JPS61146189A - 新規抗生物質ａｆ−７３６８ｅ物質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質およびその
製造法に関する。さらに詳しくは、カビ、酵母などに特
異的に作用する抗真菌性抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質
およびそのストレプトマイセス属に属する微生物による
製造法に関する。

従来の技術 本発明者らは先にストレプトマイセス属に属する微生物
の産生ずる抗真菌性抗生物質ＡＦ−７３６８Ａ物質に関
して特許出願を行った（特願昭５９−２９１２７号）。

発明が解決しようとする問題点 前述のＡＦ−７３６８Ａ物質はそれ自身強力な抗真菌活
性を有しているが、本発明はこれよりもさらに強力な抗
真菌活性を有する物質を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明者らは多種類の土壌などの試料から微生物を分離
し、それらが生産量る抗生物質を検索したところ、ある
種の微生物がカビおよび酵母に特異的に作用する抗真菌
性抗生物質を多種類生産することを知った。これらの物
質のうちＡＦ−７３６８Ａ物質は前述のとおりであるが
、その後このＡＦ−７３６８Ａ物質とは明らかに理化学
的性質の異なる第二の有効物質の単離に成功し、この物
質をＡＦ−７３６８Ｅ物質と命名した。

本発明の抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質は以下に示す理
化学的、生物学的性質を有する新規な抗・。

生物質である。

■元素分析：炭素　５７．８５％ 水素　　８．１０％ 窒素　　２．０６％ ■融　　点：明確な融点を示さず、１３０℃から除々に
変色し、１５０〜１６０℃で褐変分解する。

■比旋光度：　（α）、＋８７．４゜ （Ｃ＝１．０，メタノール） ■紫外線吸収スペクトル（メタノール中）＝２３２　ｎ
ｍ付近に吸収極大を有する。吸収極大はアルカリ性メタ
ノールおよび酸性メタノール溶液中でもシフトしない（
第１図に示す）。

■赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）：第２図に示
す。

■溶剤に対する溶解性： メタノール、エタノール、ブタノール、ジメチルスルホ
キシドに易溶；クロロホルム。

塩化メチレンに可溶；水、アセトン、アセトニトリル、
酢酸エチルに難溶；ヘキサン、四塩化炭素、エーテル、
ベンゼンに不溶。

■呈色反応： ニンヒドリン反応、α−ナフトール反応に陽性、坂口反
応、ミロン反応、エルソンーモルガン反応に陰性。

■酸性、中性、塩基性の区別：酸性 ■物質の色：白色 ［相］高速液体クロマトグラフィーでの保持時間：ＴＳ
Ｋｇｅ　１−ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（東洋曹達社製、
４．６ｆｉφＸ　２５０ｍｍ　）を用いた高速液体クロ
マトグラフィーでの保持時間は１６．０〜１８．０分で
ある。

（溶媒ニア５％メタノール、流速１−７分）■薄層クロ
マトグラフィーにおけるＲｆ値ニジリカゲル薄層クロマ
トグラフィー（メルク社製；キーゼルゲル６０）を使用
し、ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１：１）で展開し
たときのＲｆ値は０．３９である。

＠抗菌スペクトル： 寒天希釈法で測定した各種の微生物に対する最少発育阻
止濃度は第１表に示す通りである。同表から分かるよう
にカビ、酵母類に生育阻害作用を示すが、細菌類には試
験した範囲では作用しない。

第１表 上記した抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質の理化学的性質
および生物学的性質を既知抗生物質のそれと比較したと
ころ、該当する物質はなく本物質は新規抗生物質である
ことが確認された。また、本発明物質の抗真菌活性は、
特定の真菌に対する最小発育阻止濃度が、例えば前述の
ＡＦ−７３６８Ａ物質に比較して数十分の−乃至画数十
分の−である。

抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質はアスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属、リゾープス（Ｒｈ１ｚｏｐ
ｕｓ）属、トリコツアイトン（Ｔｒｆｃｈｏｐｈｙｔｏ
ｎ）属、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ　）
属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ　）属、クリプ
トコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏ　−ｃｃｕｓ）属などの
カビおよび酵母に抗菌力を有するので、農業用抗菌剤と
して、あるいは動物並びに人の真菌症の予防または治療
剤として利用することが可能である。

本発明に従い、抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質を製造す
るために用いられる微生物の一例として、本発明者らが
山口県萩市の土壌より分離して得たストレプトマイセス
属に属する１ｍ　７３６８株が挙げられる。ｌｌｈ　７
３６８株の菌学的性質は次の通りである。

（ａ）　　形態 よく分枝した基中菌糸から１μ内外の気菌糸を伸長しそ
の主軸より単純分枝し側枝となり、その先端にらせん状
胞子の連鎖が見られる。培養後期に気菌糸上に湿った黒
色の部分（ハイグロスコピックエリア）が出現する。鞭
毛胞子、菌核、胞子のうなどは認められない。胞子の表
面構造は平滑である。胞子の形態は楕円〜円筒型でその
連鎖数は１０胞子以上である。胞子の大きさは０．６〜
０．８　Ｘ　０．９〜１．４である。

（ｂｌ　　各培地における生育状態 １４〜２１時間培養したときの生育状態を第２表に示す
。

（以下余白） （Ｃ１生理的性質 ■　生育温度範囲：　Ｂｅｎｎｅｔｔｉ’ｓ　ｂｒｏｔ
ｈを用いた温度勾配培養装置での生育試験の結果、１０
〜３８°Ｃの範囲で生育した。

■　ゼラチンの液化：陽性 ■　スターチの加水分解：陽性 ■　脱脂乳の凝固：陰性 ■　脱脂乳のペプトン化：陽性 ■　メラニン様色素の生成：陰性 （ｄ＞　　各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリー
ブ寒天培地上） グルコース、フラクトース、ガラクトース、ラフィノー
ス、マンニット、イノジット、シュークロースを同化す
る。

キシロース、アラビノース、ラムノース、サリシンを同
化しない。

以上よりｌｂ　７３６８株の菌学的特徴を要約すると、
気菌糸はらせん糸を形成し、胞子表面構造は平滑状であ
る。気菌糸の色は灰色で培養後期にはハイグロスコピッ
クエリアが観察される。裏面は黄味白色〜黄茶色で特殊
な色調はみられない。

以上の菌学的性質を示す菌種について、パージエイズ・
マニュアル・オブ・デイターミネイティブ・バタテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）
第７版（１９５７年）、同第８版（１９７４年）、シャ
ーリングとゴドリーブのｌ５Ｐ（インターナショナル・
ストレプトマイセス・プロジェクト）報告（１９６８年
、１９６９年および１９７２年）およびワックスマン著
、ジ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ　）第２巻（１９６１年）を参考に検索すると
、Ｎ１７３６８株に最も近縁するものとしてストレプト
マイセス・バイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｎ＋ｙ
ｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｔｃｕｓ）が挙げられる。

即ち、（１）、らせん糸を形成する、（２）灰色の気菌
糸を着生する、（３）　　気菌糸がハイグロコピツクと
なる、の基本的な性質が一致している。しかし糖の資化
性においては若干の相違が認められる。従って、Ｎ１７
３６８株はストレプトマイセス・バイグロスコピカスと
若干の相違があるものの異なる菌種と考えられる程の相
違ではなく、ストレプトマイセス・バイグロスコピカス
と種を同しくするものと判断し、ストレプトマイセス・
バイグロスコピカスｍ７３６８　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｌｍ　７３６８）
と命名した。本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第７４４０号（ＦＥＲＭＰ−７４４０）
として寄託されている。

本発明において使用される微生物としてのストレプトマ
イセス・パイグロスコピカス漱７３６８はその一例であ
って、本菌株を紫外線、放射線、化学薬剤などを用いた
手段で変異して得られる変異株、並びにストレプトマイ
セス属に属する微生物であって抗生物質ＡＦ−７３６８
Ｂ物質を生産する能力を有する微生物はすべて本発明に
用いることができる。

本発明法により抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質を製造す
るには、まず、ストレプトマイセス属に属する抗生物質
ＡＦ−７３６８Ｅ物質生産菌株を培地に培養して、培養
物中に抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質を蓄積せしめる。

培養方法は、放線菌の一般的な培養方法が用いられる。

培地としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、大豆粉、綿実粉、コーンステイープリカー、硝酸ナ
トリウム、硝酸アンモニウム、硫安などの窒素源、ブド
ウ糖、澱粉、蔗糖、デキストリンなどの炭素源、並びに
リン酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カル
シウム、亜鉛、鉄などの無機塩類が必要に応じて使用さ
れる。

培養方法は通気攪拌下、好気的に行うのが好ましい。培
地のｐＨ１培養温度、培養時間などの培養条件は菌株の
発育に適し、しかも抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質の生
産が最高になるような条件が選ばれる。例えば培地のｐ
Ｈは５〜８、特に好ましくは中性付近がよく、培養温度
は２５〜３５℃が望ましい。培養時間は抗生物質ＡＦ−
７３６８Ｅ＠ＩＫ。

の蓄積が最高に達する時間を選べばよく、通常２〜５日
間である０以上述べた培地組成、培地のｐＨ１培養温度
、培養時間並びに通気攪拌などの条件は使用する菌株の
種類や外部の条件などによって最適な条件が選択される
ことは言うまでもない。

このようにして得られた培養物から抗生物質ＡＦ−７３
６８Ｅ物質を得るには、抗生物質の精製に通常用いられ
る精製手段を適宜利用して行われる。例えば吸着親和力
の差を利用する手段、分子量の差を利用する手段、イオ
ン結合力の差を利用する手段、溶媒への溶解性を利用す
る手段などが用いられ、これらの方法はそれぞれ単独で
、あるいは組合せて、あるいは反復して行われる。

−例を示して更に詳しく説明すれば、抗生物質ＡＦ−７
３６８Ｅ物質を培養物から分離するには、まず、ろ過、
遠心分離などの手段で澄明なろ液区分と菌体区分に分画
する。通常本発明物質は、ろ液区分よりも菌体区分に２
〜４倍量多く存在するが、培養条件によってはろ液区分
に存在する比率が高い場合もある。菌体区分より本発明
物質を採取するには、これにメタノール、エタノール、
プロパツールなどの溶媒を加えて抽出する。また、ろ液
区分より本発明物質を採取するには、ダイヤイオンＨＰ
−２０（三菱化成社製）、アンバーライトＸＡＤ−２（
ローム・アンド・ハース社製）などの合成吸着剤並びに
活性炭などの吸着剤に本発明物質を吸着せしめた後、メ
タノール、エタノール、プロパツールなどの溶媒で溶出
する。

菌体区分から得られた抽出液、およびろ液区分から吸着
剤による吸着、溶離で得られた溶出液は、これらを合わ
せて、減圧下、５０℃以下で濃縮して溶媒を除去し、本
発明物質の濃縮液を得る。次いで、濃縮液に対して１〜
２倍量のｎ−ブタノールを加えて本発明物質をｎ−ブタ
ノール層に抽出する。ｎ−ブタノール層の水溶性不純物
は水を加え振盪抽出することにより水層に除去される。

ｎ−ブタノール層は、これにアセトン、酢酸エチルなど
の溶媒を加えた後、またはこれを濃縮乾固し、次いでメ
タノールなどの溶媒に溶解した後、シリカゲルなどを用
いる順相クロマトグラフィーを行う、ここで得られた活
性画分を濃縮乾固することにより本発明物質の粗標品が
得られる。この粗標品をエタノールなどの溶媒に溶解し
た後、ＤＥＡＥ−）ヨパール（東洋曹達社製）を用いる
イオン交換クロマトグラフィー、オクタデシルシランを
用いる逆相クロマトグラフィーなどを適宜繰り返すこと
により高純度のＡＦ−７３６８Ｂ物質が得られる。

及施用− シュークロース２％、ポリペプトン０．５％、肉エキス
０．３％、酵母エキス０．１％、リン酸−カリウム０．
１％、硫酸マグネシウム０．０５％から成る組成の液体
培地（ｐＨ６，８）　１００　ｉｆ！の入った５００−
容の坂ロフラスコを用意し、これにストレプトマイセス
・バイグロスコピカス１ＩｋＬ７３６８　（ＦＥＲＭ　
Ｐ−７４４０）を接種し、２８℃、２日間振盪培養して
種培養液を得た。次に、３０β容の醗酵タンクに上記と
同じ組成の培地２ＯＮを入れ、上記種培養液２００ｍｆ
！を接種したのち、攪拌回転数２５０回転／分、通気量
１０１／分、内圧０．５ｋｇ／ｃｊ、温度２８℃におい
て６６時間培養を行った。

培養液をろ過し、ろ液１８１および湿菌体２３０　ｇを
得た。ろ液は、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（ベッド
容１Ｊｌ　８００ｍ１！＞に通過させて本発明物質を吸
着せしめ、次いで５０％メタノール溶液２．５！、純メ
タノール２．５１を順次通過させて溶出を行った。活性
画分は純メタノール部分に溶出され、溶出液１．５１を
得た。一方、湿菌体は、２１のメタノールを加えて２時
間攪拌したのち、菌体を除き、抽出液１．８Ｅを得た。

この抽出液と上記ダイヤイオンＨＰ−２０による活性画
分の溶出液とを合わせ、減圧下にて濃縮して褐色のシロ
ップ液を得た。これを５００−の水に懸濁し、１．５倍
容量のｎ−ブタノールを加え振盪攪拌することにより活
性両分をｎ−ブタノール層に抽出せしめた。ｎ−ブタノ
ール層を分取し、同容量の水を加え振盪攪拌して洗浄し
たのち、ｎ−ブタノール層を分取し、これに等容量のア
セトンを加えた。次いで、ｎ　−ブタノール：アセトン
（１：　１）の混合液であらかじめ平衡化したシリカゲ
ル（和光純薬社製、商、。

ｍ、ワコーゲルＣ−２００）　２００　ｇを充填したカ
ラムを用意し、上記活性画分を含むｎ−ブタノール−ア
セトン溶液を流して活性を吸着させた。その後同じ組成
の溶媒２Ｎでカラムを洗浄した後、メタノール：酢酸エ
チル（４：１）の混合液２βで溶出し、活性画分を含む
溶出液８００−を得た。この溶出液を減圧下濃縮乾固し
て黄色粉末４５０■を得た。この黄色粉末を５０１ｎ１
のエタノールに溶解した後、あらかじめ７．５　ｍＭの
酢酸アンモニウムを含む６０％エタノール溶液で平衡化
したＤＥＡＥ−）ヨバール力ラム（ベッド容量５００ｒ
ｎＩりに載せて、同組成の溶媒で溶出し、活性画分を含
む１゜２１の溶出液を得た。これに精製水１．２君を加
えた後、あらかじめ３０％エタノール溶液で平衡化した
調製用のＰｒｅｐＰＡＫ−５００／　Ｃ１Ｂカートリツ
ジカラム（ウォーターズ社製；５ＣＩｌｌφＸ３０Ｃ１
１）に流し、本発明物質を吸着させた。同組成の溶媒５
００−でカラムを洗浄し、続いて６０％エタノール溶液
で溶出した。

活性は１．３１２から２．８１までの両分に溶出された
。

この活性画分を減圧下濃縮乾固した後、３０％エタノー
ル溶液の１ｇに溶解し、再度同じカラムに吸着させた。

３０％エタノール溶液の５００−でカラムを洗浄した後
、７５％メタノール溶液で溶出したところ、活性は２．
Ｏｌから３．５１までの両分に溶出された。この溶出液
を減圧下濃縮し、次いで凍結乾燥することにより純粋な
抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質３２■を得た。

発明の効果 本発明によれば、第一に、アスペルギルス属、リゾーブ
ス属、トリコツアイトン属、ピリキュラリア属、ゲオト
リカム属、クリプトコツカス属などのカビおよび酵母に
抗菌力を有する新規な抗真菌性抗生物質ＡＦ−７３６８
Ｅ物質が提供される。

第二に、ストレプトマイセス属に属しＡＦ−７３６８Ｅ
物質生産能を有する微生物を用いた上記物質の製造法が
提供される。ＡＦ−７３６８Ｅ物質の抗菌活性は本発明
者らが先に見いだしたＡＦ−７３６８Ａ物質に比較して
、特定の真菌に対する最小発育阻止濃度が数十分の−乃
至画数十分の−である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質の紫外
線吸収スペクトル（メタノール中）を示す図であり、第
２図は同じく赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次の理化学的性質を有する新規抗生物質ＡＦ−７３
   ６８Ｅ物質。 （１）元素分析：炭素５７．８５％ 水素８．１０％ 窒素２．０６％ （２）融点：明確な融点を示さず、１３０℃から除々に
   変色し、１５０〜１６０℃で褐変分解する。 （３）比旋光度：〔α〕＿Ｄ＋８７．４° （Ｃ＝１．０、メタノール） （４）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）：２３２
   ｎｍ付近に吸収極大を有する（第１図に示す）。 （５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）：第２図
   に示す。 （６）溶剤に対する溶解性： メタノール、エタノール、ブタノール、ジ メチルスルホキシドに易溶；クロロホルム、塩化メチレ
   ンに可溶；水、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル
   に難溶；ヘキサン、四塩化炭素、エーテル、ベンゼンに
   不溶。 （７）呈色反応： ニンヒドリン反応、α−ナフトール反応に 陽性、坂口反応、ミロン反応、エルソン−モルガン反応
   に陰性 （８）酸性、中性、塩基性の区別：酸性 （９）物質の色：白色 ２　ストレプトマイセス属に属し抗生物質ＡＦ−７３６
   ８Ｅ物質生産能を有する微生物を培地に培養して抗生物
   質ＡＦ−７３６８Ｅ物質を生成蓄積せしめ、これを採取
   することを特徴とする新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物
   質の製造法。 ３　ストレプトマイセス属に属する微生物がストレプト
   マイセス・ハイグロスコピカスである特許請求の範囲第
   ２項記載の新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質の製造法
   。 ４　ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスがストレ
   プトマイセス・ハイグロスコピカスＮｏ．７３６８（Ｆ
   ＥＲＭ　Ｐ−７４４０）である特許請求の範囲第３項記
   載の新規抗生物質ＡＦ−７３６８Ｅ物質の製造法。