JPS60252475A - 新規抗生物質オキセチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質オキセチンおよびその製造方法
に関するものである。

従来、除草剤として使用されている物質は合成化合物が
主体であるが、環境汚染が問題となυつつある今日、自
然界で安全に代謝分解され、消滅する性質がめられてい
る・従って・自然の産物である天然物、例えば、微生物
により生産された抗生物質は、理論的にも上述の問題に
かなったものと考えられる。

さて、グルタミン合成酵素は、微生物や植物で、グルタ
ミン酸合成酵素とともに窒素同化に関与していることが
知られており、特に植物においては、種々のアミノ酸や
核酸などの生合成のために、無機態♀素を同化する酵素
としてきわめて重要である。近年、微生物代謝産物とし
て知られるタブトキシン（Ｎａｔｕｒｅ、　２２９．１
７４．　（１）１９７１）の構成成分であるタブトキシ
ンが、植物のグルタミン合成酵素を阻害する結果として
アンモニアが蓄積し、植物に害作用をもたらすことが報
告された（　Ｐｂ１ｓｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈ
ｏｌ、。

２０、２０３．１９８２　）。　（２）本発明者らは、
グルタミン合成酵素の選択的（３）阻害物質が除草剤と
なりうるとの考えに基づき、多数の微生物の培養Ｐ液の
中からグルタミンと拮抗する物質の検索を行なった。本
発明は、ス（４）トレプトミセス・エスピー・０Ｍ−２
３１７株の培養Ｐ液中よシ単離されたグルタミン合成酵
素を（５）阻害する新規抗生物質オキセチンが各種植物
に対して殺草活性を有するという知見に基づくも（６）
のである。

本発明の目的は、本発明者によってオキセチ（７）ンと
命名された新規抗生物質およびその装造方法を提供する
ことである。　（８） 本発明によって提供される抗生物質オキセブンは、次の
ような理化学的性質を有する。

元素分析値：炭素、水素、窒素、酸素からなシ、リン、
イオウ、７１０２ンは含まない。本物質の元素分析値の
例をあげ ると次に示す通りである。

Ｇ　４０．７３チ、Ｈ６，１，６係、’　Ｎ　１１．６
９　ｑ６融点：１８５〜１９０℃（分解する） 分子量：１１７である。すなわち、ＦＤマススペクトル
分析において、１１８　（ｍ／ｚｐＭ＋＋１）のイオン
ピークが観測される。

比旋光度：〔α”］２９５＝　＋　５６．４°（ｃ＝１
．０゜Ｈ２０） 紫外線吸収スペクトル：末端吸収を示すのみである。

赤外線吸収スペクトル：第１図のとおりである。

プロトン核磁気共鳴スペクトル：第２図のとおシである
（重水中で測定）。

溶剤に対する溶解性：水によく溶け、メタノール、エタ
ノール、フタノール、ア セトン、酢酸エチル、クロロホルム、 ベンゼン、ヘキサン、エチルエーテル 等の有機溶媒には溶は難い。

（９）塩基性、中性、酸性の区分：両性物質である０ （１０）物質の色：白色 ０１）　Ｒ，ｆ値ニジリカゲルおよびセルロース薄層ク
ロマトグラフィー（メルク社製、 ＴＬＣアルミシート厚さｏ、２」、キーゼルゲル６０Ｆ
２５４　およびセルロースＦ２５４）を、常法により行
なったときのＲｆ値 は次のとおりである。検出には、ニン ヒドリン発色を行なう。

シリカゲル　セルロース １）メタノール／水（３：１）　０．１４　０．５１１
１）アセトン／酢酸／水 （３：１：１　）　０．３０　０．１６ｉｉｉ）　ｎ−
プロ／Ｒノール／水 （３：１　）　０．２４　０．２０ １ｖ）　ｎ−ブタノール／酢酸／ 水（３：１：１　）　０．１９　０．２４（１２）呈色
反応：ニンヒ）％　ＩＪン試薬に陽性である。

以上の理化学的性質より、オキセチンの分子式は、０４
Ｈ７Ｎｏ３　が最も適当である。

本物質は、第１図に示した赤外吸収スペクトルにおいて
、１６４０Φ−１にカルボニル基＜ｃｏｏ−＞の吸収が
、１５６００１！”にアミン基の吸収が認められ、オキ
セチンは、アミノ酸と考えられる。

さらに、カーボンゴ３核磁気共鳴スペクトル、本物質の
誘導体のガスクロマトグラフィー−マススペクトルおよ
びＸ線結晶解析の結果、本物質は、下記の構造を有する
ことが明らかとなった。

Ｈ２ オキセチンの生物学的性質は次のとおりであるＣ・ （リ　抗菌活性 寒天希釈法による最小発育阻止濃度ＣＭＩＣ）は、第１
表に示すとおりである。オキセチンは、天然培地では抗
菌性を示す。

第　１　表 試　験　菌　ＭＩＣ検定培地 スタフィロコッカス・アウレウス　ＫＢ２１０　＞１０
０　ａ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓ＋　ａｕｒｅｕ
＠）ノ考チルス・：＃ｆリス　ＫＢ２１１　２５　ａ（
Ｂａｃｌｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ目１）ミクロコツカス・
ルテウス　ＫＢ２１２　＞１００　ａ（Ｍｉｅｒｏｅｏ
ｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）ニジエリシア・コリ　ＫＢ２
１３　＞１００　ａ（Ｋｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ）クレゾシエ２・ニューモニアエ　ＫＢ１４８　＞Ｚ
ｏｏ　ａ（Ｋｌ＠ｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｓ）ゾロテラス・ブルガリス　ＫＢ１２７　＞１００　
ａ（Ｐｒｏｔｅｕｓ＋　ｖｕｌｇａｒｉｇ）カンジダ・
アルビカンス　ＫＦＩ　）１００　ｂ（Ｃａｎｄｉｄａ
　ａｌｂｉｃａｎａ）アスペルギウス・ニガー　ＫＦ　
１０５　＞１００　ｂ（Ａｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓ　ｎｉ
ｇｃｒ）ムコール・ラセモスス　ＫＦ２２３　）１００
　ｂＭｕｃｏｒ　ｒａｅｅｍｏｓｕｓ） ピリキュシリア・オリザエ　ＫＦ１８０　１２．５　ｂ
（Ｐｉｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｏｒｙｚａｓ）（注）検定
培地；ａ・・・デービス最小培地ｔ　ｐＨ７，０） ｂ・・・デキストロース・シア ペック培地 （２）殺草活性 抗生物質オキセチ／の植物に対する殺草活性は、次のよ
うな方法によシ行なった。すなわち、小型試験管（１，
７ＸＩＯ論）に水を含ませた脱脂綿をしき、１本につき
５〜６個の種をまき、子葉が３〜４−になるまで暗所（
２７６Ｃ）で生育させた。各穐濃度のオキセチンの水溶
液を１本につき０．２１ずつ散布し、光をあてて２７℃
で生育させた。そして４日目、９日目の生育状況を観察
した。その結果を第２表に示す（−二正常に生育、＋：
やや薬害、升：かなりの薬害、Ｆｌ＋：完全枯殺）。

第　２　表 上記したオキセチンの理化学的性質、構造式および生物
学的性質を、既知抗生物質のそれらと比較した結果、既
知抗生物質に該幽するものがなく、オキセチンは新規な
抗生物質であることがわかった。

本発明による抗生物質オキセチンは、ストレプトミセス
属に属しかつオキセチン生産能を有する微生物を培地に
好気的に培養し、菌体内外にオキセチンを蓄積させ、こ
れを回収することによって製造される。

本発明のオキセチンを生産するために使用される微生物
の実用的な例は、本発明者らによって、静岡県域ケ崎の
土壌から新たに分離されたストレフトミセス・エスピー
・０Ｍ−２３１７株カあげられる。この菌株は、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第７５２９号と
して寄託されている。その菌学的性状は次のとおりであ
る。

（１）形態学的性質 栄養菌糸は天然培地、合成培地の両方でよく発達し、通
常は隔壁を有しない。気菌糸は、オートミール寒天培地
、スターチ無機塩寒天培地、グルコース・アスｌＲラギ
ン寒天培地、チロクン寒天培地等で豊富に着生し、ペプ
トン・酵母エキス・鉄寒天培地、グリセリン・リンゴ酸
・カルシウム寒天培地、グルコース・ペプトン様天培地
、栄養寒天培地等では着生しない１．気菌糸は、白色な
いし灰色で、綿状を呈する。顕微鏡下の観察では、胞子
柄は直線状（撞たはループ状）を呈し、１０個以上の胞
子の連鎖が認められ、胞子の表面は平滑である。菌核、
胞子のうおよび遊走子は見出されない。

（２）各種培地上での性状 イー・ビー・シャーリングら（Ｉｎｔ、　Ｊ。

８ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６巻、３１３
頁、　１９６６年）の方法にしたがい、それに公知の培
地および実験方法を併せて使用した。その結果を次に示
す。色調は標進色としてカラー・ハーモニー・マニュア
ル第４版（コンテナー・コーポレーション・オプ・アメ
リカ・シカゴ、　１９５８年）を用いて決定し、色票基
とともに括弧内にそのコーＰを併せて記した。以下は、
特記しないかぎり、２７°Ｃ，２週間口の各培地におけ
る観察である。

（注）　ＩＳＰ：インターナショナル・ストレプトミセ
ス・プロジェクト選定の培地 （３）生理的諸性質 （＆）　メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天　陰性 （ロ）−９：ゾトン・イースト・鉄寒天　陰性（ハ）　
グルコース・ペプトン・ ゼラチン培地（穿刺；２１〜２３℃）陰性（（ロ）　ト
リプトン・イースト液　陰性（ｂ）　チロシナーゼ反応
　陰性 （Ｃ）　硫化水素の生産　陰性 （ｄ）　硝酸塩の還元　陽性 （ａ）　ゼラチンの液化（２１〜２３℃）　陰性（グル
コース・ペプトン・ ゼラチン培地） （ｆ）　スターチの加水分解　陽性 （ｇ）　脱脂乳の凝固（３７℃）　陽性（ｈ）　脱脂乳
のペプトン化（３７℃）　陽性（１）　セルロースの分
解　陰性 （ｊ）　生育温度範囲　１５℃〜４０℃（ｋ）　炭素源
の利用性（シリダム・ ゴットシーズ寒天培地） よく利用する＝Ｄ−グルコース、シュ ークロース 利用しない：Ｌ−アラビノース、Ｄ− キシロース、Ｄ−７ラク トース、ラムノース、Ｄ− マンニトール、ｌ−イノ シトール、メリビオース、 ラフィノース （４）　細胞壁組成 ディアミノピメリン酸はＬＬ−型であり、アラビノース
、ガラクトースは認められない。

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりになる
。

細胞壁組成はＬＬ−ディアミノピメリン酸を有する。ま
た、形態的には直線状（またはループ状）の胞子柄を形
成し、胞子の表面は平滑である。培養上の性質としては
、栄養菌糸はクリーム系の色を呈し、気菌糸の色調はホ
ワイトないしグレー系の色を呈する。可溶性色素はチャ
ートラーズイエローの色を呈し、メラニン色素は生産し
ない。

これらの結果から、本菌株はストレプトミセス属の菌種
であり、プリダムとトレスナーの分類（パーシーズ・マ
ニュアル・オブ・デタミネーテイブ・ノクテリオロジー
ｇａ版、１９７４年、７４８〜８２９頁）によるホワイ
トあるいはグレーシリーズに属する菌種と考えられる。

オキセチンを生産する能力を有する限シ、どのような１
株も本発明の目的に用いることができる。実施例に記載
された菌株は、本発明の目的に用いることができる。実
施例に記載された菌株は、本発明者によって新たに土壌
よシ分離されたストレプトミセス・エスピー・０Ｍ−２
３１７株であるが、オキセチンの生産能力を有する限り
、この菌株から自然的せたは人工的に誘導された変異株
も、抗生物質オキセチンの生産に用いることができる。

本発明の方法において、抗生物質オキセチンを生産する
培地としては、微生物の培養に常用される炭素源、窒素
源、無機物等を含む各種の培地を使用することができる
。例えば培地の炭素源としては、ブｒつ糖、麦芽糖、乳
糖、ショ糖、デンプン、デ中ストリン、オートミール、
グリセリン、水あめ、糖蜜などである。また、窒素源と
しては、大豆粉、コーンスチープリカー、綿実粉、ペプ
トン、肉エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物、トマ
トペースト、アンモニウム塩、硝酸塩などである。その
他、必要に応じて炭酸カルシウム、塊化ナトリウム、塩
化カリウム、リン酸塩尋の無機塩類を添加するほか、菌
の発育を助け、オキセチンの生産を促進するような有機
および無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、一般抗生物質生産の方法と同じく、液
体培養法、特に深部培養法が最も適している。培養は通
常、好気的条件下で行なわれ、通気攪拌培養が好適であ
る。培養温度およびｐｉ■は、微生物が発育し、オキセ
チンを生産する範囲で適宜変更できるが、好ましい温度
は２０〜４０℃であυ、好せしいｐＨは６〜８である。

培養時間は種々の条件によって異なるが、通常、２日〜
８日程度で培養液中に蓄積されるオキセチンが最高力価
に達する。培養終了後、培養液からのオキセチンの採取
は、微生物の培養液より、前述の理化学的性質を有する
抗生物質を分離精製する公知の手段を単独または組み合
わせて行なうことができる。

抗生物質オキセチンは、主として培養物の液体部分に存
在し、前記の理化学的性質で示すように水溶性の両性物
質であるので、その抽出、精製にあたっては、アンバー
ライ）ＩＲ−１２０（米国、ローム・アンｒ・ハース社
製）、ダウエックス５０Ｗ（米国、ダウ・ケミカル社製
）等の陽イオン交換樹脂もしくはアンバー２イトエ几Ａ
４１０　、ｌＲ４５ｅの陰イオン交換樹脂に吸着させ、
これを適当な酸、アルカリもしくは塩溶液を用いて溶出
することができる。実用的な分離精製法の一例を示すと
次のとおシである。

例えば、培養Ｐ液をアンバー２イ）ＩＲ−１２０〔Ｈ＋
〕を充填したカフλを通過させ、有効成分をイオン交換
樹脂に吸着させ、これをアンモニア水で溶出する方法は
、オキセチンの精製法として有効な手段である。このよ
うな方法で得られたオキセチンの粗物質は、他のイオン
交換樹脂、セルロース、シリカゲル、アルミナ、セファ
テックス（スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルス社製）およびトヨ／々−ル（東洋曹達工業製）
等を使用する公知の方法により、さらに純度を高めるこ
とができる・こうして得られたオキセチンは、無色方状
晶であり、その理化学的性質および構造式ならびに生物
学的性質は、前に述べた通シである。

オキセチンの塩は、常法に従い作製することができる。

例えば、オキセチンに轟量の苛性ソーダを加え、凍結乾
燥することにより、オキセチンナトリウム塩を取得でき
る。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム
塩、銅塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、・
ニッケル塩、マンガン塩、アンモニウム塩、１〜４級の
低級アルキル塩、低級１１イドロキシルもしくは低級ア
ルケニルアンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸
塩、リン酸塩、過塩素酸塩、硝酸塩、酢酸塩、プロピオ
ン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、モノクロル酢酸塩等を
あげることカーできる。

なお、生産されるオキセチンの検定にあたつは、次の方
法が用いられる。検定用培養基としては、合成培地であ
るデービス最小培地を、検定菌としては、バチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉａ）を用い
る。オキセチンは、これらを用いたペーパーディスク法
により検定する。

次に本発明の実施例を示すが、この実施例は単なる一例
を示すものであって、本発明を限定するものではない。

実施例 ストレプトミセス・エスピー・０Ｍ−２３１７（微工研
菌寄第７５２９号）の斜面培養から１白金耳を種培地１
００ｍＪに接種し、２７℃で３日間振とう培養後、１０
０１容ジャーファーメンタ−中７０７！の培地に１．４
％の鯖合で接種し、２７℃、９６時間、通気量１０！／
分、攪拌２００　ｒ、ｐ、ｍ、の条件で通気攪拌培養を
行なった。

種培地の組成は、グルコースｏ、１％、デンプン２．４
チ、ペプトン０．３チ、肉エキス０．３チ、酵母エキス
０．５％、炭酸カルシウム０．４％であシ、本培地の組
成は、デキストリン２．Ｏｑ６、グルコースｏ、２％、
大豆粉１．５％、酵母エキス０．３％、炭酸カルシウム
０．３％、アデカノールＴ、Ｇ−１０９（無電化製、消
泡剤）　０．０１４チで、ともにｐ）Ｊ　７．０に調整
後、１２１℃で１５分間滅菌した。

培養物７０１を６Ｎ−塩酸でｐＨ２，０に調整後、シャ
ープレス型遠心機で遠心分離して（１００００ｒ、ｐ、
ｍ、）培養上澄と菌体とに分別した。ここで得られた培
養上澄をセライト（米国、ジョンズ・マンヴイル・ゾロ
ダクツ社Ｍ）を−過励剤として用い濾過した。この培養
Ｐ液を、強酸性陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ−
１２０（Ｈ”）を充填したカラム（２，５１）を通過さ
せ、有効成分を吸着させた。引き続き水１０７で洗浄後
、０．５　規定アンモニア水で溶出させ、１１ずつ分画
した。活性画分（Ｎｏ、４〜８）を減圧濃縮後、強塩基
性陰イオン交換樹脂アンバーライ）ＩＲＡ−４１０（ｏ
Ｈ−）　を充填したカラム（０，９ｌ　）にかけた。引
き続き水３１で洗浄後、０．５規定酢酸で溶出させ、１
ノずつ分画した。活性画分（Ｎｏ　。

３〜４）を減圧濃縮後、凍結乾燥を行ない、淡η色の粗
粉末３０ｇを得た。この粗粉末をシリカゲルｒ＋ｏｏ、
９をｎ−ブタノール／酢酸／水（１３：１：１）で充填
したカラムにかけ、ｎ−ブタノール／酢酸／水（７：１
：１）で展開し、２０ｍ１ずつ分画した。ここで得た活
性画分（Ｎｏ。

７７０〜１１８０　）を減圧下濃縮後、凍結乾燥を行な
った。ついでシリカゲル９０．９をｎ−プロ、Ｑノール
／１嗟アンモニア水（７：１）で充填したカラムにかけ
、ｎ−プロー々ノール７１％アンモニア水（３：１）で
展開し、１５ｄずつ分画した。

ここで得た活性画分（Ｎｏ、　１８０〜２６０）を減圧
濃縮後、凍結乾燥し、２．３１を得た。水よシ再結晶す
ることにより、オキセチン１．６ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

ゑ 第１図は、オ中セチンノ臭化カリウム←→で共鳴スペク
トルである。 特許出願人　大　村　智

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （］）　下記の構造式を有する抗生物質オキセチンおよ
   びその塩。 （２）抗生物質オキセチンを生産する能力を有するスト
   レプトコツカス属に属する微生物を培地に好気的に培養
   し、培養液中に抗生物質オキセチンを蓄積させ、培養液
   からこれを採取することを特許とする、下記の構造式を
   有する抗生物質オキセチン−ｅ去の製造方 法。 （３）微生物がストレプトミセス　エスピー・０Ｍ−２
   ３１７（微工研菌寄第７５２９号）またはその変異株で
   ある特許請求の範囲第２項記載の方法。