TWI307363B - Methods to produce theanine - Google Patents

Description

1307363 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於茶胺酸之新穎製造方法。 【先前技術】 茶胺酸（theanine)已知為綠茶甘味的主要成分，乃以茶 為代表之食物香味物質的重要物質。此外，含茶胺酸的7 楚胺酿基衍生物’已有指出具有動植物體生理活性物質 的作用。譬如在 Chem.Parm. Bull.，19(7)，1301-1307 (1971).同 19(6)，1257-1261(1971)·同 34(7)，3053-3057 (1986).藥學雜誌，95(7)，892-895(1975)等文獻中，便有 報告指出茶胺酸、楚醯胺酸乃對咖啡因而所誘發痙攣具拮 抗作用。因而便考慮將該等化合物作用於中樞神經系統， 俾期待當作生理活性物質的有效性。 【發明内容】 (發明所欲解決之問題） 習知茶胺酸之製造方法，一般為從在含茶胺酸之玉露 \日+本上等茶的一種）生產用茶園中，獲得茶葉乾燥物中進 行萃取但疋，因為茶胺酸在茶葉乾燥物中僅儲存1.5% 左右的微少程m—般煎茶用茶園的茶葉的光合作用 較活躍’因此茶胺酸將被迅速地分解，導致頗難確保充分 的產量。所以’從茶葉乾燥物施行萃取的方法，被指為益 具工業實用性。 … 為此便期待開發工業性生產方法，其中之一便有報告指 出化學性有機合成茶胺酸的方法（Chem. Parm.

Bull·， 92121471 1307363 19(7)’ 1301-1308(1971))。但是’在此種有機合成反應 中，便有指出產率偏低，且於合成物分離純化等方面需要 繁雜操作的問題。 再者，亦有報σ才曰出利用楚酿胺酸酶的^ _麵胺酿基轉 移反應，從麩醯胺酸、乙胺合成茶胺酸的酵素法（日本專 利特公平07-55154號）。但是，經由麩醯胺酸酶的加水分 解反應，將同時存在茶胺酸與副合成的麩胺酸，而造成茶 胺酸純化變繁雜的問題。 “ 本發明乃有鑒於上述諸項缺失，其目的在於提供一種有 效率之茶胺酸的製造方法，可簡單且有利於工業性的茶胺 酸生產。 (解決問題之段） 本發明者為解決上述問題，便針對利用自然界土壤進行 新穎茶胺酸生產菌的分離、選擇進行探討，結果發現一特 定微生物所具之越醯胺酸酶性質，在相較於日本專利特公 平 07-55154 號公報中所報告 pseud〇monas nitroreducens IFO 12694的糙醯胺酸酶之下，前者屬於茶胺酸合成活性 較高且麩胺酸合成活性較低，遂基本上完成本發明。上述 茶胺酸生產菌乃本發明者等所首次發現、鑑定的新穎菌 株，屬於 Pseudomonas citronellosis GEA。此微生物已 國際寄存於下述寄存機構。寄存機構名稱：獨立行政法人 產業技術總合研究所專利生物寄存中心，收件名稱：曰本 國茨城縣筑波市東一丁目1番地1中央第6,寄存曰 期：2002年7月31日，寄存編號：FERM BP-8353。 92121471 6 1307363 以下’針對本發明進行詳細說明。 【實施方式】 其次’針對本發明實施形態進行詳細說明，惟本發明的 技術範圍並不僅限於下述實施形態，在未變更主旨之前提 下’可實施各種改變。此外，本發明的技術範圍亦及於均 等的範圍。 本發明中的「茶胺酸」係指7 -麩胺醯基乙醯胺、L-麩 胺酸〜r-乙醯胺等。茶胺酸係茶的甘味成分’使用為呈現 味道用途的食品添加物。 本發明中所採用的 Pseudomonas citronel losis GEA(寄 存編號：FERM BP-8353)，係指經本發明者等所新發現的菌 株’屬：Pseudomonas(假單胞菌），種：citronellosis，乃 具有7* -鏠胺醯基轉移反應的茶胺酸生產菌。此外，本發 明中所採用 Pseudomonas citronel losis GEA 的鑑定，係 利用根據常法的細菌學性質、生化學性質解析，以及將相 當於16s rRNA的DNA鹼基序列與已知微生物進行比較而 執行的。 本發明中的「楚酿胺酸酶」係指源自pseud〇monas citronel losis GEA的酵素。此反應的酵素源可直接採用 或經固定化的生菌體或各種處理樣本（如：菌體磨碎物、超 音波處理菌體、溶劑處理菌體、低溫乾燥菌體、硫銨鹽析 出物、純化酵素樣本等）。在本發明中為有效率的執行酵 素反應’最好設定為pH為9〜12範圍，尤以10〜11為佳。 此外’反應溫度最奸為1〇°c~55°c，尤以25°C〜35°C為佳。 92121471 7 1307363 從依此方式所獲得反應液進行茶胺酸的離析純化乃採 用週知的方法。譬如藉由組合溶劑分配及各種層析儀、 HPLC，便可輕易的執行。 以下’利用實施例更詳細的說明本發明，惟本發明的技 術範圍並不僅限制於該等實施例。 (實施例） 實施例1茶胺酸分解細菌之分離 採取曰本滋賀縣、京都府的土壌，並調製為土壤懸浮液 之後，以茶胺酸作為之碳源選擇培養基（茶胺酸0. 5%、酵 母萃取液 0. 03%、ΚΗ2Ρ〇4〇· 05%、K2HP〇4〇. 05%、MgS〇4 · 7H2〇0. 03%、pH7)，進行繼代培養三次，而分離出100株 的茶胺酸分解細菌。 實施例2無細胞萃取液之調製 利用實施例1的選擇培養基，將100株的茶胺酸分解細 菌分別在1公升、30°C下培養20小時。其後，進行集菌、 洗淨，懸浮於30mM磷酸鉀緩衝液（pH 7. 0)50毫升中，在 5°C〜20°C下施行超音波粉碎，而獲得無細胞萃取液。 實施例3酵素反應 採用實施例2的無細胞萃取液’在含有楚醯胺酸〇. 3M、 乙胺 0.6M 的 100mM 硼酸緩衝液（Na2B4〇7-Na〇H，pHll)中， 進行30°C、24小時酵素反應，而合成茶胺酸。 實施例4茶胺酸合成活性、麵胺酸合成活性的測定 將在實施例3中施行茶胺酸合成之酵素反應液進行適 當稀釋’並執行反相南速液體層析’而分別詞·茶胺酸•熟 92121471 1307363 胺酸的合成量進行定量。分析條件乃如下所示。分析管枉 乃採用Develosil ODS HG-5(野村化學（股）製），檢測器 乃採用WaterS2487雙λ UV/VIS檢測器（Waters公司製）。 此外，内部標準物質乃採用煙驗醯胺（納佳萊德斯（股） 製），移動相乃採用純水：甲醇：三氟醋酸=98〇:2〇:1比率 進行混合者。 比較例1 100株茶胺酸分解細菌的比較株乃採用

Pseudomonas nitroreducens的無細胞萃取液，而施行茶胺酸合成活性 與麩胺酸合成活性的測定。 试驗例1從以*胺酸合成活性為指標的茶胺酸分解細菌 進行高茶胺酸生產菌篩選 將在實施例1中經分離的茶胺酸分解細菌i⑼株之無細 胞萃取液’依每個菌株分別依實施例2之方法進行調製， 並依實施例3之方法進行酵素反應，然後依實施例4之方 法調查茶胺酸合成量。結果，相較於習知報告的 Pseudomonas nitroreducens之茶胺酸合成活性下，本發 明成功的獲得具4倍以上高活性的新穎茶胺酸生產菌1菌 株。 【表1】 茶胺酵合]^ U 經胺酸合成活性 Pseudomonas nitroreducens _____ 2T~- 新穎茶胺酸生產菌 Oft — Li , id -------- 2.6 單位：mM/(h · mg) 92121471 9 1307363

白糖利用率、糖原利用率。根據該等測試成績並參照 Bergey’s manual(8版）的結果，結論乃菌屬為假單胞 /« I U 1 « y~v ««« «μ. __ \ "* 一 千、木 乳糖利用率、 屬（Pseudomonas) 。 m 再者，分析相當於16s rRNA的DM鹼基序列，並與已 知微生物的相同序列進行比較。結果，本菌株鑑定為 屬：Pseudomonas(假單胞菌）’種：citronellosis，為屬於 新品種菌’命名為 pseud〇monas citronell〇sis GEA。 實施例 6 Pseudomonas citronellosis GEA 之培養條件 最佳化 採用實施例1中的菌選擇培養基（碳源：茶胺酸）外之才采

用破源的培養基，探討 Pseudomonas citronellosis GEA 的培養。碳源乃就麩醯胺酸、麩胺酸、葡萄糖、甘油等進 行探討，結果當採用甘油時將可獲得最佳的結果。其次， 探討培養基中的甘油濃度，結果依3%甘油可獲得具最優 越茶胺酸合成活性的無細胞萃取液。同時，經探討酵母萃 取液濃度，結果發現依0. 3%將可獲得具最優越茶胺酸合 92121471 10 1307363 成活性的無細胞萃取液。 【表2】 甘油 1% 甘油 2% 甘油 3% 酵母萃取物〇. 1% 茶胺酸合成活性 1. 02 1. 01 1. 05 麩胺酸合成活性 0. 34 0. 38 0. 41 酵母萃取物〇. 3% 茶胺酸合成活性 1. 21 3. 33 4. 35 麩胺酸合成活性 0. 43 0. 25 0. 30 酵母萃取物〇. 5% 茶胺酸合成活性 1. 18 1. 33 2. 02 麩胺酸合成活性 0. 54 0. 45 0. 48 單位：mM/(h · mg) 實施例 7 採用源自 Pseudomonas citronellosis GEA 之 無細胞萃取液的酵素反應條件最佳化 依實施例1的酵素反應條件，探討採用源自 Pseudomonas ci trone 11 os i s GEA之無細胞萃取液時的麩 醯胺酸、乙胺各種濃度。結果，在採用0. 3M麩醯胺酸與 0. 9M乙胺並施行48小時反應時，將可獲得最大的茶胺酸 合成量。 【表3】 乙胺 麩醯胺酸0. 2M 麩醯胺酸0. 3M 麩醯胺酸0. 4M The Glu The Glu The Glu 0. 3M 74.7(72) 10. 7 98.3(72) 13. 7 80. 0(48) 33. 3 0. 6M 81.6(60) 5 147(72) 8. 1 115(72) 19. 1 0. 9M 157(60) 3. 1 166(48) 6. 6 120(72) 6. 2 1. 2M 155(72) 2.7 160(60) 5. 2 97. 1(72) 4. 4

The:茶胺酸、GU:麩醯胺酸、（）内為反應時間（單位：小時）、單位：mM 92121471 11 1307363 實施例 8 採用 Pseudomonas citronellosis GEA 的茶胺 酸製造 採用含甘油3. 0%、酵母萃取物0. 3%、KH2P〇4〇. 05%、K2HP〇4 0. 05%、MgS〇4 · 7H2〇 0. 03%的培養液20公升，在30公升 體積的桌上型培養裝置（jar fermenter)(30°C、旋轉數 2000rpm)中，將 Pseudomonas citronellosis GEA 施行 20小時培養。培養後，利用離心分離進行集菌、洗淨， 獲得菌體180g。 採用所調製菌體l〇g，在〇. 3M麵醯胺酸、0. 9M乙胺、 pH 10、30°C條件下，進行酵素反應，結果在24小時後平 均1升可獲得40g茶胺酸。從茶胺酸反應液的離析純化， 乃利用反應液去除菌體之後，在將其置於Dowex 50x8、 Dowex 1x2的管柱層析儀中，對其施行乙醇處理而實施。 將此離析物質放置於胺基酸分析儀、濾紙層析儀（paper chromatography) ’顯示出與標準物質相同的舉動，若利 用鹽酸或麵醯胺酸酶施行加水分解處理，依1:1比率，便 將產生麵胺酸與乙胺。如此，因為離析物質將被麵醯胺酸 酶而加水分解，因此表示乙胺乃鍵結於麩胺酸的^位。此 外，利用糙胺酸脫氫酶（GluDH)亦確認到由加水分解所產 生的麩胺酸屬於L型。圖1所示為茶胺酸樣本的ir光譜。 離析物質可獲得如圖1所示IR光譜相同的光譜。由該等 結果確認到離析物質為茶胺酸。 實施例 9 採用源自 Pseudomonas citronellosis GEA 的 楚醯胺酸酶固定化酵素之茶胺酸製造 92121471 12 1307363 (1)無細胞萃取液之採集 將實施例8所取得菌體160g洗淨後，懸浮於3〇mM碟酸 鉀緩衝液（pH 7. 0)2公升中，並在5°C〜20°C施行超音波粉 碎，獲得無細胞萃取液。 (2)硫酸銨分層之採集 在上述（1)所獲得無細胞萃取液2公升中，—邊利用7% 氨水調整為pH 7 ’ 一邊添加硫酸銨。在獲得35%飽和溶液 的階段’利用離心分離去除沉澱’然後再度添加硫酸餘。 在獲得90%飽和溶液的階段時放置一晚，然後利用離心分 離回收沉澱’將其溶解於0.01M磷酸卸緩衝液中，對該緩 衝液施行透析，獲得透析酵素液。 (3) 採用DEAE-纖維素管柱層析之純化 將上述（2)所獲得透析酵素液利用〇 〇1M磷酸鉀緩衝液 進行缓衝化。其次’使其吸附於DEAE_纖維素管柱（15x6〇cm) 上，並利用0.1M之含食鹽的緩衝液溶出楚醯胺酸酶。結 果，獲得麩醯胺酸酶粗純化品8〇〇mg。 (4) 固定化麩醯胺酸酶之調製 預先將經水膨潤過之市售固定化載體的奇德帕爾 3510U 士紡績（股）製）充分水洗後，利m㈣酸納⑽ 6. 8)平衡化。將此濕潤賴2gm浮於含㈣上述⑶所 調製的麩醯胺酸酶粗純化品的㈤之__(ρΗ u)，於。η；下攪拌一晚。然後，將楚胺酸脫氫酶依最終 濃mv/v)進行添加’並於4°c下玫置3小時而進行 交聯。將經上料相簡較㈣素彻gim顧納 92121471 13 1307363 (pH 6. 8)進行洗淨，然後保存於4°C中。 (5)利用固定化麩醯胺酸酶的酵素反應 當在上述（4)所製成的固定化麩醯胺酸酶中，將基質溶 液（4%麩醯胺酸、25%乙胺pH 10. 0)依30°C、SV=0. 2流速 通過筒柱時，便可依65°/。產率獲得茶胺酸。從茶胺酸反應 液的離析純化，係利用將反應液置於Dowex 50 X8、Dowex 1 χ2的管柱層析儀中，對其施行乙醇處理而實施。 將此離析物質放置於胺基酸分析儀、濾、紙層析儀，顯示 出與標準物質相同的舉動。此外，若利用鹽酸或麩醯胺酸 酶施行加水分解處理，依1:1比率，便將產生麩胺酸與乙 胺。依此的話，因為離析物質將被麩醯胺酸酶而加水分 解，因此表示乙胺乃鍵結於麩胺酸的Τ位。而且，利用麩 胺酸脫氫酶（GluDH)亦確認到由加水分解所產生的糙胺酸 屬於L型。經施行茶胺酸之IR光譜分析結果，樣本、離 析物質均獲得如實施例8的光譜。由該等結果確認到離析 物質屬於茶胺酸。 (發明效果） 依照本發明的話，便可提供茶胺酸之有效率新穎製造方 法，其簡單並有利於工業性生產。 【圖式簡單說明】 圖1為茶胺酸之IR光譜圖。 92121471 14

Claims (1)

1307363 月日修(更)正 I .」 拾、申請專利範圍： 1. 一種茶胺酸之製造方法，係採用Pseudomonas citronellosis GEA(BCRC 910235)，由乙胺與麩醯胺酸製 造茶胺酸。 2. 如申請專利範圍第1項之茶胺酸之製造方法，係採用 源自 Pseudomonas citronellosis GEA(BCRC 910235)的 麩醯胺酸酶，由乙胺與麩醯胺酸製造茶胺酸。

3. 如申請專利範圍第1或2項之茶胺酸之製造方法，反 應時之pH為9〜12。 4. 如申請專利範圍第1或2項之茶胺酸之製造方法，反 應時之溫度為25〜35°C。 5. 如申請專利範圍第3項之茶胺酸之製造方法，反應時 之溫度為25〜35°C。

92121471 15 1307363 柒、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無 92121471 4