CN112779232B - 一种手性胺醇化合物的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种手性胺醇化合物的合成方法。本发明所提供的包括胺脱氢酶的生物材料在如下A1—A6)至少一种中的应用；A1)催化1‑羟基‑2‑丁酮生成(S)‑2‑氨基‑1‑丁醇；A2)催化4‑羟基‑2‑丁酮生成(R)‑3‑氨基‑1‑丁醇；A3)合成或制备手性胺醇化合物；A4)合成或制备2‑氨基‑1‑丁醇和3‑氨基‑1‑丁醇；A5)合成或制备(S)‑2‑氨基‑1‑丁醇和(R)‑3‑氨基‑1‑丁醇；A6)催化羟基酮底物生成胺醇化合物；实验证明，本发明所提供的方法反应条件温和，立体选择性好，收率高，操作简单等优点。

Description

一种手性胺醇化合物的合成方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种手性胺醇化合物的合成方法。

背景技术

手性胺醇是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工中间体，其中(S)-2-氨基丁醇是重要医药中间体，主要用于合成盐酸乙胺丁醇(Ethambutol)，长期以来被用作抗结核杆菌一线药使用(Wilkinson et al.,1961；Pablos-Mendez et al.,1998)。(R)-3-氨基丁醇是合成新药度鲁特韦(Dolutegravir)的重要原料(CN:102245572A，CN:101212903A)。度鲁特韦是由葛兰素史克公司研究开发的抗艾滋病整合酶抑制剂。

目前(S)-2-氨基丁醇化学合成方法有：以丁醛、偶氮二甲酸二卞酯和D-脯氨酸为原料，在NaBH₄、H₂和镍等催化作用下合成(S)-2-氨基丁醇(Kotkar&Sudalai，Tetrahedron:Asymmetry,2006,17(11):1738-1742)；用氢化铝锂还原2-氨基丁酸获得相应的手性胺醇产物(Doherty&Shapira,J Org Chem,1963,28(5):1339-1342)；采用H₂和镍在高压条件下还原L-2-氨基丁酸获得(S)-2-氨基丁醇(CN:105481703A)；或者采用NaHB₄在H₂SO₄/THF条件下还原相应的α-氨基酸获得(Li et al.,J Agr Food Chem，2016,64(46):8927-8934)；联苯甲酰酒石酸拆分法(Periasamy et al.,Synthesis-Stuttgart,2003(13):1965-1967)；L-酒石酸拆分法(Zhao et al.,J Heterocyclic Chem，2012,49(4):943-946)。

目前(R)-3-氨基丁醇主要是由国外厂家通过化学合成法生产，收率为60％～70％，它在国内的市场属于空白。1998年，Tatsuya等报道了一种合成(R)-3-氨基丁醇的方法,但该方法中原料的价格昂贵，反应条件苛刻(Tatsuya et al.,Tetrahed.Lett.，1988，29(2):231-234)；2005年，Achmatowicz等规避了昂贵的化学原料，以廉价易得的D-丙氨酸为起始原料合成(R)-3-氨基丁醇，但没有报道具体产率和ee值(Achmatowicz et al.,2005，61(38):9031-9041)。2011年，Breuer等报道了利用扁桃酸来拆分消旋的3-氨基丁醇得到(R)-3-氨基丁醇的方法(US:2011/0275855A1)。

(S)-2-氨基丁醇的生物合成方法有：在氨基基团保护的情况下，由脂肪酶选择性水解羟基形成的酯键而获得手性单体(Francalanci et al.,J Org Chem，1987,52(23):5079-5082)；固定化青霉素G酰化酶选择性水解N-苯乙酰衍生2-氨基丁醇外消旋混合物中的(S)-构型获得(S)-2-氨基丁醇(Fadnavis et al.,Tetrahedron:Asymmetry,1999,10(23):4495-4500)；2017年，Weber等报道了利用酵母构建一条从苏氨酸通过四步酶法合成(S)-2-氨基丁醇的新途径,但是(S)-2-氨基丁醇的产量只有1.1mg/L(Weber et al.,2017)。2019年，Zhang等报道了通过环氧水解酶、醇脱氢酶和转氨酶多酶级联反应“一锅法”合成(S)-2-氨基丁醇,但是转化率比较低，不到50％(Zhang et al,Catal.Sci.Technol,2019,9,70)。

(R)-3-氨基丁醇生物合成方法主要由转氨酶催化合成，2014年，范文超等报道了一种(R)-3-氨基丁醇的生物制备方法(CN:104131048A)；2018年，Khatik等通过一种具有高选择性的转氨酶，以4-羟基-2-丁酮为原料，一步合成(R)-3-氨基丁醇(WO:2018/020380A1)。

以上(S)-2-氨基-1-丁醇和(R)-3-氨基丁醇的合成方法，化学法需要高温、高压和金属催化剂，反应条件苛刻，污染大，安全系数低。生物法反应条件温和，立体选择性好，但转化率仅50％，且收率低。生物方法比较少，因此通过新酶催化非天然底物合成手性胺醇化合物具有重要的科学意义和应用价值。

发明内容

为了合成手性胺醇化合物，本发明提供了如下技术方案：

本发明一个目的是提供生物材料在如下A1—A6)至少一种中的应用或在制备具有A1—A6)至少一种功能的产品中的应用；

A1)催化1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇；

A2)催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇；

A3)合成或制备手性胺醇化合物；

A4)合成或制备2-氨基-1-丁醇和3-氨基-1-丁醇；

A5)合成或制备(S)-2-氨基-1-丁醇和(R)-3-氨基-1-丁醇；

A6)催化羟基酮底物生成胺醇化合物；

所述生物材料为如下B1或B2或B3:

B1、胺脱氢酶，B2、编码所述胺脱氢酶的核酸分子，B3、含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物；

所述胺脱氢酶为如下C1-C8任一种：

C1、序列表中序列4所示的蛋白，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstereothermophilus)的胺脱氢酶BsAmDH1；

C2、序列表中序列12所示的蛋白，球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)的胺脱氢酶LsAmDH1；

C3、序列表中序列2所示的蛋白，来源于西伯利亚微杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)的胺脱氢酶EsAmDH；

C4、序列表中序列6所示的蛋白，普通高温放线菌(Thermoactinomycesintermedius)的胺脱氢酶TiAmDH；

C5、序列表中序列8所示的蛋白，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereusBacilluscereus ATCC 14579)的胺脱氢酶BcAmDH；

C6、序列表中序列10所示的蛋白，嗜冷芽孢八叠球菌(Sporosarcinapsychrophila)的胺脱氢酶SpAmDH；

C7、将C1-C6任一所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质；

C8、C1-C7任一所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。

上述C8中的标签用于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白。

所述标签可为下表中所示的标签中的任一：

表1融合表达蛋白标签

上述应用中，

进一步的，B3所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述胺脱氢酶的DNA，该DNA不但可包括启动胺脱氢酶编码基因转录的启动子，还可包括胺脱氢酶编码基因转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

B3所述的核酸分子的重组载体可为携带有所述胺脱氢酶编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-24a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

B3所述的含有编码上述胺脱氢酶的核酸分子的重组微生物可为携带有所述胺脱氢酶编码基因的酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌等。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述重组载体为将所述核酸分子插入表达载体中得到的载体。

在上述应用中，所述胺脱氢酶以粗酶液、粗酶液冻干粉、全细胞或纯酶的形式发生催化作用。进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述胺脱氢酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。所述全细胞可按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述胺脱氢酶，得到的重组细胞即为所述全细胞。

再进一步，所述重组细胞具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：向所述宿主细胞导入能够表达所述胺脱氢酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述胺脱氢酶的所述重组细胞。

更进一步，所述“能够表达所述胺脱氢酶的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有所述胺脱氢酶的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-24a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

更进一步的，所述胺脱氢酶的编码基因是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。其中，所述重组载体可为携带有所述胺脱氢酶的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-24a等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将所述胺脱氢酶的编码基因替换pET-21b、pET-22b、pET-24a或pET-28a的NdeI和XhoI酶切位点之间的小片段后得到的重组质粒。

在所述方法中，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。

进一步的，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。

更进一步的，所述宿主细胞具体为大肠杆菌。

在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.05-1.0mmol/L(如0.1mmol/L)，20-30℃(如20℃)诱导培养10-20小时(如12小时)。

上述应用中，所述羟基酮底物为1-羟基-2-丁酮或4-羟基-2-丁酮；

所述胺醇化合物或所述手性胺醇化合物为(S)-2-氨基-1-丁醇或(R)-3-氨基-1-丁醇。

本发明另一个目的是提供一种合成或制备胺醇化合物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述生物材料催化羟基酮底物，生成胺醇化合物。

上述方法中，所述羟基酮底物为1-羟基-2-丁酮或4-羟基-2-丁酮；

所述胺醇化合物为(S)-2-氨基-1-丁醇或(R)-3-氨基-1-丁醇。

上述方法中，在以所述胺脱氢酶作为生物酶催化所述底物生成(S)-2-氨基-1-丁醇的反应中，反应体系中除了含有所述底物和所述胺脱氢酶外，还可含有胺脱氢酶的辅酶。

进一步的，所述辅酶可为NADP⁺或NAD⁺。

所述底物在所述反应体系中浓度为1-100mmol/L(如10mmol/L)；所述胺脱氢酶粗酶粉在所述反应体系中浓度为1-30g/L(如10g/L)；所述胺脱氢酶全细胞在所述反应体系中的浓度为50-500g/L(如100g/L)；所述胺脱氢酶纯酶在所述反应体系中的浓度为0.1-2g/L(如0.5g/L)；所述NADP⁺或所述NAD⁺在所述反应体系中的浓度为0.1-2.0mmol/L(如1.0mmol/L)，所述NH₄ ⁺浓度为100mmol～4mol。

所述缓冲液范围为pH 6-11，优选范围为8-10。

所述反应的温度可为20-70℃，具体可为20-65℃；所述反应的时间以反应完全为准，一般可为0.5-24小时，具体可为12小时。

不对称还原反应体系由如下组成：底物1-羟基-2-丁酮或4-羟基-2-丁酮10mmol/L、表达各个胺脱氢酶的全细胞100g/L、NAD⁺(以氧化型辅酶I水溶液形式存在)1mmol/L、GDH粗酶粉2g/L，葡萄糖100mmol/L，溶菌酶1g/L，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL，1mol/L的氯化铵/氨水缓冲液，余量为超纯水。

上述方法中，所述生物材料为序列4所示的蛋白或含有编码序列4所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为55℃，对应的催化反应pH值为9；

或所述生物材料为序列12所示的蛋白或含有编码序列12所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为55℃，对应的催化反应pH值为8.5；

或所述生物材料为序列2所示的蛋白或含有编码序列2所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为50℃，对应的催化反应pH值为8.5；

或所述生物材料为序列6所示的蛋白或含有编码序列6所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为45℃，对应的催化反应pH值为8.5；

或所述生物材料为序列8所示的蛋白或含有编码序列8所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为50℃，对应的催化反应pH值为8.5；

或所述生物材料为序列10所示的蛋白或含有编码序列10所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为50℃，对应的催化反应pH值为8.5。

上述第一个目的中的生物材料也是本发明保护的范围。

本发明还有一个目的是提供一种合成或制备胺醇化合物的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括第一个目的中的所述生物材料和羟基酮底物。

上述试剂盒中，还包括胺脱氢酶的辅酶；进一步的，所述辅酶可为NADP⁺或NAD⁺。

所述羟基酮底物为1-羟基-2-丁酮或4-羟基-2-丁酮；

所述胺醇化合物为(S)-2-氨基-1-丁醇或(R)-3-氨基-1-丁醇。

本发明从实验室构建的胺脱氢酶库中，筛选获得能够高效催化合成(S)-2-氨基-1-丁醇和(R)-3-氨基-1-丁醇的胺脱氢酶，其中，所述胺脱氢酶为来源于西伯利亚微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus)、普通高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)、蜡样芽孢杆菌(BacilluscereusBacillus cereus ATCC 14579)、嗜冷芽孢八叠球菌(Sporosarcina psychrophila)和球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)的胺脱氢酶。并考察pH、温度等对胺脱氢酶的影响，优化全细胞，粗酶液及其纯酶催化酮不对称还原胺化合成手性胺醇化合物的反应体系和反应条件；为特定种类手性胺醇的工业化制备提供了思路和依据。本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，收率高达80％以上；设备简单，在生物催化制备手性胺醇化合物具有较好的工业应用前景。

附图说明

图1为胺脱氢酶在20℃,0.1mM IPTG诱导条件下的蛋白SDS-PAGE检测图。

图2为胺脱氢酶催化还原1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇示意图。

图3为胺脱氢酶催化还原1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇和4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇反应的HPLC检测结果图谱。

图4为6个胺脱氢酶纯化后的SDS-PAGE检测图。

图5为pH对胺脱氢酶酶活性的影响；△:BsAmDH1,◇:TiAmDH,□:BcAmDH,○:SpAmDH,×:LsAmDH1,*:EsAmDH。

图6为温度对胺脱氢酶酶活性的影响；△:BsAmDH1,◇:TiAmDH,□:BcAmDH,○:SpAmDH,×:LsAmDH1,*:EsAmDH。

图7为胺脱氢酶粗酶液放大放应生物转化效率图；△:BsAmDH1,◇:TiAmDH,□:BcAmDH,○:SpAmDH,×:LsAmDH1,*:EsAmDH。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、生物催化制备手性胺醇化合物的胺脱氢酶的筛选

一、表达胺脱氢酶的重组菌的制备

1、表达胺脱氢酶的重组质粒

表达胺脱氢酶的重组质粒为将表2胺脱氢酶库中各个胺脱氢酶的编码基因(表2第5列)替换其对应的表达载体(表2第3列)的NdeI和XhoI位点间的DNA分子，得到的载体，该载体表达由各个胺脱氢酶C端融合His标签的重组蛋白。

pET22b、pET28a、pET24a、pET21b这些载体上面均带有his标签，pET22b、pET21b是氨苄抗性，pET28a、pET24a是卡那抗性。

表2为胺脱氢酶库信息表

2、表达胺脱氢酶的重组菌

将上述1制备的各个重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到表达胺脱氢酶的重组菌。

将空载体pET22b、pET28a、pET24a、pET21b分别转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到表达pET22b的重组菌、表达pET28a的重组菌、表达pET24a的重组菌、表达pET21b的重组菌。

3、胺脱氢酶的诱导表达

将上述2得到的表达胺脱氢酶的重组菌接入含有50μg/mL卡那霉素(对应载体pET28a、pET24a)或100μg/mL氨苄霉素(对应载体pET22b、pET21b)的5mL LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡过夜12h，再按照体积百分含量1％接种量分别接种到含有50μg/mL卡那霉素或100μg/mL氨苄霉素的的TB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.7时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃、220rpm诱导表达12h后，4℃、4，000rpm离心10min，收集沉淀菌体，并将收集的菌体用磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7.4)重悬得到表达各个胺脱氢酶的全细胞，即为表达重组EsAmDH的全细胞、表达重组BsAmDH1的全细胞、表达重组TiAmDH的全细胞、表达重组BcAmDH的全细胞、表达重组BsAmDH2的全细胞、表达重组SpAmDH的全细胞、表达重组LsAmDH1的全细胞、表达重组CtAmDH的全细胞、表达重组GtAmDH的全细胞、表达重组LsAmDH2的全细胞、表达重组BbAmDH的全细胞、表达重组CsAmDH的全细胞、表达重组CCaAmDH的全细胞，浓度均为500g/L。

各个胺脱氢酶的全细胞取部分进行超声破碎，收集上清、沉淀，将全细胞、上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。

部分检测结果如图1所示，M:蛋白marker,(a):1，2，3泳道分别代表阴性对照pET24a的全细胞，上清，沉淀；4，5，6泳道分别代表重组EsAmDH的全细胞，上清，沉淀；(b):1，2，3泳道分别代表重组BsAmDH1的全细胞，上清，沉淀；4，5，6泳道分别代表重组TiAmDH的全细胞，上清，沉淀；7，8，9泳道分别代表重组BcAmDH的全细胞，上清，沉淀；(c):1，2，3泳道分别代表重组SpAmDH的全细胞，上清，沉淀；4，5，6泳道分别代表重组LsAmDH1的全细胞，上清，沉淀；可以看出，阴性对照pET24a的全细胞，上清，沉淀均无目的蛋白条带；重组EsAmDH的全细胞，上清均有目的蛋白条带，蛋白的相对分子质量为41KD；重组BsAmDH1的全细胞，上清均有目的蛋白条带，蛋白的相对分子质量为47KD；重组TiAmDH的全细胞，上清均有目的蛋白条带，蛋白的相对分子质量为41KD；重组BcAmDH的全细胞，上清均有目的蛋白条带，蛋白的相对分子质量为40KD；重组SpAmDH的全细胞，上清均有目的蛋白条带，蛋白的相对分子质量为40KD；重组LsAmDH1的全细胞，上清均有目的蛋白条带，蛋白的相对分子质量为40KD。

二、生物催化制备手性胺醇化合物的胺脱氢酶

图2为胺脱氢酶催化还原1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇示意图。

分别挑取上述一得到的表达各个胺脱氢酶的全细胞分别对2种底物1-羟基-2-丁酮和4-羟基-2-丁酮进行粗酶催化反应，实现胺脱氢酶库筛选。

上述粗酶催化反应采用如下不对称还原反应体系进行：

不对称还原反应体系由如下组成：底物1-羟基-2-丁酮或4-羟基-2-丁酮10mmol/L、上述一得到的表达各个胺脱氢酶的全细胞100g/L、NAD⁺(以氧化型辅酶I水溶液形式存在)1mmol/L、GDH粗酶粉2g/L，葡萄糖100mmol/L，溶菌酶1g/L(购买于北京索莱宝科技有限公司，CAS:12650-88-3,酶活为20000U/mg)，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL(购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，CAS:9003-98-9，酶活为2000U/mg)，1mol/L的氯化铵/氨水缓冲液(pH 8.7，氯化铵和氨水等摩尔比混合得到)、余量为超纯水。

上述GDH粗酶粉为葡萄糖脱氢酶，能够催化底物葡萄糖和NAD⁺生成葡萄糖酸和NADH,加该酶是为了达到辅酶NADH再生的目的，该酶按照如下方法制备：

将葡萄糖脱氢酶基因(编码基因的核苷酸序列为序列13)整合到pET24a载体NdeI和XhoI酶切位点上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，菌体破碎后离心，将上清液置于冷冻干燥机中获得GDH粗酶粉。

检测GDH粗酶粉，比酶活为2.04U/mg，酶活测定方法如下：

通过监测NADH在340nm处吸光度的增加或减少来计算酶活，酶活定义：在pH为8.7、温度为30℃，底物为1mmol/L NAD⁺，10mmol/L的葡萄糖的条件下，每分钟内转化产生或消耗1μM NADH所需要的酶量。酶活计算公式：酶活(U)＝EW×V×103/(6220×0.3)，式中，EW表示每分钟内340nm处吸光值的变化，V表示反应液体积，单位mL，6220为辅酶的摩尔消光系数，单位L/(mol×cm)，0.3为光程距离，单位cm)。

上述不对称还原反应的条件为30℃反应24小时。

反应结束后，计算转化率并进行立体选择性分析，具体方法如下：

将上述反应液煮沸5分钟，12,000rpm离心10分钟，去除沉淀，保留上清液，用衍生剂衍生(衍生剂配制方法：取0.343g邻苯二甲醛+5mL无水乙醇+0.147g N-乙酰-L半胱氨酸，用0.4mol/L硼酸缓冲液(pH＝9.5)定溶到25mL，避光备用；衍生方法:300μL 0.4mol/L硼酸缓冲液(pH＝9.5)+150μL超纯水+200μL衍生剂+100μL反应液，混匀并静置2分钟，12，000rpm离心10分钟后，取上清，用滤膜过滤后上样)，然后进行HPLC检测反应。HPLC检测条件：Agilent SB-Aq C18柱(4.6*250mm，5μm)，检测波长334nm，柱温：35℃，流速：1mL/min，上样量：10μL。梯度洗脱程序如表3所示。

表3HPLC的梯度洗脱程序

注：表中的％表示体积百分含量。

HPLC检测结果如表4和表5所示。

转化率＝A₁/A₂×100％；A₁：液相色谱分析获得的(S)-2-氨基-1-丁醇或(R)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值；A₂：液相色谱分析获得的标准品(S)-2-氨基-1-丁醇或(R)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值。

胺脱氢酶催化还原1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇反应的HPLC检测结果图谱如图3所示，A：混旋-2-氨基-1-丁醇标准品(购买于玛雅试剂，CAS:96-20-8)液相色谱结果；B：重组BsAmDH1；C：重组BcAmDH；D：重组LsAmDH1；E：重组SpAmDH；F：重组EsAmDH；G：重组TiAmDH；结果显示，这6个胺脱氢酶可以不对称还原催化1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇，转化率为19-99％，立体选择性为大于99％(S)。

表2中其余胺脱氢酶未检测到有产物生成。

胺脱氢酶不对称还原催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇反应的HPLC检测结果图谱如图3所示，H：混旋3-氨基-1-丁醇标准品(购买于Accela，CAS:2867-59-6)液相色谱结果；I：重组BsAmDH1；J：重组BcAmDH；K：重组LsAmDH1；L：重组SpAmDH；M：重组EsAmDH；结果显示，这5个胺脱氢酶可以不对称还原催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇，转化率为14-36％。

表2中其余胺脱氢酶未检测到有产物生成。

表4为胺脱氢酶催化1-羟基-2-丁酮检测结果

注：表中ee＝(A_S-A_R)/(A_S+A_R)×100％；A_S：液相色谱分析获得的(S)-2-氨基-1-丁醇的峰面积值；A_R：液相色谱分析获得的(R)-2-氨基-1-丁醇的峰面积值。

表5为胺脱氢酶催化4-羟基-2-丁酮检测结果

注：表中ee＝(A_S-A_R)/(A_S+A_R)×100％；A_S：液相色谱分析获得的(S)-2-氨基-1-丁醇的峰面积值；A_R：液相色谱分析获得的(R)-2-氨基-1-丁醇的峰面积值。

上述表4和表5中第一列代表表达对应酶的全细胞。

上述结果可以看出，表4和表5中的6种蛋白均能够制备手性胺醇化合物，均为胺脱氢酶，其中，BsAmDH1酶催化还原1-羟基-2-丁酮生成(S)-2-氨基-1-丁醇的效果最好，转化率为99％，其次为BcAmDH，转化率为82％；BsAmDH1酶催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇的效果也最好，转化率为36％，高于其他酶。

实施例2、胺脱氢酶生物催化制备手性胺醇化合物的条件优化

一、纯胺脱氢酶的制备

将实施例1的一制备的表达重组EsAmDH的全细胞、表达重组BsAmDH1的全细胞、表达重组TiAmDH的全细胞、表达重组BcAmDH的全细胞、表达重组SpAmDH的全细胞、表达重组LsAmDH1的全细胞的全细胞分别超声破碎，12，000rpm,60min,4℃离心收集上清后，用0.45μm水系滤膜过滤后用ATKA蛋白纯化仪进行纯化，所用层析柱为HisTrap HP 5mL预装柱(GE)，货号17524802。上样及平衡缓冲液A(50mM磷酸钾缓冲液，0.5M NaCl,20mM咪唑，pH 8.0)；洗脱缓冲液B(50mM磷酸钾缓冲液，0.5M NaCl,500mM咪唑pH 8.0)，洗脱流速2mL/min；收集洗脱液，得到重组EsAmDH纯酶、重组BsAmDH1纯酶、重组TiAmDH纯酶、重组BcAmDH纯酶、重组SpAmDH纯酶、重组LsAmDH1纯酶，浓度均为2mg/mL。

经过SDS电泳结果如图4所示，1和2泳道分别为重组BsAmDH1的上清与沉淀；3和4泳道分别为重组TiAmDH的上清与沉淀；5和6泳道分别为重组BcAmDH的上清与沉淀；7和8泳道分别为重组SpAmDH的上清与沉淀；9和10泳道分别为重组LsAmDH1的上清与沉淀；11和12泳道分别为重组EsAmDH的上清与沉淀。

上述各个重组纯酶为将各个酶的氨基酸序列的C端添加6个His标签得到的重组酶。

二、pH对胺脱氢酶活性的影响

根据辅酶NADH在340nm的吸收值来检测酶活，摩尔吸光系数ε340＝6.22x10³(M^{- 1}cm^-1)。酶活单位定义为：一分钟内转化产生或消耗1μM NADH所需要的酶量。酶活计算公式：酶活(U)＝EW×V×10³/(6220×0.3)，式中，EW表示每分钟内340nm处吸光值的变化，V表示反应液体积，单位mL，6220为辅酶的摩尔消光系数，单位L/(mol×cm)，0.3为光程距离，单位cm。

200μL反应体系：0.2mM NADH、10mM 1-羟基-2-丁酮、浓度为0.1mg/mL上述一制备的纯酶液，浓度为1M的pH为6-10的缓冲液(含1M NH₄ ⁺)(用等浓度的氯化铵和氨水按一定的体积比例混合调PH值)、其余为超纯水。

反应条件：30℃下反应，监测NADH的吸光值变化。

检测结果如图5所示，BsAmDH1的最适pH为9，TiAmDH，BcAmDH，SpAmDH，LsAmDH1，EsAmDH的最适pH为8.5。

三、检测温度对胺脱氢酶活性的影响

200μL反应体系：0.2mM NADH，10mM 1-羟基-2-丁酮,1M且为纯酶最佳pH值的氯化铵/氨水缓冲液，终浓度为0.1mg/mL上述一制备的纯酶液，其余为超纯水。

反应条件：20-65℃温度下反应，反应5min；

将反应液提前预热2min，以不加酶液作为空白对照，加入0.2mM NADH启动反应，根据实验组与空白对照组的OD差值检测酶活。

检测结果如图6所示，BsAmDH1的最适反应温度为55℃，TiAmDH最适反应温度为45℃，BcAmDH最适反应温度为50℃，SpAmDH，最适反应温度为50℃，LsAmDH1最适反应温度为55℃，EsAmDH的最适反应温度为50℃。

四、优化条件下的粗酶催化生物转化反应

不对称还原反应体系的各组分及其在体系中的浓度分别如下：

底物1-羟基-2-丁酮50mmol/L、全细胞100g/L、NAD⁺(氧化型辅酶I水溶液的形式存在)1mmol/L、GDH粗酶粉2g/L，葡萄糖100mmol/L，溶菌酶1g/L(购买于北京索莱宝科技有限公司，CAS:12650-88-3,酶活为20000U/mg)，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL(购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，CAS:9003-98-9，酶活为2000U/mg)，1mol/L的氯化铵/氨水缓冲液((pH 8.5或9)、余量为超纯水。

将反应液煮沸5分钟，12,000rpm离心10分钟，去除沉淀，保留上清，用邻苯二甲醛衍生后进行HPLC检测反应。

检测结果如表6和图7所示，可以看出，BsAmDH1和LsAmDH1转化率为高达98％以上，立体选择性为大于99％。

表6.粗酶催化生物转化结果

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种手性胺醇化合物的合成方法

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggtggaaa ccaatgttga agcacgtttt agcatttttg aaacaatggc tatggaagat 60

tacgaacagg ttgttttctg tcatgataaa gttagcggtc tgaaagccat tattgcaatt 120

catgatacca ccctgggccc ggccctgggc ggtttacgta tgtggaatta tgcaagcgat 180

gaagaagccc tgattgatgc actgcgcctg gccaaaggca tgacctatag caatgcagcc 240

gccggtctga atctgggtgg tggcaaagca gttattattg gcgatgcaaa aacccagaaa 300

agcgaagcac tgtttcgtgc ctttggccgc tatgttcaga gtctgaatgg tcgctatatt 360

accgcagaag atgttaatac caccgttgca gatatggatt atattcacat ggaaaccgat 420

tttgtgaccg gcgttagccc ggcctttggt agtagtggta atccgagtcc ggtgaccgca 480

tacggtgttt atcgtggtat gaaagcagca gcaaaagaag tgtatggcac cgatagtctg 540

ggtggtaaaa ccgttgcaat tcagggtgtg ggtaatgttg cctttaatct gtgtcgccat 600

ctgcatgaag aaggtgcaaa actgattgtt accgatatta atcaggatgc cctgcgccgc 660

gcagaagaag catttggcgc cctggttgtt ggcccggatg aaatctatag tgtggatgca 720

gatatttttg caccgtgcgc actgggcgcc accctgaatg atgaaaccat tccgcagctg 780

aaagttaaaa ttattgccgg tgcagccctg aatcagctga aagaagatcg ccacggtgac 840

atgctgcagg aacgcggtat tctgtatacc ccggattttg ttattaatgc cggcggtgtg 900

attaatgttg cagatgaact ggatggttat aatcgtgaac gcgcaatgaa aaaagtggaa 960

ctggtgtatg atgcagttgc aaaagtgatt gaaattgcaa aacgtgatca tctgccgacc 1020

tatcgcgcag cagaaaaaat ggccgaagaa cgtattgcaa caatgggtag tgcccgcagc 1080

cagtttctgc gccgtgataa aaatattctg ggtagtcgcg gcctcgagca ccaccaccac 1140

caccactga 1149

<210> 2

<211> 374

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met

1 5 10 15

Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser

20 25 30

Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu

50 55 60

Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala

85 90 95

Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val

100 105 110

Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr

115 120 125

Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly

130 135 140

Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly

165 170 175

Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn

180 185 190

Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu

195 200 205

Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala

225 230 235 240

Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr

245 250 255

Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Leu Asn Gln

260 265 270

Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu

275 280 285

Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu

305 310 315 320

Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp

325 330 335

His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile

340 345 350

Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn

355 360 365

Ile Leu Gly Ser Arg Gly

370

<210> 3

<211> 1290

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggaactgt ttaagtacat ggaaacctat gattatgagc aggtgctgtt ttgccaggat 60

aaagaaagcg gtctgaaagc aattattgcc attcatgata ccaccctggg cccggccctg 120

ggtggtacac gtatgtggat gtataatagc gaagaagaag cactggaaga tgccctgcgc 180

ctggcccgcg gtatgaccta tagcaatgca gcagccggtc tgaatctggg cggcggtaaa 240

accgtgatta ttggtgaccc gcgtaaagat aaaaatgaag ccatgtttcg cgcatttggt 300

cgctttattc agggtctgaa tggtcgctat attaccgccg aagatgtggg tacaaccgtg 360

gcagatatgg atattatcta tcaggaaacc gattatgtga ccggcattag tccggaattt 420

ggtagcagcg gcaatccgag cccggccacc gcatacggtg tgtatcgtgg tatgaaagcc 480

gccgccaaag aagcctttgg cagtgatagc ctggaaggta aagttgttgc cgtgcagggt 540

gtgggtaatg tggcatatca tctgtgtcgt catctgcatg aagaaggtgc caaactgatt 600

gttaccgata ttaataagga ggttgttgcc cgcgccgttg aagaatttgg tgccaaagca 660

gttgatccga atgatatata tggcgtggaa tgcgatattt ttgcaccgtg cgccctgggt 720

ggcattatta atgatcagac cattccgcag ctgaaagcaa aagttattgc cggcagtgca 780

ctgaatcagc tgaaagaacc gcgtcatggt gacattattc atgaaatggg tattgtttac 840

gccccggatt atgttattaa tgccggcggt gtgattaatg ttgcagatga actgtatggt 900

tataatcgtg aacgtgccat gaaaaagatt gaacagatat atgataacat cgagaaggtt 960

tttgccattg ccaaacgtga taatattccg acctatgttg ccgcagatcg catggccgaa 1020

gaacgcattg aaaccatgcg caaagccgcc agtcagtttc tgcagaatgg ccatcatatt 1080

ctgagtcgtc gtccgcgtcc gctgaccgca gcacgtgcag gtctgcgccg tgccgatgat 1140

ggcggtacaa ccaccatgca ggaacagaaa tttcgtattc tgaccattaa tccgggcagc 1200

accagtacca aaattggtgt gtttgaaaat gaacgcgcaa ttgcaagcaa aaaacgtagc 1260

gcaacccgtg ccggcgcaag tgcaatttaa 1290

<210> 4

<211> 429

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Glu Leu Phe Lys Tyr Met Glu Thr Tyr Asp Tyr Glu Gln Val Leu

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Met Tyr

35 40 45

Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe

85 90 95

Arg Ala Phe Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Ala Asp Met Asp Ile Ile Tyr Gln

115 120 125

Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Glu Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Asp Ser Leu Glu Gly Lys Val Val

165 170 175

Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Arg His Leu

180 185 190

His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Val

195 200 205

Val Ala Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Lys Ala Val Asp Pro Asn

210 215 220

Asp Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Gly Ile Ile Asn Asp Gln Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Pro Arg His Gly Asp Ile

260 265 270

Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Met Lys Lys Ile Glu Gln Ile Tyr Asp Asn Ile Glu Lys Val

305 310 315 320

Phe Ala Ile Ala Lys Arg Asp Asn Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asp

325 330 335

Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Glu Thr Met Arg Lys Ala Ala Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Gln Asn Gly His His Ile Leu Ser Arg Arg Pro Arg Pro Leu

355 360 365

Thr Ala Ala Arg Ala Gly Leu Arg Arg Ala Asp Asp Gly Gly Thr Thr

370 375 380

Thr Met Gln Glu Gln Lys Phe Arg Ile Leu Thr Ile Asn Pro Gly Ser

385 390 395 400

Thr Ser Thr Lys Ile Gly Val Phe Glu Asn Glu Arg Ala Ile Ala Ser

405 410 415

Lys Lys Arg Ser Ala Thr Arg Ala Gly Ala Ser Ala Ile

420 425

<210> 5

<211> 1101

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgaagattt ttgactacat ggagaagtat gattacgaac agctggttat gtgccaggat 60

aaagaaagcg gtctgaaagc aattatttgc attcatgtta ccaccctggg tccggcactg 120

ggcggcatgc gtatgtggac ctatgccagt gaagaagaag caattgaaga tgcactgcgt 180

ctgggccgcg gtatgaccta tagtaatgca gccgccggtc tgaatctggg cggcggtaaa 240

accgtgatta ttggtgaccc gcgtaaagat aaaaatgaag ccatgtttcg cgccctgggt 300

cgttttattc agggtctgaa tggtcgttat attaccgccg aagatgtggg tacaaccgtt 360

gaagatatgg atattattca tgaagagacc cgttatgtga ccggtgttag cccggcattt 420

ggtagcagtg gtaatccgag cccggtgacc gcatacggtg tttatcgtgg catgaaagca 480

gccgccaaag aagcctttgg cgatgatagt ctggaaggta aagtggttgc agttcagggt 540

gtgggccatg ttgcctatga actgtgcaaa catctgcata atgaaggcgc aaaactgatt 600

gtgaccgata ttaataagga aaatgccgat cgtgccgtgc aggaatttgg tgccgaattt 660

gttcatccgg ataaaatcta tgatgtggaa tgcgatattt tcgcaccgtg cgccctgggc 720

gccattatta atgatgaaac cattgaacgt ctgaaatgca aagttgtggc aggtagcgcc 780

ctgaatcagc tgaaagaaga acgccacggt aaaatgctgg aagaaaaagg tattgtttac 840

gcaccggatt atgtgattaa tgcaggtggt gttattaatg ttgccgatga actgctgggc 900

tataatcgcg aacgcgcaat gaaaaaagtg gaaggcatct atgataaaat cctgaaagtt 960

tttgagatcg caaaacgcga tggcattccg agctatctgg ccgcagatcg tatggccgaa 1020

gaacgtattg aaatgatgcg taaaacccgc agcacctttc tgcaggatca gcgcaatctg 1080

attaatttta ataacaagta a 1101

<210> 6

<211> 366

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Lys Ile Phe Asp Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Met Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Cys Ile His

20 25 30

Val Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Met Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Ser Glu Glu Glu Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Gly Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe

85 90 95

Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile His Glu

115 120 125

Glu Thr Arg Tyr Val Thr Gly Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Asp Asp Ser Leu Glu Gly Lys Val Val

165 170 175

Ala Val Gln Gly Val Gly His Val Ala Tyr Glu Leu Cys Lys His Leu

180 185 190

His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Asn

195 200 205

Ala Asp Arg Ala Val Gln Glu Phe Gly Ala Glu Phe Val His Pro Asp

210 215 220

Lys Ile Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Glu Arg Leu Lys Cys Lys Val Val

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Glu Arg His Gly Lys Met

260 265 270

Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Leu Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Met Lys Lys Val Glu Gly Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Val

305 310 315 320

Phe Glu Ile Ala Lys Arg Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Asp

325 330 335

Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Glu Met Met Arg Lys Thr Arg Ser Thr

340 345 350

Phe Leu Gln Asp Gln Arg Asn Leu Ile Asn Phe Asn Asn Lys

355 360 365

<210> 7

<211> 1101

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atgaccctgg aaatttttga atacctggaa aaatacgact acgaacaggt ggtgttttgt 60

caggataaag aaagcggcct gaaagccatt attgccattc atgataccac cctgggtccg 120

gcactgggtg gcacccgtat gtggacctat gatagcgaag aagcagccat tgaagatgcc 180

ctgcgtctgg caaaaggtat gacctatagc aatgccgccg caggtctgaa tctgggcggc 240

gctaaaaccg ttattattgg cgatccgcgt aaagataaaa gtgaagccat gtttcgtgcc 300

ctgggccgtt atattcaggg tctgaatggc cgctatatta ccgcagaaga tgttggtaca 360

accgtggatg atatggatat tattcatgaa gaaaccgatt tcgtgaccgg cattagtccg 420

agctttggta gtagcggtaa tccgagtccg gttaccgcat acggtgttta tcgcggcatg 480

aaagccgcag caaaagaagc atttggcacc gataatctgg aaggtaaagt gattgccgtt 540

cagggcgttg gtaatgtggc atatcatctg tgtaaacatc tgcatgcaga aggtgcaaaa 600

ctgattgtta ccgatattaa taaggaggca gttcagcgcg cagttgaaga atttggtgcc 660

agtgccgtgg aaccgaatga aatctatggt gttgaatgtg atatatatgc cccgtgcgcc 720

ctgggtgcaa ccgttaatga tgaaaccatt ccgcagctga aagcaaaagt tattgcaggc 780

agcgccctga atcagctgaa agaagatcgt catggtgaca ttattcatga gatgggtatt 840

gtttatgcac cggattatgt gattaatgca ggtggtgtta ttaatgttgc agatgaactg 900

tatggttata atcgcgaacg cgcactgaaa cgcgtggaaa gcatctatga taccattgca 960

aaagtgattg aaatcagcaa acgtgatggc attgccacct atgttgccgc agatcgcctg 1020

gcagaagaac gcattgcaag cctgaaaaat agtcgcagta cctatctgcg caatggtcat 1080

gatattatta gccgccgtta a 1101

<210> 8

<211> 366

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln

1 5 10 15

Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala

20 25 30

Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp

35 40 45

Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala

50 55 60

Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly

65 70 75 80

Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala

85 90 95

Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr

100 105 110

Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile

115 120 125

His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser

130 135 140

Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys

165 170 175

Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys

180 185 190

His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys

195 200 205

Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu

210 215 220

Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala

225 230 235 240

Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys

245 250 255

Val Ile Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly

260 265 270

Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile

275 280 285

Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn

290 295 300

Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala

305 310 315 320

Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala

325 330 335

Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg

340 345 350

Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg

355 360 365

<210> 9

<211> 1095

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

atggaaatct tcaagtacat ggaacatcag gattatgaac agctggttat ttgtcaggat 60

aaagccagtg gtctgaaagc aattattgcc attcatgata ccaccctggg cccggccctg 120

ggtggtacac gtatgtggac ctatgccagt gaagaagaag caattgaaga tgcactgcgc 180

ctggcacgtg gtatgaccta tagtaatgca gcagcaggcc tgaatctggg tggcggcaaa 240

accgttatta ttggtaatcc gaaaaccgat aaaaacgatg aaatgtttcg tgcatttggt 300

cgctatattg aaggtctgaa tggtcgttat attaccgcag aagatgttgg caccaccgaa 360

gcagatatgg atctgattaa tctggaaacc gattatgtta ccggcaccag cgcaggtgca 420

ggtagtagtg gcaatccgag cccggtgacc gcatacggta tctattatgg catgaaagcc 480

gccgccaaag aagcctttgg cgatgatagc ctggcaggta aaaccgttgc cgttcagggc 540

gttggtaatg ttgcctatgc cctgtgcgaa tatctgcatg aagaaggcgc aaaactgatt 600

attaccgata ttaatgagga ggccgtgcag cgcgccgtgg atgcttttgg cgccaccgca 660

gttggtatta atgaaatcta tagtcaggaa gccgatattt ttgccccgtg cgcactgggt 720

gcaattatta atgatgaaac cattccgcag ctgaaagcca aagttattgc cggtagcgca 780

ctgaatcagc tgaaagaaac ccgccacggt gacctgattc atgaaatggg cattgtgtat 840

gcaccggatt atgttattaa tagtggcggt gtgattaatg ttgccgatga actggatggc 900

tataatcgtg aacgcgcact gaaacgtgtg gaaggcatct atgatgttat tggcaaaatt 960

tttgcgatca gcaaacgtga taatattccg acctatgttg cagccgatcg catggccgaa 1020

gaacgtattg cacgcgtggc aaatacccgc agtacctttc tgcagaatga aaaaagtgtg 1080

ctgagccgtc gttaa 1095

<210> 10

<211> 364

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 10

Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu His Gln Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Ile Cys Gln Asp Lys Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Ser Glu Glu Glu Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asn Pro Lys Thr Asp Lys Asn Asp Glu Met Phe

85 90 95

Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Glu Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ala Asp Met Asp Leu Ile Asn Leu

115 120 125

Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Thr Ser Ala Gly Ala Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Ile Tyr Tyr Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Asp Asp Ser Leu Ala Gly Lys Thr Val

165 170 175

Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr Ala Leu Cys Glu Tyr Leu

180 185 190

His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Ile Thr Asp Ile Asn Glu Glu Ala

195 200 205

Val Gln Arg Ala Val Asp Ala Phe Gly Ala Thr Ala Val Gly Ile Asn

210 215 220

Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Thr Arg His Gly Asp Leu

260 265 270

Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ser

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Gly Ile Tyr Asp Val Ile Gly Lys Ile

305 310 315 320

Phe Ala Ile Ser Lys Arg Asp Asn Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asp

325 330 335

Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Asn Thr Arg Ser Thr

340 345 350

Phe Leu Gln Asn Glu Lys Ser Val Leu Ser Arg Arg

355 360

<210> 11

<211> 1095

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

atggaaatct tcaagtacat ggaaaagtat gattacgaac agctggtgtt ttgtcaggat 60

gaagcaagcg gcctgaaagc agtgattgca attcatgata ccaccctggg tccggccctg 120

ggtggtgcac gtatgtggac ctatgcaagc gaagaaaatg cagttgaaga tgccctgcgc 180

ctggcacgcg gtatgaccta tagtaatgca gcagcaggtc tgaatctggg cggtggtaaa 240

accgtgatta ttggcgatcc gtttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg cgcactgggt 300

cgttttattc agggtctgaa tggtcgttat attaccgccg aagatgttgg caccaccgtg 360

accgatatgg atctgattca tgaagaaacc gattatgtta ccggtattag cccggccttt 420

ggcagtagtg gcaatccgag tccggttacc gcctatggtg tgtatcgtgg catgaaagca 480

gccgccaaag aagcctttgg cagcgaaagt ctggaaggtc tgaaaattag tgtgcagggt 540

ctgggcaatg ttgcatataa actgtgtgaa tatctgcata atgagggcgc caaactggtt 600

gtgaccgata ttaatcaggc agcaattgat cgcgttgtga atgattttga tgccattgcc 660

gtggcaccgg atgaaatcta tgcacaggaa gtggatattt ttagtccgtg tgccctgggt 720

gcaattctga atgatgaaac cattccgcag ctgaaagcca aagtgattgc cggtagcgcc 780

ctgaatcagc tgaaagatag tcgtcatggt gactttctgc atgaactggg cattgtgtat 840

gcaccggatt atgttattaa tgccggcggt gtgattaatg tggcagatga actgtatggc 900

tataatcgtg aacgtgcact gaaacgcgtg gatggtatct atgatagcat tgaaaaaatc 960

ttcgccatta gtaaacgcga tggcattccg acctatgtgg cagccaatcg cctggcagaa 1020

gaacgtattg cccgtgtggc caaaagccgt agtcagtttc tgaaaaatga aaagaatatc 1080

ctgcacggtc gctaa 1095

<210> 12

<211> 362

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 12

Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Val Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Ser Glu Glu Asn Ala Val Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe

85 90 95

Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu

115 120 125

Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Glu Ser Leu Glu Gly Leu Lys Ile

165 170 175

Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu

180 185 190

His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala

195 200 205

Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Asp Ala Ile Ala Val Ala Pro Asp

210 215 220

Glu Ile Tyr Ala Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Asp Ser Arg His Gly Asp Phe

260 265 270

Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile

305 310 315 320

Phe Ala Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn

325 330 335

Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu His

355 360

<210> 13

<211> 786

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccat tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggatgaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacga cgatcaataa ggagaaattt 600

gctgaccctg aacagagagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

Claims (7)

1.生物材料在如下A1—A2）至少一种中的应用或在制备具有A1—A2）至少一种功能的产品中的应用；

A1）催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇；

A2）合成或制备(S)-2-氨基-1-丁醇和(R)-3-氨基-1-丁醇；

所述生物材料为如下B1或B2或B3:

B1、胺脱氢酶，B2、编码所述胺脱氢酶的核酸序列，B3、含有所述核酸序列的表达盒、重组载体或重组微生物；

所述胺脱氢酶为如下C1-C2任一种：

C1、序列表中序列4所示的蛋白；

C2、C1所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述重组微生物为将重组载体导入宿主菌中得到的重组菌；

所述重组载体为将所述核酸序列插入表达载体中得到的载体。

3.一种合成或制备胺醇化合物的方法，包括如下步骤：用权利要求1或2所述生物材料催化羟基酮底物，生成胺醇化合物；

所述羟基酮底物为4-羟基-2-丁酮；

所述胺醇化合物为(R)-3-氨基-1-丁醇。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述生物材料对应的催化反应温度为20-65℃，其对应的催化反应pH值为6-10。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述生物材料为序列4所示的蛋白或含有编码序列4所示的蛋白核酸的重组微生物，其催化反应温度为55 ℃，对应的催化反应pH值为9。

6.一种合成或制备胺醇化合物的试剂盒，包括权利要求1或2中的所述生物材料和羟基酮底物；

所述羟基酮底物为4-羟基-2-丁酮；

所述胺醇化合物为 (R)-3-氨基-1-丁醇。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括胺脱氢酶的辅酶。

Images