JPS63119689A - 抗生物質ｓｋ−２０４９およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｖ「親杭生物質ＳＫ−２０４９およびその製
造方法に関する。

従来の技術 生体内の葉酸代藺経路は、化学療法剤の効力の判断にと
って重要である。例えば、ジヒドロ葉酸還元＃素を阻害
する能力を有するトリメンプリム、メントレキセートお
よびビリミサミンは、それぞれ抗菌剤、抗がん剤、抗１
ラリア剤として臨床上使用されている。また主要な抗が
ん剤の一つである５−フルオロウラシルは、生体内で５
−フルオロデオキシウリジル酸く変換され、チミジル酸
合成酵素を阻害することによって、抗がん活性を発現す
ることが知られている。チミジル酸合成＃％素は、デオ
キシリボ核酸合成の律速酵素の一つであう、基質は、デ
オキシウリジル酸と５，１０−メチレンテトラ上２口葉
酸である。この酵素は抗がん剤の主要な標的となってい
る。しかし葉酸代謝拮抗作用を有する抗生物質は従来知
られていない。本発明は、本発明者が見出した放線菌Ｓ
Ｋ−２０４９株の培養ろ液から単離した抗生物質が葉酸
代謝拮抗性を有し、各種チミジル酸合成酵素を阻害する
活性を有するという知見に基づくものである。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、新規葉酸代燵拮抗物質およびその製造
方法を提供することである。

本発明によって提供される抗生物質（本発明者によって
ＳＫ−２０４９と命名された）は次の理化学的性質を有
する。

（１）　　元素分析値：炭素、水素、窒素、酸素からな
シ、リン、イオウ、ハロゲンは含１ ない。実施例で得られた本物質の元素 分析の例をあげると次に示すとおりで ある。

実測値（喝　Ｃ４４，４６，Ｈ５，５２，Ｎ　１６．２
８理論値（％）　　ＣｚｓＨｓｏＮｓＯｇ・５Ｈ２０と
してＣ４４，３８，Ｈ５，９６，Ｎ　１６，５６（２）
　　融点：１９６℃以上で分解する。

（３）　　分子量：５８６゜ＦＤマススペクトル分析に
おいて、６０９　（ｒｒＶ／ｚ　、　Ｍ”　＋　Ｎａ）
、５８７（ｒｒｖＺ　、　Ｍ＋＋　１　　）のイオンビ
ークが観測される。

（４）　　比旋光度：〔α〕２も一＋２４．ｏ°（ｃ　
＝　０．２５、Ｈｌｏ） （５）紫外部吸収スペクトル：第１図のとおシである。

（６）　　赤外線吸収スペクトル：第２図ノドおリテあ
る。

（７）　　プロトン核磁気共鳴スペクトル（重水中で測
定）：第３図のとおりである。

（８）溶剤に対する溶解性：アルカリ水溶液によく溶け
、水にはかなり溶けるが、メタ ノール、エタノール、アセトン、酢酸 エチル、クロロホルム、ベンゼン、ヘ キサン等の有機溶媒には溶は難い。

（９）塩基性、中性、酸性の区分二両性物質である。

（１０）　　物質の色：淡黄色。

（１１）　　Ｒｆ　値ニジリカゲル薄層クロマトグラフ
ィー（メルク社製、ＴＬＣアルミシート厚さ０．２龍、
キーゼルデル６０Ｆ２δ４）を常法により行なったとき
のＲｆ　値は ０．２９である。検出にはＵＶ検出器を用いた。

展開溶媒：ｎ−プロ、ｅノール／水／アンモニア水（２
：１：０．０６） （１２）　　ｆｆ１色反応：ライｒンースミス反応に陽
性である。

以との理化学的性質より抗生物質ＳＫ−２０４９の分子
式は、ＣｔｓＨ３（ＩＮ＠Ｏ＠　　であると推定される
。

本物質は＼第１図に示す紫外部吸収スペクトルより還元
型プテリジン環の存在が示唆され、第２図に示す赤外線
吸収スペクトルよＦ）啄−ｊ’ｆｒであることが示唯さ
れた。本物質を酸加水分解後、トリメチルシリシ化を行
ない、ガスクロマトグラフィー−質量分析計で分析した
結果、本物質はグルタミン酸２モルとパラアミ７安息香
酸１モルを含むことが明らかとなった。さらに４００　
ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトル、カーホａｙ　−
ｔ３ｉ磁気共鳴スペクトル、マススＪトル等による構造
解析の結果、本物質は次式で表わされる構造を有するこ
とがわかった。

（式中、Ｇ１とＯ８とは、そのいずれかにペプチド結合
されたグルタミン酸を表わす。） 抗生物質ＳＫ−２０４９の生物学的性質は次のとおυで
ある。

（１）　　抗菌活性 ８に−２０４９の１００μ９７１１１を浸漬させたペー
／ｑ−ディスクによる阻止用の直径は第１表に示すとお
シである。抗生物質ＳＫ−２０４９は、制限量のブチロ
イン酸、葉酸、５−７オルミル葉酸の入った培地とでは
、エンテロコツカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏａｃｏ
ｅｕｓ　ｆａｅｅｉｕｍ）に対して抗菌活性を示したが
、多量に、ブチロイン酸、葉酸、５−フォルミル葉酸を
加えた培地や、チミジンの入った培地上では抗菌活性を
示さなかった。

第１表において用いた検定培地は次のとおりである。

ａ：デービス最少培地 す二葉酸定量用培地（日永） Ｃ：デ中ストロース・ツアペック培地 第１表 スタフィロコッカス・アウレウス　　　　−　　　　　
　　ａ（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｅｅｕ４　；ｕｒｅｕ；
）ＡＴＣｏ　　６５３８Ｐ ミクロフッカス・ルテウス　　　　　　　−　　　　　
　　１（Ｍｉｅｒｏｃｏａｅｕｓ　　１ｕｔｅｕｓ）Ａ
ＴＣｏ　　９３４１ バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　　−ａ
ａｕｂｔｌｌｉｓ）　ＰＣ：Ｉ　　２１９エンテロコツ
カス・フェシウム　　　　２３．８　　　　　１）（Ｅ
ｎｔｅｒｏｅｏｃｃｕｓ　　ｆａ＠ｃｉｕｍ）１１’０
　３１８１ マイコバクテリウム・スメグマチス　　　−　　　　　
　　ａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｓｇｍａｔ
ｌｇ）ＡＴＣＣ６０７ エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ＠ｒｉｃｈ１ｍ　　　−
１゜堅す１）ＮＩＨＪ カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　　　−ｃａ
ｌｂｌｏａｎｓ）ＫＦ　　１ アスペルギルス・ニガー　　　　　　　　−Ｃ（幻上暫
工１１１ｕｓ　恒エリ）ＫＰ−１０５ピリキユラリア・
オリザエ　　　　　　　−　　　　　　。

（Ｐｉｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｖｌμす）ＫＦ−１８０（
２）　　チミジル酸合成酵素阻害活性エンテロコツカス
・フェシウム（ｎＯ ｆｊｅｐｉ■）、ノチルス・ズブチリス（ｍｌｓｕｂ％
１１１ｇ、）およびマウス・エールリッヒ腹水がん細胞
より調製したチミジル酸合成酵素阻害活性を調べた」詰
果、　ＳＫ−２０４９はいずれの酵素をも阻害し、Ｋｌ
値は、それぞれ１５，７　ｎＭ　ｓｌｏ、９　ｎＭ　、
　７５．２　ｎＭであった。

（３）　　急性毒性 マウスに対する急性毒性は、腹腔内投与２００ｍ９／に
？で認められなかった。

上記のＳＫ−２０４９の理化学的性質、構造式および生
物学的性質を既知抗生物質のそれらと比較した結果、既
知抗生物質に該当するものがないので、ＳＫ−２０４９
は新規抗生物質であることがわかった。

本発明によシ提供される抗生物質ＳＫ−２０４９の製造
方法は、抗生物質ＳＫ−２０４９生産能力を有する放線
菌を培地に好気的に培養して、培養物中に抗生物質ＳＫ
−２０４９を蓄積させ、培養物からこれを採取すること
を特徴としている。

抗生物質ＳＫ−２０４９を生産するために用いる微生物
は、ＳＫ−２０４９を生産する能力を有する限りいずれ
の菌株も本発明の目的に用いることができる。実施例く
記載された菌株は、本発明の目的に用いることができる
。この菌株から自然的または人工的に誘導された変異株
も、　ＳＫ−２０４９の生産能力を有する限り、本発明
の目的に用いることができる。

実施例に記載された微生物５ｔｒａｌｎ　８に−２０４
９は、本発明者によって高知県宿毛市の土壌から新たに
分離された放線菌で、１９８６年１０月２５に工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８９８７号とし
て寄託されている。その菌学的性状は次のとおシである
。

（１）　　形態的性質 栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断が観察さ
れる。気菌糸の着生は非常に僅かである。胞子の着生は
認められない。

（ｆｆ）　　各種培地上での性状 イー・ビー・シャーリング（Ｅ、Ｂ、　Ｓｈｌｒｌｉｎ
ｇ）とデー・ゴツトリーブ（Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｌ＠ｂ）
の方法（インターナシフナル・ジャーナル・オフ・クス
テイマテイツク・バクテリオロリー、１６巻、３１３頁
、　　１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状
を次表に示す。色調は標章色トシテ、カラー・ハーモニ
ー−マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション
・オフ・アメリカ・シカゴ、　　１９５８年）を用いて
決定し、色票基とともに括弧内にセリフ−ｒを併記した
。以下は特記しない限り・２７℃、２週間口の各培地に
おける観察の結果である。

培養性状 （Ｉ［Ｄ　　生理学的諸性質 （１）　　メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天　　　　　　　　陰性（ロ）　ペプ
トン・イースト鉄寒天　　陰性←→　グルコース・ペプ
トン・ ゼラチン培地（２１−２３℃）　　陰性に）　トリプト
ン・イースト液　　　陰性（２）　　チロシナーゼ反応
　　　　　　　陰性（３）硫化水素の生産　　　　　　
　　陰性（４）　　硝酸塩の還元　　　　　　　　　陰
性（５）　　ゼラチンの液化（２］　−２３℃）　　陽
性（グルコース・ペプトン・ ゼラチン培地） （６）　　スターチの加水分解　　　　　　陽性（７）
脱脂乳の凝固（３７℃）　　　　　　陰性（８）脱脂乳
のペプトン化（３７℃）　　　陽性（９）生育温度範囲
　　　　　　１５−３．７℃（］０）　　炭素源の利用
性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培地） 利用ｆる：　Ｄ−ｆルコース、スクロース、メリピオー
ス、Ｄ−マンニト ール、Ｄ−７ラクトース、Ｄ− 中シロース やや利用する：ラフィノース 利用しない：Ｌ−アラビノース、１−イノシトール、ラ
ムノース、サ リシン、マンノース、セル口 −ス ンを含む。

以上の本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである
。

細胞壁のアミノ酸組成としてリジンを含み、気菌糸は僅
かしか着生せず、胞子の連鎖は観察されず、栄養菌糸は
分断を起こす。栄養菌糸はグレイ系あるいはイエロー系
の色調を呈する。

以とのように本菌は、細胞壁中にリジンを含み、栄養菌
糸の分断を起こすことから、レシエパリｘ　（Ｈ，Ａ、
　Ｌ＊ｃｈｅｖａｌｉｓｒ）の分類（インターナショナ
ル・ジャーナル・オフ・システィマチイック・バクテリ
オロジー、２０巻、４３５−４４３頁、１９７０年）に
よる細胞壁ｖ１■あるいは■型に分類される放線菌であ
ると認められる。

本発明の方法において、抗生物質ＳＫ−２０４９を生産
する培地としては、微生物の培養に常用される炭素源、
窒素源、無機物等を含む各種の培地を使用することがで
きる。例えば培地の炭素源としては、ブｒつ糖、麦芽糖
、乳糖、ショ糖、デンプン、デキストリン、オートミー
ル、グリセリン、水あめ、糖蜜などである。、着た窒素
源としては、大豆粉、コーンスチープリカー、綿実粉、
ペプトン、肉エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物、
トマトペースト、アンモニウム塩、硝酸塩などである。

その他、必要に応じて炭酸カルシウム、塩化ナトリウム
、塩化カリウム、リン酸塩等の無機塩類を添加するほか
、菌の発育を助け、ＳＫ−２０４９の生産を促進するよ
うな有機および無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、一般抗生物質生産の方法と同じく、液
体培養法、特に深部培養法が最も適している。培養は通
常、好気的条件下で行なわれ、通気攪拌培養が好適であ
る。培養温度およびｐｔｉは、微生物が発育し、ＳＫ−
２０４９を生産する範囲で適宜変更できるが、好ましい
温度は２〇−３５℃であり、好せしいｐ　ｔ、Ｉは６−
８である。

培養時間は種々の条件によって異なるが、通常２−８日
程度で培養液中に蓄積されるＳＫ−２０４９が最高力価
に達する。培養終了後、培養液からのＳＫ−２０４９の
採取は、微生物の培養液より、前述の理化学的性質を有
する抗生物質を分離精製する公知の手段を単独または組
み合わせて行なうことができる。

抗生物質ＳＫ−２０４９は、主として培養物の液体部分
に存在し、前記の理化学的性質で示すように水溶性の両
性物質であるから、その抽出、精製にあたっては、アン
バーライトＩＲ−１２０（米国、ローム・アンＰ・ハー
ス社製）、タフエックス５０Ｗ（米国、ダウ・ケミカル
社製）等の陽イオン交換樹脂もしくはアンバーライトＩ
ＲＡ４１０　、　ｌＲ４５、ダイヤイオンＷＡ−３０（
三菱化成！Ｊ４）等の陰イオン交換樹脂に吸着させ、こ
れを適当な酸、アルカリもしくは塩溶液を用いて溶出す
ることができる。あるいは、培養液を活性炭もしくはダ
イヤイオンＨＰ　２０等の吸着剤に吸着させ、含水アセ
トン、含水メタノール等の適当な含水有機溶剤を用いて
溶出することができる。

実用的な精製法の一例を示すと次のとおりである。例え
ば、培養ろ液をダイヤイオンＷＡ−３０〔ＯＨ′″〕を
充填したカラムを通過させて有効成分をイオン交換樹脂
に吸着させ、これを希塩酸で溶出する方法はＳＫ−２０
４９の精製法として有効な手段である。このような方法
で得られたＳＫ−２０４９の粗物質は、他のイオン交換
樹脂、セルロース、シリカゲル、アルミナ、セファデッ
クス（スエーデン国、ファルマシア・ファイン−ケミカ
ルス社製）およびトヨパール（東洋曹達工業製）等を使
用する公知の方法によシ、さらに純度を高めることがで
きる。こうして得られたＳＫ−２０４９は、淡黄色の粉
末であり、その理化学的性質および構造式ならびに生物
学的性質は前述のとおシである。

抗生物質ＳＫ−２０４９の薬理学的に許容し得る塩は、
常法に従い作製することができる。例えばＳＫ−２０４
９の水溶液に当量の水酸化ナトリウム溶液を加え、凍結
乾燥することにより、ＳＫ−２０４９のナトリウム塩を
取得できる。適当な塩の例としてナトリウム塩、カリウ
ム塩、リチウム塩、銅塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、亜鉛塩、ニッケル塩、マンガン塩、アンモニウム塩
、１−４級の低級アルキル塩、低級ハイげロキシルもし
くは低級アルケニルアンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、
臭化水素酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、硝酸塩、酢酸塩
、プロピオン酸塩、クエン酸塩＼酒石酸塩、モノクロル
酢酸塩等をあげることができる。

なお、生産される抗生物質ＳＫ−２０４９の検定の。

ために、例えば次の方法が用いられる。検定用培養基と
しては、葉酸定量用培地（日永製）にプロティン酸をｌ
ｎｇ／ｍｊ！添加した培地を用い、検定菌トしてｉ’ｉ
　、エンテロフッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｆａ＠ｃｉｕｍ）を用い、公知のべ、ｌ−デ
ィスク法により検定を行なう。

次に示す本発明の抗生物’Ｘ　ＳＫ−２０４９の実施例
は本発明を限定するものではない。

の斜面培養（スラント）から１白金耳を種培地１００　
ｒｎｌに接種し、２７℃で３日間振どう培養後、１、Ｏ
ＯＪ容ジナジャ−ファーメンタの培地７０１に２俤の割
合で接種し、２７℃、３日間、通気ｆｔｌ。

ｌ７分、攪拌２００　ｒ、ｐ、ｎｌ、　　の条件で通気
攪拌培養を行なった。

１培地の組成は、グルコース０．１％、デンプン２．４
チ、ペプトン０．３チ、肉エキス０．３優、酵母エキス
０．５　％　、炭酸カルシウム０．４　％であり、本培
地の組成は、デキストリン２．０％、グルコース０．２
％、大豆粉１．５％、酵母エキス０．３％、炭酸カルシ
ウム０．３　％　、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化
製、消泡剤）　０．０１４　ｑ６である。

いずれも使用的にｐＨ７，、Ｏに調整後、１２１　℃で
１５分間滅菌した。

培養物７０１をシャープレス型遠心機で遠心分離しく　
１００００　ｒ、ｐ、ｍ、）　、培養Ｊ：澄と面体とに
分別した。ここで得られた上澄をセライト（米国、ジョ
ンズ・マンヴイル・プロダクツ社製）をろ過助剤として
用いろ過した。この培養ろ液を、弱塩基性の陰イオン交
換樹脂ダイヤイオン〜ＶＡ−３０（ＯＨ−：］を充填し
たカラム（７，５７）を通過させ、有効成分を吸着させ
た。ついで水６０１で洗浄した後、０．５規定塩酸で溶
出させ、ｌｌずつ分画した。活性画分（Ｎｎ２６−４２
）を集めて、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ−２０のカラ
ム（１，２１）に有効成分を吸着させた。水２５１で洗
浄後、５０チメタノールで溶出したところ、活性はメタ
ノール溶液の１．２−１．７ノに認められた。活性画分
を集め、減圧濃縮後、弱酸性陰イオン交換樹脂アンバー
ライトｒＲｃ−ｓｏ　（ＮＨ４＋〕のカラム（４００ｍ
）を通過させた。カラムを水洗し、通過液２３０Ｍと水
洗液６００コとをあわせて、強酸性陽イオン交換樹脂ア
ンバーライトＩＲ−１２０〔Ｈ＋〕のカラム（Ｉｌ）に
吸着させた。カラムを水４ノで洗浄した後、０．５規定
アンモニア水で溶出し、活性画分（溶出液の３．７−４
．６１　）を集め、減圧下４００　ｍまで濃縮した。濃
縮液をｎ−ブタノール５００１で洗浄後、さらに減圧下
濃縮後、凍結乾燥して粗粉末３．５　Ｉｌを得た。この
粗粉末を少量の水に溶解後、バイオデルＰ−４（米国、
パイオラツｒ社製）カラム（２８，１φｍ窟Ｘ　５６０
　ｆｉｌ　）を用いてゲルろ過を行なった。展開溶媒は
精製水を用い、流出液を各５−ずつ分取した。活性画分
ｍ４Ｏ−５５を集め、減圧下濃縮乾固した。このものを
０．０２　−１ｌニルの２−メルカプトエタノールを含
む０．０１　　モルのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，
０）に溶解し、あらかじめ同じ緩衝液で平衡された弱塩
基塩陰イオン交換体ＤＥＡＥ−セファデックス人−２５
のカラム（１６φＭｓ　Ｘ　６００１１　）にかけた。

展開溶媒として０．０２モルの２−メルカプトエタノー
ルを含むリン酸カリウム緩衝ｇ（ｐＨ６，０）を用い、
リン酸カリウム濃度を０．０１モルから０．８モルまで
直線的に上昇させた。溶出液を各１５ｍずつ分画した。

活性画分醜１２０から１２７を集め、次にダイヤイオン
Ｉ−ＩＰ　−２０カラム（２９φｆｆｌｌＸ９０ｍ鳳）
を用いて脱塩した。このものを濃縮後、凍結乾燥した。

ここで得られた粗粉末を、分取用高速液体クロマトグラ
フィー（日本分光１！！りを用いて精製した。

溶媒として０．０１規定のギ酸を含むＯから２０％メタ
ノールを用い、４０分間、直線的に濃度勾配−一をかけ
た。流速は６ｍ１Ｚ分で行なった。溶出時間３４分に現
われる単一のピークを集め、減圧下濃縮し、凍結乾燥す
ることにより、抗生物質ＳＫ−２０４９の淡黄色粉末７
■を得た。本物質の物性は前記のとおりであった。

発明の効果 本発明は新規葉酸代謝拮抗性抗生物質ＳＫ−２０４９お
よびその製造法を提供する。本物質は抗菌剤、抗がん剤
、抗マラリア剤として有用であることが期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質ＳＫ−２０４９の０．０１規定の塩酸
水、水および０．０１規定のアンモニア水中で測定した
紫外部吸収スペクトルである。 第２図は抗生物質ＳＫ−２０４９の臭化カリウム銑中で
測定した赤外線吸収スペクトルである。 第３図は抗生物質ＳＫ−２０４９の重水中で測定したプ
ロトン核磁気共鳴スペクトルである。 １］

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式で表わされる抗生物質ＳＫ−２０４９および
   その薬理学的に許容し得る塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｇ＿１とＧ＿５とは、そのいずれかにペプチド
   結合されたグルタミン酸を表わす。）
2. （２）次式で表わされる抗生物質ＳＫ−２０４９を生産
   する能力を有する放線菌を培地に好気的に培養し、培養
   物中に抗生物質ＳＫ−２０４９を蓄積させ、培養物から
   これを採取することを特徴とする、抗生物質ＳＫ−２０
   ４９の製造方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｇ＿１とＧ＿５とは、そのいずれかにペプチド
   結合されたグルタミン酸を表わす。）
3. （３）微生物が放線菌ＳｔｒａｉｎＳＫ−２０４９（微
   工研菌寄第８９８７号）またはその変異株である、特許
   請求の範囲第２項記載の方法。