CN101701239B - 一种海因酶法制备谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海因酶法制备谷胱甘肽的方法。该方法包括下列步骤：采用谷氨酸和氰酸盐为原料制备5-羧乙基海因；进而采用接肽试剂依次接上S-R基-L-半胱氨酸和甘氨酸制备N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸；然后以含有L-海因酶和L-氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，催化水解N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸制备S-R基-谷胱甘肽；最后脱除S-R基制备得到谷胱甘肽。本发明方法采用海因环共保护谷氨酸中的α-氨基和α-羧基，仅暴露出γ-羧基，保证了接肽反应的位置专一性。本发明方法避免了多数化学合成中反复的保护与脱保护步骤，操作简单，减少了副反应的发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用海因酶法制备谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(γ-L-glutanmy-L-cysteinyl-glycine，glutathione)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。早在1888年，法国科学家de Rey-Pailhade就在面包酵母的乙醇萃取物中首先发现了谷胱甘肽，将其命名为“Philothion”。1921年英国生化学家Hopkins从酵母抽提物中分离得到了谷胱甘肽并正式命名为“Glutathione”。其后，经过化学分析、酸碱滴定、降解与合成等方面的研究，谷胱甘肽的化学分子结构才最终被确定(Wieland T.Chemistry and Properties of Glutathiones Colowick S，Schwarz D R，Lazarow A，et al.Glutathione.New York：Academic Press，1954，45～57.)。作为生物体内的非蛋白巯基化合物，谷胱甘肽主要有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形态，通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽。
GSH是一种白色晶体，分子量为307.33，熔点为195℃，等电点为5.93，比旋光度为[α]D 17-17.4(c 2.80，H2O)，易溶于水、稀醇、液氨和N，N-二甲基甲酰胺，微溶于醇、醚和丙酮等有机溶剂。GSH固体较为稳定，其水溶液在空气中易被氧化。两分子GSH的活泼巯基可以氧化缩合为二硫键，即得到GSSG。
GSH的生理功能主要包括维持红细胞膜的完整性，对于需要巯基的酶有保护与恢复活性的功能，是多种酶的辅基与辅酶，参与氨基酸的吸收及运转，参与高铁血红蛋白的还原作用及促进铁的吸收和清除体内有害毒物和代谢物等(段学辉，谢雷波，王锦.谷胱甘肽的应用和酶法生产谷胱甘肽的研究进展.江西科学，2005，23(6)：750～753.)。
GSH是一种非常重要的氨基酸衍生物，具有非常广泛的应用前景。作为试剂，GSH广泛用于生化、医学、生物学、化学的研究与测定；在食品加工中，GSH作为食品添加剂可提高营养，加强食品风味及防止变质；GSH还可制成复合治疗和保健的药品用于人体保健；临床上，GSH可用于肝炎的辅助治疗，有机物及重金属的解毒，癌症辐射和化疗的保护，白内障、HIV的抑制，细胞膜的保护，改善性功能等(杨培慧，齐剑英，冯德雄等.谷胱甘肽的应用及其检测方法.中国生化药物杂志，2002，23(1)：52～54.)。
目前，GSH的合成方法主要有提取法、发酵法、化学合成法和酶法。提取法是生产GSH的经典方法，主要以富含GSH的动、植物组织和酵母为原料，通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶处理，再分离精制而成，但此法存在GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高等许多问题，因此已很少使用。发酵法生产就是通过选育(构建)GSH合成能力强和胞内产物含量高的微生物、筛选和优化培养配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高产物的产率和质量，发酵法的主要问题是转化效率低，发酵周期长，过低的GSH含量需要复杂的分离工艺，设备投入大，生产成本高，而且产品纯度和收率相对较低，因而限制了该法的进一步推广。化学合成法通常都需要对L-谷氨酸的α-氨基和α-羧基分别分步进行保护，仅游离出γ-羧基进行接肽反应，接肽结束后还需要再分别分步将α-氨基和α-羧基的保护基脱除，这样在反复的保护和脱保护过程中，容易造成肽键断裂、消旋化等现象，从而使得收率降低、光学纯度降低。可以用于合成GSH的酶有两种：GSH合成酶系(GSH I和GSH II)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，但前者在进行催化转化合成GSH的同时，需要消耗能量ATP，必须构建ATP再生系统，而后者虽不需要消耗ATP，却也容易产生水解、自转肽等多种副反应。
因此，开发一种新的、简便的、易于大规模制备谷胱甘肽(1)的方法对于谷胱甘肽的工业化生产具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便的、易于工业化规模生产的海因酶法制备谷胱甘肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种海因酶法制备谷胱甘肽的方法，包括下列步骤：
(1)谷氨酸制备5-羧乙基海因。
以氰酸盐和谷氨酸为原料，氰酸盐与谷氨酸的摩尔比为1～1.4∶1，在碱性条件下进行反应，酸化成环后形成5-羧乙基海因，实现对谷氨酸α-氨基和α-羧基的共保护。
其中，所述的谷氨酸为L-谷氨酸、D，L-谷氨酸、D-谷氨酸和谷氨酸一氢钠中的任意一种。所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。所述的碱性条件为pH8.5～10.0、50～80℃、搅拌反应1～5h，调碱所适用的碱可以是氢氧化钠或是氢氧化钾。所述的酸化成环反应条件为pH1.0～2.5，90～120℃、搅拌反应0.2～3h，调酸所适用的酸为有机酸如甲酸、乙酸，或无机酸如盐酸、硫酸、磷酸，优选盐酸或硫酸，可以是稀盐酸或稀硫酸，也可以是浓盐酸或浓硫酸。
(2)5-羧乙基海因与S-R基-L-半胱氨酸反应制备N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸。
在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，采用接肽试剂将5-羧乙基海因末端羧基接上S-R基-L-半胱氨酸，接肽试剂与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.4∶1，S-R基-L-半胱氨酸与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.6∶1，经萃取、浓缩结晶分离，可获得N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸。
其中，采用接肽试剂在5-羧乙基海因末端羧基接上S-R基-L-半胱氨酸，具体方法即为先将接肽试剂与5-羧乙基海因反应1～8h，去除沉淀，取滤液加入S-R基-L-半胱氨酸反应10～18h。所述的接肽试剂为DCC/HOBt(二环己基碳二亚胺/1-羟基-苯并三氮唑)、DIC/HOBt(二异丙基碳二亚胺/1-羟基-苯并三氮唑)、DCC/HOSu(二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)和DCC/HOAt(二环己基碳二亚胺/1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)中的任意一种。S-R基-L-半胱氨酸中，所述的R基为巯基保护基，可以为苄基、对甲基苄基、对甲氧基苄基、二苯甲基、三苯甲基、叔丁基、乙酰胺甲基、三甲基乙酰胺甲基和芴甲基等保护基团中的任意一种，S-R基-L-半胱氨酸可直接以固体的形式加入反应液中，或者采用S-R基-L-半胱氨酸/DMF溶液(如0.3mol/1L DMF)的形式加入反应液中。
(3)N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸与甘氨酸反应制备N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸。
在DMF中，采用接肽试剂将N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸末端羧基接上甘氨酸，接肽试剂与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸的摩尔比为1～1.4∶1，甘氨酸与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸的摩尔比为1～1.6∶1，经萃取、浓缩结晶分离，可获得N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸。
其中，采用接肽试剂在N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸羧基接上甘氨酸，具体方法即为先将接肽试剂与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸反应1～5h，去除沉淀，取滤液加入甘氨酸反应10～18h。所述的接肽试剂为DCC/HOBt、DIC/HOBt、DCC/HOSu和DCC/HOAt中的任意一种。甘氨酸可直接以固体的形式加入反应液中，或者采用甘氨酸/DMF溶液(如0.1mol/1LDMF)的形式加入反应液中。
(4)N-海因丙酰-S-R基L-半胱氨酰-甘氨酸经海因酶水解制备S-R基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，即S-R基-谷胱甘肽。
以含有L-海因酶和L-氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解步骤(3)得到的N-海因丙酰-S-R基L-半胱氨酰-甘氨酸制备S-R基-谷胱甘肽，将所得的酶转化溶液经分离、冻干得到S-R基-谷胱甘肽。
其中，所述的含有L-海因酶和L-氨甲酰酶的湿菌体为芽孢杆菌MH602(Bacillusfordii MH602，中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCC NO.M206144)。所述的弱碱性条件为pH7.5～9.5。湿菌体与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸的重量比为1∶1～8。催化水解反应温度为35～45℃，反应时间10～24h。
(5)S-R基-谷胱甘肽脱除S-R基制备谷胱甘肽。
将步骤(4)得到的S-R基-谷胱甘肽脱除S-R基，经过滤(或萃取)、浓缩、离子交换分离得到谷胱甘肽。
其中，所述的脱除S-R基的方法为一般多肽合成中的常规脱保护方法(Sewald N，Jakubke H-D.Peptides：Chemistry and Biology.Weinheim：WILEY-VCH Verlag GmbH &Co.KGaA，2002.；黄惟德，陈常庆.多肽合成.北京：科学出版社，1985.；Green T W，Wuts P G M.Protective Group in Organic Synthesis.Third Edition.New York：John Wiley &Son，Inc.，1999.)，如采用Pd/C催化剂加氢脱除S-苄基等S-保护基，加氢反应条件为20～60℃、搅拌反应1～10h，Pd/C催化剂为0.5％～20％Pd/C催化剂，加氢反应氢供体为甲酸及其盐、肼、次磷酸及其盐、环己烯和氢气中的任意一种。
有益效果：本发明的海因酶法制备谷胱甘肽的方法与其他制备方法相比有如下优点：
1、采用海因环共保护谷氨酸中的α-氨基和α-羧基，仅暴露出γ-羧基，保证了接肽反应的位置专一性，并且在后续接肽反应过程中无需氨基和羧基保护。
2、采用同时含有L-海因酶与L-氨甲酰酶的菌体进行水解海因环，一步脱除α-氨基和α-羧基的共保护，避免了多数化学合成中反复的保护与脱保护步骤，操作简单，同时也避免了GSH合成酶系酶法合成中能量ATP的使用以及γ-谷氨酰转肽酶酶法合成中水解、自转肽等副反应的发生。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、反应条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：5-羧乙基海因的合成。
L-谷氨酸(0.1mol)与氰酸钾(0.12mol)溶于50mL水中，用0.5mol·L-1氢氧化钾溶液调节pH＝9.0，75℃搅拌反应2h，生成中间产物N-氨甲酰L-谷氨酸。加入0.5mol·L-1盐酸调节溶液pH＝1～2，升温到100℃加热回流反应0.5h，冷却，过滤干燥得白色固体，用水重结晶，可得到白色晶体5-羧乙基海因13.7g，产率79.5％，m.p.179～181℃；1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：12.14(s，1H，COOH)，10.59(s，1H，NH)，7.91(s，1H，NH)，4.03～4.00(m，1H，CH)，2.33～2.30(m，2H，CH2)，1.95～1.68(m，2H，CH2)；HRMS(ESI)calcd for C6H8N2NaO4[M+Na]+195.0376，found 195.0374。
实施例2：5-羧乙基海因的合成。
L-谷氨酸一氢钠(0.1mol)与氰酸钠(0.14mol)溶于50mL水中，用0.1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH＝8.5，80℃搅拌反应2h，生成中间产物N-氨甲酰-L-谷氨酸。加入浓盐酸调节溶液pH＝1～2，升温到100℃加热回流反应1.5h，冷却，过滤干燥得白色固体，用水重结晶，可得到白色晶体5-羧乙基海因14.2g，产率82.7％(m.p.179～181℃)。
实施例3：N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酸的合成。
实施例1得到的5-羧乙基海因(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.1mol)和HOBt(0.1mol)，反应2h，过滤除去DCU(二环己基脲)，取滤液。加入S-苄基-L-半胱氨酸(0.13mol)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酸33.4g，产率91.4％，m.p.81～83℃；1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：12.80(s，1H，COOH)，10.62(s，1H，NH)，8.25(d，J＝8.0Hz，1H，NH)，7.89(s，1H，NH)，7.32～7.24(m，5H，PhH)，4.45～4.41(m，1H，CH)，4.05～4.03(m，1H，CH)，3.75(s，2H，CH2)，2.81～2.63(m，2H，CH2)，2.31～2.17(m，2H，CH2)，1.96～1.70(m，2H，CH2)；HRMS(ESI)calcd for C16H19N3NaO5S[M+Na]+388.0938，found 388.0946。
实施例4：N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酸的合成。
实施例2得到的5-羧乙基海因(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DIC(0.12mol)和HOBt(0.12mol)，反应6h，过滤除去DIU(二异丙基脲)，取滤液。加入S-苄基-L-半胱氨酸/DMF溶液(0.15mol/300mL DMF)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酸30.7g，产率84.0％(m.p.81～83℃)。
实施例5：N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酸的合成。
实施例1得到的5-羧乙基海因(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.1mol)和HOBt(0.1mol)，反应2h，过滤除去DCU，取滤液。加入S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酸(0.13mol)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酸35.8g，产率90.5％。
实施例6：N-海因丙酰-S-二苯甲基-L-半胱氨酸的合成。
实施例2得到的5-羧乙基海因(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DIC(0.12mol)和HOBt(0.12mol)，反应6h，过滤除去DIU，取滤液。加入S-二苯甲基-L-半胱氨酸/DMF溶液(0.15mol/300mL DMF)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-二苯甲基-L-半胱氨酸38.5g，产率87.2％。
实施例7：N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸的合成。
实施例3得到的N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酸(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.1mol)和HOBt(0.1mol)，反应2h，过滤除去DCU，取滤液。加入甘氨酸(0.13mol)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸37.9g，产率89.7％，m.p.90～92℃；1H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：12.76(s，1H，COOH)，10.62(s，1H，NH)，8.28(d，J＝7.9Hz，1H，NH)，8.23(t，J＝5.3Hz，1H，NH)，7.87(s，1H，NH)，7.30～7.21(m，5H，PhH)，4.49～4.43(m，1H，CH)，4.02～3.99(m，1H，CH)，3.86(d，J＝5.4Hz，2H，CH2)，3.73(s，2H，CH2)，2.79～2.61(m，2H，CH2)，2.32～2.19(m，2H，CH2)，1.94～1.71(m，2H，CH2)；HRMS(ESI)calcd forC18H24N4NaO6S[M+Na]+445.1153，found 445.1161。
实施例8：N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸的合成。
实施例4得到的N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酸(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DIC(0.12mol)和HOBt(0.12mol)，反应3h，过滤除去DIU，取滤液。加入甘氨酸/DMF溶液(0.15mol/300mL DMF)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸36.1g，产率85.5％(m.p.90～92℃)。
实施例9：N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酸-甘氨酸的合成。
实施例5得到的N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酸(0.1mol)加入200mLDMF，室温搅拌溶解，加入DCC(0.1mol)和HOBt(0.1mol)，反应2h，过滤除去DCU，取滤液。加入甘氨酸(0.13mol)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酸-甘氨酸39.1g，产率86.4％。
实施例10：N-海因丙酰-S-二苯甲基-L-半胱氨酸-甘氨酸的合成。
实施例6得到的N-海因丙酰-S-二苯甲基-L-半胱氨酸(0.1mol)加入200mL DMF，室温搅拌溶解，加入DIC(0.12mol)和HOBt(0.12mol)，反应3h，过滤除去DIU，取滤液。加入甘氨酸/DMF溶液(0.15mol/300mL DMF)，反应过夜。倒入水中，加入乙酸乙酯萃取三次，萃取液经干燥后浓缩，得白色固体，经甲醇重结晶后获得白色晶体N-海因丙酰-S-二苯甲基-L-半胱氨酸-甘氨酸41.8g，产率83.8％。
实施例11：发酵产酶。
取葡萄糖20g，玉米浆20mL，K2HPO4 15g，MgSO4 0.5g，5-羧乙基海因5g，pH7.5加自来水配制成0.5L液体发酵培养基，分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，0.1MPa高压蒸汽灭菌25min备用。
将芽孢杆菌MH602(Bacillus fordii MH602，CCTCC NO.M206144)，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g·L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20)上，活化培养24h，接入种子培养基(种子培养基(g·L-1)：葡萄糖15，蛋白胨20，K2HPO4 2，MgSO4 0.25)在33℃、220r·min-1振荡培养20h，培养结束接入发酵培养基，于33℃、200r·min-1发酵培养24h，发酵结束后，8000r·min-1离心25min，收集湿菌体。
实施例12：海因酶法水解N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸制备S-苄基-谷胱甘肽。
取实施例7得到的N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸1g于25mL Tris-HCl(pH9.0，0.1mol·L-1)，加入实施例11得到的湿菌体0.6g，混合均匀置于水浴摇床反应18h，反应温度为37℃。反应结束后，反应液取样加入1mol·L-1盐酸混匀(体积为取样液10％)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为DIONEX Acclaim 120，C18，5μm Analytical(4.6×150mm)，检测波长为200nm，流动相为95％水(含1‰三氟乙酸)：5％乙腈)，N-海因丙酰-S-苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸的转化率为90.3％。由上述得到的酶转化反应液25mL，加水25mL，8000r·min-1离心15min除去菌体，采用分子量为1000的超滤膜去除酶蛋白。透过液加入活性炭(活性炭与S-苄基-谷胱甘肽得质量比为2％)，70℃保温脱色30min，过滤，滤液冻干得白色固体，经水重结晶后获得白色晶体S-苄基-谷胱甘肽0.62g，m.p.160～161℃；1H NMR(D2O，500MHz)δ：7.42～7.34(m，5H)，4.45(dd，J＝8.3，5.1Hz，1H)，3.83～3.74(m，5H)，2.99(dd，J＝14.2，4.9Hz，1H)，2.80(dd，J＝14.0，8.7Hz，1H)，2.49～2.43(m，2H)，2.17～2.11(m，2H)；HRMS(ESI)calcdfor C17H23N3NaO6S[M+Na]+420.1200，found 420.1203。
实施例13：海因酶法水解N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸制备S-对甲氧基苄基-谷胱甘肽。
取实施例9得到的N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基L-半胱氨酰-甘氨酸1g于25mLTris-HCl(pH 9.0，0.1mol·L-1)，加入实施例11得到的湿菌体0.6g，混合均匀置于水浴摇床反应18h，反应温度为37℃。反应结束后，反应液取样加入1mol·L-1盐酸混匀(体积为取样液10％)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为DIONEXAcclaim 120，C18，5μm Analytical(4.6×150mm)，检测波长为200nm，流动相为95％水(含1‰三氟乙酸)：5％乙腈)，N-海因丙酰-S-对甲氧基苄基-L-半胱氨酰-甘氨酸的转化率为88.1％。由上述得到的酶转化反应液25mL，加水25mL，8000r·min-1离心15min除去菌体，采用分子量为1000的超滤膜去除酶蛋白。透过液加入活性炭(活性炭与S-对甲氧基苄基-谷胱甘肽得质量比为2％)，70℃保温脱色30min，过滤，滤液冻干得白色固体，经水重结晶后获得白色晶体S-对甲氧基苄基-谷胱甘肽0.59g。
实施例14：海因酶法水解N-海因丙酰-S-二苯甲基L-半胱氨酰-甘氨酸制备S-二苯甲基-谷胱甘肽。
取实施例10得到的N-海因丙酰-S-二苯甲基L-半胱氨酰-甘氨酸1g于25mLTris-HCl(pH 9.0，0.1mol·L-1)，加入实施例11得到的湿菌体0.6g，混合均匀置于水浴摇床反应18h，反应温度为37℃。反应结束后，反应液取样加入1mol·L-1盐酸混匀(体积为取样液10％)，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为DIONEXAcclaim 120，C18，5μm Analytical(4.6×150mm)，检测波长为200nm，流动相为95％水(含1‰三氟乙酸)：5％乙腈)，N-海因丙酰-S-二苯甲基L-半胱氨酰-甘氨酸的转化率为85.9％。由上述得到的酶转化反应液25mL，加水25mL，8000r·min-1离心15min除去菌体，采用分子量为1000的超滤膜去除酶蛋白。透过液加入活性炭(活性炭与S-二苯甲基-谷胱甘肽得质量比为2％)，70℃保温脱色30min，过滤，滤液冻干得白色固体，经水重结晶后获得白色晶体S-二苯甲基-谷胱甘肽0.55g。
实施例15：谷胱甘肽的合成。
实施例12得到的S-苄基-谷胱甘肽0.5g加入20mLMeOH中，加入1.0g 10％Pd/C催化剂以及0.5g甲酸铵(氢供体)，50℃反应5h，冷却后过滤，用MeOH洗涤Pd/C催化剂两次，合并滤液，蒸除溶剂，白色固体溶于5mL水，转至阳离子交换柱内，水淋洗，再用氨水淋洗，收集溶液，蒸干，经水重结晶后获得白色晶体谷胱甘肽0.29g，产率75.0％，m.p.199～201℃，[α]D 25-15.7(c0.10，H2O)；1H NMR(D2O，500MHz)δ：4.56(t，J＝6.1Hz，1H)，3.98(s，2H)，3.83(t，J＝6.3Hz，1H)，2.98～2.90(m，2H)，2.59～2.52(m，2H)，2.19～2.15(m，2H)；13C NMR(D2O，500MHz)δ：177.73，176.38，175.26，58.39，56.59，44.28，33.98，28.76，28.13；HRMS(ESI)calcd for C10H17N3NaO6S[M+Na]+330.0730，found 330.0733。
实施例16：谷胱甘肽的合成。
实施例13得到的S-对甲氧基苄基-谷胱甘肽0.5g加入20mL三氟甲璜酸中，加入0.5mL苯甲醚，40℃反应1h，蒸除溶剂，白色固体溶于5mL水，转至阳离子交换柱内，水淋洗，再用氨水淋洗，收集溶液，蒸干，用水重结晶后获得白色晶体谷胱甘肽0.26g，产率72.3％(m.p.199～201℃，[α]D 25-13.3(c 0.10，H2O))。
实施例17：谷胱甘肽的合成。
实施例14得到的S-二苯甲基-谷胱甘肽0.5g加入20mL三氟乙酸中，加入0.1g苯酚，30℃反应2h，蒸除溶剂，白色固体溶于5mL水，转至阳离子交换柱内，水淋洗，再用氨水淋洗，收集溶液，蒸干，用水重结晶后获得白色晶体谷胱甘肽0.22g，产率67.8％(m.p.199～201℃，[α]D 25-19.5(c 0.10，H2O))。
Claims (9)
1.一种海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)以氰酸盐和谷氨酸为原料，氰酸盐与谷氨酸的摩尔比为1～1.4∶1，在碱性条件下进行反应，酸化成环后形成5-羧乙基海因；
(2)采用接肽试剂将步骤(1)得到的5-羧乙基海因末端羧基接上S-R基-L-半胱氨酸，接肽试剂与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.4∶1，S-R基-L-半胱氨酸与5-羧乙基海因的摩尔比为1～1.6∶1，经萃取、浓缩结晶得到N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸；
(3)采用接肽试剂将步骤(2)得到的N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸末端羧基接上甘氨酸，接肽试剂与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸的摩尔比为1～1.4∶1，甘氨酸与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酸的摩尔比为1～1.6∶1，经萃取、浓缩结晶得到N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸；
(4)以含有L-海因酶和L-氨甲酰酶的湿菌体为催化剂，在弱碱性条件下，催化水解步骤(3)得到的N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸制备S-R基-谷胱甘肽，将所得的酶转化溶液经分离、冻干得到S-R基-谷胱甘肽；
(5)将步骤(4)得到的S-R基-谷胱甘肽脱除S-R基，经过滤、浓缩、离子交换分离得到谷胱甘肽。
其中，所述R基为巯基保护基；
步骤(4)中，所述的含有L-海因酶和L-氨甲酰酶的湿菌体为芽孢杆菌MH602Bacillusfordii MH602，CCTCC NO.M206144。
2.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的R基为苄基、对甲基苄基、对甲氧基苄基、二苯甲基、三苯甲基、叔丁基、乙酰胺甲基、三甲基乙酰胺甲基和芴甲基中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的谷氨酸为L-谷氨酸、D，L-谷氨酸、D-谷氨酸和谷氨酸一氢钠中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。
5.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的碱性条件下进行反应为pH8.5～10.0，50～80℃，搅拌反应1～5h。
6.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的酸化成环条件为pH1.0～2.5，90～120℃，搅拌反应0.2～3h。
7.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中，所述的接肽试剂为DCC/HOBt、DIC/HOBt、DCC/HOSu和DCC/HOAt中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(4)中，所述的弱碱性条件为pH7.5～9.5。
9.根据权利要求1所述的海因酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于步骤(4)中，所述的湿菌体与N-海因丙酰-S-R基-L-半胱氨酰-甘氨酸的重量比为1∶1～8。
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