JPS60172286A - 新規抗生物質ａｆ−７３６８ａ物質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質およびその
製造法に関する。

本発明者らは多種類の土壌などの試料から微生物を分離
し、それらが生産する抗生物質を検索したところ、ある
種の微生物がカビ、酵母に特異的に作用する新規な抗真
菌抗生物質を生産することを知り、更に研究した結果本
発明を完成した。

本発明の抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質は以下に示す理
化学的、生物学的性質を有する新規な抗生物質である。

■元素分析：炭素　５２．０３％ 水素　７．１５％ 窒素　２．６９％ ■融　点：明確な融点を示さず、１５０℃から除々に変
色し、１６５〜１７０℃で褐変分解する。

■比旋光度：　（α）　２ｉＪ’　＋７４．０゜（Ｃ＝
０．１．メタノール） ■紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：２３２ｎ−
１近に吸収極大を有する。吸収極大はアルカリ性メタノ
ールおよび酸性メタノール溶液中でもシフトしない（第
１図に示す）。

■赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：第２図に示す。

■溶剤に対する溶解性： メタノール、エタノール、ブタノール、ジメチルスルホ
キシドに易溶、クロロホルム。

水に可溶、エーテル、アセトンに難溶、ベンゼン、ヘキ
サン、酢酸エチル、四塩化炭素に不溶。

■呈色反応： ニンヒドリン反応、α−ナフトール反応に陽性、坂口反
応、ミロン反応、エルシンーモルガン反応に陰性。

■酸性、中性、塩基性の区別：酸性物質■物質の色：白
色粉末 ［相］高速液体クロマトグラフィーでの保持時間：ＴＳ
Ｋｇｅｌ　−０ＤＳ　１２０Ｔカラム（東洋曹達社製、
４．６鶴φＸ　２５０＋＋＋ｅ＋　）を用いたときの保
持時間は２．８〜３．２分である。

（溶媒＝４５％アセトニトリル、流速＝１−／分） ■薄層クロマトグラフィーにおけるＲｆ値ニジリカゲル
薄層クロマトグラフィー（メルク社製キーゼルゲル６０
）を使用し、ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：　１　：
　１）で展開したときのＲｆ値は０．２９である。

＠抗菌スペクトル： 寒天希釈法で測定した各種の微生物に対する最少発育阻
止濃度は第１表に示す通りである。同表から分かるよう
にカビ、酵母類に生育阻害作用を示すが、細菌類には試
験した範囲では作用しない。

第１表 上記した抗生物質ＡＰ−７３６８Ａ物質の理化学的性状
および生物学的性状を既知抗生物質のそれと比較し元と
ころ、該当する物質はなく本物質は新規抗生物質である
ことが確認された。

抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質はアスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐ
ｕｓ）属、トリコツアイトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏ
ｎ）属、ビリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ　）
属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ　）属、キャン
デイダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属、クリプトコツカス（Ｃ
ｒｙｐ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ）属なとのカビおよび酵母に
抗菌力を有するので、農業用抗菌剤として、あるいは動
物並びに人の真菌症の予防または治療剤として利用する
ことが回部である。

本発明に従い、抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質を製造す
石ために用いセれる微生物としては、本発明者らが山口
県萩市の土壌より分離して得たストレプトマイセス属に
属するｍ　７３６８株が挙げられる。　１ｋ７３６８株
の菌学的性質は次の通りである。

（ａ）　形態 よく分枝した基土菌糸から１μ内外の気菌糸を伸長しそ
の主軸より単純分枝し側枝となり、その先端にらせん状
胞子の連鎖が見られる。培養後期に気菌糸上に湿った黒
色の部分（ハイグロスコピックエリア）が出現する。鞭
毛胞子、菌核、胞子のうなどは認められない。胞子の表
面構造は平滑である。胞子の形態は楕円〜円筒型でその
連鎖数は１０胞子以上である。胞子の大きさは０．６〜
０．８　Ｘ　０．９〜１．４である。

（ｂｌ　各培地における生育状態 １４〜２１時間培養したときの生育状態を第２表に示す
。

（以下余白） （Ｃ）　生理的性質 ■　１育温度範囲：　Ｂｅｎｎｅｔ“ｓ　ｂｒｏｔｈを
用いた温度勾配培養装置での生育試験の結果、１０〜３
８℃の範囲で生育した。

■　ゼラチンの液化：陽性 ■　スターチの加水分解：陽性 ■　脱脂乳の凝固：陰性 ■　脱脂乳のペプトン化：陽性 ■　メラニン様色素の生成：陰性 （ｄ）　各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリーブ
寒天培地上） グルコース、フラクトース、ガラクトース、ラフィノー
ス、マンニット、イノジット、シュークロースを同化す
る。

キシロース、アラビノース、ラムノース、サリシンを同
化しない。　゛ 以上よりｍ　７３６８株の菌学的特徴を要約すると、気
菌糸はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑状である
。気菌糸の色は灰色で培養後期にはハイグロスコピック
エリアが観察される。裏面は黄味白色〜黄茶色で特殊な
色調はみられない。

以上の菌学的性質を示す菌種について、パージエイズ・
マニュアル・オブ・ディターミネイティブ・バクテリオ
ロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｆｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）
第７版＜１９５７年）、同第８版（１９７４年）、シャ
ーリングとゴドリーブのｌ５Ｐ（インターナショナル・
ストレプトマイセス・、プロジェクト）報告（１９６８
年、１９６９年および１９７２年）およびワックスマン
著、ジ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ　）第２巻（１９６１年）を参考に検索する
と、ｌ１ｍ　７３６８株に最も近縁するものとしてスト
レプトマイセス・バイグロスコピカス（ＳｔｒｅｐＬｏ
ｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）が挙げられ
る。即ち、！１１　らせん糸を形成する、（２）　灰色
の気菌糸を着生する、（３）　気菌糸がハイグロコピツ
クとなる、の基本的な性質が一致している。しかし糖の
資化性においては若干の相違が認められる。従って、Ｆ
ｈ　７３６８株はストレプトマイセス・バイグロスコピ
カスと若干の相違があるものの異なる菌種と考えられる
程の相違ではなく、ストレプトマイセス・バイグロスコ
ピカスと種を同じくするものと判断し、ストレプトマイ
セス・バイグロスコピカスＩ１ｍ　７３６８と命名した
。本菌株は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第７４４０号（ＦＥｌ？Ｍ　Ｐ−７４４０）
として寄託されている。

本発明において使用する微生物であるストレプトマイセ
ス・バイグロスコピカスｌ’ｈ　７３６８はその一例で
あって、本菌株を紫外線、放射線、化学薬剤などを用い
た変異手段で変異して得られる変異株、並びにストレプ
トマイセス属に属する微生物であって抗生物質ＡＦ−７
３６８Ａ物質を生産する能力を有する微生物はすべて本
発明に用いることができる。

本発明法により抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質を製造す
るには、まず、ストレプトマイセス属に属する抗生物質
ＡＦ−７３６８Ａ物質生産菌株を培地に培養して、培養
物中に抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ＠軍を蓄積せしめる。

培養方法は、放線菌の一般的な培養方法が用いられる。

培地としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープリカー、硝酸ナ
トリウム、硝酸アンモニウム、硫安などの窒素源、ブド
ウ糖、澱粉、蔗糖、デキストリンなどの炭素源、並びに
リン酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カル
シウム、亜鉛、鉄などの無機塩類が必要に応じて使用さ
れる。

培養は通常の通気攪拌下で好気的に行うのが好ましい。

培地のｐｉ、培養温度、培養時間などの培養条件は微生
物の発育に通し、しかも抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質
の住産が最高になるような条件が選ばれる。例えば培地
のｐｌ＋は５〜８、特に好ましくは中性付近がよく、培
養温度は２５〜３５℃が望ましい。培養時間は抗生物質
ＡＰ−７３６８Ａ物質の蓄積が最高に達する時間を選べ
はよく、通常２〜５日間である。以上述べた培地組成、
培地のｐＨ、培養温度、培養時間並びに通気攪拌などの
条件は使用する菌株の種類や外部の条件などによって最
適な条件を選択されることは言うまでもない。

このようにして得られた培養物から抗生物質ＡＦ−７３
６８Ａ物質を得るには、抗生物質の精製に通常用いられ
る精製手段を適宜利用して行われる。例えば吸着親和力
の差を利用する手段、分子量の差を利用する手段、イオ
ン結合力の差を利用する手段、溶媒への熔解性を利用す
る手段などが用いられ、これらの方法はそれぞれ単独で
、あるいは組合せて、あるいは反復して行われる。

−例を示して更に詳しく説明すれば、抗生物質ＡＦ−７
３６８Ａ物質を培養物がら分離するには、まず、ろ過、
遠心分離などの手段で澄明なろ液区分と菌体区分に分画
する。通常抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質は、ろ液区分
に菌体区分よりも２〜４倍量多く存在するが、培養条件
によっては菌体区分に存在する比率が高い場合もある。

菌体区分より抗生物質ＡＰ−７３６８Ａ物質を採取する
には、菌体区分にメタノール、エタノール、プロパツー
ルなどの溶媒を加えて抽出する。ろ液区分より抗生物質
ＡＰ−７３６８Ａ物質を採取するには、ダイヤイオンＨ
Ｐ−２０（三菱化成社製）、アンバーライトＸＡＤ−２
（ローム・アンド・ハ−ス社製）などの合成吸着剤並び
に活性炭などの吸着剤に吸着せしめた後、メタノール、
メタノール、プロパツールなどの溶媒で溶出する。

菌体区分から得られた抽出液、およびろ液区分から吸着
剤による吸着、溶離で得られた溶出液は、混合して、減
圧下、５０℃以下で濃縮して溶媒を除去し、抗生物質Ａ
Ｆ−７３６８Ａ物質の濃縮液を得る。次いで、濃縮液に
対して１〜２倍量のｎ−ブタノールを加えて、抗生物質
ＡＦ−７３６８Ａ物質をｎ−ブタノール層に抽出する。

ｎ−ブタノール層の水溶性不純物は水を加え振盪抽出す
ることにより水層に除去される。ｎ−ブタノール層を減
圧下、５０℃以下で濃縮乾固することにより抗生物質Ａ
Ｆ−７３６８Ａ物質を含有した濃厚シロップが得られ、
更に上述のｎ−ブタノール抽出、濃縮乾固を繰り返して
より純度の高い粗標品を得る。

粗標品を更に精製して抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質を
得るには、これをメタノールに溶解し、メタノールを展
開溶媒とするセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア
社製）、シリカゲルなどを用いる順相クロマトグラフィ
ー並びにオクタデシルシランを用いる逆相クロマトグラ
フィーなどで精製すると高純度の抗生物質ＡＦ−７３６
８Ａ物質が得られる。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより制
限されるものではない。

実施例 シュークロース２％、ポリペプトン０．５％、肉エキス
０．３％、酵母エキス０．１％、リン酸−カリウム０．
１％、硫酸マグネシウム０．０５％から成る組成の液体
培地（ｐＨ６，８）　１００　ｍｅを５０〇−容坂ロフ
ラスコに入れ、これにストレプトマイセス・パイグロス
コピカス隘７３６Ｂ　（ＦＥＢＭ　Ｐ−＝　７４メ９）
を接種し、２８℃、２日間振盪培養して極液を得た。次
に、３０Ｊ容の醗酵タンクを使用し、上記と同じ組成の
培地２０βを入れ、極液２００１ｄ！を接種したのち、
攪拌回転数２５０回転／分、通気量１０１／分、内圧Ｑ
、５ｋｇ／ｃ＋ａで２８℃、６６時間培養を行った。

培養液をろ過し、ろ液１ＢＮおよび湿菌体２３０ｇを得
た。ろ液は、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（ベッド容
量８００ｍ　）に通過させて本発明物質を吸着せしめ、
次いで５０％メタノール溶液２．！Ｍ。

１００％メタノール２．５１を順次通過させて溶出を行
った。活性画分は１００％メタノール部分に溶出され、
溶出液１．５Ｉｌを得た。一方、湿菌体は、２１のメタ
ノールを加えて２時間攪拌したのち、菌体を除き、抽出
液１．８１を得た。この抽出液と上記ダイヤイオンＨＰ
−２０による活性画分の溶出液とを合わせ、減圧下にて
濃縮して褐色のシロップ液を得た。これを５００ｗ＆の
水に熔解し、　１．５倍量のｎ−ブタノールを加え振盪
攪拌することにより活性画分をｎ−ブタノール層に抽出
せしめた。

ｎ−ブタノール層を分取し、同容量の水を加え振盪攪拌
して洗浄したのち、ｎ−ブタノール層を減圧下で濃縮し
、シロップ液を得た０次いで、シリカゲル（和光純薬社
製、ワコーゲルＣＣ−２００）２００を充填したカラム
を用意し、あらかじめメタノール：酢酸エチル（、ｌ：
１）の混合液で平衡化したのち、上記シロップ液をのせ
、メタノール：酢酸エチル（１：　１）の混合液２１、
メタノール：酢酸エチル（４：　１）の混合液２１で順
次溶出した。活性画分はメタノール：酢酸エチル（４：
ｌ）の混合液で溶出され、溶出液７２０＋ｄを得た。

溶出液を減圧下濃縮乾固して黄色粉末４３０■を得た。

この黄色粉末２００■を少量のメタノールに溶解し、メ
タノールで平衡化したセファデックスＬＨ−２０カラム
（ベッド容量２５０ｍ）にのせて、メタノールで溶出し
、活性画分１２０ｍを得た。これを減圧下濃縮乾固して
淡黄色粉末１２０嘲を得た。

次ぎに、あらかじめ７５％メタノールで平衡化したＴＳ
Ｋ−ＯＤＳ−１２０Ｔゲル（東洋曹達社製）カラム（内
径２．１５Ｃ１１、長さ３０３）を用い、逆相クロ、マ
ドグラフィーにより精製した。活性画分は１４Ｇ−から
２００ｍまでの両分に溶出された。この活性画分を減圧
下で濃縮乾固することにより純粋な抗生物質ＡＦ−７３
６８Ａ物質２６■を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質の紫外部吸収ス
ペクトル（メタノール中）を示し、　第２図は同じく赤
外部吸収スペクトル（ＫＢｒ中）を示す図である。 特許出願人　天野製薬株式会社 第１図 波　長（ｎｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次の理化学的性質を有する新規抗生物質ＡＦ〜７３
   ６８Ａ物質。 ■元素分析：炭素　５２．０３％ 水素　７．１５％ 窒素　２．６９％ ■融　点：明確な融点を示さず、１５０℃から除々に変
   色し、１６５〜１７０℃で褐変分解する。 ■比旋光度：　〔α〕２Ｂ・ぢ＋７４．０゜（Ｃ−０，
   １，メタノール） ■紫外部吸収スペクトル（メタノール中）　：２３２１
   ｍ付近に吸収極大を有する（第１図に示す）。 ■赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：第２図に示す。 ■溶剤に対する溶解性： メタノール、エタノール、ブタノール、ジメチルスルホ
   キシドに易溶、クロロホルム。 水に可溶、エーテル、アセトンに難溶、ベンゼン、ヘキ
   サン、酢酸エチル、四塩化炭素に不溶。 ■呈色反応： ニンヒドリン反応、α−ナフトール反応に陽性、坂口反
   応、ミロン反応、エルシンーモルガン反応に陰性 ■酸性、中性、塩基性の区別：酸性物質■物質の色：白
   色粉末 ２　ストレプトマイセス属に属し抗生物質ＡＦ−７３６
   ８Ａ物質を生産する微生物を培地に培養して抗生物質Ａ
   Ｆ−７３６８Ａ物質を生成蓄積せしめ、これを採取する
   ことを特徴とする新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質の
   製造法。 ３　ストレプトマイセス属に属する微生物がストレプト
   マイセス・バイグロスコピカスである特許請求の範囲第
   ２項記載の新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質の製造法
   。 ４　ストレプトマイセス・バイグロスコピカスがストレ
   プトマイセス・バイグロスコピカス１１７３６８　（ｌ
   ｉ＆工研菌寄第７４４０号）である特許請求の範囲第３
   項記載の新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質の製造法。