CN101270376B

CN101270376B - 一种酶法合成l-茶氨酸的方法

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Publication number: CN101270376B
Application number: CN2008100248355A
Authority: CN
Inventors: 姚忠; 邓海霞; 周治; 吴明刚; 徐虹; 韦萍
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2028-05-14
Also published as: CN101270376A

Abstract

本发明公开了一种用L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为供体酶法制备L-茶氨酸的方法，包括：利用化学法合成L-谷氨酰胺-铜(II)配合物；将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物和乙胺的混合水溶液中反应。利用本方法可避免自转肽问题，且大大提高对供体的转化率，操作简单，条件温和，成本低。

Description

一种酶法合成L-茶氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种L-茶氨酸的合成方法，尤其涉及一种以L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为谷氨酰供体，利用γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

茶氨酸属酰胺类化合物，是茶叶的特征氨基酸，也是茶叶的主要呈味物质之一，大量存在于茶树中，是一种非蛋白游离氨基酸。茶氨酸作为一种氨基酸，也有D型和L型，但天然存在的茶氨酸均为L型。L-茶氨酸除了调味之外，还具有很多生理功能：镇静和松弛神经作用；增强学习记忆能力；降血压作用；抗肿瘤作用和提高抗癌药物的疗效；保护脑神经作用；减肥作用；抗疲劳作用。因此，L-茶氨酸可用于药品，保健品，化妆品等各行业。

目前L-茶氨酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法和提取法。化学合成法制备L-茶氨酸采用的均为谷氨酸的衍生物与乙胺或乙胺化合物反应，涉及到谷氨酸的保护与脱保护，反应路线复杂，条件苛刻，副反应多，且容易产生消旋体，同时大量有机溶剂会污染环境。而发酵法有以下不足：产物浓度和转化率较低、发酵时间过长、下游分离难度大、设备成本高。提取法就是从茶叶组织中直接提取，由于茶氨酸在茶叶中含量很低，因而提取法并不适于大量制备。

近年来，由于L-茶氨酸的生理功能不断被发现，L-茶氨酸的应用研究受到越来越多的重视。目前，L-茶氨酸已在日本和欧洲被正式批准为食品添加剂，并广泛应用；L-茶氨酸在药品中的应用也在开发之中。随着L-茶氨酸的市场需求日益扩大，有关其合成技术的研究也受到广泛的关注。

专利WO2004016798公开了一种酶法合成茶氨酸的方法。该方法从自然界土壤中分离选定香茅醇假单胞菌GEA作为具有γ-谷氨酰基转移活性的茶氨酸生产菌，在pH为9～12的条件下，以L-谷氨酰胺和乙胺为底物，将来自该菌的谷氨酰胺酶用于催化制备茶氨酸。专利WO2006001296在前述专利方法上做了扩展改进，使用来自芽孢杆菌属、霉菌或酵母中的一种或两种以上的来自微生物的谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺和乙胺衍生物反应，生成L-茶氨酸。该方法主要考察了不同菌种、不同活性的酶对反应进行催化。

但是上述酶法均以L-谷氨酰胺为底物，存在自转肽问题，即由于L-谷氨酰胺具有α-氨基，在实际反应中也可作为γ-谷氨酰受体，形成谷氨酰谷氨酰胺(Glu-Gln)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法合成L-茶氨酸的方法，以避免自转肽现象。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种酶法合成L-茶氨酸的方法，包括如下步骤：

1、利用化学法合成底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物；

2、将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物和乙胺的混合水溶液中，L-谷氨酰胺-铜(II)配合物的起始浓度为3～6mmol/L，乙胺的起始浓度为50～200mmol/L，γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的1～16％，反应pH为8.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时，得L-茶氨酸-铜(II)配合物；

3、在反应液中加入盐酸使L-茶氨酸-铜(II)配合物分解为L-茶氨酸；

4、将所得茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。

步骤1中，化学法合成L-谷氨酰胺-铜(II)配合物是本领域技术人员已知技术。底物L-谷氨酰胺通过金属配位，保护了L-谷氨酰胺上的α-氨基，解决了L-谷氨酰胺的自转肽问题，从而提高转化率。

步骤2中，反应受体乙胺的比例高，有利于反应转化率的提高。其反应方程式如下：

步骤2中，优选纯度大于95％的γ-谷氨酰转肽酶，其加入体积为底物混合水溶液体积的1％。

上述γ-谷氨酰转肽酶可通过如下方法制备：

a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2，发酵产γ-谷氨酰转肽酶。

b、利用蛋白分离纯化系统制备γ-谷氨酰转肽酶。

步骤a中，产酶微生物枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCC No.0833)的培养条件为：以单糖或双糖作为碳源，如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；氮源以有机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏。该菌是好氧培养菌，在pH8～9、温度30～40℃的通气条件下，生长良好。在发酵时使用液体培养，一般发酵周期在20～30小时。

步骤b中，可采用

explorer 100蛋白纯化仪(Amersham Pharmacia公司生产)分离纯化γ-谷氨酰转肽酶，该纯化方法对本领域普通技术人员而言，属于一般的分离纯化过程。设备使用的依照该系统的使用手册即可。

步骤2中，供体L-谷氨酰胺-铜(II)配合物与受体乙胺的起始摩尔比优选3∶25～100。

步骤3中，加入盐酸的目的是破坏L-茶氨酸-铜(II)配合物的结构，利用酸性条件下氨基酸金属螯合物分解而得到茶氨酸。若选用1mol/L盐酸，则加入体积为步骤2得到的反应液体积的8～10％。

步骤4中，可利用乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸，用乙醇沉淀法分离纯化茶氨酸技术为本领域技术人员公知技术。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为反应供体，L-谷氨酰胺的α-氨基用金属离子螯合保护，解决了L-谷氨酰胺在γ-谷氨酰转肽酶催化下会发生自转肽的问题，从而使反应相对供体谷氨酰胺的转化率得到很大提高。

2、本发明采用γ-谷氨酰转肽酶催化L-谷氨酰胺-铜(II)配合物与乙胺转肽反应，仅需一步就可以得到L-茶氨酸-铜(II)配合物，加入盐酸即可得到产物L-茶氨酸。与化学合成法相比，反应简单，收率高，不需对游离羧基进行复杂的保护与脱除，反应过程中也不会产生消旋体。

3、本发明采用的γ-谷氨酰转肽酶是通过分离纯化得到的精制酶，反应在碱性的水溶液中进行，转化率高(详见实施例转化效果)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：

取蔗糖15g，玉米浆30g，蛋白胨15g，K₂HPO₄ 15g，MgSO₄ 0.5g，pH7.5加自来水配制成1L液体培养基，按此配方配制3.5L装入5L发酵罐中0.1MPa高压蒸汽灭菌25分钟备用。同时分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，与发酵罐一起灭菌备用。

将冰箱内保存的菌种——枯草芽抱杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCCNo.0833)取出后，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20)上，活化培养24小时，接入种子培养基(种子培养基(g/L)：葡萄糖15，玉米浆10，蛋白胨10，K₂HPO₄ 2，MgSO₄ 0.25)在33℃、220r/min振荡培养20小时。培养结束接入发酵罐，于33℃、200r/min，发酵培养40小时。

发酵结束后，8000r/min离心25分钟，收集上清液。以60％～90％饱和度的硫酸铵梯度进行蛋白质分级沉淀，分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0，0.05mol/L)复溶，用疏水层析分离，收集30％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl)浓度处的洗脱峰，10万分子量的透析袋透析过夜，PEG20000浓缩，再用DEAE离子交换层析分离，20％～75％洗脱液(pH8.0，0.05mol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl)(约25min)梯度洗脱处第一个洗脱峰得到纯的(纯度＞95％)γ-谷氨酰转肽酶(比活为59.6U/mg蛋白)。(疏水层析及DEAE离子交换层析的方法为本领域普通技术人员公知的技术)。

实施例2：

称取7.3g(0.1mol)L-谷氨酰胺，4.2g碳酸氢钠溶解于50mL水，通过恒流泵流加50mL五水合硫酸铜，控制反应温度在60℃左右。流加结束后，室温继续反应约2小时，然后过滤、洗涤、干燥、得到L-谷氨酰胺-铜(II)配合物。

实施例3：

取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物10.6mg(0.03mmol)于2.5mLTris-HCl缓冲液中(pH 9，0.1mol/L)，加入2.5mL 400mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶0.8mL，混合均匀置于水浴锅反应2小时，反应温度为37℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：DIONEX1 Acclaim120 5μC18；检测波长为200nm；流动相为95％水(含1‰三氟乙酸)，5％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为71％。

实施例4：

取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物53mg(0.15mmol)于12.5mL Tris-HCl(pH 9，0.1mol/L)，加入12.5mL 400mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶4mL，混合均匀置于水浴锅反应3小时，反应温度为40℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸混匀(体积为反应液10％)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为DIONEX1 Acclaim120 5μC18，检测波长为200nm，流动相为95％水(含1‰三氟乙酸)，5％乙腈，对谷氨酰胺的转化率为70.8％。

实施例5：

取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物0.075mmol于12.5mL Tris-HCl(pH 9，0.1mol/L)，加入12.5mL 150mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶0.25mL，混合均匀置于水浴锅反应5小时，反应温度为45℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸混匀(体积为反应液10％)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为DIONEX1 Acclaim120 5μC18，检测波长为200nm，流动相为95％水(含1‰三氟乙酸)，5％乙腈，对谷氨酰胺的转化率为64.2％。

实施例6：

同实施例4的方法，所不同的是取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物0.125mmol于12.5mL Tris-HCl(pH11.0，0.1mol/L)，加入12.5mL 300mmol/L的乙胺。对谷氨酰胺的转化率为67.1％。

实施例7：

同实施例4的方法，所不同的是取实施例2得到的L-谷氨酰胺-铜(II)配合物0.075mmol于12.5mLTris-HCl(pH 8.0，0.1mol/L)，加入12.5mL 100mmol/L的乙胺。对谷氨酰胺的转化率为57.5％。

实施例8：

由实例4得到的茶氨酸反应液，超滤去除酶蛋白，然后减压蒸发结晶，无水乙醇重结晶。得茶氨酸25.25mg。

Claims

1.一种酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)利用化学法合成底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物；

(2)将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺-铜(II)配合物和乙胺的混合水溶液中，L-谷氨酰胺-铜(II)配合物的起始浓度为3～6mmol/L，乙胺的起始浓度为50～200mmol/L，γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的1～16％，反应pH为8.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时，得L-茶氨酸-铜(II)配合物；

(3)在反应液中加入盐酸使L-谷氨酰胺-铜(II)配合物分解为茶氨酸；

(4)将所得茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶；

其中，所述的γ-谷氨酰转肽酶由枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis NX-2、保藏号为CGMCC No.0833发酵得到。

2.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸方法，其特征在于所述γ-谷氨酰转肽酶的纯度大于95％。

3.根据权利要求2所述的酶法合成L-茶氨酸方法，其特征在于γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的1％。

4.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(3)中，加入体积为反应液体积8～10％的1mol/L盐酸。

5.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中，利用乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸。