JP2578486B2

JP2578486B2 - 新規物質ｋｓ―５０２

Info

Publication number: JP2578486B2
Application number: JP22405188A
Authority: JP
Inventors: 聡中西; 耕二山田; 勲川本; 勝彦安藤; 浩佐野; 亨安澤; 廣加瀬
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-09-07
Filing date: 1988-09-07
Publication date: 1997-02-05
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: JPH0272185A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はスポロスリックス（Sporothrix）属に属する
微生物が生産する血小板のセロトニン放出抑制作用及び
抗健忘作用を有する新規物質KS−502に関する。

従来の技術微生物が生産する血小板のセロトニン放出抑制作用あ
るいは凝集抑制作用を有する物質として、下記のような
物質が報告されている。

・ピロシン類（pyrrothines）ケミカル・アンド・ファーマスーティカル・ブリティン
（Chem.Pharm.Bull.）28,3057−3162（1980）チオルチン（thiolutin）:R＝CH₃ オーレオスリシン（aureothricin）:R＝CH₂CH₃ イソブチロピロシン（isobutyropyrrothine）:R＝CH（C
H₃）_２・WF−5239 ジャーナル・オブ・アンチビオティクス（J.Antibio
t.）37,469−474（1984）・WF−30581 ジャーナル・オブ・アンチビオティクス（J.Antibio
t.）37,1153−1160（1984） WF−30581A:R＝CH₂CH₂CH₃ WF−30581B:R＝CH₂CH₂CH₂CH₃ ・KS−290 II i−２特開昭61−195689号公報・スタウロスポリン（staurosporine）アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリィ（Agric.Biol.Chem.）50,2723−2727（1
986）また、微生物が生産する抗健忘作用を有する物質は、
まだ知られていない。

発明が解決しようとする課題血小板のセロトニン放出抑制作用、凝集抑制作用ある
いは、抗健忘作用を有する物質は、常に求められてい
る。

課題を解決するための手段医薬品またはその中間体となりうる有用な新規生理活
性物質を提供するという目的のもとに、天然界より入手
した数多くの微生物の生産性について研究を行った結
果、新たに分離した微生物が血小板のセロトニン放出抑
制作用および抗健忘作用を示す生理活性物質を生産する
という事実を見い出した。該生理活性物質を単離、精製
し、その理化学的性質を調べたところ新規物質であるこ
とが判明した。以下、該物質をKS−502と称する。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は、下記の理化学的性質を有する新規物質KS−
502を提供する。

性状：白色粉末融点:119〜120℃ 比旋光度：▲〔α〕²³ _D▼−45゜（c0.3,メタノール）溶解性：易溶：メタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ピ
リジン、モノエタノールアミン、酢酸、アルカリ性水可溶：クロロホルム、酢酸エチル、アセトニトリル不溶：ヘキサン、四塩化炭素、ベンゼン、中性水、酸性
水呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、塩化第二鉄の各
反応に陽性、アニリンフタル酸、ニンヒドリン、ライド
ンスミスの各反応に陰性紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液：λ_max（ε） 210nm（56,000）,245nm（12,000）,290nm（6500）酢酸メタノール溶液：λ_max（ε） 252nm（14,100）,282nm（6600,sh）,300nm（5400,sh）アルカリ性メタノール溶液：λ_max（ε） 234nm（18,900,sh）,298nm（24,800）赤外部吸収スペクトル:KBr 3450,2972,2940,2872,1724,1595,1463,1432,1375,1343,
1245,1161,1135,1062cm^-1 マススペクトル:SIMS,ネガティブ m/z:647（Ｍ−１）^-1,392,251 NMRスペクトル：¹ H−NMR（400MHz,CD₃OD,δ）:6.60（1H,d,J＝2.3Hz）,
6.58（1H,d,J＝2.1Hz）,6.51（1H,d,J＝2.3Hz）,6.38
（1H,d,J＝2.1Hz）,5.54（1H,d,J＝1.8Hz）,4.27（1H,d
d）,ca.4.1（2H）,3.76（1H,br t,J＝5.9Hz）,3.65＆3.
61（2H,ABin ABX,J_AB＝11.0,J_AX＝5.6,J_BX＝7.0Hz）,3.
09（2H,br,dd）,2.65（2H,br,dd）,ca.1.6（4H,m）,1.2
〜1.4（16H）,0.88（3H,t,J＝6.6）,0.87（3H,t,J＝6.
7）¹³ C−NMR（100MNz,CD₃OD,δ）:176.6,168.2,164.3,161.
2,157.3,154.6,149.6,144.8,116.0,115.7,115.6,111.1,
108.6,108.4,102.0,85.5,83.5,78.6,72.2,64.4,36.5,3
4.9,33.2,33.1,33.0,32.6,31.0,30.7,30.5,30.3,23.74,
23.70,14.46,14.43 以上の理化学的性質からKS−502は下記の式で表わさ
れる新規物質であることが判明した。

次に、各種展開剤によるKS−502の薄層クロマトグラ
フィーのRf値を第１表に示す。検出は、253.7nmの紫外
線照射により行った。

薄層：シリカゲル60F₂₅₄プレート（メルク社5628）展開：室温、上昇法、15〜30分 KS−502は血小板セロトニン放出抑制作用および抗決
健忘作用を有する。

次に、KS−502の製造法について説明する。

KS−502は、スポロスリックス（Sporothrix）属に属
し、KS−502生産能を有する微生物を培地に培養し、培
養物中、主に菌体にKS−502を生成蓄積させ、該培養物
からKS−502を採取することにより製造される。

KS−502生産性微生物としてはスポロスリックス（Spo
rothrix）属に属し、KS−502生産能を有するものであれ
ばいずれの微生物でもよい。具体的に好適な一例とし
て、神奈川県足柄上郡山北町において採集された落葉よ
り、本発明者により分離されたスポロスリックス・スピ
ーシーズ（Sporothrix sp.）KAC−1985株（以下TAC−19
85と称す）があげられる。

KAC−1985の菌学的性質は次の通りである。

（１）各培地における生育状態麦芽エキス寒天培地上およびバレイショ・ブドウ糖寒
天培地上とも、下記に示したような生育状態を示す。

生育は比較的遅く、20℃、30日間の培養で集落の直径
は29〜33mmに達する。集落は、ドーム状を呈し、集落表
面および裏面とも白色あるいはクリーム色を呈す。

菌糸は隔壁を有し、培地中および培地上を伸長する。
菌糸は、直径１〜６μｍで無色、平滑で良く分岐し、時
折菌糸融合が見られる。分生子柄は、無色、平滑で長さ
4.5〜20μｍ、幅1.5〜2.5μｍで、隔壁を有する場合も
ある。分生子柄先端部において分生子をシンポジアルに
形成し、その後分生子柄を伸長させる場合も見られる。
分生子は、単細胞で無色、平滑、長楕円形を呈し、長さ
４〜７μｍで稀に10μｍに至り、幅１〜２μｍである。
なお、本菌株の完全世代は見られない。

（２）生理的性質成育温度:5〜25℃ 至適成育温度:15〜25℃ 成育pH:3〜11 至適成育pH:4〜９以上の菌学的性質から、KAC−1985の分類学上の位置
をザ・ジュネラ・オブ・ファンジャイ・スポルレイティ
ング・イン・ピュア・カルチャー第２版（The Genera o
f Fungi Sporulating in Pure Culture,2nd ed Cramer,
Vaduz,J.A.von Arx,1974年）に従って検索した。その結
果本菌株は、スポロスリックス・スピーシーズ（Sporot
hrix sp.）に属することが認められた。本発明者は、本
菌株をスポロスリックス・スピーシーズKAC−1985と命
名し、微工研条寄第1278号（寄託日：昭和62年２月４
日）として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

微生物の培養に際しては菌類の培養に用いられる通常
の培養方法が適用される。用いられる培地は菌の資化し
うる炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地
であれば天然培地、合成培地いずれでも用いうる。

炭素源としてはグルコース、フラクトース、スタビロ
ース、サッカロース、ラクトース、澱粉、デキストリ
ン、マンノース、マルトース、糖蜜、マッシュポテトの
素などの炭水化物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマー
ル酸などの有機酸、グルタミン酸などのアミノ酸あるい
はグリセロール、綿実油などが用いられる。

窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアン
モニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、シスチン、
アラニンなどのアミノ酸、尿素、麦芽エキス、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチー
プ・リカー、大豆粉、綿実粕、大豆カゼイン、カザミノ
酸、ファーマメディア、ソルブル・ベンジタブル・プロ
ティン、野菜、果実のジュースなどが用いられる。

無機物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二
ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マン
ガン、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテン酸カルシウ
ム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アルミニウムカリ
ウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、塩化コバルト、
塩化ナトリウム、リン酸マグネシウムなどが用いられ
る。

その他必要に応じて培地にビタミン、サイアミンなど
菌体の増殖あるいはKS−502の生産を促進する物質を加
えることができる。

用いられる微生物が成育に特定の物質を要求する場合
は成育に必要な物を加えることが必要である。

培養は振盪培養法、通気攪拌培養法などにより15〜25
℃の温度で中性付近のpHで行われる。３〜15日の培養に
よってKS−502の蓄積が最大に達し、培養は完了する。

蓄積したKS−502を菌体から単離採取するに際して
は、通常の生理活性物質を菌体から採取する方法が適用
される。

即ち、過、遠心分離などによる菌体の取得、メタノ
ール、アセトンなどの有機溶剤による菌体からの抽出、
水または二種類以上の有機溶剤による分配、吸着樹脂、
シカゲル、シラナイズドシリカゲル、アルミニウム、セ
ルロース、珪藻土、珪酸マグネシウム、ゲル過剤など
を用いるカラムクロマトグラフィーもしくは薄層クロマ
トグラフィーによる活性物質の吸脱着処理などによって
KS−502を単離することができる。

菌体からKS−502を単離する１例は次の通りである。

培養液を過もしくは遠心分離することによって菌体
を取得する。得られた菌体にメタノールなどの有機溶剤
を添加し、充分攪拌した後、再度過もしくは遠心分離
によって菌体と液もしくは上清液とを分離する。得ら
れた液もしくは上清液から溶剤を減圧下で蒸発させて
濃縮し、水溶液とする。ついで、この水溶液から酢酸エ
チルなどの水と混和しない適当な溶剤を用いて抽出す
る。抽出液を減圧濃縮した後、クロロホルム−メタノー
ルの混和溶媒を展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラ
フィーを行う。メタノールの含量を段階的にふやすこと
によりKS−502を溶出する。KS−502を含む画分を集めて
減圧下で濃縮し、セファデックスLH−20（ファルマシア
社製）のカラムクロマトラフィーを行う。KS−502を含
む画分を集めて減圧下で濃縮乾固することによりKS−50
2の白色粉末を得る。

上記精製工程中のKS−502の検出はシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー、ついでヨウ素反応または253.7mmの
紫外線照射により行った。

以下に実施例を示す。

実施例種菌としてスポロスリックス・スピーシーズ（Sporot
hrix sp.）KAC−1985を用いる。該菌株をグルコース1.0
g/dl、ペプトン（極東製薬工業株式会社製）0.5g/dl、
乾燥酵母エビオス（朝日麦酒社製）0.5g/dl、Ｖ−８野
菜ジュース（キャンベル社製）0.2dl/dl、炭酸カルシウ
ム0.3g/dl、pH6.0の組成の種培地40mlに植菌した。つい
で25℃で菌が充分生育するまで振盪培養した。この種培
養液10mlを下記の組成の発酵培地100mlに植菌した。

発酵培地；グルコース1.0g/dl、ペプトン0.5g/dl、乾
燥酵母エビオス0.5g/dl、Ｖ−８野菜ジュース0.2dl/d
l、リンゴジュース（明治屋社製）0.2dl/dl、炭酸カル
シウム0.5g/dl、pH6.0 培養は25℃で12日間振盪下に行った。培養終了後、培
養液1.3を遠心分離（日立製作所社製RPR−９−２型ロ
ーター、7000rpm）した。ついで、菌体に1.3のメタノ
ールを添加し、充分攪拌した。その後、過によって菌
体を除去した。得られたメタノール抽出液から減圧下で
メタノールを留去し水溶液（約100ml）にした。これを2
N塩酸でpH2に調整した後、100mlずつの酢酸エチルで３
回抽出した。酢酸エチル抽出液を減圧下で濃縮した後、
少量のクロロホルムに溶解した。これをクロロホルムを
用いて充填した250mlのシリカゲルＣ−200（和光純薬社
製）カラムを用いて500mlずつのクロロホルム、５％メ
タノール／クロロホルム（V/V）、10％メタノール／ク
ロロホルム（V/V）さらに20％メタノール／クロロホル
ム（V/V）を展開溶媒として順次溶出を行った。溶出画
分を18gずつ分取すると、フラクション番号160から201
にKS−502が溶出してくる。この画分を集め減圧下で濃
縮した後、少量のメタノールに溶解した。これをメタノ
ールを用いて充填した100mlのセァデックスLH−20（フ
ァルマシア社製）カラムを用いて、メタノールを展開溶
媒として溶出を行った。溶出画分を4.4mlずつ分取する
とフラクション番号19から28にKS−502が溶出してく
る。この画分を集め減圧下で濃縮乾固することにより、
92mgのKS−502の白色粉末を得た。なお、上記精製工程
中のKS−502の検出はシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー、ついでヨウ素反応または253.7nm紫外線照射法によ
り行った。

次に、KS−502の血小板セロトニン放出抑制作用およ
び抗健忘作用を実験例により説明する。

実験例1. 血小板からのセロトニン放出に及ぼす影響（１）方法白色家兎血液9.25volを頚動脈より、77mM エチレン
ジアミン四酢酸（以下EDTAと略記する）0.75vol中に採
取し、200×ｇ、15分遠心して、多血小板血漿（PRP）を
得た。

このPRPを〔¹⁴C〕−セロトニン（２μCi/100mlPRP）
と37℃、１時間インキュベートして、〔¹⁴C〕−セロト
ニンを取り込ませた。その後、650×ｇで15分遠心して
血小板沈査を得た。この血小板沈査をトリス緩衝生理食
塩水（pH7.4、1mM EDTAを含む）で洗浄後、最後に、Ca
⁺⁺−free Tyrode液10⁹cells/mlになるように浮遊させ
た。

このようにして調製した〔¹⁴C〕−セロトニン放射化
血小板浮遊液0.475mlに被検薬物溶液５μを入れて37
℃で３分インキュベート後、刺激薬トロンビン（終濃度
0.25U/ml）または、A23187（終濃度２μＭ）＋CaCl
₂（0.5mM）を加え、さに３分インキュベートした。ただ
ちに、反応液0.3mlを取り、氷冷した0.1Mホロムアルデ
ヒド−5mM EDTA液30μ中に入れ、反応を停止した。3,
000rpmで10分間、０℃で遠心後、上清250μを取って
液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定し
た。

（２）実験成績第２表に示すようにKS−502は濃度依存的に血小板の
セロトニン放出を抑制した。

実験例2. スコポラミン健忘に対する作用（１）方法実験装置としては明暗箱装置を用いた。すなわち4Wの
白色蛍光灯で照明された15×９×11cmの明室と15×14×
18cmの暗室からなり、２つ部屋は３×3cmのギロチンド
アで仕切られている。各部屋の床はステンレススチール
製グリッド床になっており、暗室の床からは弱い電流が
通電できるようになっている。

まず、生理食塩水に溶解していた被検薬（10ml/0.1m
l）を体重24〜28gの雄性dd系マウスの腹腔内に投与し、
さらにその直後にスコポラミン0.5mg/kgを腹腔内に注入
することにより健忘処理を行った。健忘処理の30分後に
以下の方法により獲得試行を行った。

すなわち、マウスを明室にいれ、10秒後にギロチンド
アを開放し、マウスの四肢が完全に暗室に入った直後に
床グリッドに通電してfoot shock（0.18mA、２秒間）を
与えて直ちに取り出した。なお明室から暗室にはいるま
でに60秒以上を要したマウスはこの試験から除外した。

獲得試行の24時間後に試験試行を行った。すなわち、
マウスを再び明室にいれ、10秒後のドア開放からマウス
が完全に暗室に入るまでの潜時（latency）を測定し
た。最大測定時間は600秒とし、600秒以上の回避を示し
たマウスの潜時は600秒とした。なお、１群の動物数は3
0匹以上とした。

第３表に示すようにスコポラミンによる健忘に対して
KS−502は0.156〜10mg/kgの広範囲にわたって有為な抗
健忘作用を示した。

発明の効果本発明は、血小板のセロトニン放出抑制作用および抗
健忘作用を有する新規物質KS−502を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者加瀬廣東京都小金井市前原町３―35―18 審査官谷口博

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表わされる新規物質KS−502。