JPH0822858B2

JPH0822858B2 - 新規抗生物質ｈ９およびその製造法

Info

Publication number: JPH0822858B2
Application number: JP12664288A
Authority: JP
Inventors: 勝重猪飼; 一任竹迫; 学井東; 浩之黒田; 栄之安田; 輝也中村; 英世山口; 勝久内田
Original assignee: 寶酒造株式会社
Priority date: 1988-05-24
Filing date: 1988-05-24
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPH01299280A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、真菌感染症の治療剤として有用な新規抗生
物質H9およびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、真菌感染症の治療剤としてはアンホテリシン
Ｂ、ナイスタチン、トリコマイシン、グリセオフルビ
ン、ピロールニトリン、クロトリマゾール、硝酸ミコサ
ゾール等約20種類あるが、効力および毒性の点に問題が
ある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は真菌感染症の治療剤として高活性、低毒性の
新規抗生物質を提供することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは新規な抗生物質の探索を目的として多数
の微生物を土壌中より分離し、その産生する抗生物質を
分離し、その生物学的性質を調べたところ、ストレプト
ミセス属に属する微生物の培養物中にカンジダ・アルビ
カンスその他の病原性真菌に対して抗菌活性を示す文献
未載の新規抗生物質が生産されることを見出した。

この抗生物質を該培養物から単離し、その理化学的性
質を調べた結果、後述の式Ｉの構造式を有する新規物質
であることを確認しこの抗生物質をH9と命名した。

すなわち本発明は、下記式で表わされる抗生物質H9およびその製造法を提供するも
のである。

まず本発明において用いる微生物は新規抗生物質H9の
生産能を有するストレプトミセス属に属する菌種であ
る。

その一例としてストレプトミセスsp.FH317と称する微
生物が前記の特性を有する新菌株で、本発明に有効に利
用しうる。ストレプトミセスsp.FH317（以下単にFH317
株という）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申
請し（昭和63年４月30日）、微工研菌寄第10012号とし
て受託された。

FH317株は下記の菌学的性質を有する。

1.形態学的性質気菌糸はイースト・麦芽寒天培地、スターチ・無機塩
寒天培地、チロシン寒天培地などで良好に着生する。分
岐法は単純分岐で車軸分岐は認めら減ない。気菌糸先端
の形状は直状または屈曲状であり３〜10個の短い胞子連
鎖が認められる。胞子の表面構造は平滑であり形状は楕
円形または円筒形で大きさは0.6〜0.7×0.9〜1.0μｍで
ある。胞子のう、菌核、菌糸束などの構造物は認められ
ない。

〔各種培地上における性質（28℃、２週間培養後観
察）〕（１）イースト・麦芽寒天培地（ISP培地No.2に準じ
る）生育は普通。気菌糸着生は良好で灰色。発育裏面は黄
褐色から暗褐色。可溶性色素は認められない。

（２）オートミール寒天培地（ISP培地No.3に準じる）生育はやや貧弱。気菌糸着生はやや不良で白色から灰
色。発育裏面は特徴のない淡黄色。可溶性色素は認めら
れない。

（３）スターチ・無機塩寒天培地（ISP培地No.4に準じ
る）生育は普通。気菌糸着生は良好で灰色。発育裏面は特
徴のない淡黄色または黄褐色。可溶性色素は認められな
い。

（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP培地No.
5に準じる）生育は貧弱。気菌糸着生はないかまたは非常に不良。
可溶性色素は認められない。

（５）グルコース・アスパラギン寒天培地生育は貧弱。気菌糸着生はないかまたは非常に不良。
可溶性色素は認められない。

（６）チロシン寒天培地（ISP培地No.7に準じる）生育は普通。気菌糸着生は良好で灰色。発育裏面は暗
褐色。可溶性色素は認められない。

（７）シュクロース・硝酸塩寒天培地生育は貧弱。気菌糸着生は不良で白色から明るい灰
色。可溶性色素は認められない。

（８）栄養寒天培地生育は普通。気菌糸着生は不良で白色から灰色。発育
裏面は特徴のない淡黄色。可溶性色素は認められない。

2.生理学的性質（１）生育温度範囲（トリプトン・イースト液体培地、
温度勾配装置使用、７日間）生育可能温度:12℃〜40℃ 生育適温:22℃〜32℃ （２）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン培地、28℃、２週間）陽性（３）脱脂乳の凝固、ペプトン化（10％スキムミルク、
28℃、２週間）ペプトン化：陽性凝固：陰性（４）メラノイド色素の生成チロシン寒天培地：陰性ペプトン・イースト・鉄寒天培地：陰性トリプトン・イースト液体培地：陰性（５）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地、炭素源１％、28℃、２週間）陽性：グルコース、フラクトース、キシロース、マンニ
トール、ラフイノース擬陽性：アラビノース陰性：ラムノース、イノシトール、シユクロース（６）耐塩性（イースト・麦芽寒天培地にNaClを添加、
28℃、２週間） NaC10％まで生育、NaC13％では生育しない。

上に記した形態学的および生理学的性質に加え全菌体
の加水分解物からLL−ジアミノピメリン酸が検出されFH
317株は明らかにストレプトミセス属に属する菌種と認
められる。

FH317株の示す諸性状をバージエイズ・マニユアル・
オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー（第８
版、1974年）；ザ・アクチノミセテス第２巻（ワツクス
マン著、1962年）およびイー・ビー・シヤーリングらの
報告（インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・システ
マテイツク・バクテリオロジー第18巻、1968年、第69ペ
ージ、同第18巻、1968年、第279ページ、同第19巻、196
9年、第391ページ、同第22巻、1972年、第265ページ）
に記載されている既知のストレプトミセス属菌種とその
性状を比較すると比較的近似する菌種としてストレプト
ミセス・ハルステデイ（Streptomyces halstedii）およ
びストレプトミセス・カテヌラエ（Streptomyces caten
ulae）の２菌種が挙げられる。以上の２菌種はメラノイ
ド色素の生産が認められず胞子連鎖が短く（10個以
下）、胞子表面が平滑状で胞子鎖形態が直状または屈曲
状という点で近似している。ストレプトミセス・ハルス
テデイは気菌糸色調が灰色、発育裏面が特徴のない灰黄
色から黄褐色である点でも本菌に近似しているが胞子鎖
形態が屈曲状が主体である点、耐塩性がNaCl≧７％（10
％＞）である点、および炭素源としてマンニトールとラ
フイノースを利用しない点で本菌と異なる。ストレプト
ミセス・カテヌラエは耐塩性がNaCl≧10％（13％＞）で
ある点、および炭素源の利用性がキシロースを除いて一
致している点で本菌に近似している。しかしながら気菌
糸の色調が緑色から灰緑色、発育裏面が灰黄色から灰緑
茶色である点で本菌と異なる。

以上FH317株はストレプトミセス・ハルステデイおよ
びストレプトミセス・カテヌラエに近似する点もあるが
異なる点も認められ本菌は上記２菌種のいずれに属させ
るのも妥当ではない。

したがつて本菌をストレプトミセス属に属する別の菌
種と認めストレプトミセスsp.FH317（Streptomyces sp.
FH317）と命名した。

本発明の抗生物質H9は、上記菌株を栄養源含有培地に
接種し、好気的に培養することにより製造される。抗生
物質H9生産菌としては上記菌株に限らず、ストレプトミ
セス属に属し、抗生物質H9を生産する能力を有するもの
であれば、すべて本発明に使用することができる。

次に、抗生物質H9の製造における菌株の培養について
説明する。

H9を生産する菌の培養に際しては、炭素源として例え
ばグルコース、フラクトース、デンプン、テキストリ
ン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸類などの
資化し得る有機炭素化合物が、窒素源としては例えば大
豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプ
トン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、
アンモニウム塩などの有機窒素化合物や無機窒素化合物
が、また塩類としては例えばナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無
機塩類が単独あるいは適宜組合せて使用される。さらに
必要に応じて、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩などの
重金属、ビオチン、ビタミンB₁などのビタミン類、その
他菌の発育を助け、H9の生産を促進するような有機物や
無機物を適宜添加してもよい。また、シリコーンオイ
ル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤や
界面活性剤を培地に加えてもよい。

培養法としては、一般の抗生物質の生産に用いられる
方法が採用されるが、液体培養法、特に振とうまたは深
部通気攪拌培養が最適である。培養には好気的条件が適
し、培養温度は通常22〜32℃が好ましく、培養pHは６〜
８であるが、７付近が好ましい。培養物中のH9の生産量
は２〜６日の培養で充分高くなる。

以上の如く培養物中に蓄積されたH9を培養物中から採
取するためには、後記する本抗生物質の理化学的性質を
利用することによつて有利に行われる。

すなわち、H9は培養液に含有されるので、まず培養
物に過助剤を加えて過あるいは遠心分離することに
よつて、菌体を除去する。得られた培養液を担体に接
触させて液中の有効成分を吸着させ、次いで溶媒で有効
物質を脱着させ、分別採取する手段が有利に利用され
る。クロマトグラフイーの担体としては活性炭、粉末セ
ルロース、吸着性樹脂など化合物の吸着性の差を利用す
るものが有効に用いられる。これら担体から目的とする
化合物を溶出するためには担体の種類、性質によつて組
み合せが異なるが、例えば水溶性有機溶媒の含水溶液す
なわち含水アセトン、含水アルコール類などを適宜組み
合せて用いることができる。

またこれらのクロマトグラフイーによつて得られた抗
生物質を含む粗物質を分取用高速液体クロマトグラフイ
ーに付し、精製品を得る事もできる。

さらに詳しく述べるならば、担体として吸着性樹脂例
えばダイヤイオンHP20あるいはSP 207（三菱化成工業株
式会社製）、アンバライトXAD-2（ローム・アンド・ハ
ース社製、米国）などを用いると液中の抗菌性物質は
吸着され、含水アセトンあるいは含水アルコール類など
で溶出される。分画された溶出画分は濃縮できる。

得られた粗物質をさらに精製するためには高速液体ク
ロマトグラフィー法（HPLC）が有効に利用できる。用い
られる担体としてはたとえばTSKゲル（トーソー株式会
社製）、YMCゲル（山村化学研究所製）などが挙げられ
移動層としては含水メタノールあるいは含水アセトニト
リルなどを用いることができる。

以上の如くして得られた抗生物質H9は次の物理化学的
性質を有する。

外観：無色粘稠な液体比旋光度：▲〔α〕²⁰ _D▼‐461.0°（c0.1アセトニ
トリル）元素分析（C₁₂H₁₈O₄として）Ｃ％Ｈ％実測値 63.63 8.03 理論値 63.70 8.02 分子量（FABマススペクトルによる） 319〔MH＋グリセリン〕^＋紫外部（UV）吸収スペクトル：アセトニトリル−水
中（第１図参照） λ_max255nm（▲E^1% _1cm▼＝377）赤外部（IR）吸収スペクトル:KBr法（第２図参照）主な吸収を示す（波数） 3450,2970,1845,1775,1275,920cm^-1 ¹³C核磁気共鳴（NMR）スペクトル:50MHz、δppm、
重クロロホルム中下記のシグナルが認められる（第３図参照） 165.6（ｓ）,165.2（ｓ）,143.6（ｓ）,142.1（ｓ）,
72.2（ｄ）,41.1（ｔ）,36.8（ｄ）,25.2（ｄ）,24.0
（ｔ）,21.3（ｑ）,15.7（ｑ）,10.1（ｑ） s:一重線、d:二重線、t:三重線、q:四重線高速液体クロマトグラフイー（HPLC）カラム：カプセルパツクC₁₈（4.6φ×250mm、資生堂
製）移動相：CH₃CN‐H₂O（1:1）、流速:0.8ml/分、Rt＝15.5
（分）呈色反応：陰性：ニンヒドリン、ドラーゲンドルフ、坂口、ライド
ン・スミス、レゾルシン−硫酸、過マンガン酸カリウム溶解性：可溶：メタノール、アセトニトリル、クロロホルム、酢
酸エチル難溶：水酸性、中性、塩基性の区別：中性 H9は各種スペクトルを検討した結果、前記式Ｉの構造
を有すると決定された。この構造に一致する既知物質は
報告されていないのでH9は新規物質であると決定した。

次にH9の各種微生物に対する抗菌スペクトルを第１表
に示す（液体培地希釈法による）さらに、H9のマウスを用いた急性毒性試験では200mg/
Kgの腹腔内投与で異常を認めなかつた。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。なお、培地におけるパーセントは特にことわりのな
い限り重量／容量％を示す。

実施例１ FH317株の斜面培養から一白金耳を100mlの種培地（グ
ルコース1.0％、ポリペプトン0.2％、ビーフエキス0.1
％、イーストエキス0.1％）を入れた500ml容の三角フラ
スコに接種し、27℃で２日間振とう培養して種培養液を
得た。この種培養液1400mlを、140lの生産培地（ポテト
スターチ0.7％、グルコース0.7％、SBM1.0％、イースト
エキス0.35％、塩化ナトリウム0.2％、炭酸カルシウム
0.3％）を入れた200l容ジヤーフアーメンターに接種
し、27〜30℃、66時間通気攪拌培養（通気量80〜110l/m
in、攪拌200r.p.m）を行つた。培養液をpH3に調整後セ
ライト1.5Kgを加えてフイルタープレスで過し、菌体
を除去し、液110lを得た。

この液を4lの吸着型合成樹脂ダイヤイオンHP20（三
菱化成社製）を充填したカラムに通した後、水でカラム
を洗浄し、次いで50％メタノール水で溶出した。溶出液
を減圧濃縮し、残渣24.5gを得た。この残渣をメタノー
ルで抽出し、抽出液を減圧濃縮し、粗物質17.5gを得
た。粗物質を分取用逆相高速液体クロマトグラフイー
〔カラム:YMC S-343（山村化学研究所製）、移動相50％
アセトニトリル水〕に付し、活性画分を得た。この画分
を減圧濃縮し、無色粘稠な液体の抗生物質H9 2.05gを得
た。

〔発明の効果〕

本発明のH9は放線菌によつて生産される新規抗生物質
であり、毒性が低くカンジダに対する抗菌活性を有する
ので臨床用医薬品たとえば真菌症の治療剤として有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質H9の紫外部吸収スペクトル、第２図は
同抗生物質の赤外部吸収スペクトル、第３図は¹³C核磁
気共鳴（NMR）スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者黒田浩之滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寶酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者安田栄之滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寶酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者中村輝也滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寶酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者山口英世神奈川県川崎市多摩区栗谷２丁目15番５号 (72)発明者内田勝久東京都練馬区中村３丁目16番３号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式で表わされる新規抗生物質H9。
【請求項２】ストレプトミセス属に属し、抗生物質H9を
生産する菌株を栄養培地にて培養し、培養物から抗生物
質H9を採取することを特徴とする新規抗生物質H9の製造
法。