KR20050026531A - 테아닌의 제조법 - Google Patents

테아닌의 제조법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테아닌의 효율적인 신규 제조법을 제공하고, 간편하며 또 공업적으로 유리한 테아닌 생산을 가능하게 하는 것을 목적으로 한다. 본 발명자들이 자연계의 토양으로 부터 신규하게 분리, 선정한 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA (Pseudomonas citronellosis GEA)는 속: 슈도모나스(Pseudomonas), 종: 시트로넬로시스(citronellosis)에 속하고, γ-글루타밀기 전이반응을 갖는 테아닌 생산균이다. 이 생산균 유래의 글루타미나아제를 글루타민과 에틸아민의 혼합물중에 pH 9~12의 조건하에서 이용하는 것에 의해 종래 방법에 비하여 매우 효율적으로 테아닌을 제조할 수 있다.

Description

테아닌의 제조법{Process for producing theanine}
본 발명은 테아닌의 신규한 제조법에 관한 것이다.
테아닌(theanine)은 녹차의 맛의 주요성분으로서 알려져 있고, 차를 비롯한식품의 향미물질로서 중요한 물질이다. 또한 테아닌을 포함하여 γ글루타밀 유도체는 동식물체에 있어서 생리활성물질로서 작용하는 것이 지적되어 있다. 예컨대 Chem. Parm. Bull., 19(7), 1301-1307 (1971). 동 19(6), 1257-1261 (1971), 동 34(7), 3053-3057 (1986). 야쿠가쿠잣시(藥學雜紙), 95(7), 892-895 (1975) 등의 문헌에는 테아닌 및 글루타민이 카페인에 의해 유발되는 경련에 저항하는 것이 보고되어 있다. 이 때문에 이들 화합물이 중추신경계에 작용하는 것으로 생각되어 생리활성물질로서 유용성이 기대되고 있다.
종래부터, 테아닌의 제조법으로서는 테아닌을 함유하는 고급차 생산용 다원에서 얻을 수 있는 차엽 건조물로 부터 추출하는 방법이 일반적이다. 그러나, 테아닌은 차엽 건조물당 겨우 1.5% 전후 정도밖에 축적되지 않을 뿐 아니라 일반적인 엽차용 다원의 차엽은 광합성이 활발하기 때문에 테아닌이 신속하게 분해되어 버리므로 충분한 수량을 확보하기가 곤란하다. 따라서 차엽 건조물로 부터의 추출법으로는 공업적으로 실용적이지 않은 것으로 지적되어 있다.
이와 같은 점에서 공업적 생산방법의 개발이 기대되고 있고, 그 하나로서 테아닌을 화학적으로 유기 합성하는 방법이 보고되어 있다(Chem. Parm. Bull., 19(7), 1301-1308 (1971)). 그러나, 이와 같은 유기 합성 반응에서는 수율이 낮고 합성물의 분리정제법에서 번잡한 조작을 필요로 하는 문제점이 지적되어 있다.
또한 글루타미나아제의 γ-글루타밀기 전이반응을 이용하여 글루타민, 에틸아민으로 부터 테아닌을 합성하는 효소법도 보고되어 있다 (특허공보 평성07-55154호). 그러나, 글루타미나아제의 가수분해반응에 의해 테아닌과 동시에 부합성되는 글루타민산의 존재가 테아닌 정제를 번잡하게 하는 문제점이 있다.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 실시된 것으로 그 목적은 테아닌의 효율적인 제조법을 제공하여 간편하고 또 공업적으로 유리한 테아닌 생산을 가능하게 하는 것에 있다.
도 1은 테아닌의 IR 스펙트럼을 나타낸다.
발명의 개시
본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위하여, 자연계의 토양으로 부터 신규 테아닌 생산균의 분리, 선정을 반복한 결과, 특정의 미생물이 가진 글루타미나아제의 성질이 특허공보 평성07-55154호에서 보고되어 있는 슈도모나스 니트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens) IFO 12694의 글루타미나아제에 비하여 높은 테아닌 합성 활성, 낮은 글루타민산 합성 활성을 갖는 것을 발견하고, 기본적으로 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 상기 테아닌 생산균은 본 발명자들이 처음으로 발견하고, 확인한 신규한 균주이며, 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA) (기탁기관의 명칭: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁 센터, 주소: 일본 이바라키켄 쯔쿠바시 토우 1초메 1반치 추오우 제6, 기탁일: 평성14년 7월 31일, 수탁번호: FERM BP-8353)이다.
본 발명에 의하면 테아닌의 효율적인 신규 제조법을 제공하고 용이하고 또 공업적으로 유리한 생산을 가능하게 할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하 본 발명의 실시형태에 관하여 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 하기 실시 형태에 의해 한정되지 않으며, 그 요지를 변경함없이 다양하게 변화시켜 실시할 수 있다. 또한 본 발명의 기술적 범위는 균등 범위까지 미친다.
본 발명에 있어서 테아닌이라는 것은 γ-글루타밀에틸아미드, L-글루타민산 γ-에틸아미드 등이다. 테아닌은 차의 맛 성분이고, 맛을 내는 용도로 하는 식품첨가물로서 사용되고 있다.
본 발명에 사용되는 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA (Pseudomonas citronellosis GEA) (수탁번호 FERM BP-8353)는 본 발명자들에 의해 신규하게 발견된 균주이고, 속: 슈도모나스(Pseudomonas), 종: 시트로넬로시스(citronellosis)에 속하고, γ-글루타밀기 전이반응을 갖는 테아닌 생산균이다. 또한 본 발명에 사용되는 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)의 동정은 표준법에 기준한 균학적 성질, 생화학적 성질의 해석 및 16s rRNA에 상당하는 DNA의 염기서열을 기존의 미생물과 비교하는 것에 의해 실시한 것이다.
본 발명에서 글루타미나아제는 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA) 유래의 효소이다. 이 반응의 효소원으로서는 생균체 또는 각종 처리 표품, 예컨대 균체마쇄물, 초음파처리균체, 용매처리균체, 저온건조균체, 황산암모늄 염석물, 정제효소 표품 등을 그대로, 또는 고정화시킨 것이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 효율적인 효소반응을 실시하기 위해서는 pH는 9~12의 범위가 바람직하고, 10~11 보다 바람직하다. 또한 반응온도는 10℃ 내지 55℃가 바람직하고, 25℃ 내지 35℃가 보다 바람직하다.
이와 같이 하여 수득할 수 있는 반응액으로 부터의 테아닌의 단리 정제는 공지 방법이 이용될 수 있다. 예컨대 각종 크로마토그래피 (예컨대 용매분배 크로마토그래피, HPLC 등)를 조합하는 것에 의해 용이하게 실시할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만 본 발명의 기술적 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 테아닌 자화성 균의 분리
시가켄, 교토후의 토양을 채집하고, 토양현탁액을 제조한 후에 테아닌을 탄소원으로 하는 선택배지(테아닌 0.5%, 효모 추출물 0.03%, KH2PO4 0.05%, K2 HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.03%, pH 7)에 의해 계대배양을 3회 실시하는 것에 의해 테아닌 자화성 균을 100주 분리하였다.
실시예 2: 무세포 추출액의 제조
실시예 1의 선택배지에서 100주의 테아닌 자화성 균을 각각 1 리터에서 30℃, 20시간 배양하였다. 그후, 집균, 세정을 실시하고, 30 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 50 밀리리터에 현탁시키고, 5℃ 내지 20℃에서 초음파 파쇄하여 무세포 추출액을 수득하였다.
실시예 3: 효소반응
실시예 2의 무세포 추출액을 사용하여 글루타민 0.03M, 에틸아민 0.6 M을 함유하는 100 mM 붕산 완충액 (Na2B4O7-NaOH, pH 11)중에서 30℃, 24시간 효소반응을 실시하여 테아닌을 합성하였다.
실시예 4: 테아닌 합성 활성, 글루타민산 합성 활성의 측정
실시예 3에서 테아닌 합성을 실시한 효소반응액을 적절히 희석시키고, 역상 HPLC를 실시하는 것에 의해 테아닌, 글루타민산의 합성양을 각각 정량하였다. 분석 조건은 다음과 같았다. 분석 칼럼으로서 Developsil ODS HG-5 (노무라카가쿠 가부시끼가이샤)를 이용하고, 검출기는 Waters2487 듀얼 λUV/VIS 검출기 (Waters사제)를 이용하였다. 또한 내부 표준물질로서 니코틴아미드(나카라이테스크 가부시끼가이샤 제조)를 이용하였다. 이동상은 순수: 메탄올: 트리플루오로아세트산 = 980: 20: 1 의 비율로 혼합한 것을 사용하였다.
비교예 1
100주의 테아닌 자화성 균과의 비교주로서 슈도모나스 니트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens)의 무세포 추출액을 사용하여 테아닌 합성 활성 및 글루타민산 합성 활성의 측정을 실시하였다.
시험예 1: 테아닌 합성 활성을 지표로 한 테아닌 자화성 균 집단으로부터의 높은 테아닌 생산균의 선별
실시예 1에서 분리한 테아닌 자화성 균 100주의 무세포 추출액을 각 균체 마다 각각 실시예 2의 방법으로 제조하고 실시예 3의 방법으로 효소반응을 실시하며 실시예 4의 방법으로 테아닌 합성양을 조사하였다. 그 결과, 종래 보고되어 있는 슈도모나스 니트로레두센스(Pseudomonas nitroreducens)의 테아닌 합성 활성에 비하여 4배 이상 높은 활성을 가진 신규 테아닌 생산균인 1균주를 얻는데 성공하였다.
테아닌 합성활성 글루타민산 합성활성
슈도모나스 니트로레두센스 2.1 2.2
신규 테아닌 생산균 9.6 2.6
단위: mM (h·mg)
실시예 5: 신규 테아닌 생산균의 동정
실험예 1에서 수득한 신규 테아닌 생산균의 균학적, 생화학적 성질을 기준법에 따라서 다음 항목, 즉 그램 염색, 세포형태, 카탈라아제 시험, 질산염 환원능, 피라지나미다제, 피롤리도닐아릴아미다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, β-글루크로니다아제, α-글루코시다아제, N-아세틸-β-글루코사미니다아제, 우레아제, 젤라틴액화능, 에스크린 이용능, 말토오스 이용능, 리포오스 이용능, 크실로오스 이용능, 만니톨 이용능, 말토오스 이용능, 유당 이용능, 백당 이용능, 글리코겐 이용능에 관하여 시험을 실시하였다. 이들 시험 성적에 기초하여 Bergey's manual (8판)을 참조한 결과, 균의 속은 슈도모나스((Pseudomonas)인 것으로 결론지었다.
또한 16s rRNA에 상당하는 DNA 염기서열을 결정하고, 기존 미생물의 동일 서열과의 비교를 실시하였다. 그 결과, 본 균체를 속: 슈도모나스(Pseudomonas), 종: 시트로넬로시스(citronellosis)인 것으로 동정하고, 신종의 균인 것으로 부터 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA (Pseudomonas citronellosis GEA)로 명명하였다.
실시예 6: 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA( Pseudomonas citronellosis GEA) 의 배양 조건의 최적화
실시예 1에서 균선택배지 (탄소원: 테아닌) 이외의 탄소원을 사용한 배지에 의한 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA((Pseudomonas citronellosis GEA)의 배양을 검토하였다. 탄소원으로서 글루타민, 글루타민산, 글루코오스, 글리세롤 등을 검토한 결과, 글리세롤을 사용한 때에 최적 결과를 얻었다. 이어 배지중의 글리세롤 농도를 검토한 결과, 3% 글리세롤에서 최적 테아닌 합성활성을 가진 무세포추출액을 얻을 수 있었다. 동시에 효모 추출액의 농도를 검토했더니, 0.3%에서 가장 양호한 테아닌 합성활성을 가진 무세포추출액을 얻을 수 있었다.
글리세롤1% 글리세롤2% 글리세롤3%
효모 추출액0.1% 테아닌 합성활성 1.02 1.01 1.05
글루타민산 합성활성 0.34 0.38 0.41
효모 추출액0.3% 테아닌 합성활성 1.21 3.33 4.35
글루타민산 합성활성 0.43 0.25 0.30
효모 추출액0.5% 테아닌 합성활성 1.18 1.33 2.02
글루타민산 합성활성 0.54 0.45 0.48
단위: mM/(h·mg)
실시예 7: 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA( Pseudomonas citronellosis GEA) 유래의 무세포추출액을 사용한 효소반응 조건의 최적화
실시예 1에서의 효소반응 조건에서 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA) 유래의 무세포추출액을 사용한 때의 글루타민, 에틸아민의 각종 농도를 검토하였다. 이 결과, 0.3M 글루타민과 0.9M 에틸아민을 사용하여 48시간 반응시킨 때 최대의 테아닌 합성양을 얻을 수 있었다.
에틸아민 글루타민 0.2M 글루타민 0.3M 글루타민 0.4M
The Glu The Glu The Glu
0.3M 74.7(72) 10.7 98.3(72) 13.7 80.0(48) 33.3
0.6M 81.6(60) 5 147(72) 8.1 115(72) 19.1
0.9M 157(60) 3.1 166(48) 6.6 120(72) 6.2
1.2M 155(72) 2.7 160(60) 5.2 97.1(72) 4.4
The: 테아닌, Glu: 글루타민산, ( )내는 반응시간 (단위: 시간), 단위: mM
실시예 8: 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA( Pseudomonas citronellosis GEA) 를 사용한 테아닌 제조
글리세린 3.0%, 효모 추출액 0.3%, KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.03%를 포함하는 배양액 20 리터를 사용하여 30 리터 들이 자퍼멘터 (30℃, 회전수 2000 rpm)중, 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA) 를 20시간 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의한 집균, 세정을 실시하여 균체 180g을 얻었다.
제조한 균체 10g을 사용하여 0.3 M 글루타민, 0.9M 에틸아민, pH 10, 30℃의 조건에서 효소반응을 실시한 결과, 24시간 후에 1리터당 40g의 테아닌을 얻었다. 테아닌의 반응액으로부터 단리 정제는 반응액으로부터 균체를 제거한 후에 Dowex 50 x 8, Dowex 1 x 2 칼럼 크로마토그래피에 걸어 이들을 에탄올 처리하는 것에 의해 실시하였다.
이 단리 물질을 아미노산 애널라이저, 페이퍼 크로마토그래피에 걸면, 표준물질과 동일한 거동을 나타내고, 염산 또는 글루타미나아제로 가수분해처리를 실시하면, 1:1의 비율로 글루타민산과 에틸아민을 생성하였다. 이와 같이, 단리물질이 글루타미나아제에 의해 가수분해된 점에서 에틸아민이 글루타민산의 γ 위치에 결합하고 있었던 것이 밝혀진다. 또한 가수분해에서 생긴 글루타민산이 L형인 것도 글루타민산 데히드로게나제 (GluDH)에 의해 확인되었다. 도 1에는 테아닌 표품의 IR 스펙트럼을 나타내었다. 단리물질은 도 1의 IR 스펙트럼과 동일한 스펙트럼이 얻어졌다. 이들 결과로 부터, 단리물질이 테아닌인 것이 확인되었다.
실시예 9: 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA( Pseudomonas citronellosis GEA) 유래 글루타미나아제 고정화 효소를 사용한 테아닌 제조
(1) 무세포 추출액의 채취
실시예 8에서 수득한 균체 160 g을 세정후, 30 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 2리터에 현탁시키고, 5℃ 내지 20℃에서 초음파 파쇄시켜 무세포 추출액을 수득하였다.
(2) 황산암모늄 분획의 채취
상기 (1)에서 수득한 무세포 추출액 2 리터에 7% 암모니아수로 pH를 7로 조정하면서 황산 암모늄을 첨가하였다. 35% 포화 용액을 얻은 단계에서 원심분리에 의해 침전을 제거하고, 다시 황산암모늄을 첨가하였다. 90% 포화 용액을 얻은 단계에서 하룻밤 방치하고, 원심분리에 의해 침전을 회수하고, 이것을 0.01M 인산칼륨 완충액에 용해시키고, 동일 완충액에 대하여 투석을 실시하여 투석효소액을 얻었다.
(3) DEAE-셀룰로오스 칼럼 크로마토그래피를 사용한 정제
상기 (2)에서 수득한 투석효소액을 0.01M 인산칼륨 완충액에서 완충화하였다. 이어 DEAE-셀룰로오스 칼럼(15 x 60 cm)에 흡착시켜 글루타미나아제를 0.1M의 식염을 포함하는 완충액으로 추출하였다. 이 결과, 글루타미나아제 조 정제품 800 mg을 얻었다.
(4) 고정화 글루타미나아제의 제조
미리, 물로 팽윤시킨 시판하는 고정화 담체인 키토펄 3510 (후지호우세키 가부시끼가이샤 제조)을 충분히 수세한 후, 0.1 M 인산 나트륨 (pH 6.8)으로 평형화시켰다. 이 습윤 담체 2g을 상기 (3)에서 제조한 글루타미나아제 조 정제품 35 mg을 포함하는 5 ml의 20 mM 인산나트륨 (pH 6.8)에 현탁시키고, 4℃에서 하룻밤 교반하였다. 또한 글루타르알데히드를 최종 농도 2.5% (V/V)로 첨가하고, 4℃에서 3시간 방치하는 것에 의해 가교시켰다. 이상의 조작에 의해 얻은 고정화 효소를 0.1M 인산나트륨(pH 6.8)로 충분히 세정하고 4℃에서 보존하였다.
(5) 고정화 글루타미나아제에 의한 효소 반응
상기 (4)에서 제조한 고정화 글라타미나제에, 기질용액(4% 글루타민, 25% 에틸아민 pH 10.0)을 30℃, SV = 0.2의 유속으로 통관시킨 경우, 65%의 수율로 테아닌을 수득할 수 있었다. 테아닌의 반응액으로부터의 단리 정제는 반응액을 Dowex 50 x 8, Dowex 1 x 2 칼럼 크로마토그래피에 걸처, 이것을 에탄올로 처리하는 것에 의해 실시하였다.
이 단리물질을 아미노산 애널라이저, 페이퍼 크로마토그래피에 걸면, 표준물질과 동일한 거동을 나타내었다. 또한 염산 또는 글루타미나아제로 가수분해처리를 실시하면, 1:1의 비율로 글루타민산과 에틸아민을 생성하였다. 이와 같이, 단리물질이 글루타미나아제에 의해 가수분해되는 점에서 에틸아민이 글루타민산의 γ 위치에 결합되어 있음이 밝혀졌다. 또한 가수분해에서 생긴 글루타민산이 L형인 점도 글루타민산 데히드로게나제(GluDH)에 의해 확인되었다. 테아닌의 IR 스펙트럼 분석을 실시했더니, 표품, 단리물질 모두 실시예 8과 동일한 스펙트럼을 얻었다. 이 점에서 부터, 단리물질이 테아닌이라는 것이 확인되었다.

Claims (2)

  1. 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)를 사용하는 것을 특징으로 하는 테아닌의 제조법.
  2. 제 1항에 있어서, 슈도모나스 시트로넬로시스 GEA(Pseudomonas citronellosis GEA) 유래의 글루타미나아제를 사용하는 것을 특징으로 하는 테아닌의 제조법.
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