CN115927224A - 一种羰基还原酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其应用。本发明的羰基还原酶突变体的突变位点包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。本发明的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性。其中部分羰基还原酶突变体的酶活性是野生型羰基的50倍。本发明的羰基还原酶突变体在液态反应体系中，在辅酶存在下，能使如式I所示化合物进行如下式所示的还原反应，并以转化率>99％，手性ee值>99％，手性de值>99％制备得到如式ⅠⅠ所示化合物。

Description

一种羰基还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物催化合成领域，涉及一种羰基还原酶突变体及其应用。

背景技术

含有手性氨基醇类结构的化合物具有多样的生物活性，被广泛应用于医药化工领域，如用于治疗帕金森病和低血压症的屈西多巴，具有广谱的抗菌活性的氯霉素，兽药氟苯尼考和甲砜霉素，口服戈谢病治疗药物依利格鲁司他和其他具有抗炎抗感染抗肿瘤等活性的临床候选药物。其中，1949年上市的氯霉素作为广谱抗生素，全球的产量主要集中在中国，国内生产规模约在3000吨。但随着环保标准的不断提高以及处理三废(废水、废气、废固)成本越来越高，现有的生产工艺已经难以满足发展的要求。因此迫切需要一条更加绿色经济环保的工艺路线，去解决现有生产工艺存在的环保问题。本实验室中国专利申请公开文本CN111808893A中使用羰基还原酶介导的动态动力学拆分还原的生物催化方法，能够有效解决氯霉素现有生产工艺中存在的高污染、高能耗、低效率、低质量等问题。因此工业界迫切需要一个更加高效且稳定的羰基还原酶，用于合成氯霉素和其他手性氨基醇类药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中羰基还原酶突变体的活性较低的缺陷，提供一种羰基还原酶突变体及其应用。本发明的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性，可用于催化如式Ⅰ所示化合物发生羰基还原反应

本发明提供了一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体的突变位点包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。

本发明中，较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的一位或多位。

本发明中，更佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括还选自如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的至少3位。

本发明中，较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点，所述羰基还原酶突变体的突变位点选自以下任一组：

(1)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位和第193位；

(2)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位和第201位；

(3)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第204位和第206位；

(4)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第206位和第207；

(5)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位、第206位和第207位；

(6)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第192位、第193位、第204位和第206位；

(7)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位和第204位。

本发明中，较佳地，所述第82位的氨基酸残基由W突变为L。

本发明中，较佳地，所述第88位的氨基酸残基由F突变为V、I或S，例如I或V。

本发明中，较佳地，所述第121位的氨基酸残基由V突变为A。

本发明中，较佳地，所述第138位的氨基酸残基由A突变为V或L，例如L。

本发明中，较佳地，所述第142位的氨基酸残基由R突变为M、F、H或L，例如M。

本发明中，较佳地，所述第190位的氨基酸残基由A突变为V。

本发明中，较佳地，所述第192位的氨基酸残基由R突变为M。

本发明中，较佳地，所述第193位的氨基酸残基由S突变为A。

本发明中，较佳地，所述第201位的氨基酸残基由Y突变为F。

本发明中，较佳地，所述第204位的氨基酸残基由N突变为A或G，例如A。本发明中，较佳地，所述第206位的氨基酸残基由K突变为H。

本发明中，较佳地，所述第207位的氨基酸残基由K突变为N。

本发明中，所述羰基还原酶突变体的突变位点和种类如下表1所示：

表1

本发明还提供一种如式II所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在液态反应体系中，如式I所示化合物在辅酶和前述羰基还原酶突变体存在下，进行如下式所示的还原反应即可；

R₁为H、

或苄基；

R_1-1为C₁-C₆烷基或苄基；

R₂为H、

或苄基；

R_2-1为C₁-C₆烷基或苄基；

R₃为

其中R_3-1为C₁-C₆烷基；

R₄为H、NO₂、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆烷基取代的磺酰基。

本发明中，较佳地，所述卤素为F、Cl、Br或I。

本发明中，较佳地，所述C₁-C₆烷基为C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。

本发明中，较佳地，R₁为H、

本发明中，较佳地，R₂为H、

本发明中，较佳地，R₄为H、NO₂、F、Cl、Br、I、甲基、甲氧基或

本发明中，较佳地，R₃为

本发明中，更佳地，R₁为H、R₂为

R₃为

R₄为F、Cl或Br。

本发明中，较佳地，所述如式I所示化合物为

本发明中，较佳地，所述如式II所示化合物为

本发明中，所述辅酶可为本领域常规的辅酶，较佳地，所述辅酶为还原性辅酶和/或氧化性辅酶。所述氧化性辅酶优选为NAD⁺和/或NADP⁺；所述还原性辅酶优选为NADH和/或NADPH。

本发明中，所述辅酶的用量可为本领域辅酶的常规用量，较佳地，所述辅酶与所述如式I所示化合物的质量比为1:(1-100)；较佳地为1:(50-100)；例如1:100或1:75。

本发明中，所述液态反应体系可为本领域常规的适于羰基还原酶反应的液态反应体系，较佳地，所述液态反应体系包括用于辅酶再生的酶和用于辅酶再生的共底物。所述用于辅酶再生的酶优选为醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种；例如葡萄糖脱氢酶。所述共底物优选为异丙醇、葡萄糖和甲酸铵中的一种或多种，例如葡萄糖。

本发明中，所述液态反应体系中，所述共底物的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述共底物在所述液态反应体系中的质量浓度为5-30％，更佳地为5％-20％；例如16％、8％或12％。

本发明中，所述液态反应体系中，所述用于辅酶再生的酶的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述用于辅酶再生的酶在所述液态反应体系中的质量浓度为1-10％；更佳地为1％-5％；例如2.5％、1.6％或2.3％。

本发明中，所述还原反应的反应温度可为本领域常规的反应温度，较佳地为10℃-50℃，更佳地为25℃-35℃，例如30℃。

本发明中，所述还原反应的反应时间与反应温度及反应规模相关，较佳地为0.1-72小时，更佳地为3-24小时。

本发明中，所述还原反应的pH可为本领域常规的pH，较佳地为6-10，更佳地为7.0-9.0，例如7.5-8.0。

本发明中，所述羰基还原酶突变体以本领域常规的形式加入所述还原反应中，较佳地为游离形式的酶、固定化酶、菌粉或菌体形式的酶，更佳地为菌体形式的酶。

本发明中，所述液态反应体系还包括缓冲液例如磷酸缓冲液。所述磷酸缓冲液优选为0.1M的磷酸盐缓冲液。所述磷酸缓冲液用于调控所述液态反应体系的pH。

本发明中，所述液态反应体系还包括助溶剂。所述助溶剂可为本领域常规的助溶剂；较佳地选自二甲基亚砜、异丙醇和甲苯中的一种或多种，更佳地为二甲基亚砜。

本发明中，所述助溶剂的用量可为本领域常规用量，较佳地，所述助溶剂在所述液态反应体系中的质量浓度为10％-50％；更佳地为20％-30％；例如30％、29％或28％。

本发明中，所述还原反应结束后，还包括后处理步骤。

本发明中，所述后处理步骤为本领域常规的后处理步骤，较佳地，所述后处理步骤包括：向前述液态反应体系中加入有机溶剂，加热、过滤菌体、萃取，有机相水洗、干燥和过滤浓缩有机层得如式II所示化合物。

本发明中，所述有机溶剂可为本领域常规的有机溶剂，较佳地为酯类溶剂、醚类溶剂、醇类溶剂、芳烃类溶剂或氯代烷烃类溶剂。所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯或乙酸异丙脂。所述醚类溶剂优选为甲基叔丁基醚或2-甲基四氢呋喃。所述醇类溶剂优选为正丁醇。所述芳烃类溶剂优选为甲苯。所述氯代烷烃类溶剂优选为二氯甲烷。

本发明中，所述加热的温度以使蛋白变性为准，较佳地为60℃。

本发明中，所述加热的时间以使蛋白变性为准，较佳地为1h。

本发明中，所述水洗中的水包括纯水和含无机盐的水；例如纯水和/或5％食盐水。

本发明中，所述干燥的按照方式可采用本领域常规干燥方法，较佳地为使用干燥剂干燥；所述干燥剂优选为无水硫酸钠。

更佳地，所述后处理步骤包括：向前述还原反应的反应液中加入甲叔醚或乙酸乙酯、加热、过滤菌体和萃取，有机相纯水洗、5％食盐水洗、无水硫酸钠干燥和过滤浓缩有机层得如式II所示化合物。

本发明还提供一种如前所述羰基还原酶突变体在还原羰基中的应用。

本发明中，较佳地，所述应用的反应底物和反应条件如前所述的如式II所示化合物的制备方法中的反应底物和反应条件。

术语

对映体过量(ee，enantiomeric excess)：通常用来表征手性分子中一个对映异构体相对于另一个对映异构体的过量值。

非对映体过量(de，diastereomeric excess)：通常用来表征两个及以上手性中心的分子中一个非对映体相对于另一个非对映体的过量值。

异构体含量(ic，isomeric content):通常用来表征两个及以上手性中心的分子中一个异构体占所有异构体总量的百分数。

(R，S)-羰基还原酶

在本发明中，“立体选择性羰基还原酶”指能够立体选择性不对称催化还原潜手性酮为手性醇的酶。

典型地，在本发明中，所述立体选择性羰基还原酶优选为(R，S)-羰基还原酶，立体选择性定义为对映体过量(ee)≥80％，非对映体过量(de)≥80％。

同理当(R，R)-羰基还原酶时，立体选择性定义为对映体过量(ee)≥80％，非对映体过量(de)≥80％，依此类推。

辅酶

本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。

助溶剂

本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。

如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。

动态还原动力学拆分反应原理

通过羰基还原酶立体选择性的还原单一构型的潜手性酮(如R-构型)的同时，另一构型的潜手性酮(如S-构型)通过羰基的烯醇互变，实现α-位手性构型的消旋化，还原与消旋化在同一反应条件下进行，实现高效构建含两个手性中心仲醇的目的。

典型地，本发明中通过筛选获得仅识别Ⅰ-S(S构型化合物Ⅰ)的羰基还原酶，对羰基进行立体选择性的还原获得手性羟基，而不被识别的Ⅰ-R(R构型化合物Ⅰ)通过消旋化转化为Ⅰ-S，消旋与还原过程衔接推进，以此转化，理论上便可100％的获得所需手性产物。通过羰基还原酶对潜手性羰基底物进行还原，同时经烯醇互变消旋，两者巧妙结合，一步反应高效经济构建两个手性中心，表现了良好的应用开发前景。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的羰基还原酶突变体相对于野生型羰基还原酶具有更高的酶活性。其中部分羰基还原酶突变体的酶活性是野生型羰基的50倍。本发明的羰基还原酶突变体可应用于催化如式Ⅰ所示化合物发生羰基还原反应。

本发明提供的制备方法能以转化率>99％，手性ee值>99％，手性de值>99％制备得到如式ⅠⅠ所示化合物。本发明的制备方法具有绿色、环保和经济的特点。

附图说明

图1为对比例1中消旋体化合物1b的四个异构体和WTEA酶转化反应制备化合物1b的手性纯度的液相对比图。

图2为对比例1中消旋体化合物1b的四个异构体和突变体羰基还原酶(突变体65)转化反应制备化合物1b的手性纯度的液相对比图。

图3为对比例1中消旋体化合物2b的四个异构体的液相图。

图4为对比例1中WTEA酶转化反应制备化合物2b的手性纯度的液相图。

图5为对比例1中突变体羰基还原酶(突变体65)转化反应制备化合物2b的手性纯度的液相图。

图6为对比例2中消旋体化合物5b的四个异构体的液相图。

图7为对比例2中WTEA酶转化反应制备化合物5b的手性纯度的液相图。

图8为对比例2中突变体羰基还原酶(突变体65)转化反应制备化合物5b的手性纯度的液相图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

具体地，本发明的生物制备方法以化合物Ⅰ(例如化合物1)为原料，以羰基还原酶为生物催化剂，在辅酶的存在下，高效地制备具有立体构象的化合物Ⅱ(还原收率>99％，手性ee值>99％，手性de值>99％)，一步反应构建两个手性中心，从而极大地提高生产效率，降低生产成本。

材料

基因全合成由南京金斯瑞完成。

通过商业化的全基因合成得到编码基因，然后将编码基因构建入表达载体，导入宿主菌，诱导表达得到羰基还原酶。

酶还原底物化合物Ⅰ的制备可参见Tetrahedron.2016，72:1787-1793所述方法。

方法

1.酶的制备方法

通过本领域常规技术，将上述实现辅酶再生的葡萄糖脱氢酶，甲酸脱氢酶与目的基因及其突变体分别构建在pET28a(+)载体上，然后导入表达宿主大肠杆菌，通过诱导表达，分别获得含有葡萄糖脱氢酶的菌体，甲酸脱氢酶的菌体和羰基还原酶的菌体。可直接使用离心获得菌体，也可使用其破壁获得粗酶液、粗酶粉进行后续的生物转化反应。

2.生物催化还原化合物Ⅰ制备化合物Ⅱ的方法

本发明提供了一种羰基还原酶催化还原化合物Ⅰ从而制备化合物Ⅱ的方法。反应式如下：

R₁为H、

或苄基；R_1-1为C₁-C₆烷基或苄基；R₂为H、

或苄基；R_2-1为C₁-C₆烷基或苄基；R₃为

其中R_3-1为C₁-C₆烷基；

R₄为H、NO₂、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆烷基取代的磺酰基。

其中，所述生物催化体系包括羰基还原酶和辅酶。本发明中所述羰基还原酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。根据本领域一般常识，上述羰基还原酶基因可通过商业化的全基因合成得到。

根据上述优选体系，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在助溶剂，如二甲基亚砜或异丙醇，然后加入到磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，加入菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NADP⁺与共底物葡萄糖，维持在20℃～40℃，TLC或HPLC监控，至原料剩余<2％，终止反应。反应液用有机溶剂萃取，有机溶剂可为甲基叔丁基醚、甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、二氯甲烷、2-甲基四氢呋喃或正丁醇。萃取水层2-3次，合并有机相；用饱和食盐水洗涤2～3次，浓缩后得到淡黄色固体，即为化合物II(根据底物不同，分别为1b-7b，如表3)。

体系中底物化合物Ⅰ的终浓度为10-200g/L，反应温度为20-40℃，转速为200rpm/min，反应时间约3-24h，反应时间根据底物浓度而有所变化或通过HPLC监控原料转化情况，一般为当原料剩余<2％，终止反应。

3.化合物Ⅱ的手性正相监测方法：

样品溶于甲醇，浓度10mg/mL；进样体积2μL，具体检测方法如表2。

表2手性正相监测方法^a.

^a通用的检测条件:温度:30℃；流速:1mL/min

^b IB-3:CHIRALPAK IB-3column(3μm，4.6mm×250mm，DAICEL，Shanghai)

^c OJ-H:CHIRALPAK IB-3column(5μm，4.6mm×250mm，DAICEL，Shanghai)表3.1b-7b化合物结构

4.化合物Ⅱ的反相监测方法：

HPLC条件：phenomenex Gemini 5u C18 110A，250×4.6mm，5μm；流速：1mL/min；流动相：乙腈：水＝55：45；紫外检测波长：210，220，245nm；柱温：30℃；样品浓度：10mg/mL；进样体积10μL。

实施例1表达重组羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶的基因工程菌的构建

将羰基还原酶WTEA(核苷酸序列为SEQ ID NO:2，氨基酸序列为SEQ ID NO:1)目的基因、葡萄糖脱氢酶GDH目的基因委托商业化公司进行全基因合成，分别克隆入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，平板培养，挑取阳性转化子单菌落并提取质粒测序确定后，提取重组质粒，导入BL21(DE3)菌株中，挑单菌，LB培养，分别获得可以诱导表达重组羰基还原酶的基因工程菌pET28a(+)-WTEA和表达重组葡萄糖脱氢酶GDH的基因工程菌pET28a(+)-GDH。

实施例2重组羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶的制备

将上一步保存于甘油中的基因工程菌，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养14h，得到种子培养液。将种子培养液按1.5％的比例接种到含50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基上，然后37℃、220rmp培养至OD₆₀₀值>2.0。加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，降温至25℃诱导蛋白表达，继续培养20h，放罐，离心(离心条件为4000g离心30min)得菌体，为生物转化做准备。

LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，去离子水1L，pH7.0。

发酵培养基2(g/L)：酵母提取物24.0，大豆蛋白胨12.0，NaCl 3.0，甘油5.0，K₂HPO₄·3H₂O 2.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，去离子水1L，pH 7.5。

实施例3羰基还原酶WTEA突变体构建及筛选

通过定向进化将野生型的羰基还原酶基因WTEA进行突变，获得包含进化的羰基还原酶基因的质粒文库。然后将其转入大肠杆菌BL21(DE3)(货号：康为世纪CW0809S)中，并在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上涂板。在37℃烘箱中培养14h后，将单菌落挑选至含400μL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96孔板中，37℃，200rpm过夜培养，得种子液。然后将10μL种子液转移至含400μL发酵培养基(发酵培养基2，含50μg/mL卡那霉素)的96深孔板中，37℃，200rpm，培养3h。然后加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，降温至25℃诱导突变体表达，继续培养20-24h。接着在4000g，30min离心沉淀细胞后，重新悬浮于200μL裂解缓冲液(含有1000U溶菌酶的0.1M磷酸缓冲液，pH 7.0)中，在30℃裂解1h。然后96深孔板用离心机在4℃以4000g离心30min，澄清的上清液用于测定突变体活性。将190μL反应液(含0.4mM底物、1mM NADPH、40μL二甲基亚砜)加入新的96孔板中，再加入10μL的上清液后，在340nm检测NADPH的变化。NADPH的消耗量反应突变体酶活的高低，各个突变体的相对活性如表4。

表4：突变体及其相对活性

*野生型羰基还原酶基因WTEA(SEQ ID NO:1)的活性设为100％。

实施例4生物催化法制备化合物1b

其中R₁为H；R₂为Boc；R₃为CH₃；R₄为NO₂，Ⅰ为化合物1a，Ⅱ为化合物1b。

取0.1M的磷酸盐缓冲液(140mL)，加入葡萄糖(40g)，加入NADP⁺(0.2g)，加入上述发酵所得的突变体65菌体(20g)，加入葡萄糖脱氢酶(GDH)菌体(6g)，剧烈搅拌并缓慢加入化合物1a(20g)的DMSO(60mL)溶液，30℃，间隔0.5h，5％碳酸钠水溶液调节pH7.5-8.0，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。

加入甲叔醚(200mL)萃取，加热至60℃保温1h，使菌体中的蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(100mL)萃取水层，合并有机层，水洗(100mL×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得浅黄色油状物即为化合物1b(17.6g)，ee值99.9％，de值99.9％。

实施例5生物催化法制备化合物2b

其中R₁为H；R₂为Boc；R₃为CH₂CH₃；R₄为Cl，Ⅰ为化合物2a，Ⅱ为化合物2b。

取0.1M的磷酸盐缓冲液(70mL)，加入葡萄糖(10g)，加入NADP⁺(0.1g)，加入上述发酵所得的突变体65菌体(10g)，加入葡萄糖脱氢酶(GDH)菌体(3g)，剧烈搅拌分批加化合物2a(7.5g)的DMSO(30mL)溶液，30℃，间隔0.5h，5％碳酸钠水溶液调节pH7.5-8.0，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。

加入甲叔醚(100mL)萃取，加热至60℃保温1h，使菌体中的蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(50mL)萃取水层，合并有机层，水洗(50mL×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得浅黄色油状物，即为化合物2b(6.6g)，ee值99.9％，de值99.9％。

实施例6生物催化法制备化合物3b

其中，R₁为H；R₂为Boc；R₃为CH₂CH₃，R₄为SO₂Et，Ⅰ为化合物3a，Ⅱ为化合物3b。

取0.1M的磷酸盐缓冲液(70mL)，加入葡萄糖(15g)，NADP⁺(0.1g)，加入上述发酵所得突变体65菌体(10g)，加入葡萄糖脱氢酶(GDH)菌体(2g)，剧烈搅拌分批加化合物3a(10g)的DMSO(30mL)溶液，30℃，间隔0.5h，5％碳酸钠水溶液调节pH7.5-8.0，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。

加入甲叔醚(200mL)萃取，加热至60℃保温1h，使菌体中的蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(100mL)萃取水层，合并有机层，水洗(100mL×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得浅黄色油状物，即为化合物3b(4.7g)，ee值99.9％，de值99.9％。

实施例7生物催化法制备化合物4b

其中，R₁为H；R₂为Boc；R₃为CH₃，R₄为SO₂Me，Ⅰ为化合物4a，Ⅱ为化合物4b。

取0.1M的磷酸盐缓冲液(140mL)，加入葡萄糖(40g)，加入NADP⁺(0.2g)，加入上述发酵所得的突变体65菌体(20g)，加入葡萄糖脱氢酶(GDH)菌体(6g)，剧烈搅拌并缓慢加入化合物4a(20g)的DMSO(60mL)溶液，30℃，间隔0.5h，5％碳酸钠水溶液调节pH7.5-8.0，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。

加入甲叔醚(200mL)萃取，加热至60℃保温1h，蛋白失活，加入10％的硅藻土，过滤菌体，甲叔醚(100mL)萃取水层，合并有机层，水洗(100mL×2)，5％食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得浅黄色油状物，即为化合物4b(17.6g)，ee值99.9％，de值99.9％。

对比例1野生型羰基还原酶和突变体羰基还原酶生物催化法制备化合物1b，2b，4b比较

取140mL的0.1M的磷酸盐缓冲液，加入40g的葡萄糖，加入0.2g的NADP⁺，加入6g的葡萄糖脱氢酶(GDH)，加入20g的发酵所得的野生型羰基还原酶(或突变体47，或突变体63，或突变体65)菌体，剧烈搅拌并缓慢加入含20g底物1a(或20g底物2a，20g底物4a)的DMSO(60mL)溶液，30℃，间隔0.5h，5％碳酸钠水溶液调节pH7.5-8.0，反应24h终止反应，HPLC监控反应转化率。

消旋体化合物1的四个异构体和WTEA酶转化反应制备化合物1b的手性纯度的液相对比图如图1所示，四个异构体物质保留时间分别为23min；28min；39min；47min，WTEA酶转化反应得到的化合物1b的保留时间为39min，手性纯度(de)为98％。

消旋体化合物1b的四个异构体和突变体羰基还原酶(突变体65)转化反应制备化合物1b的手性纯度的液相对比图如图2所示，突变体65转化反应得到的化合物1b的保留时间为39min，手性纯度(de)为99％。

消旋体化合物2b的四个异构体的液相图如图3所示，四个异构体的保留时间分别为8min；10min；12min；16min。

WTEA酶转化反应制备化合物2b的手性纯度的液相图如图4所示，WTEA酶转化反应得到的化合物2b的保留时间为10min，手性纯度(de)为89％。

突变体羰基还原酶(突变体65)转化反应制备化合物2b的手性纯度的液相图如图5所示，突变体65转化反应得到的化合物2b的保留时间为10min，手性纯度(de)为99％。

表5：野生型羰基还原酶和突变体羰基还原酶催化(1a，2a，3a)的活性和立体选择性比较

注：SEQ ID NO 1为野生型羰基还原酶；突变体47来源公开号为CN109207531A的专利申请文本。

对比例2野生型羰基还原酶和突变体羰基还原酶生物催化法制备化合物1-7b的立体选择性比较

配制含有不同底物和不同羰基还原酶的2mL反应体系：底物1a–7a(20mM)，10％二甲基亚砜(v/v)，葡萄糖(40mM)，NADP⁺(0.2mM)，羰基还原酶菌体(50g/LWTEA或突变体65菌体)，葡萄糖脱氢酶菌体(25g/L)，磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)。反应混合物在30℃，220rpm下反应24小时。反应结束后，用二氯甲烷萃取反应液，有机层用无水硫酸钠干燥。最后用高效液相检测野生型羰基还原酶和突变体羰基还原酶生物催化法制备化合物1-7b的立体选择性。

消旋体化合物5b的四个异构体的液相图如图6所示，四个异构体的保留时间分别为13min；16min；17min；29min。

WTEA酶转化反应制备化合物5b的手性纯度的液相图如图7所示，WTEA酶转化反应得到的化合物5b的保留时间为16min，手性纯度(ic)为69％。

突变体羰基还原酶(突变体65)转化反应制备化合物5b的手性纯度的液相图如图8所示，突变体65转化反应得到的化合物5b的保留时间为16min，手性纯度(ic)为96％。

表6：野生型羰基还原酶和突变体羰基还原酶(突变体65)催化底物(1-7a)制备化合物1-7b的立体选择性比较

SEQUENCE LISTING

<110> 上海医药工业研究院

中国医药工业研究总院

<120> 一种羰基还原酶突变体及其应用

<130> P21014495C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> Exiguobacterium acetylicum

<400> 1

Met Lys Tyr Thr Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Glu

1               5                   10                  15

Thr Ala Lys Leu Leu Ala Gly Lys Gly Lys Ser Leu Val Leu Val Ala

            20                  25                  30

Arg Arg Thr Ser Glu Leu Glu Lys Leu Arg Asp Glu Val Lys Gln Ile

        35                  40                  45

Ser Pro Asp Ser Asp Val Ile Leu Lys Ser Val Asp Leu Ala Asp Asn

    50                  55                  60

Gln Asn Val His Asp Leu Tyr Glu Gly Leu Lys Glu Leu Asp Ile Glu

65                  70                  75                  80

Thr Trp Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Asp Phe Asp Leu Val Gln Asp

                85                  90                  95

Ile Glu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Met Leu Arg Leu Asn Ile Glu Ala

            100                 105                 110

Leu Thr Ile Leu Ser Ser Leu Phe Val Arg Asp His His Asp Ile Glu

        115                 120                 125

Gly Thr Thr Leu Val Asn Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Arg Ile Val

    130                 135                 140

Pro Asn Ala Val Thr Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Tyr Val Ser Ala Tyr

145                 150                 155                 160

Thr Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Gln Lys Gly Gly Ala Lys Leu Arg

                165                 170                 175

Ala Lys Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Glu Thr Glu Phe Ala Asp Arg

            180                 185                 190

Ser Arg Gly Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Lys Asn Val Lys Lys Tyr

        195                 200                 205

His Thr Ala Ala Glu Met Ala Gly Phe Leu His Gln Leu Ile Glu Ser

    210                 215                 220

Asp Ala Ile Val Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Tyr Glu Phe Glu Leu

225                 230                 235                 240

Arg Gly Pro Leu Phe Asn Tyr Ala Gly

                245

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> Exiguobacterium acetylicum

<400> 2

atgaaataca ccgttatcac cggtgcttct tctggtatcg gttacgaaac cgctaaactg 60

ctggctggta aaggtaaatc tctggttctg gttgctcgtc gtacctctga actggaaaaa 120

ctgcgtgacg aagttaaaca gatctctccg gactctgacg ttatcctgaa atctgttgac 180

ctggctgaca accagaacgt tcacgacctg tacgaaggtc tgaaagaact ggacatcgaa 240

acctggatca acaacgctgg tttcggtgac ttcgacctgg ttcaggacat cgaactgggt 300

aaaatcgaaa aaatgctgcg tctgaacatc gaagctctga ccatcctgtc ttctctgttc 360

gttcgtgacc accacgacat cgaaggtacc accctggtta acatctcttc tgcgggtggt 420

taccgtatcg ttccgaacgc tgttacctac tgcgctacca aattctacgt ttctgcttac 480

accgaaggtc tggctcagga actgcagaaa ggtggtgcta aactgcgtgc taaagttctg 540

gctccggctg ctaccgaaac cgaattcgct gaccgtagcc gtggtgaagc tggtttcgac 600

tactctaaaa acgttaaaaa ataccacacc gctgctgaaa tggctggttt cctgcaccag 660

ctgatcgaat ctgacgctat cgttggtatc gttgacggtg aaacctacga attcgaactg 720

cgtggtccgc tgttcaacta cgctggttaa 750

Claims (10)

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点包括如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的第88位、第142位、第190位和第193位。

2.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的一个或多个；

较佳地，所述羰基还原酶突变体的突变位点还包括还选自如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第121位、第138位、第192位、第201位、第204位、第206位和第207位中的至少3个。

3.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点选自以下任一组：

(1)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位和第193位；

(2)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位和第201位；

(3)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第204位和第206位；

(4)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第206位和第207；

(5)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位、第206位和第207位；

(6)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第192位、第193位、第204位和第206位；

(7)所述羰基还原酶突变体的突变位点为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第82位、第88位、第121位、第138位、第142位、第190位、第193位、第201位和第204位。

4.如权利要求2或3所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体包括以下突变中的一种或多种：

①所述第82位的氨基酸残基由W突变为L；

②所述第142位的氨基酸残基由R突变为M、F、H或L，例如M；

③所述第190位的氨基酸残基由A突变为V；

和④所述第193位的氨基酸残基由S突变为A；

较佳地，所述羰基还原酶突变体还包括以下突变中的一种或多种：

①所述第88位的氨基酸残基由F突变为V、I或S，例如I或V；

②所述第121位的氨基酸残基由V突变为A；

③所述第138位的氨基酸残基由A突变为V或L，例如L；

④所述第192位的氨基酸残基由R突变为M；

⑤所述第201位的氨基酸残基由Y突变为F；

⑥所述第204位的氨基酸残基由N突变为A或G，例如A；

⑦所述第206位的氨基酸残基由K突变为H；

和⑧所述第207位的氨基酸残基由K突变为N。

5.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的突变位点和种类如下表所示：

6.一种如式II所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：在液态反应体系中，如式I所示化合物在辅酶和如权利要求1-5中任一项所述的羰基还原酶突变体存在下，进行如下式所示的还原反应即可；

R₁为H、

或苄基；

R_1-1为C₁-C₆烷基或苄基；

R₂为H、

或苄基；

R_2-1为C₁-C₆烷基或苄基；

R₃为

其中R_3-1为C₁-C₆烷基；

R₄为H、NO₂、卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆烷基取代的磺酰基。

7.如权利要求6所述的如式II所示化合物的制备方法，其特征在于，所述的还原反应满足下述条件中的一种或多种：

①所述卤素为F、Cl、Br或I；

②所述C₁-C₆烷基为C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；

③所述辅酶为还原性辅酶和/或氧化性辅酶；所述氧化性辅酶优选为NAD⁺和/或NADP⁺；所述还原性辅酶优选为NADH和/或NADPH；

④所述辅酶与所述如式I所示化合物的质量比为1:(1-100)；较佳地为1:(50-100)；例如1:100或1:75；

⑤所述液态反应体系包括用于辅酶再生的酶和用于辅酶再生的共底物；所述用于辅酶再生的酶优选为醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或多种；例如葡萄糖脱氢酶；所述共底物优选为异丙醇、葡萄糖和甲酸铵中的一种或多种，例如葡萄糖；较佳地，所述液态反应体系还包括缓冲液例如磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液优选为0.1M的磷酸盐缓冲液；

⑥所述还原反应的反应温度为10℃-50℃，更佳地为25℃-35℃，例如30℃；

⑦所述还原反应的反应时间为0.1-72小时，较佳地为3-24小时；

⑧所述还原反应的pH为6-10，较佳地7.0-9.0，例如7.5-8.0；

和，⑨所述羰基还原酶突变体以游离形式的酶、固定化酶、菌粉或菌体形式的酶加入所述还原反应中，较佳地为菌体形式的酶。

8.如权利要求7所述的如式II所示化合物的制备方法，其特征在于，所述还原反应满足下述条件中的一种或多种：

①R₁为H、

②R₂为H、

③R₃为

④R₄为H、NO₂、F、Cl、Br、I、甲基、甲氧基或

⑤所述液态反应体系还包括助溶剂，所述助溶剂较佳地选自二甲基亚砜、异丙醇和甲苯中的一种或多种，更佳地为二甲基亚砜；

⑥所述共底物在所述液态反应体系中的质量浓度为5-30％，较佳地为5％-20％；例如16％、8％或12％；

⑦所述用于辅酶再生的酶在所述液态反应体系中的质量浓度为1-10％；较佳地为1％-5％；例如2.5％、1.6％或2.3％；

⑧所述还原反应结束后，还包括后处理步骤；较佳地，所述后处理步骤包括：向前述液态反应体系中加入有机溶剂，加热、过滤菌体、萃取，有机相水洗、干燥和过滤浓缩有机层得如式II所示化合物；

较佳地，R₁为H、R₂为

R₃为

R₄为F、Cl或Br。

9.如权利要求8所述的如式II所示化合物的制备方法，其特征在于，所述还原反应满足下述条件中的一种或多种：

①所述如式I所示化合物为

②所述如式II所示化合物为

③所述助溶剂在所述液态反应体系中的质量浓度为10％-50％；较佳地为20％-30％；例如30％、29％或28％；

④所述有机溶剂为酯类溶剂、醚类溶剂、醇类溶剂、芳烃类溶剂或氯代烷烃类溶剂；所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯或乙酸异丙脂；所述醚类溶剂优选为甲基叔丁基醚或2-甲基四氢呋喃；所述醇类溶剂优选为正丁醇；所述芳烃类溶剂优选为甲苯；所述氯代烷烃类溶剂优选为二氯甲烷；

⑤所述加热的温度为60℃；

⑥所述加热的时间为1h；

⑦所述水洗中的水包括纯水和含无机盐的水；例如纯水和/或5％食盐水；

和⑧所述干燥为使用干燥剂干燥；所述干燥剂优选为无水硫酸钠；

较佳地，所述后处理步骤包括：向前述还原反应的反应液中加入甲叔醚或乙酸乙酯、加热、过滤菌体和萃取，有机相纯水洗、5％食盐水洗、无水硫酸钠干燥和过滤浓缩有机层得如式II所示化合物。

10.一种如权利要求1-5中任一项所述的羰基还原酶突变体在还原羰基中的应用；

较佳地，所述应用的反应底物和反应条件如权利要求6-9中任一项所述的如式II所示化合物的制备方法中的反应底物和反应条件。

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