JPS60180582A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属に属する
新規微生物に関する。更に詳しくは９本発明はス／ピー
ＲＡ　２８５９に関する。

本発明者等は、土壌微生物より各種菌株を分離、探索す
る過程で、熊本県阿蘇郡白用村の土壌から分離されたＲ
Ａ　２８５９株がセレノ化合物を有する培地中で生育能
を有し、さらにその培養液中に多量の　し−セレノシス
チンをｉｆｆることをつきとめた。Ｌ−セレノシスチン
は、従来特殊な植物から分離された報告はあるが、微生
物の培養液から羊離された事例はない。

以下２本発明の微生物を詳細に説明する。

ＲＡ　２８５９株の菌学的性質を示すと以下の通りであ
る。

１１、形態学的性質 栄養寒天培地上で３７０，２８〜４８時間培養した細胞
は、０，５〜０．８　Ｘ　２．０〜３．０μｍの大きさ
をもつ桿菌であり２周鞭毛を有し、運動性がある。

菌体の中央またはや〜末端寄りに１個の胞子を形成し、
その大きさは１．２〜１５μｍ程である。この胞子は１
００　Ｃ１時間の加熱に耐熱性を示す。

Ｉｌ、各種培地における生育状態 （１１肉汁寒天培地（３７Ｃ，２日） 白〜黄味白で光沢ある薄℃・円形のコロニーを形成する
。１％グルコース加肉汁寒天培地ではわずかに赤味を帯
びた可溶性色素を培地中に生産する。

（２）　肉汁ブロス（３７Ｃ，２日） 静置培養では表面にしわ状のにぷ黄色の薄・膜を形成し
、培養液は殆んどにごらない。

（３）　リトマスミルり（３７Ｕ、２日）中性〜アルカ
リ性のままペプトン化する。

（４）　肉汁ゼラチン穿刺培養（２０Ｃ，２〜７日）２
日後わずかに液化し、１週間後の生育はあまり良くない
が、液化はかなり進行する。

■、生理学的性質 （１）　デンプンの加水分解　陰性 （２）　ゼラチンの液化　陽性 （３）　カゼインの加水分解　陽性 （４）　カタラーゼ反応　陽性 （５）　インドールの生成　陰性 （６）　硫化水素の生成　陰性 （７）　ウレアーゼ反応　陰性 （８）硝酸塩の還元　疑陽性 （９）　クエン酸の利用（シモンズ培地）　陽性（１１
）　オキシダーゼ　陰性 饅　ｖｐテスト　陽性 （１３１ＭＲテスト　陽性 側　栄養要求性　なし ａツ　嫌気性条件下での生育　生育せず（１ｓ　チロシ
ンの分解　陰性 αη　ポリ−β−〕・イドロキシブチレートの体内蓄積
　陰性ａυ　Ｏ−Ｆテスト　Ｏ型ガス陰性 （イ）　至適　ｐＨ７，０〜８゜０ ψυ　糖の利用性 下記の糖を唯一の炭素源として利用生育する。

トレハロース、フラクトース、グルコース。

マンニトール、Ｄ−ガラクトース、マルトース。

Ｄ−ソルビトール、サリシン、グリセリン。

シュクロース。

下記の糖では利用性が疑わしく・。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、イノシトールＬ−
ラムノース ラクトースでは生育しない。

以上の菌学的性質をまとめると、当該菌株は。

ダラム陽性で運動性を有し、耐熱性の有芽胞桿菌で、好
気条件下でのみ生育する。その生育温度範囲は１５〜５
５　Ｃである。いくつかの培地中で僅かに茶〜赤味茶の
色素を生成する。ｖｐ反応、ＭＲテスト、硝酸塩の還元
、カタラーゼ試験は陽性であるが、デンプンの分解、イ
ンドールの生成、硫化水素の生成は陰性である。

このような性質を有する菌をパージエイズマニュアル　
オプ　デターミネイティブ　バクテリオロジイ（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）第８版および
その他の文献により一検索すると、当該菌株はバシラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属に属することは明らかである
。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ属は、２グループに分類され、グル−
１１，２２種、グループ■、２６種計４８種が記載され
ているが、ＲＡ　２８５９株に類似した株として、Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｂ、ｐｕｍｉｌｉｓ、　Ｂ、　ｌ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓがあげられろ。

このうち、Ｂ、　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓは通性嫌
気性であり、スターチの分解力が陽性である点で本菌と
は異なる。Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｂ、ｐｕｍｉｌｉ
ｓは本菌とほぼその性状が一致しているが表ＩＶＣ示し
た点でわずかに異なる。

表１゜ 「 以上の観点から当該菌株をＢａｃｉｌｌｕＳ属に属する
新菌種としてＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　ＲＡ　２８５
９と命名した。

甑 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に。

受託番号微工研菌寄第７４’、！−３号として寄託され
ている。

本発明に係る微生物は、上記の菌学的性質に言うセレン
化合物とは、セレノ酸、亜セレン酸およびそれらの塩類
（ナトリウム塩、カリウム塩など）等である。

微生物の諸性質は常に一定したものでなく自然的９人工
的に変化することは周知のとおりであう。ヶ９．Ｃ，オ
、エイおウケ順よｒ　＝ａ　２＜　井’ラス　エスピー
　ＲＡ　２８５９株のみに限定されるシ ものではなく、該ＲＡ　、２８５９株と同一の菌種バチ
ラス　エスピーに属する全ての菌株、あるいは・・；ラ
ヘ属に属品９・ノシヘチ・を液体培地中に産生ずる全て
の菌株を包含するものである。

かかる菌株の具体例としては１例えば上記ＲＡ２８５９
株に、Ｘ線、γ線、紫外線等の照射、化学変異剤処理、
ファージ接触、形質転換、形質導入、接合による遺伝子
組換え、細胞融合による遺伝子組換え、プラスミドによ
る遺伝子導入などの変異処理を施すことにより、Ｌ−セ
レノシスチンの生産能を高めた人工的変異株ある℃・は
ＲＡ２８５９株の培養中などにおいて自然発生した突然
変異株が挙げられる。

本発明の新菌種に属する微生物は天然の土壌より分離し
て取得したものであるが、前記微生物工業技術研究所に
寄託した菌株の凍結乾燥品？復元することによって容易
に取得することができる。

本発明に係る微生物の培養は、その微生物が利用する栄
養源を含有する培地を用いて行なわれる。培地は合成、
半合成、又は天然の、固体又は液体培地のいずれを用（
・でもよいが１通常天然の栄養を含む液体培地が好適で
ある。　培地に添加する栄養源としては、炭素源として
椿油、大豆油、ヤシ油、ナタネ油、胚芽油、ヒマワリ油
、サフラワー油、ゴマ油、米ぬか油、ピーナツツ油、シ
ークａ−ス、糖蜜、あるいはコハク酸ナトリウム、クエ
ン酸ナトリウムが、窒素源としては肉エキス、ペプトン
、グルテンミール、カゼイン加水分解物、綿実粕、大豆
粉、落下生粉、米ぬか、魚粉、コーンスチープリカー。

）７−マメデア、乾燥酵母、ふすま、酵母エキス。

小麦胚芽、各種アミノ酸（例えばグルタミン酸。

アラニン、リジン等）、アンモニウム塩（例えハ硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム等）。

尿素などの有機、無機の窒素源が用いられる。

また、培地には必要に応じナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄などの金属の硫酸塩、
硝酸塩、塩化物、炭酸塩。

リン酸塩などを添加することができる。

培養は好気的条件下に行なうのがよく、静置。

振盪１通気攪拌培養の（・ずれも可能であるが。

振盪ある（・は通気攪拌培養が有利である。培養温度は
およそ１８〜３５Ｃの範囲内が好ましく。

殊に約２７〜３５　Ｕが有利である。また、培地のｐＨ
は約５５〜８５．殊に約６〜８の中性付近に保持するの
が好適である。培養期間は培地の組成。

温度等の培養条件によって異なるが４通常約２日〜１０
日程度がよし・。

培養物に蓄積されたし一セレノンスチノを単離・液中に
蓄積されるので、遠心分離又は濾過等により菌体を除去
した後、除菌液より単離精製される。かくして、単離さ
れた　し−セレノシスへ１１２　１Ｎｔｉ２ は１重金属中毒の解毒作用、抗癌作用を具備する有用な
化合物である。

なお、Ｌ−セレノシスチンは特殊な植物（チャノヒキ　
ＡｌｌｉｕＡｌｌｌｕ　）から分離されたことがあるが
、その量は極めて微量である。また１合成的にもＤＬ体
を取得した報告がある。

実施例 〉 ［バチラス　エスピー　ＲＡ　２８５９の分離］熊本県
阿蘇郡白用村で採取された土壌サンプルを一夜風乾し、
適当な濃度になるまで滅菌生食液で希釈した後９分離用
培地にサンプルを混釈しシャーシに流す。なお分離用培
地の組成はグリセリン２％、ふすま１％、５−１１１ミ
一ト１％。

フ７−マメディア０５％、クエン酸ナトリウム０３％、
寒天１５％であり、　ｐＨは７．０−’Ｃ−ある。２８
ｃで５日間培養した後、ベネット寒天斜面培地に釣菌し
、さらに同温度で７日間培養したものを原菌株（ＲＡ　
２８５９株）とした。

［Ｌ−セレノシスチンの採取］ （１）　椿油１％、ふすま１％、Ｓ−ノＩＩミート１％
。

フ７−マメディア０５％、クエン酸ナトリウム０．３　
％　＋　セレノ酸ナトリウム０．１％を含むｐＨ７，０
の液体培地６１を用意し、培地を５００ｍ１の三角フラ
スコにそれぞれ６０ｍｔずつ分注し、　−１２０Ｃで２
０分間滅菌する。滅菌終了後、予シ しめ調製したバチラス　エスピー　ＲＡ　２８５９　ｑ
の前培養菌液なそれぞれのフラスコＫ　２　ｍｌ　スつ
接種し、３０Ｃで５日間振盪培養する。

培養終了後、それぞれのフラスコ中の培養液を集め、ｐ
Ｈ７，０とし、除蛋白のため１等量のエチルアルコール
を加えて攪拌したのち。

１３．０００回転、１０分間遠心分離し、遠心上清を集
めると、約１０乙のエチルアルコール混液が得られる。

この混液をアニオン性イオン交換樹脂であるＤＯＷＥＸ
　ＩＸ２　（酢酸型）　、’５００　ｍｌに吸着させ、
２ｔの水で水洗したのち、２ｔのＩＮ酢酸水溶液で溶離
する。溶離液を４５Ｃの温浴中で濃縮乾固すると、　ｉ
ｏ、３７ｇの粗物質が得られる。この粗物質ｌｏｇを１
．２ｔの蒸留水に溶解したのちｐＨ７，０に修正し、Ｈ
Ｐ−２０の２００　ｍｌＯカラムで処理し、その通過液
をｐＨ７，５に修正し、カチオン性イオン交換樹脂ＩＲ
Ｃ−５０（アンモニウム型）２００ｍＺのカラムを通過
させる。通過液を希塩酸水溶液でｐＨ５，５に修正し。

更にアニオン性イオン交換樹脂ＩＲＡ−６８（塩素型）
１５０ｍｌを通過させる。通過液をｐＨ７，５に修正し
、カチオン性イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（水素型
）　３００　ｍｌＯカラムに吸着させる。

吸着させたのち、水洗し、５％ピリジノ水溶液で溶離分
画すると１分画３〜６に濃縮して溶離され、その分画を
濃縮して冷所（５ｃ）Ｋ放置すると沈澱が出現し、それ
をｆ取すると約５００　ｍ１ｌｉの純度９０％以上のし
一セレノシスチンが得られる。得られたセレノシスチン
の比旋光度測定の結果、左旋性を示す事よりＬ型である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は　ＫＢｒ錠剤中でのＬ−セレノシスチンの赤外
線吸収スペクトラムを 示す。 第２図は　真水および重塩酸の混液中でのし一セレノシ
スチンの１Ｈ−核磁気 共鳴スペクトラムな示す。 第３図は　重水および重塩酸の混液中でのＬ−セレノシ
スチンの１３ｃ−核磁 気共鳴スペクトラムを示す。 第４図は　ＦＡＢ−ＭＳ（ファースト・アトム・ポンバ
ートメ／トー質量分析法） のスペクトラムを示す。 特許出願人 山之内製薬株式会社 代理人 弁理士長井省三 第１図 ４０００　３Ｂ００３０００２５００２０００１＋１１
（り庶１４（イ）１魚α℃改℃６■４■δ０第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. セレノ化合物を含有する培地中に　Ｌ−セレノシスチン
   な蓄積する能力を有するバよラスニスｌピー（Ｂａｃｉ
   ｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＲＡ　２８５９