CN112322676B

CN112322676B - 一种酶催化制备氟伐二醇的方法

Info

Publication number: CN112322676B
Application number: CN202011248032.5A
Authority: CN
Inventors: 程加铭; 张锦涛; 陈恬; 顾学新; 谷绪顶; 杨晶晶
Original assignee: Jiangsu Baju Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Baju Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: CN112322676A

Abstract

本发明涉及一种酶催化制备氟伐二醇的方法，属于药物合成技术领域。为了解决现有的选择性差的问题，提供一种酶催化制备氟伐二醇的方法，该方法包括在弱碱性物质存在的条件下，使在供氢体和固载后的羰基还原酶的作用下将式Ⅰ化合物氟伐醇酮通过酶法反应转化为产物式Ⅱ化合物氟伐二醇；固载后的所述羰基还原酶的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明能够极大的提高了手性选择性的反应效率，减少了副产物的产生，且产物手性纯度高的效果。

Description

一种酶催化制备氟伐二醇的方法

技术领域

本发明涉及一种酶催化制备氟伐二醇的方法，属于药物合成技术领域。

背景技术

氟伐二醇作为氟伐他汀的主要中间体，其合成是必不可少的，但是目前主流的合成方法还是化学合成法，如中国专利申请(公开号：CN 1978428A)主要用氟伐主环作为原料经和乙酰乙酸叔丁酯、氢化钠、丁基锂反应合成氟伐醇酮，然后，氟伐醇酮再先经过硼氢化钠、二乙基甲氧基硼烷还原环合，在经过双氧水氧化水解的到氟伐二醇。然而，该传统化学方法制备氟伐二醇工艺繁琐，成本高，危险系数高等缺点。因此，研究反应温和且成本低，工艺简单的酶催化工艺是非常有必要的。

又如中国专利申请(公开号：CN 1687032A)公开的一种以氟伐主环为原料来合成相应的氟伐二醇。同样是采用化学合成的方式进行，且工艺路线长且成本高和选择性不高的问题，存在产物构型分离难。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种酶催化制备氟伐二醇的方法，解决的问题是如何提供采用酶法合成且产物手性选择性高。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种酶催化制备氟伐二醇的方法，该方法包括以下步骤：

在弱碱性物质存在的条件下，使在供氢体和固载后的羰基还原酶的作用下将式Ⅰ化合物氟伐醇酮通过酶法反应转化为产物式Ⅱ化合物氟伐二醇；

固载后的所述羰基还原酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

通过上述的羰基还原酶进行酶催化作用于底物，且通过将羰基还原酶进行固载后，在弱碱性条件下能够使对底物的转换具有高选择性，也就是说极大的提高了手性选择性产物的合成，且反应效率高，使得到本发明的产物具有手性选择性高，也减少了副产物的产生，产品手性纯度高，能够有效避免了不同产物构型导致的分离难的缺陷，能够使产品纯度达到99％以上，且其ee值也能够达到99.5％以上；同时，由于采用羰基还原酶进行酶法反应，使反应条件温和，更易于操作，且所采用的原料成本低，反应的安全性高，更有利于实际生产操作，这里的羰基还原酶可直接通过购买得到，也可以根据本发明的SEQ ID NO.1所示的序列按照一般的方法得到。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，作为优选，所述固载后的羰基还原酶采用硅藻土作为载体进行固载。能够很好的将羰基还原酶进行吸附固载，且也能够保证羰基还原酶的活性，具有高反应选择性的特性。更进一步的讲，所述固载后的羰基还原酶具体采用以下方法得到：

将羰基还原酶和硅藻土加入醚类溶剂中进行混合充分后，过滤，收集滤饼进行冻干后，得到相应的固载后的羰基还原酶。通过采用硅藻土进行固载后，能够极大的提高羰基还原性的催化活性，大大的提升转化过程中的产物手性选择性，具有反应效率高的优点。同时，由于采用硅藻土对羰基还原酶进行固载，能够提高酶的重复利用，实现多次套用的优点，且重复利用后也能够保证手性选择性和转化率的效果。作为更进一步的优选，所述混合充分后还包括加入海藻酸钠和水进行搅拌混合，再进行过滤处理。通过硅藻土固载后且在过滤处理之前，再采用海藻酸钠进行包埋处理，能够有效的避免出现羰基还原酶的固载脱落的现象，更好的提高固载后的酶的利用率，也大大的降低了生产成本，且经过包埋处理也能够提高酶催化还原的手性选择性，提高反应效果。更进一步的优选，所述硅藻土与羰基还原酶的质量比为1：1.2～1.5。最好使上述海藻酸钠与羰基还原酶的质量比为1：3～4。具有更好的包埋效果。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，作为优选，所述醚类溶剂选自甲基叔丁基醚、异丙醚和四氢呋喃中的一种或几种。采用上述溶剂，能够很好的溶解底物和反应后的产物，且易于保证反应的转化率，易于跟固载后的羰基还原酶的分离，提高了溶剂回收利用率和处理，减少三废产生的同时也能够降低成本。最好使所述醚类溶剂的体积用量与氟伐醇酮的质量比2.0～3.2：1。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，所述供氢体采用醇类物质，能够有效的提供氢，使底物更好的被还原为相应的产物，且能够实现重复利用，这里的醇类物质如异丙醇、乙醇或丙醇等。作为优选，所述供氢体采用异丙醇。最好使所述氟伐醇酮与供氢体的摩尔比为1：1.1～1.5。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，作为优选，所述酶法反应的温度为25℃～35℃。由于采用本发明的羰基还原酶，使在酶催化下进行反应，具有反应条件温和的效果。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，作为优选，所述弱碱性物质选自有机醇胺。提供弱碱性条件，促进酶催化反应更好的向正方向进行，提高反应效率和产物的纯度效果,所述有机醇胺如二乙醇胺、二异丙基乙醇胺和三乙醇胺中的一种或几种等。作为更进一步的优选，所述有机醇胺选自三乙醇胺。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，所述氟伐醇酮与羰基还原酶CIR的质量比为1：0.5～0.8，能够使具有更好的转化率，减少原料的浪费和降低成本的优点，最好还添加有NAD+，且所述NAD+的加入量为羰基还原酶CIR质量的0.1％～0.2％。

在上述酶催化制备氟伐二醇的方法中，作为优选，所述酶法反应结束后，还包括后处理。最好使所述后处理具体为：

将得到的反应液进行过滤回收固载后的羰基还原酶，得到的滤液进行减压蒸馏除去溶剂后，再加入乙腈溶剂进行搅拌后，加入适量水，充分搅拌后，降温至0～5℃进行析晶处理，得到相应的产物氟伐二醇。

本酶催化制备氟伐二醇的方法的合成方程式如下所示：

上述合成方程式中以供氢体为异丙醇为例。

综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.本发明通过采用羰基还原酶进行酶催化作用于底物，且通过将羰基还原酶进行固载处理，能够极大的提高了手性选择性的反应效率，减少了副产物的产生，且产物手性纯度高的效果，能够有效避免了不同产物构型导致的分离难的缺陷，产品纯度达到99％以上，且ee值达到99.5％以上。

2.由于采用羰基还原酶进行酶法反应，使反应条件温和，更易于操作，且所采用的原料成本低，反应的安全性高，更有利于实际生产操作。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

实施例1

在室温条件下，向洁净的反应器中加入15g的提纯后的羰基还原酶CIR和10g硅藻土，这里的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后加入100ml的甲基叔丁基醚,控制温度在20±5℃，搅拌超过10小时以上，至羰基还原酶CIR和硅藻土充分结合，再加入海藻酸钠5g和2g水搅拌10小时后，过滤，得到滤饼冻干后，得相应的25g固载后的羰基还原酶CIR，在-10℃-0℃的条件下保存待用。

实施例2

室温条件下，向洁净的反应器中加入100ml的甲基叔丁基醚，加入10ml(0.13mol)的异丙醇，1g(0.0067mol)的三乙醇胺，然后加入46.5g(0.1mol)的氟伐醇酮，搅拌至底物完全溶解后，最后加入实施例1方法得到的固载后的羰基还原酶CIR 25g和0.05g的NAD⁺,然后，再控制温度在25～30℃条件下反应10小时，反应结束后，抽滤，滤饼为固载后的羰基还原酶CIR可重复套用，向收集的母液(滤液)加入30ml水洗涤三次，然后控制温度在50℃以下进行减压蒸馏至干除去溶剂，再加入90ml乙腈搅拌30分钟，然后，在50℃的条件下滴加30ml的水，滴加完毕后，搅拌下缓慢降温至0～5℃，抽滤得固体产物，固体产物在60℃内烘干，得到相应的干品产物氟伐二醇，产量为44.36g(0.095mol)，收率为95％，纯度为99.5％，ee值为99.8％。

实施例3

室温条件下，向洁净的反应器中加入100ml的四氢呋喃，加入10ml(0.13mol)的异丙醇，1g(0.0067mol)的三乙醇胺，然后加入46.5g(0.1mol)的氟伐醇酮，搅拌至底物完全溶解后，最后加入实施例2中回收的固载后的羰基还原酶CIR，以及0.05g的NAD⁺,然后，再控制温度在25-30℃条件下反应10小时，反应结束后，抽滤，滤饼为固载后的羰基还原酶CIR可重复套用，向收集的母液(滤液)加入30ml水洗涤三次，然后控制温度在50℃以下进行减压蒸馏至干除去溶剂，再加入90ml乙腈搅拌30分钟，然后，在50℃的条件下滴加30ml的水，滴加完毕后，搅拌缓慢降温至0-5℃，抽滤得固体产物，固体产物在60℃内烘干，得到相应的干品产物氟伐二醇，产量44.83g(0.096mol)，收率为96％，纯度为99.3％，ee值为99.9％。

实施例4

室温条件下，向洁净的反应器中加入100ml的甲基叔丁基醚，加入10ml(0.13mol)的异丙醇，1g(0.0067mol)的三乙醇胺，然后加入46.5g(0.1mol)的氟伐醇酮，搅拌至底物完全溶解后，最后加入实施例3中回收的固载后的羰基还原酶CIR和0.05gNAD⁺,然后，再控制温度在25-30℃条件下反应10小时，反应结束后，抽滤，滤饼为固载后的羰基还原酶CIR可重复套用，向收集的母液(滤液)加入30ml水洗涤三次，然后控制温度在50℃以下进行减压蒸馏至干除去溶剂，再加入90ml甲醇搅拌30分钟，然后，在50℃的条件下滴加30ml的水，滴加完毕后，搅拌下缓慢降温至0-5℃，抽滤得固体产物，固体产物在60℃内烘干，得到相应的干品产物氟伐二醇43.43g(0.093mol)，收率为93％，纯度为99.8％，ee值为99.6％。

实施例5

室温条件下，向洁净的反应器中加入150ml的甲基叔丁基醚，加入10ml(0.13mol)的异丙醇，1g(0.0067mol)的三乙醇胺，然后加入46.5g(0.1mol)的氟伐醇酮，搅拌至底物完全溶解后，最后加入实施例1方法得到的固载后的羰基还原酶CIR30g和0.05g的NAD⁺,然后，再控制温度在28-30℃条件下反应12小时，反应结束后，抽滤，滤饼为固载后的羰基还原酶CIR可重复套用，向收集的母液(滤液)加入30ml水洗涤三次，然后控制温度在50℃以下进行减压蒸馏至干除去溶剂，再加入90ml乙腈搅拌30分钟，然后，在50℃的条件下滴加30ml的水，滴加完毕后，搅拌下缓慢降温至0-5℃，抽滤得固体产物，固体产物在60℃内烘干，得到相应的干品产物氟伐二醇，产量为44.83g，收率为96％，纯度为99.6％，ee值为99.7％。

实施例6

室温条件下，向洁净的反应器中加入116ml的甲基叔丁基醚，加入10ml(0.13mol)的异丙醇，1.0g(0.0067mol)的三乙醇胺，然后加入46.5g(0.1mol)的氟伐醇酮，搅拌至底物完全溶解后，最后加入实施例1方法得到的固载后的羰基还原酶CIR37.2g和0.1g的NAD⁺,然后，再控制温度在28-30℃条件下反应11小时，反应结束后，抽滤，滤饼为固载后的羰基还原酶CIR可重复套用，向收集的母液(滤液)加入30ml水洗涤三次，然后控制温度在55℃以下进行减压蒸馏至干除去溶剂，再加入90ml乙腈搅拌30分钟，然后，在55℃的条件下滴加30ml的水，滴加完毕后，搅拌下缓慢降温至0-5℃，抽滤得固体产物，固体产物在60℃内烘干，得到相应的干品产物氟伐二醇，产量为44.5g，收率为95％，纯度为99.3％，手性纯度ee值为99.6％。

实施例7

室温条件下，向洁净的反应器中加入93ml的异丙醚，加入9ml(0.12mol)的异丙醇，1.2g(0.008mol)的三乙醇胺，然后加入46.5g(0.1mol)的氟伐醇酮，搅拌至底物完全溶解后，最后加入实施例1方法得到的固载后的羰基还原酶CIR28g和0.12g的NAD⁺,然后，再控制温度在28-30℃条件下反应10小时，反应结束后，抽滤，滤饼为固载后的羰基还原酶CIR可重复套用，向收集的母液(滤液)加入40ml水洗涤三次，然后控制温度在55℃以下进行减压蒸馏至干除去溶剂，再加入100ml乙腈搅拌30分钟，然后，在55℃的条件下滴加40ml的水，滴加完毕后，搅拌下缓慢降温至0-5℃，抽滤得固体产物，固体产物在60℃内烘干，得到相应的干品产物氟伐二醇，产量为44.5g，收率为94.3％，纯度为99.2％，手性纯度ee值为99.5％。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

序列表

<110> 江苏八巨药业有限公司

<120> 一种酶催化制备氟伐二醇的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 羰基还原酶(CIR)

<400> 1

Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala Val Val

1 5 10 15

Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala Met Lys

20 25 30

Ala Ala Asn Ala Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser Ala Asp

35 40 45

Val Glu Gly Ala Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser Glu Ala

50 55 60

Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly Arg Val

65 70 75 80

Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Leu Val Thr Lys Phe Glu

85 90 95

Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn Val Asp

100 105 110

Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys Glu Gly

115 120 125

Gly Lys Ala Arg Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser Ser Val

130 135 140

Gly Gly Leu Arg Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr Ser Lys

145 150 155 160

Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly Ile Asp

180 185 190

Thr Pro Met Leu Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu Gly Ala

195 200 205

Ala Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg His Pro

210 215 220

Ile Gly Arg Met Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val Val Tyr

225 230 235 240

Leu Cys Ser Asp Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe Val Met

245 250 255

Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val

260

Claims

1.一种酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

在弱碱性物质存在的条件下，使在供氢体和固载后的羰基还原酶的作用下将式Ⅰ化合物氟伐醇酮通过酶法反应转化为产物式Ⅱ化合物氟伐二醇；所述供氢体选自醇类物质，所述醇类物质选自丙醇、乙醇或异丙醇；

固载后的所述羰基还原酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述固载后的羰基还原酶采用硅藻土作为载体进行固载。

3.根据权利要求1所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述固载后的羰基还原酶具体采用以下方法得到：

将羰基还原酶和硅藻土加入醚类溶剂中进行混合充分后，过滤处理，收集滤饼进行冻干后，得到相应的固载后的羰基还原酶。

4.根据权利要求3所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述混合充分后还包括加入海藻酸钠和水进行搅拌混合，再进行过滤处理。

5.根据权利要求3所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述硅藻土与羰基还原酶的质量比为1：1.2～1.5。

6.根据权利要求3所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述醚类溶剂选自甲基叔丁基醚、异丙醚和四氢呋喃中的一种或几种。

7.根据权利要求1-6任意一项所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述供氢体采用异丙醇。

8.根据权利要求1-6任意一项所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述酶法反应的温度为25℃～30℃。

9.根据权利要求1-6任意一项所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述弱碱性物质选自有机醇胺。

10.根据权利要求9所述酶催化制备氟伐二醇的方法，其特征在于，所述有机醇胺选自三乙醇胺、二乙醇胺和二异丙基乙醇胺中的一种或几种。