JPH0273046A - 新規化合物ｂａ−１２物質，その製造方法並びにそれを含有するくろほ病防除剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、植物のくろは病菌の胞子に対して発芽阻害作
用を有する下記の構造式で表わされる新規化合物ＢＡ−
１２物質またはその塩、その製造方法並びにそれを含有
するくろは消防除剤に関する。

ＮＨＣＯＣＨｓ ＨｚＮ−ＣＨｚ−Ｃ８潟ＣＨ−ＣＩ（２−ＣＭ−ＣＯＯ
Ｈ［従来の技術及び発明が解決しようとする課［１従来
、農業用殺菌剤として使用されている物質は合成化合物
が主体であるが、環境汚染が問題となりつつある今日に
おいては、自然界で安全に分解代謝され、消滅する物質
が求められている。

そのような物質としては、自然の産物である天然物、例
えば微生物により生産された物質などが考えられる。

植物のくろは病菌は人類にとって古来より重要な害菌で
あるが、これに有効な薬剤は少ないので、くろは病菌の
抑制に有効で、かつ低毒性物質の出現が期待されている
。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、くろは病菌胞子に対する特異的な発芽阻
害物質が低毒性の抗くろは病剤になるとの考えに基づぎ
、多数の微生物の培養ン戸液の中からくろは病菌胞子に
対する特異的な発芽阻害物質を検索したところ、サーモ
アクチノミセス・ブルガリアスＢＡ−１２株の培養炉液
より単離された新規化合物のくろは病菌胞子に対する発
芽阻害性を見いだし、かかる知見に基づき本発明を完成
させた。

すなわち、本発明は下記の構造式で表わされる新規化合
物ＢＡ−１２物質 Ｎ１（ＣＯＣ）１３ ）ＩＪ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＯＯＨ
またはその塩を提供するものであり、さらに該新規化合
物ＢＡ−１２物質を生産する能力を有するサーモアクチ
ノミセス属に属する微生物を液体培地にて好気的に培養
することにより培養液中に該ＢＡ−１２物質を生産させ
、培養液から該ＢＡ−１２物質を採取し、必要に応じ常
法に従い塩とすることを特徴とする該ＢＡ−１２物質ま
たはその塩の製造方法および該Ｂへ−１２物質またはそ
の塩を有効成分として含有するくろは消防除剤を提供す
るものである。

本発明の新規化合物Ｂへ−１２物質は、次のような理化
学的性質を有する。

１）元素分析値：炭素、水素、窒素、酸素からなり、リ
ン、イオウ、ハロゲンを含まない。本物質の元素分析値
の例をあげると、次に示す通りである。

Ｃ：　４３．６８％　Ｈ：　７．８７％、　Ｎ　：　１
２．８０％２）融点：１２５〜１２９℃ ３）分子量：１８６である。すなわち、ＢＡ−１２物質
のトリメチルシリル化物（７ＭＳ化物）のガスクロマト
グラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ分析）において２４３
（ｍ／ｚ、Ｍ″″−ＮＨ−ＴＭＳ）のフラグメントイオ
ンピークが観測される。

４）比旋光度二　［α］Ｄ−−２−０（旦＝０．４４．
　Ｎ２０）５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収を示す
のみである。

６）赤外線吸収スペクトル：第１図に示す通りである。

１６４０ｃ＋ｎ−’にカルボニル基（ＣＯＯ−’）の１
５８０ｃｍ−’にアミノ基（ＮＨ２−’）の吸収が認め
られるので、　ＢＡ−１２物質はアミノ酸である。

７）プロトン核磁気共鳴スペクトルニ第２図に示す通り
である（重水中にて測定）。

８）溶剤に対する溶解性：水にはよく溶け、メタノール
、エタノールには一部溶け、アセトン。

酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサン、エチ
ルエーテルには溶は難い。

９）塩基性、中性、酸性の区分二両性物質である。

１０）物質の色：非常に薄い黄色。

１１）　Ｒｆ値：シリカゲおよびセルロース薄層クロマ
トグラフィー（メルク社製、　Ｔｔ、ｃアルミシート厚
さ；　０．２ｍＩＱ、薄層、キーゼルゲル６０Ｆ２５４
１　あるいはセルロースＦ２５４）を常法により行い、
ニンヒドリン発色により検出されたＲｆ値は次の通りで
ある。

第１表 １２）呈色反応：ニンヒドリン反応およびライドンスミ
ス反応に陽性である。

以上の物理化学的性質を勘案すると、　ＢＡ−１２物質
に最も適合する分子式はＣａ）ｌ＋４Ｎｚｏｓであり、
本物質は下記の構造を有することが明らかとなった。

Ｎ）ＩＣ（ＩｃＩ（３ ８２Ｎ−（：）Ｉｚ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨｚ−ＣＨ−ＧＯ
ＯＨ上記のＨＡ−１２物質の理化学的性質および化学構
造式を既知化合物のそれらと比較したところ、本物質は
いずれの既知化合物にも該当しないので、ＢＡ−１２物
質は新規な化合物であると判定した。

本発明のＢＡ−１２物質は、ＢＡ−１２物質生産能を有
するサーモアクチノミセス属に属する微生物を液体培地
にて好気的に培養することにより、培養液中に８Ａ−１
２物質を蓄積させ、これを回収することにより製造され
る。

本発明のＢＡ−１２物質生産能を有する微生物としては
、本発明者らによって土壌から新たに分離された放線菌
サーモアクチノミセス・ブルガリアスＢへ−１２株があ
り、以下の菌学的性質を有する。

ｌ）形態学的性質 栄養菌糸は酵母エキス・麦芽エキス寒天培地。

オートミール寒天培地等ではよく発達するが、ペプトン
・酵母エキス・鉄寒天培地、グリセリンアスパラギン寒
天培地、グルコース・硝酸塩寒天培地等では生育しない
。菌糸は通常は隔壁を有しない。気中菌糸は、酵母エキ
ス・麦芽エキス寒天培地、オートミール寒天培地等では
豊富に着生する。気中菌糸は白色で、主として粉状を呈
する。

顕微鏡下の観察によると、胞子柄は直線状（またはルー
プ状）を呈し、気中菌糸および基中菌糸のいずれにも主
に球状の単胞子が着生する。胞子の表面は平滑である。

菌核、胞子のりおよび遊走子は形成されない。

２）各培地上での性状 イー・ビー・シャーリングらの方法（Ｉｎｔ、　Ｊ。

５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６巻、３１３
頁、　１９６６年）に従い、それに公知の培地および実
験方法を併用した。その結果を第２表に示す。色調は標
準色としてＪＩＳ　Ｚ８７２１に準拠の標準色表（日本
色彩研究新版）を用いて決定し、色名とともに括弧内に
そのコードを併せて記す。以下特記しないかぎり４８℃
、１週間目の各培地における観察である。

また、第２表中のＩＳＰはインターナショナル・ストレ
プトミセス・プロジェクト選定の培地、Ｗはワックスマ
ン氏培地を示す。

第２表 培 地 項　　目 培養特性 第２表（続き） 培 地 項　　目 培養特性 可溶性色素　生産しない 可溶性色素　生産しない 気菌糸 可溶性色素 粉状に豊富に着生、 白色 生産しない 可溶性色素　生産しない 可溶性色素　生産しない 生　　育 貧弱に発育、白色 可溶性色素　生産しない 第２表（続き） 地 グルコース グルコース 項 生 目 目 培養特性 生育しない 可溶性色素 生産しない 生　　育 生育しない 可溶性色素　生産しない ３）生理的諸性質 ａ）メラニン色素の生成 杓　チロシン寒天培地 口）　トリプトン・イース ｂ）チロシナーゼ反応 Ｃ）硫化水素の生産 ｄ）硝酸塩の還元 ｅ）ゼラチンの液化 （グルコース・ペプトン・ ｆ）スターチの加水分解 ｇ）脱脂乳の凝固（３７℃） ｈ　脱脂乳のペプトン化 ｉ　生育温度範囲 ｊ）炭素源の利用 （ブリダム・ボッ 好んで利用する： 陰性 ト　ン夜　　　　　　　　　陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 ゼラチン培地、３７℃） 陽性 陰性 （３７℃）　　　陽性 ３３℃〜５５℃ トリーブ寒天培地） Ｄ−グルコース、フルク トース、Ｄ−マンニトール 僅かに利用する；Ｌ−アラビノース、シュクロース、メ
ルビオース、ラ フィノース 利用しない　　：Ｌ−ラムノース、サリシン、Ｄ−キシ
ロース、Ｄ− マンノース、ｉ−イノシ トール、ニスキュリン ｋ）ノボビオシン感受性（２５μｇ／ｍＬ）　　　耐性
ｌ）胞子の耐熱性　　　　　　　高度耐熱性（１００℃
の煮沸に耐える） ｍ）チロシンの資化性　　　　　　　　陽性４）細胞壁
組成 細胞壁中のジアミノピメリン酸はｍｅｓｏ−型である。

細胞壁中にアラビノースおよびガラクトースが認められ
ない。

本面に関する以上の菌学的性状を要約すると次の通りに
なる。すなわち、本菌は１：細胞壁にｍｅｓｏ−型ジア
ミノピメリン酸を含有するが、特徴的な糖を含有しない
。２：形態的には直線状（もしくはループ状）の胞子柄
を形成し、匙中菌糸および気中菌糸のいずれにも主とし
て球状の！＃胞子が着生する。３：胞子の表面は平滑で
ある。４：胞子は高度耐熱性である。５：培養中の栄養
菌糸はイエロー系の色を呈し、気菌糸はホワイト系の色
を呈する。６：可溶性色素およびメラニン色素を生産し
ない。

既知のサーモアクチノミセス・ブルガリアスＩＦＯ１４
０５１株を基準種として、「放線菌の同定法」　（日本
放線菌学界縁、昭和６０年）により、上記のごとき菌学
的性質を有するＢＡ−１２株を比較すると、　ＢＡ−１
２株はサーモアクチノミセス属ブルガリアス種に相当す
る放線菌に一致することから、本発明者らはＢＡ−１２
株を新菌株サーモアクチノミセス・ブルガリアスＢＡ−
１２と命名した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に「微工研菌寄第９９６９号」として寄託されてい
る。

本発明では、ＢＡ−１２物質を生産するための微生物は
サーモアクチノミセス・ブルガリアスＢＡ−１２株に限
定されることはなく、サーモアクチノミセス属に属し、
　ＢＡ−１２物質を生産する能力を有する菌株であれば
、自然的または人工的に訪導された変異株であってもよ
い。

ＢＡ−１２物質を生産する微生物を培養するための培地
としては、微生物の培養に常用される炭素源、窒素源、
無機物等を含む各種の培地を使用することができる。例
えば炭素源としては、ブドウ糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、
デンプン、デキストリン、オートミール、グリセリン、
水飴、糖蜜などが用いられ、窒素源としては、大豆粉、
コーンスチーブリカー、綿実粉、ペプトン、肉エキス。

乾燥酵母、カゼイン加水分解物、トマトペースト、アン
モニウム塩、硝酸塩などが用いられる。

その他、必要に応じて炭酸カルシウム、塩化ナトリウム
、塩化カリウム、リン酸塩等の無機塩類を適宜添加した
り、微生物の生育を助け、ＢＡ−１２物質の生産を促進
するような有機および無機物を適当に添加することがで
きる。

ＢＡ−１２物質を生産するサーモアクチノミセス属の微
生物を培養する方法は、抗生物質を生産する一般の方法
に準じて行えばよく、液体培養法、特に深部培養法が最
適である。培養は通常、好気的条件下で行われ、通気攪
拌培養が好適である。培養温度およびｐＨは微生物が発
育し、ＢＡ−１２物質を生産する範囲で適宜変更できる
が、好ましい温度は３７〜５５℃であり、好ましいｐＨ
は６〜８である。

培養期間は種々の条件によって異なるが、培養液中に生
成されるＢＡ−１２物質が最高量に達した時点で培養を
終了すればよく、通常は１〜４日程度である。

培養終了後、培養液からのＢＡ−１２物質の採取に当た
フては、前述の理化学的性質を有する抗生物質を微生物
の培養液より分離精製する公知の手段を単独または組み
合わせて行うことができる。すなわち、ＢＡ−１２物質
は主として培養物の液体部分に存在し、前記の理化学的
性状で示すように水溶性の両性物質であるので、その抽
出および精製に当っては、アンバーライトＩＲ−１２０
（米国、ローム・アンド・ハース社製）、ダウエックス
５０Ｗ（米国、ダウ・ケミカル社製）等の陽イオン交換
樹脂もしくはアンバーライトＩＲＡ　４１Ｇ等の陰イオ
ン交換樹脂に吸着させ、次いでＢＡ−１２物質を適当な
酸、アルカリもしくは塩溶液を用いて溶出すればよい。

例えば、培養ン戸液をアンバーライトＩＲ−１２０［Ｈ
”ｌを充填したカラムに通過させることにより有効成分
をイオン交換樹脂に吸着させ、これをアンモニア水で溶
出させる方法はＢＡ−１２物質の精製法として有効な手
段である。このような方法で得られたＢＡ−１２物質の
組物質は、他のイオン交換体やセルロース、シリカゲル
、アルミナ、セファデクス（スウェーデン国、ファルマ
シア・ファインケミカル社製）、バイオゲル（米国、バ
イオラッド社製）等を使用する公知の方法により、さら
に純度を高めることがで台る。

次に、ＢＡ−１２物質の塩は常法に従い作成することが
可能である０例えば、　ＢＡ−１２物質に等量の苛性ソ
ーダを加え、凍結乾燥することにより　ＢＡ−１２物質
のナトリウム塩を得ることができる。その他の塩として
はカリウム塩、リチウム塩、銅塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩、亜鉛塩、ニッケル塩、マンガン塩、アンモ
ニウム塩、１〜４級の低級アルキル塩、低級ハイドロキ
シルもしくは低級アルケニルアンモニウム塩、塩酸塩、
硫酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、硝酸塩
、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩。

モノクロル酢酸塩等をあげることができる。

上記方法により得られたＢＡ−１２物質またはその塩を
有効成分とすることによりくろは消防除剤を得ることが
可能である。例えば、その剤型は特に制限はないが、Ｂ
Ａ−１２物質が高い水溶性を示すことから液剤でよく、
その場合のＢＡ−１２物質またはその塩の含有量を２％
以上、望ましくは１０％以上にする。またその剤型は、
土壌処理における効果の持久性を高めるために、有効成
分を徐倣効果を持つセライト（米国、ジョーンズ・マン
パイル・セールス社製）等の物質に吸着せしめて粉剤或
は粒剤とすることができる。ギョウギシバにおける防除
時期は胞子の完熟期から飛散直前が適期である。くろは
病が土壌感染による場合の防除法は土壌処理、なかんず
く表層処理、望ましくは全層処理による。土壌処理量は
有効成分で１０ｍｇ／ａ＋’以上、望ましくはＳｏｆｆ
Ｉｇ／ｍ”以上である。

［実施例］ 次に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。

実施例１ サーモアクチノミセス・ブルガリアスＢＡ−１２株（微
工研菌寄第９９６９号）の斜面培養菌体から１白金耳分
を種培地１００＋ｎｊ！に接種し、５０℃で２日間培養
した。次いで、これを３０ｊ２容ジャーファーメンタ−
中の本培地１５λに１％の割合で接種し、５０℃で７２
時間１通気；１１５ｕ／分、攪拌数２００ｒｐｍの条件
で通気攪拌培養を行った。なお、種培地の組成はグルコ
ース０．１％、デンプン２．４％、ペプトン０．３％、
肉エキス０．３％、酵母エキス０．５％。

炭酸カルシウム０．４％であり、本培地の組成はデンプ
ン１．０％、グリセリン０．２％、ペプトン０．２％１
硫酸アンモニウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％
、硫酸マグネシウム０．１％、塩化ナトリウム０．１％
、炭酸カルシウム０．２％であり、共にｐＨ７，０に調
整し、１２１℃で１５分間滅菌した。

培養終了後、培養物１５℃を６　Ｎ　−ＮＣＲで９１１
２　、０に調整し、シャープレス型遠心機で遠心分前（
ｘ　１０．ＯＱＯｒｐｍ　）　して、培養上清と菌体と
に分別した。得られた培養上清を強酸性陽イオン交換樹
脂アンバーライトＩＲ−１２０［１（”］を充填したカ
ラム（１，５Ｉｌ）に通過させ、有効成分を吸着させた
。

引続き水５．．ＩＺで洗浄し、０，５規定アンモニア水
で溶出させ、０．５　ｆＬずつ分画した。得られた活性
画分（Ｎｏ、　　３〜７）を減圧濃縮し、１０倍量のメ
タノールを添加した。

生じた沈澱物を遠心除去し、得られた上清を減圧濃縮し
た。この濃縮液約５０ｍ１にアセトン５００ｍｊ！を添
加し、生じた沈澱物を遠心分列した。この沈澱物を少量
の水に溶解させ、凍結乾燥することにより黄色の粗ペー
スト４．７ｇを得た。

この徂ペーストをセルロース３００　ｇをｎ−ブタノー
ル／酢酸／水（１０：１：１）で充填したカラムにかけ
、ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：１１）で展開し、１
００＋ｎｉＪずつ分画した。次いで、得られた活性画分
（Ｎｏ、１１〜２０）を減圧下で濃縮し、バイオゲルＰ
−２カラム（３５０ＩＭｊ））にかけ、水で展開し、５
ｍＲずつ分画した。さらに、得られた活性画分（Ｎｏ、
１４〜１６）を減圧下で濃縮し、凍結乾燥を行い、シリ
カゲル３０ｇをｎ−ブタノール／酢酸／水（５：１：１
）で充填したカラムにかけ、ｎ−ブタノール／酢酸／水
（３：１：１）で展開し、３ｍρずつ分画した。最後に
、得られた活性画分（Ｎｏ、５９〜７７）を減圧下で濃
縮し、凍結乾燥することにより淡黄色粉末状のＢＡ−１
２物質４４０ｍｇを得た。

実施例２ ギョウギシバ〈ろは病菌の胞子に対するＢＡ−１２物質
の発芽阻害試験を次のような方法により行った。すなわ
ち、直径９ｃｍのシャーレに１．５％に溶解した寒天を
１０ｍ１ｌ入れ、静置し、寒天が固化するのを待って、
直径１０ｍｍ＋の寒天小片をくり抜いた。

得られた寒天小片にＢＡ−１２物質を所定濃度含むくろ
は病菌胞子懸濁液２０μ！を乗せ、室温にて２４時間培
養したのち、顕微鏡下（ｘｔＯＯ）で胞子の発芽を観察
し、発芽阻害率を算定した。なお、胞子懸濁液の鞄子量
は１視野あたり１００個程度になるように調整した。そ
の結果、　０Ａ−１２物質の最少発芽阻害濃度は０．０
８μｇ／Ｉｎｆｌであった。

実施例３ マウスを用いて、ＢＡ−１２物質の腹腔内投与による急
性毒性試験を環境制御室にて実施したところ、６００ｍ
ｇ／ｋｇで毒性を全く示さなかった。

実施例４ 以下に示す微生物９　ｆｆｆｉを用いてＢＡ−１２物質
の発育阻止試験を実施した。使用した菌株は、スタフィ
ロコッカス・アウレウス（Ｓｔａ　ｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓａｕｒｅｕｓ）　ＦＤＡ　２０９Ｐ、バチルス・ズブ
チルレス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｌｌｌｓ）ＡＴ
ＣＣ３９８、ミクロコツカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ　１ｕｔｅｕｓ）　ＰＣ１２１９，エシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　１
３．シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ肚匹旦皿二）ＩＦＯ３４４９，キサントモナス・
キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　リ見ＬＢ
Ｌ」）　ＮＩＡＥＳ　１１５１．サツカロミセス・セレ
ビシｚ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ｋｙｏｋａｉ−７，キャンディダ・アルビカ
ンス（Ｃａｎｄｌｄａａｌｂｉｃａｎｓ）　ＡＴＣＣ１
０２５９，アスペルギルス・ニガー（旦と」匡■胚山二
）　ｒＡＭ　２０２０”ｌ’、？＋ル。その結果、寒天
希釈法による最少発育阻止濃度はｌＯＯμｇ／ｍρ以上
であった。　　　　１実施例２〜４の結果より、　ＢＡ
−１２物質はくろは病菌に対する選択的発芽阻害物質で
あり、かつ低毒性物質であることが判った。

［発明の効果］ 本発明によれば、植物のくろは病菌に対して選択的発芽
阻害作用を有するＢＡ−１２物質を、微生物を用いて効
率よく製造することができる０本発明の新規化合物Ｂ＾
−１２物質およびその塩は、植物のくろは病の抑制に有
効であり、かつ低毒性物質であるので、安全なくろは消
防除剤としての必要条件を満たしている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　ＢＡ−１２物質を臭化カリウム錠剤法で測
定した赤外線吸収スペクトルである。第２図は、ジオキ
サンを内部標準として、　ＢＡ−１２物質をアルカリ性
下の重水中で測定したプロトン核磁気共鳴吸収スペクト
ルである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の構造式で表わされる新規化合物ＢＡ−１２
   物質またはその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）請求項１記載の新規化合物ＢＡ−１２物質を生産
   する能力を有するサーモアクチノミセス属に属する微生
   物を液体培地にて好気的に培養することにより培養液中
   に該ＢＡ−１２物質を生産させ、培養液から該ＢＡ−１
   ２物質を採取し、必要に応じ常法に従い塩とすることを
   特徴とする新規化合物ＢＡ−１２物質またはその塩の製
   造方法。
3. （３）サーモアクチノミセス属に属し、新規化合物ＢＡ
   −１２物質を生産する菌がサーモアクチノミセス・ブル
   ガリアスＢＡ−１２株（微工研菌寄第９９６９号）また
   はその変異株である請求項２記載の製造方法。
4. （４）請求項１記載の新規化合物ＢＡ−１２物質または
   その塩を有効成分として含有するくろほ病防除剤。