CN113373167B

CN113373167B - 羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用

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Publication number: CN113373167B
Application number: CN202110664103.8A
Authority: CN
Inventors: 张红蕾; 李玮; 杜洁; 王旭明; 王力竞; 胥稳智; 杨魁
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2023-01-13
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113373167A

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用。羰基还原酶基因序列如SEQ：ID：NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ：ID：NO:2所示。本发明应用聚羟基脂肪酸酯（PHA）磁性纳米微球合成了固定化羰基还原酶，本发明公开了羰基还原酶在生物合成R型托伐普坦中的应用。和游离酶相比，固定化酶在pH为8.0缓冲体系中稳定性最好，提高了耐碱性。本发明制备的固定化羰基还原酶有效改善了游离酶稳定性差，耐受性差，不可重复使用等缺点。

Description

羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体地说是一种羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用。

背景技术

托伐普坦(Tolvaptan)，是一种口服非肽类血管加压素V2受体拮抗剂，已被FDA批准用于临床的重度低钠血症和等容量性低钠血症的治疗。托伐普坦的苯并嗪环的5位上有一个不对称的碳，所以目前都以外消旋混合物的形式口服给药。虽然5R-tolvaptan的V2受体拮抗剂活性与5S-tolvaptan相似，但他们的血药浓度在动物体内显示出很大的差异。另有研究表明，在对多囊性肾病的哺乳动物注射光学纯的托伐普坦后，药物的半衰期比注射外消旋体托伐普坦时更长。在人体中(S)-Tolvaptan比外消旋体托伐普坦的代谢稳定性更高，然而在鼠体内(R)-Tolvaptan的代谢稳定性更高。此外，也有研究表明，通过肌肉注射光学纯托伐普坦的水相悬浮液后，血清中药物浓度比注射外消旋体托伐普坦时的浓度更高。体外试验也表明光学纯的托伐普坦比消旋体的托伐普坦吸收速率更快。为了阐明光学纯托伐普坦的作用机理和药理特性，不对称制备托伐普坦的光学纯异构体就显得非常重要。

光学纯托伐普坦，通常由手性试剂不对称催化前手性酮7-氯-1-[2-甲基-4-[(2-甲基苯甲酰基)氨基]苯甲酰基]-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1-苯氮

(简称PK1)合成。Matsubara等报道了一种通过脂肪酶的酯基转移催化合成光学纯托伐普坦的方法。该方法中的脂肪酶催化的脂基转移作用发生在托伐普坦合成过程的中间步骤，即生成中间产物S-(+)-2-S-7-Chloro-5-hydroxy-1-(p-toluenesulfonyl)-2,3,4,5-tetrahydro-1H-1-benzazepine，转化率为52％，e.e.值为93％。但是，该方法制备的光学纯托伐普坦的产率和光学纯度较低，限制了其工业化应用。然而，与化学合成方法相比，生物酶催化法提供了一种高效率低能耗的制备方法。目前，已经报道了利用树干毕赤酵母不对称还原前手性酮进行光学纯托伐普坦的合成。当菌体浓度为1.0g/mL，底物浓度为10.0mg/mL，在大豆油与水相的体积比为1:9的两相体系中反应72h时转化率达到74.5％，产物e.e.为99.0％。且从树干毕赤酵母中分离到醇脱氢酶(PsADH)，并利用共表达醇脱氢酶和甲酸脱氢酶(CpFDH)的大肠杆菌全细胞于水-大豆油两相体系中催化合成(S)-Tolvaptan。产物(S)-Tolvaptan的光学纯度为99.5％，生物转化效率为86.1％。上述方法在推动(S)-Tolvaptan的合成方面发挥重要作用，但是应用生物酶催化的方式合成(R)-Tolvaptan的研究还未见报道。因此，筛选具有高底物转化率和高产物光学纯度的优良转化酶类对(R)-Tolvaptan的催化合成具有重要的实用价值和现实意义。

游离酶在催化过程中不能被回收利用，并且会受到温度、pH、有机溶剂等因素的影响而导致酶活力下降，甚至丧失活性。为了提高酶的稳定性，促进其重复使用，便于连续的工业化生产，固定化酶技术被广泛应用。固定化酶的策略很多，诸如吸附法、交联法、载体结合法、包埋法。其中，应用聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)纳米微球作为载体承载各种融合蛋白进行表面展示的原位固定化策略引起了关注。该PHA微球内部是由疏水的聚酯链构成的疏水核心，其外层是由磷脂界膜及膜上嵌入或附着的PHA合酶PhaC和PHA颗粒结合蛋白PhaP等蛋白构成的边界层。PhaC通过共价键连接在PHA微球表面，而PhaP通过疏水相互作用吸附在PHA微球表面。通过将外源性功能蛋白与PhaC或PhaP进行融合表达，在重组微生物体内就能直接合成表面带有功能蛋白的PHA纳米微球复合体。由于该纳米微球在微生物细胞内是以独立的包涵体形式存在，因此通过细胞破碎及离心等方法就能简便、有效地从细胞中分离并得以纯化。鉴于PHA微球这种表面易被修饰改造的特性，多种功能蛋白可以通过与PHA微球表面蛋白(PhaC或PhaP)的融合表达，呈递在其表面，使其成为一种低成本、高效率的蛋白固定化方式。此外，PHA微球是一种可生物降解的内聚酯，进入自然界后可以被微生物完全降解，从而有效缓解固定化基质废弃物对环境的污染。

这种酶固定化的方式有以下优点：①避免了传统方法的繁琐工序，使生产成本大大减低。②酶通过疏水相互作用与载体PHA微球相连，结合牢固，不易脱落。③酶在生产的同时实现固定化，酶的空间结构未受其他物理或化学因素破坏，制得的固定化酶活力较高。④酶连接在载体外部，酶与底物结合不受限，不影响酶活性的发挥。⑤减轻了固定化酶基质的后处理过程。因此，将PHA微球应用于光学纯托伐普坦的生物合成具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用，以解决现有技术中没有合成(R)-托伐普坦的生物酶以及游离酶应用时不稳定，易受环境干扰的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种羰基还原酶基因，其基因序列如SEQ：ID：NO:1所示。

一种羰基还原酶，其所述基因编码得到，其氨基酸序列如SEQ：ID：NO:2所示。

一种重组质粒，其包含上述羰基还原酶基因，所述重组质粒为pET系列载体。

一种重组菌株，其包含上述的重组质粒，所述重组菌株为大肠杆菌。

一种固定化羰基还原酶的制备方法，包括以下步骤：

a、以PHBHHx和Fe₃O₄为原料，利用溶剂法合成PHA磁性纳米颗粒；

b、分别克隆上述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因，所述连接蛋白基因为PhaP基因，将所述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因与双酶切后的质粒进行连接，构建包含羰基还原酶基因和连接蛋白基因的重组质粒；

c、将重组质粒转化到感受态细胞中，得到包含羰基还原酶基因和连接蛋白基因的融合表达菌株，诱导所述菌株进行表达，得到融合蛋白；

d、将步骤a合成的PHA磁性纳米颗粒与融合蛋白充分混合，然后磁吸分离后即得到所述PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶。

步骤a中，将PHBHHx在50-60℃条件下溶解于二氯甲烷中，然后加入Fe₃O₄并进行超声分散；将所得液体滴加到浓度为1-3％的PVA中，混合均匀后进行旋蒸，再经离心、洗涤、冻干后得到PHA磁性纳米颗粒。

步骤b中，使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对pET28a质粒进行双酶切，将所述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因与双酶切后的pET28a质粒进行连接；步骤c中，感受态细胞为感受态的E.coli BL21(DE3)；步骤d中，PHA磁性纳米微球与融合蛋白混合方式为：在2-5℃条件下，慢速摇动混合2-4h。

上述羰基还原酶或上述制备的固定化羰基还原酶在生物合成光学纯托伐普坦中的应用。

所述光学纯托伐普坦为R型托伐普坦。

在合成光学纯托伐普坦时，在反应体系中加入辅酶NADPH和金属离子，所述金属离子为Mg²⁺或Mn²⁺。

应用游离的羰基还原酶合成光学纯托伐普坦时，反应体系pH为5.0-7.0，温度为28-50℃；应用固定化羰基还原酶合成光学纯托伐普坦时，反应体系的pH为5.0-9.0，温度为28-40℃。

本发明建立了(R)-TVP的生物催化合成路线，通过蛋白纯化技术和基因工程方法从兔肝脏中筛选出具有(R)-TVP合成能力的羰基还原酶(RLSR5)。为了进一步增强游离酶的稳定性以及重复利用率，成功合成了固定化RLSR5的聚羟基脂肪酸酯(PHA)磁性纳米微球，实现光学纯托伐普坦的高效合成。固定化酶可生物催化合成R型托伐普坦，底物浓度为2.23mM时，37℃反应12h，转化率达97％，e.e.值达到99％。和游离酶相比，固定化酶在pH为8.0缓冲体系中稳定性最好，保持较高的活性。反应温度为30℃时酶的稳定性较好，剩余酶活达到93％。固定化羰基还原酶经过10次重复使用后仍保持78.62％剩余酶活。此固定化方法有效改善了游离酶稳定性差，耐受性差，不可重复使用等缺点。为应用于工业化生产提供了更多的稳定因素，使产业化的可能性大大增加。

附图说明

图1是实施例1纯化前后酶液的SDS-PAGE蛋白电泳图。(a)兔肝脏粗酶液SDS-PAGE蛋白电泳图；(b)兔肝脏粗酶液纯化后蛋白电泳图；M：Protein Marker；lane1：未纯化的兔肝脏粗酶液；lane2：纯化后的兔肝脏粗酶液。

图2是实施例2的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA marker；1：RLSR5；2：RLSR1；3：RLSR2；4：RLSR3。

图3是实施例2诱导表达后的SDS-PAGE电泳图。(a)IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR3的SDS-PAGE检测图，M：Protein Marker；lane1未加入IPTG诱导的重组E.coliBL21(DE3)/pET28a-RLSR3；2-3加入IPTG诱导的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR3表达的破碎上清；(b)IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR1的SDS-PAGE检测图；M：ProteinMarker；lane1未加入IPTG诱导的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR1；2加入IPTG诱导的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR1表达的破碎上清；(c)IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR5的SDS-PAGE检测图；M：Protein Marker；lane1未加入IPTG诱导的重组E.coliBL21(DE3)/pET28a-RLSR5；2加入IPTG诱导的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR5表达的破碎上清。

图4是实施例2中重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR5转化PK1的HPLC分析图。a：(R)-Tolvaptan、PK1和(S)-Tolvaptan标准品；b：不含菌株的转化体系；c：E.coliBL21(DE3)/pET28a-RLSR5转化PK1体系。

图5是实施例3中Ni柱纯化后的SDS-PAGE检测图。M：Protein Marker；lane1：未加入IPTG诱导的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR5；lane2：加入IPTG诱导的重组E.coliBL21(DE3)/pET28a-RLSR5的破碎上清；lane3：纯化后目的蛋白。

图6是实施例4中pH和温度对羰基还原酶酶活影响结果图。(a)pH对酶活影响，(b)温度对酶活影响。

图7是实施例4中金属离子对羰基还原酶酶活影响结果图。

图8是实施例5中PHB磁性纳米颗粒的TEM(左)和SEM(右)图。

图9是实施例5中PhaP基因(左)与linker-RLSR5基因(右)的电泳图。

图10是实施例5中菌液PCR验证重组质粒pET28a-PhaP-linker-RLSR5的电泳图。

图11是实施例5中纯化融合蛋白PhaP-linker-RLSR5的SDS-PAGE电泳分析图。M：Protein Marker；lane1：未加入IPTG诱导的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-PhaP-linker-RLSR5；lane2：加入IPTG诱导的重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-PhaP-linker-RLSR5的破碎上清；lane3：纯化后目的蛋白。

图12是实施例6中pH和温度对固定化酶活性影响结果图。(a)pH对酶活影响，(b)温度对酶活影响。

图13是实施例6中固定化酶重复使用性测试图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中未详细说明的方法均可通过本领域常规技术手段实现。实施例中的试剂未详细标明的均为市购得到。

实施例1兔肝脏中的相关醇脱氢酶的获取

本实验室保存的新西兰兔肝粗酶液可催化合成手性托伐普坦。粗酶液经过硫酸铵盐析、DEAE阴离子交换法、Hi Trap Sephadex 6B分子排阻色谱层析、超滤管分离这四种纯化方法。纯化获得的酶液再被聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。切下被染色的条带，做蛋白质质谱检测。

结果：将纯化前后的酶液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析如图1(a)和图1(b)。从图中可观察到纯化前蛋白质的分子量主要在14.4-97.4kDa范围内，纯化后，去除了一大部分分子量较大的蛋白质，剩余有活性的酶的分子量主要分布在23-53kDa范围内。极大的缩小了筛选范围，为后续的筛选提供了极大的参考。筛选出的酶信息如表1所示。

表1筛选出的七种羰基还原酶信息

实施例2筛选并构建高效表达羰基还原酶的重组菌株

根据蛋白质谱检测报告中注释的可能为羰基还原酶的序列，使用PrimerPremier5软件进行引物设计，设计如下：

表2引物列表

解剖一只家兔，立即取出兔肝脏于RNAwait高效保护液中，防止RNAase降解RNA。取出1cm³体积的肝脏组织在研钵(DEPC水处理过)中，同时加入液氮研碎，然后在超净台中利用Trizol法提取肝脏组织的RNA。并利用试剂盒进行反转录获取兔肝脏的基因组。以反转录得到的兔肝脏基因组为模板，用已设计的引物克隆羰基还原酶基因。然后将目的片段连接到pET28a载体上，并将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。转化后，取适量菌液涂布在含100μg/mL氨苄的LB平板上，37℃避光培养，筛选阳性转化子。培养提取质粒，经测序验证后，获得重组菌株。

结果表明:

以兔肝脏cDNA为模板，利用上表引物进行羰基还原酶基因的克隆。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，如图2可以看出，通过PCR扩增，仅有4对引物可从兔肝脏基因组中克隆出目的基因。扩增得到的片段1RLSR5大约为900bp，片段长度与GenBank中PGER5(972bp)相同。泳道2中在750bp处有一很明显的条带，引物特异性良好。泳道3中得到约1000bp的单一条带，片段长度与GenBank中AKR1C29(972bp)相同。泳道4中得到约900bp的单一条带，片段长度与GenBank中PGER6(972bp)相同，通过PCR扩增成功得到了目的基因。

随机挑取Kan平板上的单菌落，选择经菌液PCR和双酶切验证为阳性克隆的菌液，接种至100mL LB培养基中，含有0.1mg/mL卡那霉素，37℃下培养4h，待菌液OD值达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mg/mL，25℃，120rpm，进行诱导表达。诱导完后8000rpm，30min收集菌体。然后用pH＝7.0的磷酸盐缓冲液PBS重悬菌体，洗去多余的培养基。经8000rpm，4℃离心30min收集洗涤后的菌体，再加入PBS缓冲液重悬菌体，超声细胞破碎仪破碎菌体，工作2s，停止5s，破碎60min，破碎完毕后12000rpm，4℃离心30min，将上清和沉淀分开收集，进行SDS-PAGE电泳分析。

结果表明：

检测结果如图3所示。从图中可以看出诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR3后表达出分子量为35kDa的蛋白质，和计算的蛋白分子量相同。从图中对比诱导E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR1前后蛋白条带，诱导后在35kDa处有一明显条带。与计算蛋白质分子量相同。如图所示诱导重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR5后在40kDa处有一明显目的条带。

为了筛选高活性的羰基还原酶重组菌株，我们以托伐普坦前手性酮(PK1)为底物，分别对构建成功的三种工程菌株进行催化活性测试，转化产物的液相色谱分析方法如下：

使用分析柱Agilent Extend C-18(4.6mm×250mm，5μm)和手性分离柱CHIRALOAKID(4.6mm×250mm，5μm)进行产物的分析。

分析柱液相条件：流动相A：含0.05％三氟乙酸水溶液，B：乙腈溶液，紫外检测波长254nm，进样量10μL，流速1mL/min，柱温30℃。梯度洗脱条件为0～14min(60％B)，14％～15min(60％～90％B)，15～20min(90％B)，20min～21min(90％～60％B)，20％～21min(60％B)。

手性分离柱液相条件：流动相A:含0.05％三氟乙酸水溶液，B：含0.05％三氟乙酸乙腈溶液，紫外检测波长254nm，进样量10μL，流速1mL/min，柱温25℃。梯度洗脱条件为0～12min(70％B)，12～13min(70％～90％B)，13％～18min(90％B)，18～19min(90％～35％B)。，19～24min(35％B)。

结果表明：

对比结果如下表3。经高效液相色谱分析如图4所示，R型托伐普坦保留时间为10.200min，托伐普坦前手性酮(PK1)保留时间为6.875min，筛选出具有较好催化活性的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-RLSR5，转化率高达91.18％，e.e.为99.0％。

表3重组菌株全细胞催化托伐普坦前手性酮活性比较

实施例3羰基还原酶RLSR5的诱导表达与纯化

挑取含有重组表达质粒的单菌落于含有100μg/mL氨苄西林的LB中过夜培养，接种菌种于2L诱导培养基中，37℃，150rpm/min培养至OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG使终浓度为0.5mmol/L，28℃诱导12h。6000rpm/min，15min离心收集菌体，用适当体积的磷酸盐缓冲液重悬后，超声破碎(工作2s，停止5s，40min，10℃，30％功率)。离心(12000rpm/min，30nin)取上清液，分别以上清液、沉淀为蛋白样品经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，记录并分析结果。

利用HisTrap^TM Hp(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)和蛋白纯化系统(

pure；GE Healthcare)纯化重组蛋白RLSR5。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Sangon Biotech(Shanghai)Co.，Ltd。)测定重组蛋白质的浓度。蛋白经SDS-PAGE检测纯度并测序。

结果表明：

蛋白纯化SDS-PAGE结果如图5所示。工程菌株诱导前没有明显的表达，IPTG诱导后在40kDa处有明显的目的条带。经过Ni柱蛋白纯化后得到分子量为40kDa的羰基还原酶，与预期计算结果相同，其氨基酸序列如序列表所示。

实施例4羰基还原酶的酶学性质研究

使用BCA蛋白质测定试剂盒(Sangon Biotech(Shanghai)Co.，Ltd。)测定重组蛋白质的浓度。通过在酶标仪(Synergy HT；BioTek，Winooski，VT，USA)上测量340nm处NADPH吸光度1min内的变化来计算RLSR5的活性。酶活检测的反应体系(0.25mL)包括0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，NADPH或NADH，托伐普坦前酮和适当的酶。为检测不同pH对酶催化活性的影响，加入不同pH的缓冲溶液185μL，底物(89μM)，NADPH(239μM)，静置1im后加入适量纯酶液，立即使用酶标仪将所有样品同时检测340nm处吸光值变化，测试10min，每一分钟检测一次。为确定酶最适反应温度，以0.1M pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液作为缓冲体系。分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下对纯化的羰基还原酶测定最佳反应温度，反应体系及检测方法同上。研究不同金属离子对酶催化活性的影响需配置含有2mM Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Na²⁺、K²⁺、Mg²⁺的最佳缓冲溶液。先在冰上加入含有金属离子的缓冲液、辅酶NADPH和底物，最后用排枪向各样品加入适量纯酶液。在最佳反应温度和pH值下进行反应，迅速用酶标仪测试340nm吸收值的变化，测试10min，每一分钟测一次。

上述条件下，每分钟消耗1μmolNADPH所需要的酶活力为1个U。根据340nm吸收值的变化，计算出NADPH浓度的变化。或根据公式计算酶活力

酶活计算公式如下：

上述公式中各字母代表含义：V(mL)代表反应体系总体积，ΔA代表吸光度差值，b(cm)代表比色皿光呈。ε代表NADPH的摩尔消光系数6.22×10³L·mol^-1·cm^-1。

结果表明：

BCA法测定得到羰基还原酶浓度为0.704mg/mL。酶活检测得出羰基还原酶酶活为2.12U，比酶活为26.5U/mL。通过比较加入不同辅酶时吸光度的改变得出结论：加入NADPH时，羰基还原酶表现出较高的活性，酶活达到2.12U。而加入NADH的酶促反应，没有表现出活性，说明该羰基还原酶在生物催化合成手性托伐普坦时依赖辅酶NADPH。

羰基还原酶在pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲溶液中参加酶促反应的结果如图6(a)。从图中可以看出，该酶的最佳反应pH为6.0。在pH为3.0时，该酶几乎没有活性。在pH为3.0-6.0之间，酶活逐渐升高，在pH为6.0时达到最大酶活。在pH为8.0时，该酶几乎又没有了活性。不同温度对酶催化活性的影响如图6(b)。从图中可以看出，20℃-30℃温度上升过程中，酶活力迅速升高，在30℃达到最大酶活。在30℃-60℃温度继续升高时，酶活力在逐渐下降。因此，最佳反应温度为30℃。

由图7可知，金属离子对酶活性有明显影响。其中起到了促进作用的金属离子为Mg²⁺、Mn²⁺，Mn²⁺对酶活性的促进作用最大。具有一定抑制作用的金属离子为Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn² ⁺，其中Zn²⁺对酶活性抑制作用最大，其他离子的抑制作用不明显。

实施例5PHA磁性纳米颗粒的合成及其固定化羰基还原酶

PHA磁性纳米颗粒的合成：

9mL二氯甲烷中加入200mg PHBHHx，在55℃水浴锅中水浴至PHBHHx溶解，加入40mg粒径为20nm的亲油四氧化三铁后超声分散均匀。将上述液体边超声边滴加到40ml1％PVA中，先用均质机混合均匀，然后用细胞破碎仪80％功率超声1h(低温下)。超声完之后低温旋蒸，12000rpm，离心旋蒸后液体30min，除去上清液，留下沉淀。水洗沉淀4次，磁吸分离，1M盐酸洗3次，再水洗3次，冻干，收集PHA磁性纳米颗粒。将合成好的PHA磁性纳米微球经过多次洗涤之后，重悬于纯水中，不要冻干，将样品稀释后超声分散，滴加在铜网上，过夜晾干。使用透射电镜(TEM)观察颗粒内部。

结果：

由上述方法合成了PHA磁性纳米颗粒，如图8，总体来看，磁性粒子少量分布在PHA微球的表面，磁性粒子在PHA内部有部分团聚。随着磁性粒子的加入，微球的粒径变大。使用扫描电镜(SEM)观察颗粒整体形貌如图8，磁性颗粒为珍珠状表面光滑的球，该条件下合成的PHB磁性纳米颗粒形貌完整，有少量聚团出现，粒径大小为500nm，且磁性粒子大多分布在纳米颗粒内部，为最佳的合成方法。

PHA微球固定化羰基还原酶：

PhaP基因的克隆

PhaP基因的克隆过程如下：

各组分加入至0.2mL离心管，冰上操作。反应条件为：

完成反应后使用PCR仪进行4℃保温。

linker-RLSR5基因的克隆

linker-RLSR5基因的克隆过程如下：

各组分加入至0.2mL离心管，冰上操作。反应条件为：

完成反应后使用PCR仪进行4℃保温。

完成PCR反应后，将PCR产物染色进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。通过凝胶成像仪观察，切下目的条带并回收DNA，进行测序。

结果表明：

PCR产物的电泳结果如下图9。从下图9可以看出在500bp处有一明显条带，与PhaP理论大小基本一致。测序结果也显示序列一致性为100％。在1000bp处出现一条明显的主带，经过测序分析，成功克隆linker-PhaP基因，基因序列大小为1017bp。可用于后续重组质粒的构建。

PhaP-linker-RLSR5融合蛋白表达体系构建及蛋白纯化：

使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对pET28a质粒进行双酶切，并使用胶回收试剂盒获取酶切产物。将上述中中测序正确的PhaP和RLSR5基因与双酶切的pET28a质粒进行连接。

连接体系如下：

16℃连接50min，使用PCR仪控温。反应完毕后转化到感受态细胞中。利用菌液PCR和酶切来验证筛选阳性菌株。

将阳性重组质粒pET28a-PhaP-linker-RLSR5的菌液接种于1L无菌LB培养基中，加入1mL 50mg/mL的卡那霉素水溶液。37℃，120rpm下培养4h，菌株发酵至OD值为0.6～0.8。加入1mL的0.5M IPTG进行诱导表达，25℃继续培养8h。使用高速离心机将菌液离心，收集菌体沉淀。使用缓冲液清洗菌体2-3遍。使用Ni-NTA树脂进行蛋白质纯化。按照前述方法进行纯化。纯化后使用SDS-PAGE来做分析。

结果表明：

由图10可以看出大约在1000-1200bp有一明显的主条带，因此将其胶回收后进行测序，测序结果显示该基因序列大小为1539bp。与理论基因片段大小一样，说明成功构建重组质粒pET28a-PhaP-linker-RLSR5。

SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化结果如图11所示。未加入IPTG时60kDa处没有条带，加入IPTG诱导后在60kDa处有明显的的蛋白表达。与预期分子量相同。因此可以认为重组质粒可在E.coli BL21(DE3)中成功表达。通过Ni-NTA亲和层析进行融合蛋白纯化，得到纯净的融合蛋白，PhaP-linker-RLSR5融合蛋白分子量为60kDa。

PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶

通过溶剂挥发法制备PHA磁性纳米颗粒。将洗涤干净的PHA磁性纳米微球冻干。精密称量4mg磁性纳米微球于无菌离心管中，加入纯化后的融合蛋白PhaP-linker-RLSR5 500μL，放置于4℃，慢速摇动3h，静置1h，使蛋白和磁性纳米微球充分结合，然后进行磁吸分离，即得到固定化酶。弃掉上清液，加入缓冲液反复洗涤固定化酶，洗涤干净以保证后续实验的准确性。磁吸分离后的固定化酶复合体用于后续的催化还原反应。

将吸取出的上清液测定其蛋白浓度，与吸附之前浓度对比。计算出PHA磁性纳米微球的固载量。计算公式如下：

其中C₁代表吸附前蛋白浓度(mg/mL)；C₂代表固定化后上清蛋白浓度(mg/mL)；V代表加入酶液的体积；m代表固定化载体质量。

结果表明：

首先通过溶剂挥发法合成固定化酶载体-PHA磁性纳米颗粒，然后将融合蛋白PhaP-linker-RLSR5与固定化酶载体混合，形成固定化酶体系，固定化过程如图所示。通过BCA法测定固定化前融合蛋白浓度为1.653mg/mL，固定化后浓度为0.025mg/mL。根据固载量公式计算得出，PHA磁性纳米微球固定化PhaP-linker-RLSR5融合蛋白固载量达到203.5mg/g。

实施例6固定化酶稳定性研究

固定化酶pH和温度稳定性研究

所用缓冲溶液为：pH3.0、4.0、5.0(0.1M乙酸-乙酸钠)；pH6.0、7.0(0.1M磷酸氢二钾-磷酸二氢钾)；pH8.0 0.1MTris-HCl。向4mg PHA磁性纳米微球固定化PhaP-linker-RLSR5的复合体中加入不同pH的缓冲溶液400μL，于4℃放置4h，然后加入NADPH(1.3mM)和底物(2.23mM)，迅速使用酶标仪检测340nm处吸收值变化，每一分钟检测一次，并记录分析。根据相对酶活，得到固定化酶的pH稳定性曲线。

结果表明：

如图12所示，显示了固定化羰基还原酶在不同缓冲溶液中的pH稳定性。从图中可以看出在pH 3.0 0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液中丧失活性，随着pH的增大酶活力在上升。在pH为5.0-6.0时出现活性降低，是由于pH为5.0和6.0时所用缓冲体系不同，缓冲体系的成分发生了改变，影响了固定化酶的稳定性，所以相对酶活性发生改变。在pH为8.0 0.1M Tris-HCl缓冲体系中达到最大酶活。从研究数据可以看出与其他缓冲体系相比，在pH8.0 0.1MTris-HCl缓冲体系中稳定性最好。与游离酶相比，固定化酶pH稳定性更好。

向上述PHA磁性纳米微球固定化PhaP-linker-RLSR5的复合体中加入最佳pH的缓冲溶液400μL，置于温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃水浴锅中放置4h，然后加入NADPH和底物，迅速使用酶标仪检测340nm处吸收值变化，每一分钟检测一次，并记录分析。计算相对酶活，得到固定化酶的温度稳定性曲线。

结果表明：

如图12显示了固定化酶在不同温度中参加反应时的温度稳定性。从图中可以看出在温度为20℃时相对酶活大约为75％，可能是由于温度比较低，没有达到酶的最佳温度导致的。当温度达到30℃时相对酶活达到最大。随着温度的上升，酶活在逐渐降低，当温度为60℃时，由于温度过高破坏了酶的空间结构，导致几乎丧失活性。经过对比发现，固定化酶在30℃的环境中稳定性最好，与游离酶相比，固定化酶的温度稳定性更好。

固定化酶重复使用性研究

在最佳反应条件下测试固定化酶在不对称合成R型托伐普坦中的可重复性如图13。将上述吸附PhaP-linker-RLSR5的PHA磁性纳米微球用缓冲溶液清洗3遍。催化反应体系为1mL，包括辅酶NADPH(1.3mM)，加入最佳pH缓冲溶液400μL，底物(2.23mM)。37℃，130rpm反应12h。反应完毕后取100μL反应液，再加入400μL乙腈，震荡、离心、过膜后进行HPLC检测反应。检测结果为首次使用固定化酶的催化能力。反应完毕后，通过磁吸分离收集固定化酶，并用缓冲溶液清洗两次，采用相同的反应体系用于后续重复使用性研究。过中使用酶标仪检测340nm处吸收值变化，并记录分析。计算相对酶活，得到固定化酶的重复使用性。

结果表明：

经HPLC检测PHA磁性纳米微球固定化酶可生物催化合成R型托伐普坦，底物浓度2.23mM时，转化率为97％，e.e.值达到99％。并回收固定化酶用于重复使用性研究，结果如图所示，制备的PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶经过10次循环使用后，仍然保持78.62％的酶活。这一结果表明固定化酶利用价值明显优于游离酶，可循环使用多次，并保持了良好的稳定性。

序列表

<110> 河北大学

<120> 羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> 兔(leporidae)

<400> 1

atggatccga aataccagcg tgttgcgctg tccgatggtc acttcatccc ggttctgggt 60

ttcggcacct atgctccgga agaagttccg aaatctaaag cactggaatc taccaaaatc 120

gcgatcgacg cgggtttccg ccacatcgat agcgcgtatc tgtacaacaa cgaagaagaa 180

gttggtctgg cgatccgttc taaaatcgcg gaaggcaccg ttaaacgcga agacatcttc 240

tacacctcta aactgtggtg caccttccat cgtccggaac tggttcgtcc gggcctggaa 300

gaaagcctga aaaaactgca gctggactac gttgatctgt atatcatcca cttcccgacc 360

gctctgaaac cgggcgaaga aatcattccg accgatgaac acggcaaaac catttttgat 420

accgttgata tctgcgcgac ctgggaagcg atggaaaaat gcaaagacgc aggtctggct 480

aaaagcatcg gcgtttccaa cttcaaccgt cgtcagctgg aaatgatcct gaacaaaccg 540

ggcctgaaat acaaaccggt ttgcaaccag gttgaatgtc acccgtatct gaaccagagc 600

aaactgctgg aattttgcaa atctaaaggt atcgttctgg ttgcgtacag cgcgctgggt 660

agccaccgcg aaccgaaatg ggtggatcag tcctctccgg tgctgctgga agacccggtt 720

atcggcgctc tggcgaaaaa acacaaacgt agcccggcgc tgatcgcgct gcgttaccag 780

ctgcagcgcg gtgttgttgt gctggcgaaa tctttcaccg aaaaacgtat caaagaaaac 840

atccagatct tcgaatttac cctgccgccg gacgacatga aagttctgga tggcctgaac 900

cgtaacgttc gttacatcac cgcggacttc gcgaccggcc acccgaacta tccgttcagc 960

gatgaatact aa 972

<210> 2

<211> 323

<212> PRT

<213> 兔(leporidae)

<400> 2

Met Asp Pro Lys Tyr Gln Arg Val Ala Leu Ser Asp Gly His Phe Ile

1 5 10 15

Pro Val Leu Gly Phe Gly Thr Tyr Ala Pro Glu Glu Val Pro Lys Ser

20 25 30

Lys Ala Leu Glu Ser Thr Lys Ile Ala Ile Asp Ala Gly Phe Arg His

35 40 45

Ile Asp Ser Ala Tyr Leu Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Val Gly Leu Ala

50 55 60

Ile Arg Ser Lys Ile Ala Glu Gly Thr Val Lys Arg Glu Asp Ile Phe

65 70 75 80

Tyr Thr Ser Lys Leu Trp Cys Thr Phe His Arg Pro Glu Leu Val Arg

85 90 95

Pro Gly Leu Glu Glu Ser Leu Lys Lys Leu Gln Leu Asp Tyr Val Asp

100 105 110

Leu Tyr Ile Ile His Phe Pro Thr Ala Leu Lys Pro Gly Glu Glu Ile

115 120 125

Ile Pro Thr Asp Glu His Gly Lys Thr Ile Phe Asp Thr Val Asp Ile

130 135 140

Cys Ala Thr Trp Glu Ala Met Glu Lys Cys Lys Asp Ala Gly Leu Ala

145 150 155 160

Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Asn Arg Arg Gln Leu Glu Met Ile

165 170 175

Leu Asn Lys Pro Gly Leu Lys Tyr Lys Pro Val Cys Asn Gln Val Glu

180 185 190

Cys His Pro Tyr Leu Asn Gln Ser Lys Leu Leu Glu Phe Cys Lys Ser

195 200 205

Lys Gly Ile Val Leu Val Ala Tyr Ser Ala Leu Gly Ser His Arg Glu

210 215 220

Pro Lys Trp Val Asp Gln Ser Ser Pro Val Leu Leu Glu Asp Pro Val

225 230 235 240

Ile Gly Ala Leu Ala Lys Lys His Lys Arg Ser Pro Ala Leu Ile Ala

245 250 255

Leu Arg Tyr Gln Leu Gln Arg Gly Val Val Val Leu Ala Lys Ser Phe

260 265 270

Thr Glu Lys Arg Ile Lys Glu Asn Ile Gln Ile Phe Glu Phe Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Asp Asp Met Lys Val Leu Asp Gly Leu Asn Arg Asn Val Arg

290 295 300

Tyr Ile Thr Ala Asp Phe Ala Thr Gly His Pro Asn Tyr Pro Phe Ser

305 310 315 320

Asp Glu Tyr

Claims

1.一种羰基还原酶在生物合成光学纯托伐普坦中的应用，其特征在于，所述羰基还原酶由序列如SEQ：ID：NO:1所示的基因编码得到, 所述光学纯托伐普坦为R型托伐普坦。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在合成光学纯托伐普坦时，在反应体系中加入辅酶NADPH和金属离子，所述金属离子为Mg²⁺或Mn²⁺。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用游离的羰基还原酶合成光学纯托伐普坦时，反应体系pH为5.0-7.0，温度为28-50℃；应用固定化羰基还原酶合成光学纯托伐普坦时，反应体系的pH为5.0-9.0，温度为28-40℃。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羰基还原酶为固定化羰基还原酶，所述固定化羰基还原酶通过以下方法制备得到：

a、以PHBHHx和Fe₃O₄为原料，利用溶剂挥发法合成PHA磁性纳米微球；

b、分别克隆羰基还原酶基因和连接蛋白基因，所述连接蛋白基因为PhaP基因，将所述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因与双酶切后的质粒进行连接，构建包含羰基还原酶基因和连接蛋白基因的重组质粒；

d、将步骤a合成的PHA磁性纳米微球与融合蛋白充分混合，然后磁吸分离后即得到所述固定化羰基还原酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤a中，将PHBHHx在50-60℃条件下溶解于二氯甲烷中，然后加入Fe₃O₄并进行超声分散；将所得液体滴加到浓度为1-3%的PVA中，混合均匀后进行旋蒸，再经离心、洗涤、冻干后得到PHA磁性纳米颗粒；步骤b中，使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对pET28a质粒进行双酶切，将所述的羰基还原酶基因和连接蛋白基因与双酶切后的pET28a质粒进行连接；步骤c中，感受态细胞为感受态的E.coli BL21（DE3）；步骤d中，PHA磁性纳米颗粒与融合蛋白混合方式为：在2-5℃条件下，慢速摇动混合2-4h。