JPH02306992A - 抗生物質ｒｋ―１０６１ｇ及びｒｋ―１０６１ｈ並びにその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規抗生物質及びその製造法に関する。

〔発明の背景〕

本発明者は、新規抗生物質の探索を目的として多数の土
壌中から微生物を分離し、その産生ずる抗生物質を分離
探索し、ストレプトミセス属に属する微生物の培養液及
び培養菌体に文献未載の新規抗生物質ＲＫ−１０６１Ａ
、　ＲＫ−１０６１Ｂ及びＲＫ−１０６１Ｃが産生、蓄
積されることのＱ新たな知見を得た（特開昭６１−２８
２０８８号公報参照）。本発明者は、上記微生物の産生
物につき更に研究を行った結果、上記ＲＫ−１０６１Ａ
、ＲＫ−１０６１ＢＳＲＫ−１０６ＩＣとは異なる新規
抗生物質を見出し、本発明を完成するに至った。

〔本発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、新規抗生物質及びその製造法を提供す
ることである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の新規抗生物質は、ストレプトミセス属に属する
抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈ生産菌
を培養し、その培養物から分離採取される、以下の構造
式と後述の理化学的性質及び生物学的性質を有する抗生
物質ＲＫ−１０６１ＧとＲＫ−１０６１Ｈを包含する。

（発明の構成） く使用する微生物〉 まず、本発明において用いる微生物は、抗生物質ＲＫ−
１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈの生産能を有するもの
であり、ストレプトミセス属に属する菌種である。

その−例として、ストレプトミセス・エスピー・ＲＫ　
−１０６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｓｐ、　　Ｒ
Ｋ−１０６１（以下“ＲＫ−１０６１株”という）と呼
称される微生物は上記の特性を有し、本発明の抗生物質
ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈを有利に生産す
るものであり、本発明方法に有効に利用し得るものであ
る。

また、上記ＲＫ−１０６１株の自然的及び人工的変異株
は勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述の抗生
物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈの生産能を
有する微生物はすべて本発明方法において使用すること
ができる。

上記ＲＫ−１０６１株は、本発明者により山梨県御坂町
で採取された土壌中より発見された土壌放線菌であり、
工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６０年５月２９
日付寄託され、その微生物受託番号は、微工研菌寄第８
２７８号（ＦＥＲＭ　Ｐ　−８２７８）である。

ＲＫ−１０６１株は、次の菌学的性質を有する。

■、形　態 ＲＫ−１０６１株は山梨県御坂町で採取した土壌より分
離した放線菌で全細胞の塩酸加水分解物のペーパークロ
マトグラフではり、　　Ｌ−ジアミノピメリン酸だけを
検出し、メソ−ジアミノピメリン酸は検出されない。各
種寒天培地上での生育試験では、試験した１０種の全て
の培地上に発育するが、スターチ・イーストエキス寒天
培地上での発育は良好で気中菌糸と胞子の着生は豊富だ
が、これ以外の寒天培地上での気中菌糸と胞子の着生は
良好でない。１１種の糖を炭素源とする利用試験に於て
は、本菌は全ての糖を利用し発育する。本菌の気中菌糸
は灰色系であり、裏面は淡褐色系であって特徴はない。

脱脂牛乳中での発育では始めに凝固を起すが後にペプト
ン化し茶色の透明液を与える。澱粉を加水分解するが、
ゼラチンを液化しない。ペプトン・イーストエキス・鉄
寒天培地およびチロシン寒天培地上でメラニン色素の生
成が認められるが可溶性色素は淡褐色ないし灰色で特徴
ある色素の生成は認められない。電子顕微鏡の観察によ
ると気中菌糸は直状柔性であり、オートミール・硝酸塩
寒天培地およびポテトエキストラクト・イーストエキス
トラクト硝酸塩寒天培地上では３〜５回のらせん状菌糸
がみられ、前者培地では密ならせん状であるが後者では
オーブンスパイラルである。一方イーストエキス、モル
トエキス寒天培地上に発育したものではらせん菌糸は認
め難い。本菌の胞子は菌糸先端より多数連なって形成さ
れらせん菌糸部分は胞子化する。胞子表面は平滑である
がしわ状である。

胞子の大きさは長さ０．５〜１．０マイクロメーター、
巾０．５〜０．７マイクロメーターである。スボランギ
アおよび運動性胞子は観察されなかった。

■、各種培地上における生育状態 （２７℃　３週間培養） 色調の記載はディスクリティブ・カラー・ネイムズ暖デ
ィクショナリー（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ　ｃｏｌｏｒ
ｎａｍｅｓ　ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）第４版の色名記号
による。

■、シュクロース・硝酸塩寒天培地 穴　　育：普通 気菌糸：なし 裏　　　面：２ｂａ（バール） 可溶性色素：な　し ２、グルコース・アスパラギン寒天培地穴　　育：普　
通 気菌糸：なし 裏　　　面：２ｈａ（バール） 可溶性色素：な　し ３、グリセロール・アスパラギン寒天培地穴　　育：普
　通 気菌糸：なし 裏　　　面：２ｈａ（バール） 可溶性色素：な　し ４、スターチ・無機塩寒天培地 発　　育：普通 気菌糸；なし 裏　　　面：２ｂａ（パール） 可溶性色素：な　し ５、チロシン寒天培地 発　　育：普通 気　菌　糸：少量ｂ　＋　３　ｎｉ＋　４　ｎｉ（オイ
スターホワイト＋コバードブラウン＋チェストナツトブ
ラウン） 裏　　　面＋３ｐｎ（ダークブラウン）可溶性色素＝３
ρｌ（ディープブラウン）６、栄養寒天培地 発　　育：不良 気菌糸：なし 裏　　　面：３ｎｇ（イエローメイブル）可溶性色素＝
３ｎ呂（イエローメイプル）７、イーストエキス・モル
トエキス寒天培地発　　育：普通 気　菌　糸：豊富ｅ（グレー） 裏　　　面：３ｐｉ（ゴールドブラウン）可溶性色Ｓ：
３ｐｎ（ダークブラウン）８、オートミール寒天培地 発　　育：普通 気　菌　糸：普通５ｇｅ（ローズウッド）裏　　　面＋
４ｇｅ（ローズベイシュ）可溶性色素：な　し ９、ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地発　　育：
不良 気菌糸：なし 裏　　　面：２ｂａ（パール） 可溶性色素＋５ｐｎ（ダークブラウン）１０、スターチ
・イーストエキス寒天培地発　　育：良好 気　菌　糸：豊富４ｇｅ＋４ｊ’ｉ　　（ローズベイシ
ュ＋ビーバー） 裏　　　面：４ｇｅ（ローズウッド：Ｌ）可溶性色素：
１ｉｈ（オリーブグレー）■、炭素源の資化性（ブリド
ハム・ボッ）　ＩＪ−ブ寒天培地）　（２７℃培養） 発育状況 １、　　Ｌ−アラビノース　　　　＋＋２、　　Ｄ−キ
シロース　　　　＋＋＋＋３　　Ｄ−グルコース　　　
　　＋＋４、　　Ｄ−フルクトース　　　　＋ ５、　シュクロース　　　　　　＋ ６゜　イノシトール　　　　　　＋ ７、　　Ｌ−ラムノース　　　　　　＋８、　ラフィノ
ース　　　　　　＋ ９、　　Ｄ−マンニトール　　　　＋ １０、　　ラクトース　　　　＋＋＋ １１、　　メリビオース　　　　　　＋＋＋：発育する ＋＋：良く発育する ＋＋＋：非常に良く発育する ■、その他の生理的性質（２７℃培養）１、ゼラチンの
液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地） 液化しない。

２、スターチの加水分解くスターチ・無機塩寒天培地） 加水分解する。

３、脱脂牛乳の凝固とペプトン化 凝固しペプトン化する。

４、メラニン様色素の形成 チロシン寒天培地、ペプトン・イースト鉄寒天培地上で
の色素の生成がある。

５、生育温度 ２０〜３５℃ 上記の諸性質を有するストレプトミセス属、すなわち、
灰色系でスパイラル菌糸を有し、メラニン様色素を生成
し、胞子平面が平滑であり、前記記載の糖を利用する種
をパージエイズ・マニュアＪいオブ・ディタミネイティ
ブ・バクテリオロジー・第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍ
ａｎｎｕａｌ　ｏｆ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　８ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（
１９７４））により調べた。その結果、本図は、ストレ
プトミセス・グリゼオスボレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｓｐｏｒｅｕｓ）か、これに極め
て近縁の種と推定される。

（培養法及び精製法） 本発明の抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１
Ｈを得るに当っては、ストレプトミセス属に属する上記
抗生物質生産菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培
養することができる。培養の形態は、液体培養でも固体
培養でもよく、工業的に有利に培養するためには、前記
生産菌の胞子′！Ｉ３濁液又は培養液を培地に接種し、
通気撹拌培養を行えばよい。

培地の栄養源としては特に限定されることはなく、微生
物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源その他を培地
中に含有させることができる。炭素源としては、澱粉、
デキストリン、グリセリン、グルコース、シュクロース
、ガラクトース、イノシトール、マンニトールなどが、
また窒素源としては、ペプトン、大豆粉、肉エキス、米
ぬか、麩、尿素、コーンステイープリカー、アンモニウ
ム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒素化合物が
用いられる。その他、無機塩類、たとえば食塩、燐酸塩
類、カリウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金
属塩類等を適宜に添加してもよく、必要に応じて消泡剤
として、動、植、鉱物油等を添加してもよい。培養温度
、培養時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、しかも
ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈの生産が最高と
なるような条件が選ばれる。たとえば、培地のｐｔ＋は
４〜９、特に６〜７付近がよく、培養の適温は２５−３
５℃程度がよい。しかし、これらの培養組成物、培地の
水素イオン濃度、培養温度、撹拌条件などの培養条件は
使用する菌株の種類や、外部の条件などに応じて好まし
い結果が得られるように適宜調節されるべきであること
はいうまでもない。このようにして得られる培養物から
、ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈを得るには、
代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜に利
用して採取し得る。たとえば、ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲ
Ｋ−１０６１Ｈと不純物との溶解度差を利用する手段、
イオン結合力の差を利用する手段、吸着親和力の差を利
用する手段、分子量の差を利用する手段のいずれも、そ
れぞれ単独、又は、適宜組合わせて、あるいは反復して
使用される。具体的には、ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−
１０６１Ｈは、大部分が、その培養濾液に存在するが１
．菌体中に存在する活性区分は、含水アセトン抽出後ア
セトンを留去して得られる。これを、前記培養濾液と合
わせ、吸着クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグ
ラフィー、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組合せ
て精製すると、ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈ
及びその他の活１＄成分を含んだ複合体（ＲＫ−１０６
１ｍ合体）を得る。吸着クロマトグラフィーの担体とし
ては、ダイヤイオンＨＰ−１０が、液体クロマトグラフ
ィーの担体としては、ＭＣＩ　　ＧＥＬ　　ＣＨＰ−２
０Ｐが、イオン交換クロマトグラフィーの担体としては
、ダウエックス　（Ｄｏｗｅｘ）　５０　Ｗ　Ｘ　４が
、またゲル濾過クロマトグラフィーの担体としては、セ
ファデックスＬＨ−２０等が好適である。

得られたＲＫ−１０６１複合体を、高速液体クロマトグ
ラフィーに付すと、多成分のピークに分れる。使用カラ
ムは、逆相分配型のものが有利である。

得られたピークのうち、ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１
０６１Ｈに相当するピークを、それぞれ分取し、濃縮、
凍結乾燥することにより、純粋なＲＫ−１０６１Ｇ及び
ＲＫ−１０６１Ｈを、それぞれ得る。

［ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈの理化学的性
質、生物学的性質〕 （１）形　状：ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈ
のいずれも白色粉末である。

（２）融　点：ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈ
のいずれも１９０℃以上で分解する。

（３）分子量：　ＦＡＢ・マススペクトルによる。

ＲＫ−１０６１Ｇ：ＭＨ”　１０３６　（分子式Ｃ，，
Ｈ，、Ｎ、０２，５）ＲＫ−１０６１）１：Ｍｌｌ”　
１０２４　（分子式Ｃ，，Ｈ，、Ｎ、０２．Ｓ）（４）
溶解性： （５）核磁気共鳴スペクトル： ４００Ｍ）Ｉｚ、溶媒ＣＤ、００、標準ＴＭＳＲＫ−１
０６１６：第１図のとおり。

ＲＫ−１０６１１１：第２図のとおり。

（６）Ｒｆ値（シリカゲル薄層クロマトグラフィー）：
溶　　　　媒　　　　　　　　　Ｒｒ値ＲＫ−１０６１
，６：ブタノールーメタノール　　０．３６水（４：１
：２） クロロホルム−メタノ−０，６８ ル（１：３） 水飽和ブタノール　　　　　０．０４ ＲＫ−１０６１１（’：　　　　　同　　　上　　　　
　　　　同　上（７）呈色反応： ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈのいずれも過マ
ンガン酸カリウム溶液を脱色し、アニスアルデヒド−硫
酸試薬、アントロン試薬、ニンヒドリン試薬に陽性であ
る。

（８）塩基性、酸性、中性の区別： ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈのいずれも濾紙
電気泳動法による区別では、両性物質である。

（９）ペプチドグリカン合成酵素阻害活性：大腸菌より
調製したペプチドグリカン合成酵素の粗酵素を用い基質
であるＵＤＰ−［Ｕ−１４Ｃ〕−Ｎ−アセチルグリコサ
ミンのペプチドグリカン画分への取りこみを測定したと
ころ、ペプチドグリカン合成酵素阻害活性が認められた
。

以上、本発明の抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１
０６１Ｈの理化学的性質及び生物学的性質を、既知の抗
生物質と比較し、新規物質であると結論した。

本発明のＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈは、各
種細菌に対して類縁の既知物質　ＲＫ−１０６１Δ、Ｒ
Ｋ−１０６１８と同等な抗菌活性を有することが期待で
き、ペプチドグリカン合成酵素阻害活性を有することか
ら、抗菌剤としての利用が期待される。

以下に、本発明を実施例によって説明する。

〈実施例〉 ３０１容積のジャーファーメンタ−に入れたグルコース
２％、可溶性澱粉１％、肉エキス０．１％、酵母０．４
％、大豆粉２．５％、食塩０．２％、第二燐酸カリ０．
００５％の組成よりなる培地１８Ｉｌに、あらかじめ同
一培地に、前記ＲＫ−１０６１株（微工研菌寄第８２７
８号）を接種して４８〜７２時間２８℃で振盪培養した
培養液１４０ｄを接種して２８℃で６５〜７０時間、ｐ
Ｈが８．４を越えるまで通気撹拌培養を行う。このとき
の通気量は毎分１８１１撹拌回転数は３５０　ｒｐｍで
ある。

培養終了後、培養液に濾過助剤セライトを加えて遠心濾
過し菌体と濾液とに分ける。菌体は８０％アセトン１５
ｆｌを用いて抽出し、これを減圧濃縮してアセトンを溜
去し２．５１の水溶液を得る。

濾液７５！　（ジャーファーメンタ−６基分）を、ＨＣ
ＩでｐＨ１，０に調整した後、先に得られた菌体抽出水
溶液と共にダイヤイオンＨＰ−１０７Ｎの樹脂塔に通過
し、吸着させる。２０βの水を用いて洗浄後、３０％含
水メタノール２０１を用いて溶出を行なうと、不純物が
溶出される。次いで、５０％含水アセトン４０１を用い
て溶出を行うと、活性部分が溶出される。これを減圧下
に濃縮し、濃縮液６１を得る。これに３Ｉ！の丁１−ブ
タノールを加えてブタノール抽出を行なう。この換作を
３回繰り返し活性成分を含むブタノール１ｉｏｐを得る
。ブタノール層を減圧濃縮し、凍結乾燥すると２７．９
　ｇのＲＫ−１０６１複合体の粗粉末を得る。この粗粉
末をクロロホルム−メタノールの溶剤系を用いてシリカ
ゲルのカラム（６，ＯＸ　６５ｃｒｎ）によりクロマト
グラフィーを行なう。活性はクロロホルム−メタノール
（１：２）より（１：　３）の溶出区分に現われる。活
性画分を減圧ａ縮し、凍結乾燥すると１６．０　ｇの粗
粉末が得られる。

この粗粉末を少量の１０％含水ア七トンに溶解し、予め
同一溶液で調製したＭＣｌ−ゲルのカラム（３，Ｏｘ　
７５ｃｍ）にチャージして、１０％含水アセトンで十分
洗浄の後、５０％含水アセトンにて活性成分を溶出する
。活性部分を集めて減圧濃縮し、凍結乾燥すると２．５
ｇの粗粉末が得られる。

水に不溶の不純物を除くために、水に溶解後室温で２８
００ｒｐｍｌＯ分間の遠心を行なう。上清を減圧濃縮し
、凍結乾燥すると１．２　ｇの粗粉末が得られる。

この粗粉末を少量の０．１　Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ４
，０）の緩衝液に溶解し、予め同一緩衝液で調製した陽
イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０　Ｗｘ　４　　（１００
〜２００ＩＴＩｅｓｈ）カラム＜３．　Ｏｘ　８０ｃｍ
）を通過させる。同一緩衝液にて素通りしてきた活性部
分を減圧濃縮し、凍結乾燥すると６２０ｍｇの粗粉末が
得られる。

さらに、これをセファデックスＬＨ−２０カラム（２，
２×７２ＣＩ１１）にかけ、３０％含水メタノールにて
展開し、活性部分を減圧濃縮し、凍結乾燥することによ
りＲＫ−１０６Ｂｉｔ合体粉末３２０ｎａｇを得る。

このＲＫ−１０６１複合体の精製は、逆相カラム（ヌク
レオジル５Ｃ１８、φ８Ｘ２５０ｍｍ）を用いた高速液
体クロマトグラフィーを、アセトニトリル−０，１％ジ
エチルアミン・炭酸（３４：６６）の溶媒系で流速２ｄ
／分にて行なうと公知のＲＫ−１０６１Δ及びＲＫ−１
０６１Ｂのピークを含む多成分のピークに分かれる（第
３図参照）。この溶媒系で、保持時間１５分付近のピー
クを分取し、アセトニトリルを除去後、混在する塩を除
くために謹り返し凍結乾燥することによりＲＫ−１０６
１Ｇの白色粉末２　ｍｇが得られる。

同様の方法にて、保持時間１６分付近のピークを分取す
ることにより、ＲＫ−１０６１Ｈ２ωｇが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は、それぞれ、ＲＫ−１０６１６％ＲＫ
−１０６１Ｈの核磁気共鳴スペクトルを示す図面であり
、第３図は、高速液体クロマトグラフィーによるＲＫ−
１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈのピークを示すクロマ
トグラムである。 第２図中、ＡはＲＫ−１０６１Ａ、ＢはＲＫ−１０６１
Ｂ、Ｇｌ；！ＲＫ−１０６１ＧＳＨはＲＫ−１０６１Ｈ
由来のピークを示す。 第３図 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １．事件の表示　　　平成１年特許願第１２７０７９号
３、補正をする各 ・１１件との関係　　出願人 名称　（６７９）理化学研究所 ４、代理人 （内容１こ叉史１ふシＪ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式で表される抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及
   びＲＫ−１０６１Ｈ。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｇ；Ｒ＝Ｃ＿１＿３Ｈ＿２＿５ Ｈ；Ｒ＝Ｃ＿１＿３Ｈ＿２＿５）
2. （２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
   属に属する抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６
   １Ｈ生産菌を培養し、その培養物から抗生物質ＲＫ−１
   ０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈをそれぞれ分離採取する
   ことを特徴とする抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−
   １０６１Ｈの製造法。
3. （３）抗生物質ＲＫ−１０６１Ｇ及びＲＫ−１０６１Ｈ
   生産菌がストレプトミセス・エスピー・ＲＫ−１０６１
   （ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＳｐ．ＲＫ−１０６１）で
   ある請求項２記載の製造法。