Arabinose, D-Mannitol,
Raffinose, Salicin, L-Sorbose und/oder D-Glucosamin verwendet werden und als
Stickstoffquelle können
Weizenkeime, Malzextrakt, Pepton, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt,
Reiskleie, Weizenkleie, Harnstoff, Maisquellwasser, Ammoniumsalz, Nitrat
und andere organische und/oder anorganische Stickstoffverbindungen
verwendet werden. Außerdem können anorganische
Salze wie Tafelsalz, Phosphat, Metallsalze, einschließlich Natrium,
Kalium, Zink, Mangan, Eisen usw. zugegeben werden, und bei Bedarf
kann tierisches Öl,
pflanzliches Öl
und/oder mineralisches Öl
als Antischaummittel zugegeben werden. Die Kultivierungsbedingungen
wie Kultivierungstemperatur, Kultivierungsdauer usw. können so
gewählt
werden, dass ein angemessenes Bakterienwachstum und eine größtmögliche Liposidomycinproduktion
erreicht wird. Ein geeigneter pH-Wert
des Kulturmediums liegt z.B. bei 4–9, vorzugsweise bei 6–7, und
eine geeignete Kultivierungstemperatur liegt vorzugsweise bei 25–35°C. Selbstverständlich sind
diese Kultivierungsbedingungen wie Kulturzusammensetzungen, pH-Wert des Kulturmediums, Kultivierungstemperatur,
Rührbedingungen
je nach der verwendeten Spezies der Bakterienzelllinie, den Umgebungsbedingungen
usw. einzustellen, um beste Ergebnisse zu erhalten.
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Wie
zuvor beschrieben, kann eine Substanz, bei der R3 eine
Sulfatgruppe oder ein Wasserstoffatom ist, ferner selektiv produziert
werden, wenn eine bestimmte Kohlenstoffquelle verwendet wird. Zur
Erzeugung von Liposidomycinen von Kulturprodukten können Mittel,
die normalerweise zur Erzeugung von Stoffwechselprodukten verwendet
werden, entsprechend verwendet werden. Zum Beispiel kann ein oder
eine Kombination von Mittel(n) zur Nutzung der Differenz zwischen
Solubilität,
Adsorptionsaffinität,
relative Molekülmasse
usw. von Liposidomycinen und von Kontaminanten einmalig oder wiederholt
verwendet werden.
-
Im
Speziellen liegen Liposidomycine sowohl im Kulturfiltrat als auch
im Myzelkörper
vor und eine aktive Fraktion in Myzel kann durch Extraktion mit
Aceton, einschließlich
Wasser, und anschließender
Verdampfung von Aceton gewonnen werden. Nachdem diese mit dem obigen
Kulturfiltrat kombiniert wurde, können Liposidomycine durch Reinigung,
z.B. Lösungsmittelextraktion,
Silikagelchromatographie, Gelfiltrationschromatographie usw., erhalten
werden. Als Lösungsmittel
für die
Lösungsmittelextraktion
ist Butanol geeignet und Sephadex LH-20 ist für die Gelfiltrationschromatographie
geeignet. Gewonnene RK-1061s werden durch Hochleistungsflüssigchromatographie
in viele Komponenten-Peaks
getrennt. Vorzugsweise wird eine Umkehrphasenverteilungssäule verwendet.
Die den jeweiligen Liposidomycinen entsprechenden Fraktionen können aufgefangen,
kondensiert, entsalzt und gefriergetrocknet werden, um reine Liposidomycine
zu erhalten.
-
[Physikochemische Eigenschaften]
-
Die
Liposidomycine (RK-1061s) haben die folgenden physikochemischen
Eigenschaften:
- (1) Aussehen: weißes Pulver
(alle Komponenten)
- (2) relative Molekülmasse
und Molekülformel:
die durch Massenspektrometrie (FAB-MS) und hochauflösende Massenspektrometrie
(HRFAB-MS) bestimmte relative Molekülmasse und die Molekülformel
sind in Tabelle 1 enthalten. Tabelle
1
- (3) Schmelzpunkt: Die jeweiligen Komponenten haben keinen eindeutigen
Schmelzpunkt und zersetzen bei 150–250°C.
- (4) Spezifisches Drehvermögen:
Liposidomycine
A- (III):(c 0,1, 50% Methanol)
Liposidomycine
Z- (III):(c 0, 1, 50% Methanol)
- (5) UV-Absorptionsspektrum: jede Komponente weist eine maximale
Absorption bei 261–263
nm (50% Methanol) auf.
- (6) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Tablette): das Infrarotabsorptionsspektrum
von Liposidomycinen Z-(III) ist in 1 dargestellt.
- (7) 1H-NMR-Spektrum: 500 MHz, in deuteriertem
Methanol, Raumtemperatur. Das Spektrum der jeweiligen Verbindungen
ist wie folgt dargestellt: Liposidomycine Z (2), L (3),
M (4), K (5), N (6), A-(II)
(7), X-(III) (8), Y-(III)
(9), Z-(III) (10), C-(III)
(11), V-(III) (12), A-(III) (13),
G-(III) (14),
M-(III) (15), K-(III) (16),
N-(III) (17),
A-(IV) (18).
Obwohl die Molekülformel
C42H67N5O16 der Liposidomycine C-(III) ohne Sulfatgruppe
die gleiche ist wie bei den Liposidomycinen B ohne Sulfatgruppe
(CAS-registrierte Nummer: 113378-45-3), hat die erstere Verbindung
eine Methylgruppe am Ende der aliphatischen Seitenkette gemäß dem 1H-NMR-Spektrum aus 11 (t,
0,89 ppm, 3H), was ein Unterschied zu den Liposidomycinen B ohne
Sulfatgruppe ist (2 Methylgruppen am Ende der Seitenkette, Isotyp).
- (8) Solubilität:
die jeweiligen Komponenten sind in Methanol, Dimethylsulfoxid und
Wasser löslich,
aber in Hexan und Chloroform unlöslich.
- (9) Rf-Wert in DC: Rf-Wert bei einer DC (Silikagel Art. 5715
(Merk)), entwickelt mit Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:2).
Verbindungen
mit Sulfatgruppe (Typ (I), (II)): 0,35
Verbindungen ohne Sulfatgruppe
(Typ (III), (IV)): 0,41
- (10) Retentionszeit in HPLC: Die Retentionszeit der jeweiligen
Komponenten unter zwei verschiedenen Bedingungen ist in Tabelle
2 dargestellt. Tabelle
2
- (11) Struktur der aliphatischen Seitenkette R1
-
Typ (I)
-
- Z: Doppelbindung in Position 5–6
- L: Isotyp
- M: normaler Typ
- K: Doppelbindungen in Position 9–10 und 12–13
- N: Doppelbindung in Position 9–10
-
Typ (III)
-
- Y-(III): Doppelbindungen in Position 5–6 und 8–9
- Z-(III): Doppelbindung in Position 5–6
- A-(III): Doppelbindungen in Position 7–8 und 10–11
- G-(III): Doppelbindung in Position 7–8
- M-(III): normaler Typ
- K-(III): Doppelbindungen in Position 9–10 und 12–13
- N-(III): Doppelbindung in Position 9–10
-
Beispiel
-
Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von veranschaulichenden
Beispielen beschrieben, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht
begrenzen.
-
[1. Beispiel] – nicht
im Rahmen der vorliegenden Erfindung
-
- Produktion von RK-1061, dessen R3-Gruppe
eine Sulfatgruppe oder Wasserstoff ist (RK-1061 mit Sulfatgruppe und
RK-1061 ohne Sulfatgruppe)
-
Die
zuvor genannte, in Schrägagar-Kulturmedium
kultivierte RK-1061 Zelllinie wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben
inokuliert, der 70 ml flüssiges
Medium (pH 6,8) aus 2% Glucose, 1% löslicher Stärke, 0,1% Fleischextrakt, 0,4%
Hefeextrakt, 2,5% Sojabohnenpulver, 0,2% Natriumchlorid und 0,005%
Kaliumsekundärphosphat
enthielt, und 2 Tage lang bei 28°C
kultiviert. Ein Milliliter des Kulturmediums wurde in einen anderen Kolben
inokuliert, der das gleiche Kulturmedium wie oben enthielt, und
48–72
Stunden lang kultiviert. Des Weiteren wurden 140 ml dieses Kulturmediums
in einen 30 Liter fassenden Gefäßfermenter
inokuliert, der 18 Liter des gleichen Mediums wie oben enthielt,
und durch Belüften
und Rühren
unter den folgenden Bedingungen bei 28°C 65–90 Stunden lang kultiviert,
bis der pH-Wert über
8,4 lag:
- Belüftungsgeschwindigkeit:
18 Liter/Minute und
- Rührgeschwindigkeit:
350 rpm
-
Nach
der Fermentation wurde der Kulturüberstand (pH 8,8, der Durchmesser
der Wachstumsinhibition gegen Mycobacterium phlei betrug 20,2 mm)
vom Myzel (2,9 kg, der Durchmesser der Wachstumsinhibition gegen
Mycobacterium phlei betrug 24,3 mm) getrennt und das Myzel wurde
mit 5 Liter Aceton über
Nacht extrahiert. Die durch Verdampfen von Aceton aus der Extraktlösung unter
Vakuum gewonnene wässrige
Lösung wurde
mit dem Kulturüberstand
kombiniert und es wurde das gleiche Volumen an Butanol zugegeben,
woraufhin eine dreimalige Extraktion folgte. Die Butanollage wurde
unter Vakuum kondensiert, um etwa 60 g Rohextrakt zu gewinnen, der
in 80 ml Methanol gelöst
wurde. Anschließend
wurden 240 ml Chloroform zugegeben, und dies wurde auf eine Silikagelsäule (8 × 12 cm,
Merk, 70 × 230
mesh) aufgebracht, die mit Chloroform/Methanol (3:1) gesättigt war,
und Kontaminanten wurden mit Chloroform/Methanol (2:1) und Chloroform/Methanol (1:1)
ausgeschlossen. Anschließend
wurden aktive Substanzen mit Chloroform/Methanol (1:2) und Chloroform/Methanol
(1:3) eluiert.
-
Das
Eluat wurde unter Vakuum kondensiert, um etwa 14 g Rohextrakt zu
gewinnen, der in 20 ml Methanol gelöst und auf eine LH-20 Säule (3 × 79 cm,
Pharmacia) aufgetragen und fraktioniert wurde, um 10,3 g aktive
Substanz zu gewinnen. Ferner wurde dies auf eine Silikagelsäule (8 × 12 cm)
aufgetragen, die mit Butanol/Methanol/Wasser (4:1:2) gesättigt war,
und mit dem gleichen Lösungsmittel
wie oben eluiert, um aktive Substanzen (6,5 g) zu gewinnen.
-
Dies
wurde dann durch HPLC fraktioniert. Zunächst fand eine Trennung in
6 Fraktionen mit Senshu-pak ODS (20 ϕ × 250 mm, ODS-5251-SS, Senshukagaku)
und Acetonitril-0,1% Diethylamin/Ameisensäure (pH 4) (40:60) als Elutionsmittel
bei einer Fließgeschwindigkeit
von 10 ml/min statt und ferner wurden diese Fraktionen mit der gleichen
Säule,
der gleichen Fließgeschwindigkeit
und Acetonitril-0,1% Diethylamin/Ameisensäure (pH 4,0) (60:40) in 6 Fraktionen
fraktioniert. Diese Fraktionen wurden unter Vakuum kondensiert und mit
Capcell pak ODS (20 ϕ × 250
mm, SG-120, Shiseido) jeweils unter den gleichen Bedingungen wie
oben refraktioniert. Die wie oben erhaltenen jeweiligen Liposidomycinfraktionen
wurden unter Vakuum kondensiert, um Acetonitril zu entfernen. Wasser
wurde zu jeder Fraktion zum Entsalzen gegeben, dann wurde dies auf
MCI GEL (1 × 5
cm, Mitsubishi kasei) gegeben, mit ausreichend Wasser gewaschen,
mit 50% Aceton eluiert, unter Vakuum kondensiert und gefriergetrocknet,
um ein weißes
Pulver aus Liposidomycinen als aktive Substanz zu erhalten.
-
[2. Beispiel] – nicht
im Rahmen der vorliegenden Erfindung
-
- Produktion von RK-1061, dessen R3-Gruppe
eine Sulfatgruppe oder Wasserstoff ist (RK-1061 mit Sulfatgruppe und
RK-1061 ohne Sulfatgruppe)
-
Die
zuvor genannte, in Schrägagarkulturmedium
kultivierte SN-1061M Zelllinie wurde in einem 500 ml Erlenmeyerkolben
inokuliert, der 70 ml flüssiges
Medium (pH 6,7) (C4 Medium) aus 2% Glucose, 1% löslicher Stärke, 0,1% Fleischextrakt, 0,4%
Hefeextrakt, 2,5% Sojabohnenpulver, 0,2% Natriumchlorid und 0,005%
Kaliumsekundärphosphat
enthielt, und 2 Tage lang bei 27°C
kultiviert. Ein Milliliter dieses Mediums wurde in einen Kolben
inokuliert, der das gleiche Medium wie oben enthielt, und 5 Tage
lang kultiviert. Das Kulturmedium wurde in Kulturüberstand
und Myzel durch Zentrifugieren getrennt, das Myzel wurde gewogen,
der pH-Wert des Überstands
wurde gemessen und die antibakterielle Wirkung des mit Aceton extrahierten
Materials von Myzel wurde untersucht. Die antibakterielle Wirkung
wurde geprüft,
indem der Durchmesser der Inhibitionszone auf einer Papierscheibe
(mit einem Durchmesser von 8 mm), die mit 40 μl des Kulturmediums getränkt wurde, nach
der Kultivierung mit Mycobacterium phlei und Escherichia coli BE
unter geeigneten Bedingungen gemessen wurde.
-
Ferner
wurden Kulturüberstand
und Myzelextrakt jeweils mit Butanol extrahiert, kondensiert und
getrocknet, in 1/10 Volumen Methanol gelöst und dann durch HPLC und
DC analysiert. Die HPLC-Analyse erfolgte mit Acetonitril/0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH
4,0) (45:55) als Elutionsmittel (Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min,
nachgewiesen bei 254 nm) und einer Capell pak ODS-Säule (4,6 ϕ × 250 mm,
Shiseido). Eine DC wurde mit Silikagel Art. 5715 (0,25 mm, Merk)
und Butanol-Essigsäure-Wasser
(4:1:2) als Entwicklungslösungsmittel
durchgeführt.
Die Ergebnisse bezüglich
antibakterieller Wirkungen sind in Tabelle 3 aufgeführt und
die Ergebnisse der DC und HPLC sind jeweils in 19 und 20 enthalten.
Außerdem
wurde eine Kultivierung wie oben durchgeführt, bei der Glucose im Kulturmedium
durch Maltose ersetzt wurde.
-
[3. Beispiel]
-
- Produktion von RK-1061, dessen R3 ein
Wasserstoffatom ist (RK-1061 ohne Sulfatgruppe)
-
Die
in Schrägagarmedium
kultivierte SN-1061 Zelllinie wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben
inokuliert, der 70 ml flüssiges
Medium enthielt, wobei Glucose als Kohlenstoffquelle in dem im 2.
Beispiel beschriebenen Medium (C4 Medium) durch eine aus der Gruppe
bestehend aus Xylose, Lactose, D-Fructose, Saccharose, Inosito oder
D-Mannitol ersetzt
wurde, und 2 bis 4 Tage lang unter Rühren mit 200 rpm bei 28°C kultiviert.
Zwei Milliliter des Kulturmediums wurden in einen Erlenmeyerkolben
inokuliert, der das gleiche Medium wie oben enthielt, und unter
den gleichen Bedingungen wie oben 5 Tage lang kultiviert; es wurde
gefunden, dass im Speziellen eine aktive Komponente ohne Sulfatgruppe
produziert wurde. Das Kulturmedium wurde zum Trennen von Kulturüberstand
und Myzel zentrifugiert. Das Myzel wurde gewogen und der pH-Wert
des Überstands
wurde gemessen. Die antibakterielle Wirkung des Acetonextrakts des
Myzels wurde untersucht. Die antibakterielle Wirkung wurde geprüft, indem
der Durchmesser der Zellwachstums-Inhibitionszone auf einer Papierscheibe
(mit einem Durchmesser von 8 mm), die mit 40 μl des Kulturmediums getränkt wurde,
nach der Kultivierung mit Mycobacterium phlei und Escherichia coli
BE unter geeigneten Bedingungen gemessen.
-
Ferner
wurden Kulturüberstand
und Myzelextrakt mit Butanol extrahiert, kondensiert und getrocknet und
in 1/10 Volumen Methanol gelöst,
und es erfolgte eine HPLC und DC Analyse. Die HPLC-Analyse erfolgte mit
Acetonitril/.0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4,0) (45:55) als Elutionsmittel
(Fließgeschwindigkeit:
1,5 ml/min, nachgewiesen bei 254 nm) und einer Capcell pak ODS-Säule (4,6 ϕ × 250 mm,
Shiseido). Eine DC fand mit Silikagel Art. 5715 (0,25 mm, Merk)
und Butanol-Essigsäure-Wasser
(4:1:2) als Entwicklungslösungsmittel
statt. Die Ergebnisse bezüglich
antibakterieller Wirkungen sind in Tabelle 3, die Ergebnisse der
DC in 19 aufgeführt.
-
[4. Beispiel]
-
- Produktion von RK-1061, dessen R3 ein
Wasserstoffatom ist (RK-1061 ohne Sulfatgruppe)
-
Die
in Schrägagarmedium
kultivierte SN-1061 Zelllinie wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben
inokuliert, der 70 ml Medium (K1 Medium) aus 40 g Saccharose (Wako-junyaku),
30 g Sojabohnenpulver (Honen-seiyu), 20 g Weizenkeimen (Sigma) oder
Malzextrakt (Difco), 6 g Natriumchlorid (Wako-junyaku), pH 7,0, enthielt, und 2 bis
4 Tage lang unter Rühren
mit 200 rpm bei 27°C
kultiviert. Zwei Milliliter des Kulturmediums wurden in einen Erlenmeyer-Kolben
inokuliert, der das gleiche Medium wie oben enthielt, und unter
den gleichen Bedingungen wie oben 5 Tage lang kultiviert; es wurde
gefunden, dass im Speziellen eine aktive Komponente ohne Sulfatgruppe
produziert wurde. Das Kulturmedium wurde zum Trennen von Kulturüberstand
und Myzel zentrifugiert. Das Myzel wurde gewogen und der pH-Wert
des Überstands
wurde gemessen. Die antibakterielle Wirkung des Acetonextrakts des
Myzels wurde untersucht. Die antibakterielle Wirkung wurde geprüft, indem
der Durchmesser der Zellwachstums-Inhibitionszone auf einer Papierscheibe
(mit einem Durchmesser von 8 mm), die mit 40 μl des Kulturmediums getränkt wurde,
nach der Kultivierung mit Mycobacterium phlei und Escherichia coli
BE unter geeigneten Bedingungen gemessen wurde.
-
Ferner
wurden Kulturüberstand
und Myzelextrakt mit Butanol extrahiert, kondensiert und getrocknet und
in 1/10 Volumen Methanol gelöst,
und es erfolgte eine HPLC- und DC-Analyse. Die HPLC-Analyse erfolgte mit
Acetonitril/0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4,0) (45:55) als Elutionsmittel
(Fließgeschwindigkeit:
1,5 ml/min, nachgewiesen bei 254 nm) und einer Capcell pak ODS-Säule (4,6 ϕ × 250 mm,
Shiseido). Eine DC erfolgte mit Silikagel Art. 5715 (0,25 mm, Merk)
und Butanol-Essigsäure-Wasser
(4:1:2) als Entwicklungslösungsmittel.
Die Ergebnisse bezüglich
antibakterieller Wirkungen sind in Tabelle 3, die der DC und HPLC
jeweils in
19 und
21 aufgeführt. Tabelle
3
-
[5. Beispiel]
-
- Produktion von RK-1061, dessen R3-Gruppe
ein Wasserstoffatom ist (RK-1061 ohne Sulfatgruppe)
-
Die
zuvor genannte, in Schrägagarkulturmedium
kultivierte SN-1061M Zelllinie (FERM BP-5800) wurde in einen 500
ml Erlenmeyerkolben inokuliert, der 70 ml KI enthielt, und 2 bis
3 Tage lang bei 28°C
kultivier. Ein Milliliter des Kulturmediums wurde in einen anderen
Kolben inokuliert, der das gleiche Kulturmedium wie oben enthielt,
und 48 bis 72 Stunden lang kultiviert. Ferner wurden 140 ml dieses
Kulturmediums in einen 30 Liter fassenden Gefäßfermenter inokuliert, der
18 Liter des gleichen Mediums wie oben enthielt, und durch Belüften und
Rühren
unter den folgenden Bedingungen bei 27°C 5 bis 8 Tage lang kultiviert:
- Belüftungsgeschwindigkeit:
18 Liter/Minute und
- Rührgeschwindigkeit:
350 rpm
-
Nach
der Kultur wurde Myzel durch Zentrifugieren getrennt und über Nacht
mit Aceton extrahiert. Zu der durch Verdampfen von Aceton von der
Extraktlösung
unter Vakuum erhaltenen wässrigen
Lösung
wurde das gleiche Volumen Butanol gegeben, woraufhin eine dreimalige
Extraktion folgte. Die Butanollage wurde unter Vakuum kondensiert,
um etwa 30,4 g Rohextrakt zu erhalten, der in 80 ml Methanol gelöst wurde.
Anschließend
wurden 240 ml Chloroform zugegeben und mit 50 g Silikagel vermischt;
dies wurde auf eine Silikagelsäule
(8 × 18
cm) aufgetragen, die mit Chloroform/Methanol (3:1) gesättigt war,
und Kontaminanten wurden mit Chloroform/Methanol (2:1) und Chloroform/Methanol
(1:1) entfernt. Anschließend
wurde die aktive Substanz mit Chloroform/Methanol (1:2) und Chloroform/Methanol
(1:3) eluiert. Die eluierte Lösung
wurde unter Vakuum kondensiert, um etwa 7,73 g Rohextrakt zu gewinnen,
der in Acetonitril/0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4) (40:60) gelöst wurde,
so dass die Konzentration davon 100 mg/ml betrug, und zum Trennen
des Kulturüberstands
zentrifugiert. Dies wurde dann weiter durch HPLC fraktioniert. Zunächst erfolgte
eine Trennung mit Senshu pak ODS (20 ϕ × 250 mm) und Acetonitril-0,1%
Diethylamin-Ameisensäure (pH
4) (40:60), (50:50), (60:40) als Stufenelutionsmittel mit einer
Fließgeschwindigkeit
von 10 ml/min. Anschließend
fand eine Refraktionierung mit Capcell pak ODS (20 ∅ × 250 mm)
mit Acetonitril-0,1% Diethylamin-Ameisensäure (pH 4)
(37,3:62,5), (42,5:57,5), (50:50) als Stufenelutionsmittel statt,
um die einzelnen Komponenten zu erhalten. Jede wie oben gewonnene
Liposidomycin-Fraktion wurde unter Vakuum kondensiert, um Acetonitril
zu entfernen. Wasser wurde zu den jeweiligen Fraktionen zum Entsalzen
gegeben; dies wurde auf MCI GEL (1 × 5 cm) aufgetragen, mit einer
ausreichenden Wassermenge gewaschen, mit 70% Aceton eluiert, unter
Vakuum kondensiert und gefriergetrocknet, um ein weißes Pulver
von Liposidomycinen als aktive Substanz zu erhalten. Unter diesen
Bedingungen wurden die Liposidomycine (C-(III) (51,8 mg) und M-(III)
(34,1 mg) als Hauptkomponenten erhalten.
-
[Biologische Aktivität]
-
(1) Antibakterielle Wirkung
-
Eine
Papierscheibe mit 8 mm Durchmesser (Thick, Toyoroshi) wurde mit
Methanollösung
der jeweiligen getesteten Substanzen in einer spezifischen Konzentration
getränkt
und getrocknet und auf eine Platte mit den jeweiligen Bakterien
gegeben. Nach einer Kultivierung unter für die jeweiligen Bakterien
geeigneten Bedingungen wurde der Durchmesser des Zellwachstums gemessen.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4, 5 und 6 enthalten. Tabelle
4
Tabelle
5
- – steht
für „nicht
geprüft"
Tabelle
6
-
(2) Inhibitionswirkung
gegen Peptidglycansynthese
-
Rohenzym
und Substrat UDP-MurNAc-Pentapeptid wurden jeweils von Escherichia
coli und Bacillus subtilis gemäß einer
Referenz (J. Biol. Chem., 243, 3180 (1968)) hergestellt. Die enzymatische
Reaktion erfolgte durch Vermischen von 5 μl 1M Tris-HCl (pH 7,5), 10 μl 0,1M MgCl2, 5 μl
2 mM UDP-MurNAc-Pentapeptid, 5 μl
Enzymlösung
(15 mg/ml Proteinkonzentration), 5 μl Probe, 5 μl UDP-[U-3H]GlcNAc (10 μ Ci/ml, 25,8 Ci/mmol,
Dupont) und 15 μl
Wasser bei 37°C über einen
Zeitraum von 60 Minuten, und 1 ml des Reaktionsgemischs wurde zu
5% TCA gegeben. Nach einer Eiskühlung
wurde es auf einem GF/C Glasfilter (2,4 cm, Whatman) aufgefangen.
Nach der Zugabe eines Szintillators wurde die Strahlung davon gezählt. Die
prozentuale Inhibition wurde durch einen Vergleich mit der Zahl
der Kontrolle berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 enthalten.
-
(3) Zytotoxizitätstest
-
BALB/3T3
Zellen (100 μl)
wurden in mit 10% FBS ergänztem
DMEM-Medium (Gibco) in einer 96-Well-Platte, um 1 × 10
5 Zellen/ml zu erhalten, unter 5% CO
2 bei 37°C
inokuliert und über
Nacht kultiviert. Die in Methanol gelöste Testsubstanz wurde zugegeben
und 3 weitere Tage kultiviert, und nach der Zugabe von 10 μl 2,5 mg/ml
MTT-Reagens (Sigma)
weitere 4 Stunden lang kultiviert. Nach dem Entfernen des Überstands
wurden 100 μl
DMSO zugegeben und über
Nacht stehen gelassen. Die Absorbanz davon bei 540 nm wurde bestimmt,
um lebensfähige
Zellen nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 enthalten. Tabelle
7
Tabelle
8
-
Industrielle Nützlichkeit
-
Wie
speziell beschrieben wurde, stellt die vorliegende Erfindung neuartige
antibiotische Liposidomycine und Salze davon sowie ein Verfahren
zur Herstellung von Liposidomycinen bereit. Antibiotische Liposidomycine
der vorliegenden Erfindung haben eine recht geringe Zytotoxizität, aber
eine starke antibakterielle Wirkung, indem sie die Peptidoglycansynthese
inhibieren.
-
Verweis auf Mikroorganismen
-
- 1.
Streptomyces sp. SN-1061M
Hinterlegungsstelle: | National
Institue of Bioscience und Human Technology Agency of Industrial
Science und Technology Ministry of International Trade and Industry |
Adresse: | 1–3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan |
Hinterlegungsdatum: | 28.
Januar 1997 |
Hinterlegungs-Nr.: | FERM
BP-5800 |