JPH01238579A - Ｙ−０５４６０ｍ−ａ物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は医薬として有用なＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物
質及び発酵法による該物質の製造法に関する。

（解決手段） 本発明者等は抗菌作用及び細胞障害作用を有する物質を
産生ずる微生物を検索し、その生産物につきスクリーニ
ングを進めてきたところ。

沖縄県西表島の土壌より分離した微生物が下記式で示さ
れるＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質を産生じていること
を見出し本発明を完成した。

本発明のＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質は下記式で示さ
れる４−アミノ−２，３−ジヒドロキシ−Ｎ−［１−（
８−ヒドロキシ−１−オギソー３．＝ｉ　−ジヒドロ−
ＩＨ−２−ベンゾピラン−３−イル）−３−メチルブチ
ル］−５−メチルヘキサ聾１ミ、ド（以下、この物質な
Ｙ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質という）である。

また２本発明の製造法は、バチルス属に属するＹ　−０
５４６０Ｍ　−Ａ物質生産菌を培養し。

培養物からＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質を採取するこ
とを特徴とするＹ−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の製製造法
及び本発明物質（Ｉ）につき詳述する。

（微生物） 本発明で使用される微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　）属に属し、　　Ｙ−０５４６０Ｍ−Ａ物質生産
能を有する微生物である。該微生物としては具体的には
バチルス　ニス・ビー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）
Ｙ　−０５４６０Ｍ株が挙げられる。このＹ　−０５４
６０Ｍ株は、沖縄県西表島の土壌より分離されたもので
ある。本菌株の菌学的性質は以下の通りである。

１）形態 肉汁寒天培地上で、３３°Ｃ，５日間培養した細胞は、
０．５〜０．９　Ｘ　１．８〜２．２μｍの桿菌でダラ
ム染色は陽性であり、菌体の中央〜末端よりに、楕円状
又は円錐状の胞子を形成する。

２）各種培地における生育状態 １、　肉汁寒天培地 黄味灰〜うす黄茶で、半透明の薄い円形のコロニーを形
成する。コロニーの周辺はスムーズ、ときにはラフな形
状を呈する。

２、　肉汁培地 培地は殆ど均一に混濁し、皮膜は形成しない。

３、　肉汁ゼラチン穿刺培養 ゆっくりと液化する。

４、　リドマスミルク 培養３日目ごろから凝固が認められた。

ついで５日目には凝固が完了し、ペプトン化が始まり、
２週間後に完了した。

３）生理的性質 ４）炭素源の利用性 十：利用する。　−二利用しない。

以上の菌学的性質をまとめると９本菌株はグラム陽性好
気性の有芽胞桿菌で、生育温度範囲は２０〜４０°Ｃで
、ＶＰ反応、ＭＲテスト。

カタラーゼ試験は陽性であるがデンプンの分解、硫化水
素の生成、インドールの生成、オキシダーゼ試験は陰性
である。

このような性質を有する菌をバーシーズ・マニュアル・
オプ・デターミネイテブ・バクテリオロジイ第８版（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　　８ｔ
ｈ　　ｅｄ、、　　１９７５　　）、　　及び　ノ（−
シーズ・マニュアル・オプ・システマティノク・バクテ
リオロジイ第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、　ｖｏｌ　Ｌ　１９８４　）　。

およびその他の文献によって検索すると２本菌株はバチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｓ　）属に属すると判断され、かつ
本菌株に似た菌種として、バチルス・ブレーヴイス（Ｂ
ａｃｉｌｌｓｂｒｅｖｉｓ　）があげられる。

ちなみに本菌株とバチルス・プレーヴイスの性状を比較
すると、前者はグラム陽性でｖｐ反応陽性であるのに対
し、後者はダラム変化性を示し、ｖｐ反応陰性である点
が相違点としてあげられるがその他の点についてはよく
一致した。以上のことから本菌株は、バチルス・プレー
ヴイスに近縁ではあるが必ずしも一致せず、また他の菌
種の中にも本菌株と一致する菌種が見いだせなかったた
め本菌株をバチルス属の新種と判断し、とりあえずバチ
ルス　ニス・ピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　Ｙ
　−０５４６０Ｍと命名した。なお本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号微工研菌寄
第９８９５号（ＦＥＢＭ　Ｐ−９８９５）として寄託さ
れている。

本発明に用いられる微生物は、上記菌学的性質における
特徴の他、抗菌作用及び細胞障害活性を有する物質を生
産する点においても特徴づけられる。

本発明の微生物は、自然的あるいは紫外線。

Ｘ線、化学薬剤などにより人工的に変異を起こす。本発
明で用いられる微生物としては。

天然より分離した上記Ｙ　−０５４６０Ｍ株や、バチル
ス属に属し、　　Ｙ−０５４６０Ｍ−Ａ物質生産能を有
する菌株の他、これらの自然変異株や人工的変異株も挙
げられる。

なお２本製造法の微生物は天然の土壌より分離して取得
したものであるが、前記微生物工業技術研究所に寄託し
た菌株の凍結乾燥品を復元することによって容易に人手
することができる。

（製造方法） 本発明の製造方法は、バチルス属に属し。

Ｙ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質生産能を有する微生物を
培養し、培養物からＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質を採
取することによって行われる。

培養は、その微生物が利用する栄養源を含有する培地を
用いて行なうのが有利である。培地は９合成、半合成又
は天然の、固体又は液体培地のいずれを用いてもよいが
９通常天然の栄養源を含む液体培地が好適である。培地
に添加される栄養源のうち、炭素源としては、Ｄ−グル
コース、クリセリン、テンプン、サリシン、スターチ、
ブドウ糖、デキストリン、ヤシ油、大豆油、α−メリピ
オース等が挙げられ、これらは単独または組合せ℃用い
られる。さらに、アルコール類、有機酸などを用いるこ
ともできる。

また、無機及び有機窒素源としては、塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などが、
有機窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母
、肉エキス、グルテンミール、コーンスチープリカー、
大豆粉、魚粉、落化生粉、綿実相、カザミノ酸や各種ア
ミノ酸（例えばグルタミン酸、アラニン、リジン等）な
どが単独又は組み合せて用いられる。

また、培地には必要に応じナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄。

コバルトなどの金属の硫酸塩、硝酸塩、塩化物。

炭酸塩、リン酸塩などやクエン酸ナトリウムなどの有機
酸塩を添加することができる。

培養は好気的条件下に行なうのがよく、静置。

振盪９通気撹拌培養のいずれも可能であるが。

撮盪あるいは通゛気撹拌培養が有利である。培養温度は
およそ１５〜５０℃の範囲内が好ましく。

殊に約３３〜４０℃が有利である。また、培地のｐＨは
約４〜９好ましくは６〜７．５に保持するのが好適であ
る。培養期間は培地の組成、温度等の培養条件によって
異なるが１通常約２〜１４日程度、好ましくは３〜５日
程度であり、上記生産物質が最高力価に達する時期を見
計らって適当な時期に培養を終了する。

培養された培養物中に蓄積されたＹ　−０５４６０Ｍ−
”Ａ物質な単離精製するには９通常用いられる単離精製
手段を適用すればよい。

即チ、バチルス　ニス・ヒ−Ｙ−０５４６０Ｍａを実施
例に記載の培養条件下で培養すると、培養液中にＹ　−
０５４６０Ｍ　−Ａ物質が蓄積される。

この物質の単離、精製は培養物を遠心分離又はｒ過して
、菌体を除去した後、適当な溶剤に対する溶解性及び溶
解度の差、溶液からの析出速度の差５種々の吸着剤に対
する吸着親和性の差、２種の液相間における分配の差な
どを利用する方法を適用して行なうのが好ましい。これ
らの方法は必要に応じて単独に用いられ、あるいは任意
の順序に組合せ、また反覆して適用できる。

このようにして培養物中に生産されたＹ　−０５４６０
Ｍ　−Ａ物質は遊離塩基の形、即ちＹ−０５４６０Ｍ　
−Ａ物質それ自体とし壬分離することができる。また、
このＹ　−０５４６０Ｍ−Ａ物質は。

酸２例えば塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、又は例えば
ギ酸、クエン酸、酒石酸＋　　ｐ−トルエンスルホン酸
等の有機酸と常法により反応させろとそれぞれの酸に対
応する塩類にも変化させう　　る　。

（生産物質） 本発明により得られるＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の
理化学的性質を以下に示す。

■分子量；４０８ ■元素分析値；（Ｃ２１Ｈ３２Ｎ２０６として）Ｃ（％
）■（％）　　Ｎ（％） 理論値　　７９．４８　　７．２８　　８．４３実験値
　　７８．９８　　７．０７　　８．３１■融点；１０
４〜１０６°Ｃ ■紫外線吸収スペクトル；第１図 ■赤外線吸収スペクトル；第２図 ■　１Ｈ−核磁気共鳴スベクトル；第３図■”Ｃ−核磁
気共鳴スベクトル；第４図■ＥＩ−マススペクトル；第
５図 ■　ＨＲ−マススペクトルｙ　（Ｃ２１Ｈ３２Ｎ２０６
として）ｍ／　ｚ　　４０８．２２６０８　（Ｍ”）［
相］外観；白色粉末 ■溶解性； メタノール、エタノール、アセトン。

酢酸エチル、クロロホルム、及び酸性 水に可溶。

ｎ−ヘキサンには不溶。

０塩基性、中性、酸性の区別； 塩基性の挙動を示す。

◎呈色反応； 陽性：　ドラゲンドルフ、硫酸、ニンヒドリン０薄層ク
ロマトグラフィー； シリカゲル６０Ｆ２！１４（メルク社）０．５３（クロ
ロホルム：メタノール−２：１）０．２７（クロロホル
ム：メタノール＝４　：　１　）０．１）（酢酸エチル
：メタノール−４＝１）０．５５（ｎ−プロパツール：
水　＝４　：　１　）［相］高速液体クロマトグラフィ
ー； カラム　ＹＭＣ−ＯＤＳ　　４．６ｇ　Ｘ　２５０ｍｍ
検出　３１２　ｎｍ　　　流速　１　ｒｎｌ／ｎｌ持分
間　１７．４分（メタノール：テトラヒドロフラン：０
．０２Ｍリン酸バッファーｐ）Ｉ７．５＝４０　：　１
０　：　５０） ６．４分（メタノール：テトラヒド ロフラン：０．０２Ｍリン酸バッファーｐＨ７，５ニア
セトニトリル＝５０　：　１０　：　４０　：　１０）
（発明の効果） Ｙ　−０５４６０Ｍ−Ａ物質は、各種細菌に対し抗菌活
性を示すとともに、各種腫瘍細胞に対し強い細胞障害活
性を有しているので抗菌剤、抗腫瘍剤として有用である
。

（１）抗菌作用 各種細菌に対するＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の最少
発育阻止濃度（ＭＩＣ）を表１に示す。

表１ （２）腫瘍細胞を用いる試験管内細胞障害作用試験方法
： Ｉ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｍ４に調整したＬｔ２ｔｏ
”ｉ　　Ｐ２Ｓ５””の各細胞液１　ｍｌに、エタノー
ルで溶解した各濃度のＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質４
μｔを加え、３７°Ｃ炭酸ガス培養器中で３日間培養し
た後、トリバンプルー染色法により生残細胞を計数した
。細胞障害活性は、薬剤無添加の細胞数を対照として各
濃度での細胞増殖抑制率を算出し、グラフ上にプロット
して求めた。

使用したｍｅｄｉｕｍ　： ※　ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０＋　１０％新生子牛血清※
※　ＲＰＭＩ−１６４０＋　５％牛脂児血清＋５μＭ２
−ヒドロキシエチル　ジスルフィド 結果　表２ （３）　　Ｐ２Ｓ５を用いた動物での抗腫瘍活性試験方
法： Ｐ３８８腫瘍細胞５Ｘ１０５セルをＢＤＦ／５ＬＣ５週
令オスマウスに腹腔内接種し、接種翌日よりＹ　−０５
４６０Ｍ　−Ａ物質を腹腔内投与で５日間連投した。効
果は対照群の中間生存日数に対する。　Ｙ−０５４６０
Ｍ−Ａ物質投与群の中間生存日数の比より延命率を算出
して求めた。

（実施例） つぎに実施例を挙げて本発明を更に説明する。

実施例 グルコース０．５％、白色デキストリン２．０％、ポリ
ペプトンＯ１５％、酵母エキス０．５％、プレインハー
トインフュージョン０．５２％、コーンスチープリカー
０．５％、肉エキス０．３％、炭酸カルシウム０．２％
ヲ含む培地Ａ（ｐＨ８，０）を作製し、これを５００ｍ
４三角フラスコに６０ｍ７ずつ分注し１２０℃で２０分
間滅菌したものに、ベネノト寒天培地上に生育させたバ
チルス−ニス・ビーＹ　−０５４６０Ｍ株の菌糸をかき
坂って接種し、２７°Ｃで４８時間振盪培養を行い種培
養液とする。つぎに培地Ａ３Ｚを作成し、これを５００
ｍ１三角フラスコに６０ｍｔずつ分注し、１２０℃で２
０分間滅菌したものに種培養液を３．０％の割合で植菌
した。２７°Ｃで４８時間振盪培養を行い種培養液（２
）とする。白色デキストリン４０％、グルコース１．０
％、ピーナツパウダー４．０％、グルテンミール１．０
％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．
２％、塩化コバルトＯ，ＯＯＯ４％、アデカノール（無
電化製＞　０．０３％を加えた培地Ｂ５１（ｐＨ６，０
）を作製し、これを３０４と２０１ジヤーに分注し。

１２０°Ｃで２０分間滅菌したものに種培養液（２）を
３．０％の割合で植菌した。２７℃で４日間振盪培養を
続はルト、バチルスズプチルス　ＡＴＣＣ６６３３株に
対する抗菌活性は最大となる。このようにして得られた
培養液に、４規定の塩酸を加えｐＨ３に調整する。この
液を遠心分離機にて毎分８０００回転の速度で遠心する
とｆ液４５１が得られる。このＰｉＱに４規定の水酸化
ナトリウムを加えてｐＨ９に調整した後、４５ｔの酢酸
エチルを加えてよく撹拌する。

酢酸エチル層を分離する。酢酸エチルでの抽出を２度行
う。これに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、さらに
減圧濃縮して５ｔにする。次にこの酢酸エチルに４規定
の塩酸でｐＨ３に調整された酸性水３１を加えて、よく
撹拌する。

酸性水での抽出を２度行う。この酸性水に４規定の水酸
化ナトリウム液を加えてｐＨ９に調整した後、４ｔの酢
酸エチルを加えてよく撹拌する。酢酸エチル層を分離す
る。酢酸エチルでの抽出を２度行う。これに無水硫酸す
）　ＩＪウムを加え℃脱水し、さらに減圧濃縮すると茶
色のオイル状物質が得られる。得られたオイル状物質を
少量の酢酸エチル：メタノール（２：１）ｉに溶解し、
ワコーゲルｃ　−２００（和光紬薬製）ｓｍｏｇを充填
したカラムに乗せ、クロロホルム：メタノール（４：１
）を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーを行い、
バチルス　ズプチルスＡＴＣＣ６６３３株に抗菌活性を
示す両分を集めて減圧濃縮すると、白色粉末が得られる
。得られた粉末を少量の酢酸エチル：メタノール（４：
１）液に溶解し、ワコーゲルＣ−２００２００ｇを充填
したカラムに乗せ、酢酸エチル：メタノール（４：１）
を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーを行い、バ
チルス　ズブチルスＡＴＣＣ６６３３株に抗菌活性を示
す両分を集めて減圧濃縮すると、白色粉末が得られる。

さらに得られた粉末をクロロホルム：メタノール（４：
１）を展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーを行い
、バチルス　ズブチルスＡＴＣＣ６６３３株に抗菌活性
を示し、かつシリカゲル６０Ｆ２５４　（メルク社）の
薄層クロマトグラフィー（展開溶媒クロロホルム：メタ
ノール＝４：１）でＲｆｏ、２７の両分を集めて減圧濃
縮すると、　　Ｙ−０５４６０Ｍ−Ａ物質の白色粉末１
．９５ｇ得られる。

このものの理化学的性状は前記の通りであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の紫外線吸収ス
ペクトルを示す。 第２図はＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の赤外線吸収ス
ペクトルを示す。 第３図はＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の１Ｈ−核磁気
共鳴スペクトルを示す。 第４図は￥　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質の１３ｃ−核磁
気共鳴スペクトルを示す。 第５図はＹ　−０５４６０Ｍ　−Ａ物質のＥｌ−マスス
ペクトルを示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるＹ−０５４６０Ｍ−Ａ物質。
2. （２）バチルス属に属するＹ−０５４６０Ｍ−Ａ物質生
   産菌を培養し、培養物からＹ−０５４６０Ｍ−Ａ物質を
   採取することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記
   載のＹ−０５４６０Ｍ−Ａ物質の製造法。
3. （３）Ｙ−０５４６０Ｍ−Ａ物質生産菌がバチルス　エ
   ス・ピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）Ｙ−０５４６０
   Ｍ（微工研菌寄第９８９５号）である特許請求の範囲第
   （２）項記載の製造法。