KR102594425B1 - 니코틴 및 이의 중간체의 제조 방법 - Google Patents

니코틴 및 이의 중간체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

이민 리덕타제 효소를 코딩하는 변형된 핵산이 기재되어 있다. 또한, 변형된 이민 리덕타제 효소가 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 이민 리덕타제는 (S)-니코틴과 같은 생성물 및 이의 중간체를 생산하는 데 사용될 수 있다.

Description

니코틴 및 이의 중간체의 제조 방법{METHODS FOR PREPARING NICOTINE AND INTERMEDIATES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참초
본 출원은 2020년 11월 18일에 출원된 중국 특허 출원 번호 2020112954567 및 2020년 12월 14일에 출원된 중국 특허 출원 번호 2020114670856에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 야생형 및 변형된 이민 리덕타제, 및 이민 리덕타제 촉매작용을 이용하여 니코틴 및 이의 중간체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
키랄 아민 및 이들의 유도체는 단일 에난티오머 약물의 중요한 브랜치이며, 많은 제약 중간체 및 농약의 구조 단위이다. 현재, 신경계, 항고혈압, 심혈관, 뇌혈관 약물 등을 포함하는 약물의 약 70% 초과가 키랄 아민 및 이들의 유도체이다.
광학적으로 순수한 2-아릴(헤테로) 피롤리딘은 중요한 구조 단위이며, 천연 생성물, 약물 분자 및 합성 중간체에서 흔히 발견된다. 기능화된 키랄 피롤리딘 화합물은 최근 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 입증되었으며, 특히 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환 및 투렛 증후군을 치료하기 위한 전구체 역할을 하기에 적합하다. 또한, 많은 키랄 2-아릴(헤테로)피롤리딘은 천연 생성물이며, 키랄 염기, 키랄 보조제 및 키랄 리간드로 사용될 수 있다.
키랄 아민의 합성은 화학적 또는 생효소적일 수 있다. 화학 합성은 다수의 반응을 필요로 하고, 엄격한 시약을 필요로 하고, 많은 불순물을 생산하고, 종종 98% 초과의 광학 순도를 달성할 수 없고, 수율이 낮고, 규모 확장이 어렵다.
키랄 아민의 생효소적 촉매작용에 일반적으로 사용되는 효소는 주로 트랜스아미나제, 모노아민 옥시다제, 데히드로게나제 및 이민 리덕타제를 포함한다. 그러나, 환원 과정에서 기질 농도는 너무 높을 수 없으며; 그렇지 않으면 전환율이 크게 감소된다. 기질 농도를 높이려면 NAD(P)H와 같은 더 고가의 보조효소(coenzyme)를 추가해야 하므로 비용이 더 높아진다.
니코틴은 강력한 생리학적 활성을 갖는 자연 발생 액체 알칼로이드이다. 니코틴은 일반적으로 천연 담배에서 주로 발견되며, 농업, 의료 분야, 화장품 산업 등에 중요한 적용을 갖는다. 또한, 니코틴산, 니코틴아미드, 코라민, 이소니아지드 및 다른 약물은 니코틴으로부터 다단계 반응을 통해 제조될 수 있다.
(S)-니코틴은 식물 추출로부터 유래하지만, 라세믹 니코틴은 합성을 통해서만 수득될 수 있다. 당업계에서 니코틴의 제조는 성가신 일이다. 많은 경로는 고가의 시약, 다량의 유기 용매를 사용하고, 복잡한 단계를 포함하고, 시간이 오래 걸리고, 저온이 필요하고, 복잡하거나 비용이 많이 드는 분리 및 정제가 필요하다. 또한, 합성적으로 제조된 니코틴은 (S)-니코틴을 제공하기 위해 분리 및 정제되어야 하는 라세미체이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스(Myxococcus fulvus)의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 전형적으로 이종 발현에 최적화된 뉴클레오티드 서열 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유도된 돌연변이 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 3-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용은 핵산 분자를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포는 서열번호 2-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 2-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 포함하는 조(crude) 효소 용액을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 박테리아 숙주 세포에서 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제, 또는 서열번호 3-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 노르니코틴을 제조하는 방법에 관한 것이다. 방법은 미오스민을 본원에 기재된 신규 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 니코틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 (S)-니코틴에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상 및 실시양태는 본 발명의 하기의 상세한 설명으로부터 쉽게 명백할 것이다.
본 개시내용에서, 단수 형태는 복수의 참조를 포함하고, 특정 수치값에 대한 언급은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 적어도 그 특정 값을 포함한다. 따라서, 예컨대, "물질"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 이러한 물질 및 이의 등가물 중 적어도 하나에 대한 언급이다.
값이 기술어 "약"을 사용하여 근사치로 표현될 때, 특정 값은 또 다른 실시양태를 형성한다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 용어 "약"의 사용은 개시된 주제에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치를 나타내며, 이의 기능을 기반으로 하여 사용되는 특정 맥락에서 해석되어야 한다. 당업자는 이를 일상적인 문제로 해석할 수 있을 것이다. 일부 예에서, 특정 값에 사용되는 유효 숫자의 수는 단어 "약"의 범위를 결정하는 하나의 비제한적인 방법일 수 있다. 다른 예에서, 일련의 값에 사용된 단계는 각각의 값에 대해 용어 "약"에 사용 가능한 의도된 범위를 결정하는 데 사용될 수 있다. 존재하는 경우, 모든 범위는 포괄적이고 조합 가능하다. 즉, 범위에 명시된 값에 대한 언급은 그 범위 내의 모든 값을 포함한다.
목록이 제시될 때, 달리 명시되지 않는 한, 그 목록의 각각의 개별 요소 및 그 목록의 모든 조합은 별도의 실시양태로 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다. 예컨대, "A, B, 또는 C"로 제시된 실시양태의 목록은 실시양태 "A", "B", "C", "A 또는 B", "A 또는 C", "B 또는 C", 또는 "A, B, 또는 C"를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
명료함을 위해, 별도의 실시양태와 관련하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 특징은 단일 실시양태에서 조합하여 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 즉, 명백히 양립할 수 없거나 배제되지 않는 한, 각각의 개별 실시양태는 임의의 다른 실시양태(들)와 조합 가능한 것으로 간주되고, 이러한 조합은 또 다른 실시양태로 간주된다. 역으로, 간결함을 위해, 단일 실시예의 맥락에서 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음에 추가로 주목한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직" 등의 배타적 용어 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다. 마지막으로, 실시양태가 일련의 단계의 일부 또는 보다 일반적인 구조의 일부로 기재될 수 있지만, 각각의 단계는 그 자체로 독립적인 실시양태로 간주될 수도 있다.
이민 리덕타제
특정 양상에서, 본 개시내용은 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제(NAD(P)-의존적 옥시도리덕타제)로부터 유래된 이민 리덕타제에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다. 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유래된 이민 리덕타제는 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다.
이민 리덕타제는 믹소코쿠스 풀부스 균주 DSM 16525의 이민 리덕타제로부터 유래될 수 있다. 믹소코쿠스 풀부스 균주 DSM 16525의 게놈 서열은 수탁 번호 NZ_FOIB01000013으로 입수가능하다. NZ_FOIB01000013 영역: 55611..56486, 네가티브 가닥은 하기와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다(서열번호 20):
서열번호 20의 역 상보적 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다(서열번호 21):
서열번호 21은 믹소코쿠스 풀부스의 야생형 이민 리덕타제를 코딩한다(단백질 ID WP_074958336.1, 서열번호 2):
서열번호 21은 믹소코쿠스 풀부스 이외의 숙주 박테리아 세포에서 이종 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 10개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 20개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 30개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 40개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 50개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 60개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 70개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 80개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 90개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 100개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 110개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 120개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 130개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 140개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 150개의 핵산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 1 내지 200개의 핵산 치환을 갖는다.
예컨대, 서열번호 21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타낸 서열번호 1이다:
서열번호 21 및 서열번호 1은 서열번호 2를 코딩한다. 그러나, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 21과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 예컨대 1 내지 약 150개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함한다:
일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 이종 발현에 최적화된 뉴클레오티드 서열 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21에 따른 뉴클레오티드 서열 및 이종 발현에 최적화된 코돈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21에 따른 뉴클레오티드 서열 및 이종 발현을 위한 코돈 최적화로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는다. 코돈 최적화 방법은 당업계에 공지되어 있으며 숙주 유기체의 코돈 사용 편향을 활용하여 표적 핵산의 코돈을 변경한다(Puigbo et al., Nucleic Acids Research, 35, Web Server issue, W126-W131 (2007)).
일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 실질적으로 유사한 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 적어도 약 75%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 적어도 약 85%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21과 적어도 약 85%의 서열 동일성을 갖는다.
핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 "실질적으로 유사한"은 2개 이상의 서열 사이의 적어도 약 65% 서열 동일성을 의미한다. 용어는 2개 이상의 서열 사이의 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 75% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 91% 서열 동일성, 적어도 약 92% 서열 동일성, 적어도 약 93% 서열 동일성, 적어도 약 94% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 적어도 약 96% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 또는 적어도 약 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 지칭한다. 이러한 동일성은 mBLAST 알고리즘과 같은 당업계에 공지된 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
유사한 뉴클레오티드 서열 코돈 최적화는 보세아 종(Bosea sp.) BIWAKO-01과 같은 보세아 종의 이민 리덕타제(NAD(P)-의존적 옥시도리덕타제)에 대한 코딩 영역에 대해 수행될 수 있다. 보세아 종의 이민 리덕타제(NAD(P)-의존적 옥시도리덕타제)를 코딩하는 예시적인 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타나 있다(서열번호 22):
서열번호 22는 하기에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 보세아 종의 이민 리덕타제(단백질 ID: WP_069881969.1)를 코딩한다(서열번호 23):
돌연변이 이민 리덕타제
본 개시내용은 또한 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유도된 하나 이상의 돌연변이 이민 리덕타제를 제공한다. 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유도된 하나 이상의 돌연변이 이민 리덕타제에 대한 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열과 실질적으로 유사할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2와 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2와 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2와 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 10개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 8개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 6개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 4개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이 이민 리덕타제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 비교하여 5개의 아미노산 치환을 갖는다.
믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유도된 하나 이상의 돌연변이 이민 리덕타제에 대한 아미노산 서열은 하기 기재되어 있으며 서열번호 3-19를 포함한다.
서열번호 3은 위치 17의 류신이 알라닌으로 대체되고 위치 39의 글루탐산이 아스파르트산으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 4는 위치 17의 류신이 알라닌으로 대체되고 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 5는 위치 18의 발린이 트레오닌으로 대체되고, 위치 22의 프롤린이 알라닌으로 대체되고, 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 6은 위치 18의 발린이 트레오닌으로 대체되고, 위치 39의 글루탐산이 아스파르트산으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 7은 위치 22의 프롤린이 알라닌으로 대체되고, 위치 64의 발린이 글루탐산으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 8은 위치 22의 프롤린이 알라닌으로 대체되고, 위치 64의 발린이 글루탐산으로 대체되고, 위치 93의 류신이 트레오닌으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 9는 위치 39의 글루탐산이 알라닌으로 대체되고, 위치 114의 아스파르트산이 트립토판으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 10은 위치 39의 글루탐산이 글리신으로 대체되고, 위치 93의 류신이 트레오닌으로 대체되고, 위치 114의 아스파르트산이 트립토판으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 11은 위치 44의 알라닌이 글리신으로 대체되고, 위치 93의 류신이 트레오닌으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 12는 위치 44의 알라닌이 글리신으로 대체되고, 위치 64의 발린이 글루탐산으로 대체되고, 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 13은 위치 64의 발린이 글루탐산으로 대체되고, 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 123의 트레오닌이 트립토판으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 14는 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 93의 류신이 리신으로 대체되고, 위치 123의 트레오닌이 트립토판으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 15는 위치 64의 발린이 글루탐산으로 대체되고, 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 123의 트레오닌이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 16은 위치 67의 아스파라긴이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 114의 아스파르트산이 트립토판으로 대체되고, 위치 123의 트레오닌이 페닐알라닌으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 17은 위치 93의 류신이 리신으로 대체되고, 위치 123의 트레오닌이 페닐알라닌으로 대체되며, 위치 212의 메티오닌이 세린으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 18은 위치 93의 류신이 리신으로 대체되고, 위치 212의 메티오닌이 세린으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
서열번호 19는 위치 212의 메티오닌이 세린으로 대체되고, 위치 243의 아스파라긴이 류신으로 대체된 것을 제외하고는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 상응한다.
또한, 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유도된 하나 이상의 돌연변이 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자가 기재된다. 핵산 분자는 코딩된 아미노산 서열을 서열번호 3-19 중 어느 하나의 것으로 변경하기 위해 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는 서열번호 1을 포함할 수 있다.
발현 벡터, 박테리아 숙주 세포 및 조 효소 용액
본 개시내용은 또한 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제로부터 유래된 이민 리덕타제의 생산을 위한 발현 벡터, 박테리아 숙주 세포, 및 조 효소 용액을 제공한다.
전형적으로, 발현 벡터는 서열번호 2-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터일 수 있다. 예시적인 발현 벡터는 pET 시리즈 플라스미드, pTXB 시리즈 플라스미드, pGEX 시리즈 플라스미드, pETduet 시리즈 플라스미드, pTYB 시리즈 플라스미드, pRSF 시리즈 플라스미드, pET-28a(+) 플라스미드, 또는 pRSFDuet1 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pET 시리즈 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pTXB 시리즈 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pGEX 시리즈 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pETduet 시리즈 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pTYB 시리즈 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pRSF 시리즈 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pET-28a(+) 플라스미드이다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 서열번호 2-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자 및 글루코스 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 분자를 갖는 이중 발현 벡터이다. 이중 발현 벡터는 pRSF 시리즈 또는 pETduet 시리즈로부터의 공지된 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 pRSFDuet1 플라스미드이다.
예시적인 숙주 박테리아 세포는 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 균주를 포함한다. 핵산의 발현을 호스팅할 수 있는 예시적인 에쉐리키아 콜리 균주는 발현 균주 BL21, ROSETTA™, ORIGAMI™, 및 TUNER™ 균주일 수 있다.
핵산의 발현 후, 예컨대 발효, 농축, 버퍼에서 세포의 재현탁 후, 세포는 조 효소 용액을 형성하는 데 사용될 수 있다. 버퍼 중의 세포는 촉매 반응에 사용되는 조 효소 용액을 수득하기 위해 고압 균질화기에 의해 파쇄될 수 있다.
이민 리덕타제의 제조 방법
이민 리덕타제를 생산하는 유전자 조작된 박테리아를 제조하는 방법은 MsIR1 WP_074958336.1, 서열번호 2를 코딩하는 믹소코쿠스 풀부스의 유전자의 코돈 최적화하는 단계, 상응하는 서열에 대한 전체 합성을 수행하는 단계, 유전자의 양 말단에 제한 효소 절단 부위 Nde I 및 EcoR I를 추가하는 단계, 합성된 유전자를 상응하는 발현 벡터에 삽입하는 단계, 발현 벡터를 수용 박테리아로 형질전환하여 이민 리덕타제를 생산하는 유전자 조작된 박테리아 M1를 수득하는 단계, 및 이민 리덕타제의 효율적인 이종 발현을 달성하기 위해 유전자 조작된 박테리아를 발효 및 배양하는 단계를 포함한다. 믹소코쿠스 풀부스의 코돈 최적화된 MsIR1 유전자(서열번호 1)에 의해 코딩된 아미노산 서열은 서열번호 2에 제공된다. 본원에 사용된 용어 "재조합" 및 "유전자 조작된"은 자연적으로 발행하지 않고 실험실 환경에서 제조되는 박테리아를 지칭한다.
본원에 기재된 이민 리덕타제 생산 유전자 조작된 박테리아의 제조에 사용하기 위한 외인성 유전자를 효율적으로 발현할 수 있는 적합한 숙주 박테리아는 BL21, ROSETTA™, ORIGAMI™, 또는 TUNER™ 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 박테리아는 BL21이다. 다른 실시양태에서, 숙주 박테리아 ROSETTA™이다. 추가 실시양태에서, 숙주 박테리아는 ORIGAMI™이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 박테리아는 TUNER™이다.
형질전환 단계는 공지된 정보에 기초하여 성장할 수 있고 본 개시내용에서 이민 리덕타제를 생산할 수 있는 플라스미드를 갖는 숙주를 사용하여 수행된다. 숙주 박테리아의 성장을 만족시킬 수 있고 표적 단백질의 발현을 허용하는 한, 적절한 탄소원, 질소원, 무기 및 다른 영양소를 함유하는 어떠한 인공 또는 천연 배지도 사용될 수 있다. 숙주의 성장이 만족되고 상응하는 활성 이민 리덕타제를 생산할 수 있는 한, 배양 방법 및 배양 조건은 제한되지 않으며, 배양 방법, 유형 등에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 이민 리덕타제는 전술된 유전자 조작된 재조합 박테리아의 배양물, 배양 배지를 원심분리하여 수득된 박테리아 세포, 또는 박테리아 세포의 처리된 생성물로부터 수득될 수 있다. 용어 "처리된 생성물"은 박테리아의 추출물 또는 파쇄 용액, 이민 리덕타제의 분리 및/또는 정제를 통해 수득된 분리된 생성물, 또는 추출물 또는 처리된 생성물의 고정화를 통해 수득된 고정화된 생성물을 지칭한다.
이민 리덕타제를 사용하는 방법
본 개시내용은 또한 전체 세포 또는 조 효소 용액 전환을 통해 키랄 2-(3-피리딜)-피롤리딘 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 2-피리딜-1-피롤린 화합물을 이민 리덕타제로 촉매 처리하여 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘을 수득하는 단계를 포함한다.
(S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘과 같은 2-피리딜 피롤리딘 화합물의 제조 방법은 이민 리덕타제(IRED) 또는 효소를 발현하고 글루코스 데히드로게나제/글루코스 시스템으로부터 보조효소를 재생하는 조작된 박테리아를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 2-피리딜-1-피롤린을 환원시키기 위해 생촉매로서 믹소코쿠스로부터 유래된 이민 리덕타제 및 동일한 조작된 박테리아 중의 글루코스 데히드로게나제/글루코스 시스템으로부터의 보조효소로서 NADP(H)를 사용함으로써 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘을 생산하는 방법을 제공하며 약 98% 초과의 광학 순도를 갖는 생성물을 제공한다. 예컨대, 반응식 1을 참조한다.
반응식 1
본원에 기재된 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자를 발현하거나 본원에 기재된 이민 리덕타제 뿐만 아니라 글루코스 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 분자를 발현하는 유전자 조작된 박테리아는 표적 단백질의 생산을 유도하기 위해 발효 배양 배지에서 증폭 및 배양된다. 이어서, 재조합 박테리아는 수집된다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 원심분리를 이용하여 수집된다.
재조합 박테리아 세포는 버퍼 용액에서 재조합 박테리아를 파쇄함으로써 수득되는 효소 용액을 형성하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 용액은 조용액(crude solution)이다. 그 후, 바람직하게는 버퍼 용액의 성분과의 반응을 위해, 버퍼 용액에 2-피리딜-1-피롤린을 첨가한다. 본원에 사용된 용어 "파쇄"는 조 효소 용액을 제공하기 위해 재조합 박테리아를 하나 이상의 단계에 적용하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 재조합 박테리아는 발효, 농축, 버퍼로 재현탁, 및 압궤를 이용하여 파쇄된다. 다른 실시양태에서, 재조합 박테리아는 조 효소 용액을 수득하기 위해 발효, 농축, 버퍼로 재현탁, 및 고압 균질화기 또는 초음파분쇄기에 의한 압궤에 의해 파쇄된다. 발효 배양 배지는 물, 발효 브로쓰, 또는 상이한 버퍼 용액을 함유하는 수성 배지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 물이다. 다른 실시양태에서, 배지는 발효 브로쓰이다. 추가 실시양태에서, 배지는 상이한 버퍼 용액을 함유하는 수성 배지이다.
버퍼 용액은 물에 첨가된 포스페이트, 트리스(Tris) 히드로클로라이드, 바이카보네이트(bicarbonate), 및 카보네이트 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 버퍼 용액은 물 중의 포스페이트이다. 다른 실시양태에서, 버퍼 용액은 물 중의 트리스 히드로클로라이드이다. 추가 실시양태에서, 버퍼 용액은 물 중의 카보네이트이다.
바람직하게는, 반응 온도는 이민 리덕타제가 이들의 활성을 발현할 수 있는 온도 범위 내, 예컨대 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 40℃로 유지된다. 일부 실시양태에서, 온도는 약 20℃이다. 다른 실시양태에서, 온도는 약 25℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 28℃이다. 추가 실시양태에서, 온도는 약 30℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 35℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 37℃이다. 또 다른 실시양태에서, 온도는 약 40℃이다.
반응이 완료된 후 상청액을 수집한다. 이어서, pH 값이 당업계의 기술을 이용하여 조정될 수 있다. 예컨대, 무기 염기를 사용하여 pH를 조정할 수 있다.
염기성화를 위한 무기 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 탄산나트륨 중 하나 이상의 조합이다. 일부 실시양태에서, 무기 염기는 수산화나트륨이다. 다른 실시양태에서, 무기 염기는 수산화칼륨이다. 추가 실시양태에서, 무기 염기는 탄산나트륨이다.
바람직하게는, pH는 이민 리덕타제가 이들의 활성을 발현할 수 있는 범위 내, 예컨대 약 6 내지 약 10으로 유지된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6이다. 다른 실시양태에서, pH는 약 7이다. 추가 실시양태에서, pH는 약 8이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 9이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 10이다.
기질 농도는 제한되지 않는다. 통상적으로, 기질 농도는 약 10 g/L 내지 약 90 g/L이다. 반응 효과를 고려하면, 기질 농도는 바람직하게는 50 g/L 이상이다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 10 g/L이다. 다른 실시양태에서, 농도는 약 20 g/L이다. 추가 실시양태에서, 농도는 약 30 g/L이다. 또 다른 실시양태에서, 농도는 약 40 g/L이다. 또 다른 실시양태에서, 농도는 약 50 g/L이다. 다른 실시양태에서, 농도는 약 60 g/L이다. 추가 실시양태에서, 농도는 약 70 g/L이다. 또 다른 실시양태에서, 농도는 약 80 g/L이다. 또 다른 실시양태에서, 농도는 약 90 g/L이다. 또한, 생산 효율을 개선하기 위해, 반응에 기질을 회분식으로 첨가할 수 있다. 반응 생성물은 또한 반응이 완료된 후 분리, 즉 수집될 수 있다. 대안적으로, 생성물을 연속적으로 제거하고 후자의 반응에서, 즉 반응 생성물을 단리하지 않고 인시츄로 사용할 수 있다.
이어서, 상청액을 사용하여 하나 이상의 추출을 수행하여 유기상을 제공한다. 일부 실시양태에서, 추출은 유기 용매를 사용하여 수행된다. 추출을 위한 유기 용매는 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 메틸 tert-부틸 에테르 중 하나 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유기 용매는 디클로로메탄이다. 다른 실시양태에서, 유기 용매는 에틸 아세테이트이다. 추가 실시양태에서, 유기 용매는 메틸 tert-부틸 에테르이다.
이어서, 유기상을 1회 또는 다수회 조합한다. 일부 실시양태에서, 추출로부터 수집된 하나의 유기상이 있다. 다른 실시양태에서, 추출로부터 수집된 하나 초과의 유기상이 있다.
이어서, 하나 이상의 유기상을 건조시킨다. 일부 실시양태에서, 건조는 건조제를 사용하여 수행된다. 건조제는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예컨대, 건조제는 무수 황산나트륨, 무수 황산마그네슘 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조제는 무수 황산나트륨이다. 다른 실시양태에서 건조제는 무수 황산마그네슘이다.
일단 건조되면, 용액은 당업계의 기술을 이용하여 여과된다.
여과 후, 용매를 제거하여 표적 생성물을 수득한다. 일부 실시양태에서, 용매는 회전 증발을 이용하여 제거된다.
본 개시내용에서, 이민 리덕타제를 생산하는 유전자 조작된 박테리아는 시드 배양 배지에서 배양되고, 특정 비율로 발효 배양 배지에 접종된다. 특정 기간 후, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG), 락토스 또는 이들의 혼합물과 같은 유도제를 첨가하여 특정 기간 동안 배양을 유도하고, 고압 파쇄를 위해 원심분리를 통해 박테리아를 수집한다. 전환은 하기 반응 조건에서 2 내지 24시간 동안 수행된다: 6.0 내지 10.0의 pH 값을 갖는 버퍼 용액, 10 g/L 내지 100 g/L의 농도를 갖는 2-피리딜-1-피롤린 기질, 20℃ 내지 40℃의 반응 온도, 및 200 rpm의 회전 속도. 반응 완료 후, 원심분리, 염기성화, 추출 및 탈용매화를 수행하여 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘을 80% 초과의 수율로 수득한다.
본 개시내용은 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 생촉매적 합성 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 믹소코쿠스 풀부스 및 이민 리덕타제의 유전자 조작된 박테리아로부터 유래된 이민 리덕타제를 사용하여 2-피리딜-1-피롤린 화합물을 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘으로 환원시키는 방법을 제공한다. 믹소코쿠스 풀부스로부터 유래된 이민 리덕타제는 높은 활성, 반응 기질 농도, 반응 수율을 갖는다. 또한, 생성물의 광학 순도가 높고, 반응 과정, 조작이 간단하고, 에너지 소비가 적다. 따라서, 믹소코쿠스 풀부스로부터 유래된 이민 리덕타제는 미국 환경 보호국(US Environmental Protection Agency)에 의해 정의된 녹색 화학 요구 사항을 충족하며, 산업 생산에서 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘 화합물의 생물전환 및 제조에 사용될 수 있다.
(S)-니코틴을 제조하기 위한 이민 리덕타제의 사용 방법
본 개시내용은 신규 효소 촉매작용 기술을 이용하여 (S)-니코틴을 제조하는 방법을 제공한다. 이렇게 함으로써 높은 수율과 높은 광학 순도를 갖는 (S)-니코틴을 수득할 수 있다. 또한, (S)-니코틴은 각각의 중간체를 별도로 단리할 필요 없이, 원-포트(one-pot) 다단계 통합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 다른 합성 경로보다 단계가 더 짧다. 유리하게는, (S)-니코틴을 제조하는 방법은 부틸 리튬 및 리튬 헥사메틸디실라지드와 같은 위험한 화학 물질을 사용할 필요가 없으므로 안전 문제, 가혹한 반응 조건, 높은 독성 등을 피할 수 있다. 또한, 산업폐수, 폐가스 및 잔류물이 적게 발생하고, 생산 비용이 낮고, 생산 안전성을 제어할 수 있다. 새로운 효소는 효율적으로 재사용될 수 있으며, 이는 여러 가지 이유로 유익하다.
방법은 또한 유리하게는 (S)-니코틴의 직접적 제조를 허용하여 불필요한 분해 단계의 필요성을 피한다. 마지막으로, 방법은 짧고 (S)-니코틴의 총 수율이 높다.
따라서, 본 개시내용은 니코틴을 제조하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "니코틴"은 하기 구조를 갖는 3-(1-메틸-2-피롤리디닐)피리딘을 지칭한다:
.
일부 실시양태에서, 니코틴은 (S)-니코틴이다. (S)-니코틴은 하기 구조를 갖는 (S)-3-(1-메틸-2-피롤리디닐)피리딘을 지칭한다:
.
유리하게는, 방법은 높은 광학 순도를 갖는 (S)-니코틴을 생산한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 약 90% ee("에난티오머 과잉")의 광학 순도를 갖는 (S)-니코틴을 제공한다. 다른 실시양태에서, 방법은 적어도 약 90% ee, 약 91% ee, 약 92% ee, 약 93% ee, 약 94% ee, 약 95% ee, 약 96% ee, 약 97% ee, 약 98% ee, 약 99% ee, 또는 약 100 % ee의 광학 순도를 갖는 (S)-니코틴을 제공한다. 따라서, 방법은 약 10% ee 미만의 (R)-니코틴을 갖는 생성물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 방법은 약 10% ee, 약 9% ee, 약 8% ee, 약 7% ee, 약 6% ee, 약 5% ee, 약 4% ee, 약 3% ee, 약 2% ee, 약 1% ee, 또는 약 0 % ee 미만의 광학 순도를 갖는 (R)-니코틴을 제공한다.
본원에 상세히 기재된 바와 같이, (S)-니코틴은 반응식 2에 나타낸 바와 같이 제조되며, 여기서 M은 알칼리 금속이고 n은 0 이상이다. 일부 실시양태에서, n은 0-10이다. 다른 실시양태에서, n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 추가 실시양태에서, n은 0이다.
반응식 2
반응식 2의 일련의 단계는 중간체 화합물 2, 3 및 4 각각을 단리하여 개별적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 반응식 2에서 일련의 단계는 각각의 중간체 화합물을 단리하지 않고 원-포트에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 화합물 2가 단리된다. 추가 실시양태에서, 화합물 3이 단리된다. 추가 실시양태에서, 화합물 4가 단리된다. 다른 실시양태에서, 화합물 2, 3 및 4 중 어느 것도 단리되지 않는다.
이 반응식에서, 니코틴산 에스테르(1) 및 비닐 피롤리돈은 축합되어 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디하이드로-1H-피롤-2-올레이트(2)의 염을 수득한다. 이어서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염은 미오스민(3)으로 전환된다. 미오스민(3)은 생물학적 효소 시스템 하에서 촉매적 환원되어 노르니코틴(4)을 수득한다. 이어서, 노르니코틴(4)의 피롤 고리는 메틸화되어 (S)-니코틴(5)을 수득한다.
방법은 니코틴산 에스테르 및 비닐 피롤리돈을 축합하여 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트의 염을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트의 염은 나트륨, 칼륨 또는 리튬 염이다. 다른 양상에서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트의 염은 칼륨 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트이다. 추가 양상에서, 염은 리튬 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트이다.
니코틴산 에스테르의 예는, 제한 없이, 메틸 니코티네이트, 에틸 니코티네이트, 또는 tert-부틸 니코티네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 니코틴산 에스테르는 메틸 니코티네이트이다. 다른 실시양태에서, 니코틴산 에스테르는 에틸 니코티네이트이다. 추가 실시양태에서, 니코틴산 에스테르는 tert-부틸 니코티네이트이다. 축합은 강염기 존재 하에 수행된다. 강염기의 예는, 제한 없이, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨, 나트륨 tert-부톡사이드, 칼륨 tert-부톡사이드, 또는 리튬 tert-부톡사이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 강염기는 수산화나트륨이다. 다른 실시양태에서, 강염기는 수산화칼륨이다. 추가 실시양태에서, 강염기는 수소화나트륨이다. 또 다른 실시양태에서, 강염기는 나트륨 tert-부톡사이드이다. 또 다른 실시양태에서, 강염기는 칼륨 tert-부톡사이드이다. 다른 실시양태에서, 강염기는 리튬 tert-부톡사이드이다. 바람직하게는, 강염기는 칼륨 tert-부톡사이드이다.
특정 실시양태에서, 비닐피롤리돈 및 칼륨 tert-부톡사이드는 n-헥산 또는 톨루엔과 같은 유기 용매에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 용매는 n-헥산이다. 다른 실시양태에서, 용매는 톨루엔이다. 반응은 승온, 예컨대 용매의 환류 온도에서 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트의 염을 형성하기에 충분한 시간 동안 수행될 수 있다. 예컨대, 온도는 약 50℃ 내지 70℃이다. 일부 실시양태에서, 온도는 약 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 약 70℃이다. 다른 실시양태에서, 온도는 약 50℃ 내지 약 70℃, 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 50℃ 내지 약 60℃, 약 50℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 55℃ 내지 약 65℃, 약 55℃ 내지 약 60℃, 약 60℃ 내지 약 70℃, 약 60℃ 내지 약 65℃, 또는 약 65℃ 내지 약 70℃이다. 추가 실시양태에서, 온도는 약 55℃ 내지 약 65℃이다.
일부 실시양태에서, 반응은 적어도 약 1시간 동안 수행된다. 다른 실시양태에서, 반응은 약 1 내지 약 6시간 동안 수행된다. 추가 실시양태에서, 반응은 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 또는 약 6시간 동안 수행된다.
본원에 사용된 용어 "환류"는 용매 또는 용매 혼합물의 환류 온도를 지칭한다. 이러한 정보는 당업자에게 이해되고, 활용되는 용매 또는 이의 혼합물에 의존한다.
그 후, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염을 단리하기 위해 추출 및 농축을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 통상적인 단계가 수행될 수 있다. 대안적으로, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염 미오스민은 단리되지 않고 다음 단계로 진행된다.
이어서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염은 미오스민으로 전환된다. 본 발명자들은 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염의 미오스민으로의 전환이 반응식 3에 나타낸 바와 같이 진행된다고 가정한다. 반응식 3에서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염은 개환(a→b), 탈카르복실화(b→c), 고리화(c→d) 및 제거(d→e)를 겪는다.
반응식 3
일부 실시양태에서, 미오스민은 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염을 희산(dilute acid)과 같은 산과 조합함으로써 형성된다. 희산의 예는, 제한 없이, 과염소산, 황산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 트리플루오로메탄술폰산, 클로로술폰산, 술팜산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 벤젠술폰산, 및 피크르산, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 양상에서, 희산은 염산이다. 다른 양상에서, 희산은 과염소산이다. 추가 양상에서, 희산은 황산이다. 또 다른 양상에서, 희산은 브롬화수소산이다. 또 다른 양상에서, 희산은 인산이다. 다른 양상에서, 희산은 트리플루오로메탄술폰산이다. 추가 양상에서, 희산은 클로로술폰산이다. 또 다른 양상에서, 희산은 술팜산이다. 또 다른 양상에서, 희산은 트리플루오로아세트산이다. 또 다른 양상에서, 희산은 트리클로로아세트산이다. 다른 양상에서, 희산은 벤젠술폰산이다. 추가 양상에서, 희산은 피크르산이다. 일부 실시양태에서, 희산의 농도는 약 3 M 내지 약 6 M이다. 다른 실시양태에서, 희산의 농도는 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6이다. 반응은 개환을 완료하기에 충분한 시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 반응은 적어도 약 1시간 동안 수행된다. 다른 실시양태에서, 반응은 적어도 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 16시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 24시간, 약 28시간, 또는 약 30시간 동안 수행된다.
반응은 환류와 같은 승온으로 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응은 약 90℃ 내지 약 110℃의 온도에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 반응은 약 90℃, 약 95℃, 약 100℃, 약 105℃, 또는 약 110℃의 온도에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 반응은 약 90℃ 내지 약 105℃, 약 90℃ 내지 약 100℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 110℃, 약 95℃ 내지 약 105℃, 약 95℃ 내지 약 100℃, 약 100℃ 내지 약 110℃, 약 100 ℃ 내지 약 105℃, 또는 약 105℃ 내지 약 110℃의 온도에서 수행된다. 그러나, 당업자는 선택된 시약에 기초하여 적절한 온도를 선택할 수 있을 것이다.
미오스민 용액은 임의적으로 염기성 pH로 조정된다. 일부 실시양태에서, 미오스민 용액의 pH는 약 10 내지 약 12의 pH로 조정된다. 다른 실시양태에서, 미오스민 용액의 pH는 약 10, 11 또는 12의 pH로 조정된다. 추가 실시양태에서, 미오스민 용액의 pH는 약 10 내지 약 11 또는 약 11 또는 약 12의 pH로 조정된다. 희산 용액은, 예컨대 약 실온으로 냉각될 수 있다. 이어서, 용액은 희산 용액의 pH를 약 9 내지 약 14로 조정하는 염기로 처리된다. 일부 실시양태에서, pH는 약 13으로 조정된다. 다른 실시양태에서, pH는 약 10으로 조정된다. 실시양태에서, pH는 약 11로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 12로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 13으로 조정된다. 다른 실시양태에서, pH는 약 14로 조정된다. 그 후, 미오스민을 단리하기 위해, 추출 및 농축을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 통상적인 단계가 수행될 수 있다. 대안적으로, 미오스민은 단리되지 않고 다음 단계로 진행된다.
이어서, 미오스민은 생물학적 효소 시스템을 사용하여 촉매적 환원되어 노르니코틴을 수득한다. 본원에 사용된 용어 "노르니코틴"은 하기 구조를 갖는 3-[2-피롤리디닐]피리딘을 지칭한다:
노르니코틴은 또한 하기 구조를 갖는 3-[(2S)-2-피롤리디닐]피리딘을 지칭하는 (S)-노르니코틴을 포함한다:
촉매적 환원은 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 온도는 약 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 또는 40℃이다. 다른 실시양태에서, 온도는 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 20℃ 내지 약 35, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 28℃, 약 25℃ 내지 약 35℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 37℃, 또는 약 35℃ 내지 약 40℃이다. 추가 실시양태에서, 온도는 약 22 내지 약 37℃이다. 촉매적 환원을 위한 반응 시간은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 촉매적 환원은 약 4시간 내지 약 24시간, 바람직하게는 약 8시간 내지 약 16시간 동안 수행된다. 다른 실시양태에서, 촉매적 환원은 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 또는 약 16시간 동안 수행된다.
그 후, 노르니코틴 중간체의 피롤 고리는 메틸화되어 니코틴을 수득한다. 본원에 사용된 용어 "메틸화"는 피롤리딘 고리의 질소 원자와 같은 노르니코틴 상의 위치에 메틸 치환기를 추가하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 메틸화는 포름알데히드 및 포름산, 즉, 에시와일러-클라크(Eschweiler-Clarke) 반응 시약을 사용하여 수행된다. 당업자는 이러한 반응을 수행하는 방법을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 과량의 포름알데히드, 과량의 포름산, 또는 과량의 포름알데히드 및 포름산 둘 모두가 사용된다. 반응은 50℃ 내지 약 70℃와 같은 승온에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 승온은 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃이다. 다른 실시양태에서, 승온은 약 50℃ 내지 약 70℃, 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 50℃ 내지 약 60℃, 약 50℃ 내지 약 55℃, 약 55℃ 내지 약 70℃, 약 55℃ 내지 약 65℃, 약 55℃ 내지 약 60℃, 약 60℃ 내지 약 70℃, 약 60℃ 내지 약 65℃, 약 65℃ 내지 약 70℃이다. 추가 실시양태에서, 승온은 약 60℃ 내지 약 65℃이다.
이어서, (S)-니코틴은 당업계의 기술을 이용하여 단리된다. 용액의 pH는 약 9 내지 약 14로 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, pH는 약 9로 조정된다. 다른 실시양태에서, pH는 약 10으로 조정된다. 추가 실시양태에서, pH는 약 11로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 12로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, pH는 약 13으로 조정된다. 다른 실시양태에서, pH는 약 14로 조정된다. 그 후, (S)-니코틴은 표준 기술을 통해 수득된다.
이어서, 니코틴은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제는, 임의적으로 감압 하의, 증류를 포함한다. 증류는 약 110℃ 내지 약 125℃와 같은 승온에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 증류는 약 110℃, 약 115℃, 약 120℃, 또는 약 125℃에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 증류는 약 110℃ 내지 약 125℃, 약 110℃ 내지 약 120℃, 약 110℃ 내지 약 115℃, 약 115℃ 내지 약 125℃, 115℃ 내지 약 120℃, 또는 약 120℃ 내지 약 125℃에서 수행된다.
이에 따라 방법은, 예컨대 약 적어도 약 95%의 높은 광학 순도로 (S)-니코틴을 제공한다. 일부 실시양태에서, 광학 순도는 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%이다. 다른 실시양태에서, 광학 순도는 100%, 즉 단일 키랄 (S)-니코틴이다. 유리하게는, 방법은 천연 추출 생성물의 광학 순도와 일치하는 광학 순도의 (S)-니코틴을 제공한다. 높은 광학 순도 외에, 방법은 높은 수율의 (S)-니코틴을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 80% 이상의 (S)-니코틴 수율을 초래한다. 특정 실시양태에서, (S)-니코틴 수율은 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%이다.
양상 I
양상 1. 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하고 이종 발현에 최적화된 뉴클레오티드 서열 코돈을 포함하는 핵산 분자.
양상 2. 양상 1에 있어서, 이종 발현이 박테리아 숙주 세포에서의 발현인 핵산 분자.
양상 3. 양상 1 또는 2에 있어서, 이종 발현이 발현 균주 BL21, ROSETTA™, ORIGAMI™, 및 TUNER™ 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 에쉐리키아 콜리 숙주 세포에서의 발현인 핵산 분자.
양상 4. 양상 1 내지 3 중 어느 한 양상에 있어서, 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
양상 5. 양상 1 내지 4 중 어느 한 양상에 있어서, 발현 벡터 내에 있는 것인 핵산 분자.
양상 6. 양상 5에 있어서, 발현 벡터가 pET 시리즈 플라스미드, pTXB 시리즈 플라스미드, pGEX 시리즈 플라스미드, pETduet 시리즈 플라스미드, pTYB 시리즈 플라스미드, pRSF 시리즈 플라스미드, pET-28a(+) 플라스미드, 및 pRSFDuet1 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
양상 7. 양상 5 또는 6에 있어서, 발현 벡터가 pRSFDuet1인 핵산 분자.
양상 8. 양상 5 내지 7 중 어느 한 양상에 있어서, 발현 벡터가 글루코스 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인 핵산 분자.
양상 9. 서열번호 3-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 믹소코쿠스 풀부스의 돌연변이 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자.
양상 10. 양상 9에 있어서, 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열번호 3-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 코딩하도록 돌연변이된 것인 핵산 분자.
양상 11. 양상 9 또는 10에 있어서, 발현 벡터 내에 있는 것인 핵산 분자.
양상 12. 양상 11에 있어서, 발현 벡터가 pET 시리즈 플라스미드, pTXB 시리즈 플라스미드, pGEX 시리즈 플라스미드, pETduet 시리즈 플라스미드, pTYB 시리즈 플라스미드, pET-28a(+) 플라스미드, 및 pRSFDuet1 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
양상 13. 양상 11 또는 12에 있어서, 발현 벡터가 pRSFDuet1인 핵산 분자.
양상 14. 양상 11 내지 13 중 어느 한 양상에 있어서, 발현 벡터가 글루코스 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인 핵산 분자.
양상 15. 양상 1 내지 14 중 어느 한 양상의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
양상 16. 양상 1 내지 14 중 어느 한 양상의 핵산 분자 및 서열번호 2-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
양상 17. 서열번호 2-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 포함하는 조 효소 용액.
양상 18. 박테리아 숙주 세포에서 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제 또는 서열번호 3-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 생산하는 방법으로서,
a) 양상 1 내지 14 중 어느 한 양상의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 발효 배양 배지에서 제1 온도에서 배양하는 단계;
b) 박테리아 숙주 세포를 발효 배양 배지에서 제2 온도에서 배양하는 단계; 및
c) 박테리아 숙주 세포를 수집하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
양상 19. 양상 18에 있어서, 발효 배지가 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 및 락토스로 이루어진 군으로부터 선택되는 유도 화합물을 포함하는 것인 방법.
양상 20. 양상 18 또는 19에 있어서, 발효 배양 배지에서 제1 온도에서 배양하는 단계가 약 30℃ 내지 40℃에서 약 150 회전/분(rpm) 내지 250 rpm의 회전 속도로 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 21. 양상 18 내지 20 중 어느 한 양상에 있어서, 발효 배양 배지에서 제1 온도에서 배양하는 단계가 발효 배지의 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 약 2.0 이상일 때까지 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 22. 양상 18 내지 21 중 어느 한 양상에 있어서, 발효 배양 배지에서 제2 온도에서 배양하는 단계가 약 20℃ 내지 30℃에서 약 150 회전/분(rpm) 내지 250 rpm의 회전 속도로 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 23. 양상 18 내지 22 중 어느 한 양상에 있어서, 발효 배양 배지에서 제2 온도에서 배양하는 단계가 약 1시간 내지 약 24시간 동안 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 24. 양상 18 내지 23 중 어느 한 양상에 있어서, 수집이 원심분리에 의한 것인 방법.
양상 25. 양상 15 또는 16의 박테리아 숙주 세포 또는 양상 17의 조 효소 용액을 2-피리딜-1-피롤린과 반응 시스템에서 조합 및 반응시키는 단계를 포함하는, 키랄 (s)-2-(3-피리딜)-피롤리딘을 생촉매적으로 합성하는 방법.
양상 26. 양상 25에 있어서, 조합 및 반응시키는 단계가 양상 15 또는 16의 박테리아 숙주 세포 또는 양상 17의 조 효소 용액을 버퍼 용액에 첨가하고, 2-피리딜-1-피롤린을 반응 시스템 중의 버퍼 용액에 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 27. 양상 25 또는 26에 있어서, 반응 시스템으로부터 상청액을 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 28. 양상 25 내지 27 중 어느 한 양상에 있어서, pH 값을 7.0 초과로 조정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 29. 양상 25 내지 28 중 어느 한 양상에 있어서, 유기상을 유기 용매를 사용하여 추출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 30. 양상 25 내지 29 중 어느 한 양상에 있어서, 유기상을 건조시켜 키랄 (s)-2-(3-피리딜)-피롤리딘을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 31. 양상 25 내지 30 중 어느 한 양상에 있어서, 2-피리딜-1-피롤린이 조합 단계에서 10 g/L 내지 100 g/L의 농도인 방법.
양상 32. 양상 25 내지 31 중 어느 한 양상에 있어서, 반응이 약 20℃ 내지 약 40℃의 반응 온도 및 약 200 rpm의 회전 속도에서 일어나는 것인 방법.
양상 33. 양상 25 내지 32 중 어느 한 양상에 있어서, 반응이 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안 일어나는 것인 방법.
양상 34. 양상 25 내지 33 중 어느 한 양상에 있어서, 반응이 약 6.0 이상의 pH에서 일어나는 것인 방법.
양상 35. 양상 26 내지 34 중 어느 한 양상에 있어서, 버퍼 용액이 약 6.0 내지 약 10.0의 pH 값을 갖는 것인 방법.
양상 36. 양상 26 내지 35 중 어느 한 양상에 있어서, 버퍼 용액이 물에 첨가된 포스페이트 버퍼, 트리스 히드로클로라이드, 바이카보네이트 버퍼, 및 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 버퍼를 포함하는 것인 방법.
양상 37. 양상 25 내지 36 중 어느 한 양상에 있어서, 반응 시스템이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 글루코스, 및 글루코스 데히드로게나제를 포함하는 것인 방법.
양상 38. 양상 25 내지 37 중 어느 한 양상에 있어서, 80% 초과의 수율을 갖는 것인 방법.
양상 II
양상 1-II. 높은 광학 순도를 갖는 니코틴의 제조 방법으로서,
(a) 니코틴산 에스테르 및 비닐 피롤리돈을 강한 알칼리 물질의 존재 하에서 축합시켜 칼륨 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트를 수득하는 단계;
(b) 칼륨 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트를 묽은 농도의 산성 화합물에서 환류 교반한 후 원-포트 반응시켜 미오스민을 수득하는 단계;
(c) 미오스민을 생물학적 효소 시스템의 존재 하에서 촉매적 환원시켜 높은 광학 순도를 갖는 중간체인 노르니코틴을 수득하는 단계; 및
(d) 노르니코틴의 피롤 고리를 아미노메틸화 반응시켜 최종 생성물인 (S)-니코틴을 수득하는 단계
를 포함하는 것인 제조 방법.
양상 2-II. 양상 1-II에에 있어서, 니코틴산 에스테르가 메틸 니코티네이트, 에틸 니코티네이트, 또는 tert-부틸 니코티네이트인 제조 방법.
양상 3-II. 양상 2-II에 있어서, 강한 알칼리 물질이 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨, 나트륨 tert-부톡사이드, 칼륨 tert-부톡사이드, 또는 리튬 tert-부톡사이드인 제조 방법.
양상 4-II. 양상 2-II에 있어서, 산성 화합물이 과염소산, 황산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 트리플루오로메탄술폰산, 클로로술폰산, 술팜산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 벤젠술폰산, 및 피크르산 중 하나 또는 2개 이상의 혼합물인 제조 방법.
양상 5-II. 양상 4-II에 있어서, 염산의 농도가 3 M 내지 6 M인 제조 방법.
양상 6-II. 양상 4-II에 있어서, 원-포트 반응이 개환 반응, 탈카르복실화 반응, 및 고리화 반응을 포함하는 것인 제조 방법.
양상 7-II. 양상 6-II에 있어서, 환류 교반 동안 생성된 미오스민을 냉각시킨 후, 알칼리를 첨가하여 pH를 9 내지 14로 조정하고, 미오스민을 추출 및 농축을 통해 수득하는 것인 제조 방법.
양상 8-II. 양상 7-II에 있어서, 생물학적 효소 촉매 시스템이 생물학적 효소 순환 촉매작용을 포함하고, 미오스민이 생물학적 효소 순환 촉매작용에 의해 환원되어 높은 광학 순도를 갖는 중간체인 노르니코틴을 수득하는 것인 제조 방법.
양상 9-II. 양상 8-II에 있어서, 생물학적 효소 시스템이 글루코스 데히드로게나제 및 이민 리덕타제를 포함하는 것인 제조 방법.
양상 10-II. 양상 9-II에 있어서, 제조된 (S)-니코틴의 광학 순도가 99% 이상에 도달하는 것인 제조 방법.
양상 11-II. 양상 10-II에 있어서, 생물학적 효소 촉매 시스템의 반응 온도가 22℃ 내지 37℃인 제조 방법.
양상 12-II. 양상 11-II에 있어서, 생물학적 효소 촉매 시스템의 반응 시간이 8 내지 16시간인 제조 방법.
양상 13-II. 양상 11-II에 있어서, 노르니코틴의 피롤 고리를 아미노메틸화 반응시킨 후, 먼저 pH를 9 내지 14로 조정하고, 최종 생성물인 (S)-니코틴을 추출제로의 추출, 농축 및 증류를 통해 수득하는 것인 제조 방법.
양상 14-II. 양상 7-II 또는 양상 13-II에 있어서, 추출에 사용되는 추출제가 n-헥산, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 및 부틸 아세테이트 중 하나 또는 2개 이상의 혼합물인 제조 방법.
양상 III
양상 III-1. 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제를 코딩하고 이종 발현에 최적화된 뉴클레오티드 서열 코돈을 포함하는 핵산 분자.
양상 III-2. 양상 III-1에 있어서, 이종 발현이 박테리아 숙주 세포에서의 발현인 핵산 분자.
양상 III-3. 양상 III-1 또는 2에 있어서, 이종 발현이 발현 균주 BL21, ROSETTA™, ORIGAMI™, 및 TUNER™ 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 에쉐리키아 콜리 숙주 세포에서의 발현인 핵산 분자.
양상 III-4. 양상 III-1 내지 3 중 어느 한 양상에 있어서, 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
양상 III-5. 양상 III-1 내지 4 중 어느 한 양상에 있어서, 발현 벡터에 있는 것인 핵산 분자.
양상 III-6. 양상 III-5에 있어서, 발현 벡터가 pET 시리즈 플라스미드, pTXB 시리즈 플라스미드, pGEX 시리즈 플라스미드, pETduet 시리즈 플라스미드, pTYB 시리즈 플라스미드, pET-28a(+) 플라스미드, 및 pRSFDuet1 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
양상 III-7. 양상 III-5 또는 6에 있어서, 발현 벡터가 pRSFDuet1인 핵산 분자.
양상 III-8. 양상 III-5 내지 7 중 어느 한 양상에 있어서, 발현 벡터가 글루코스 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인 핵산 분자.
양상 III-9. 서열번호 3-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하는 믹소코쿠스 풀부스의 돌연변이 이민 리덕타제를 코딩하는 핵산 분자.
양상 III-10. 양상 III-9에 있어서, 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열번호 3-19 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 코딩하도록 돌연변이된 것인 핵산 분자.
양상 III-11. 양상 III-9 또는 10에 있어서, 발현 벡터 내에 있는 것인 핵산 분자.
양상 III-12. 양상 III-11에 있어서, 발현 벡터가 pET 시리즈 플라스미드, pTXB 시리즈 플라스미드, pGEX 시리즈 플라스미드, pETduet 시리즈 플라스미드, pTYB 시리즈 플라스미드, pRSF 시리즈 플라스미드, pET-28a(+) 플라스미드, 및 pRSFDuet1 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
양상 III-13. 양상 III-11 또는 12에 있어서, 발현 벡터가 pRSFDuet1인 핵산 분자.
양상 III-14. 양상 III-11 내지 13 중 어느 한 양상에 있어서, 발현 벡터가 글루코스 데히드로게나제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인 핵산 분자.
양상 III-15. 양상 III-1 내지 14 중 어느 한 양상의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
양상 III-16. 양상 III-1 내지 14 중 어느 한 양상의 핵산 분자 및 서열번호 2-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
양상 III-17. 서열번호 2-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 포함하는 조 효소 용액.
양상 III-18. 박테리아 숙주 세포에서 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스의 이민 리덕타제 또는 서열번호 3-19 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 이민 리덕타제를 생산하는 방법으로서,
a) 양상 III-1 내지 14 중 어느 한 양상의 핵산 분자를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 발효 배양 배지에서 제1 온도에서 배양하는 단계;
b) 박테리아 숙주 세포를 발효 배양 배지에서 제2 온도에서 배양하는 단계; 및
c) 박테리아 숙주 세포를 수집하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
양상 III-19. 양상 III-18에 있어서, 발효 배지가 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 및 락토스로 이루어진 군으로부터 선택되는 유도 화합물을 포함하는 것인 방법.
양상 III-20. 양상 III-18 또는 19에 있어서, 발효 배양 배지에서 제1 온도에서 배양하는 단계가 30℃ 내지 40℃에서 약 150 회전/분(rpm) 내지 250 rpm의 회전 속도로 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 III-21. 양상 III-18 내지 20 중 어느 한 양상에 있어서, 발효 배양 배지에서 제1 온도에서 배양하는 단계가 발효 배지의 600 nm에서의 광학 밀도(OD600)가 약 2.0 이상일 때까지 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 III-22. 양상 III-18 내지 21 중 어느 한 양상에 있어서, 발효 배양 배지에서 제2 온도에서 배양하는 단계가 약 20℃ 내지 30℃에서 약 150 회전/분(rpm) 내지 250 rpm의 회전 속도로 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 III-23. 양상 III-18 내지 22 중 어느 한 양상에 있어서, 발효 배양 배지에서 제2 온도에서 배양하는 단계가 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
양상 III-24. 양상 III-18 내지 23 중 어느 한 양상에 있어서, 수집이 원심분리에 의한 것인 방법.
양상 III-25. 양상 III-15 또는 16의 박테리아 숙주 세포 또는 양상 III-17의 조 효소 용액을 2-피리딜-1-피롤린과 조합하는 단계를 포함하는, 2-(3-피리딜)-피롤리딘을 제조하는 방법.
양상 III-26. 양상 III-25에 있어서, 2-(3-피리딜)-피롤리딘이 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘인 방법.
양상 III-27. 양상 III-25에 있어서, 양상 III-15 또는 16의 박테리아 숙주 세포 또는 양상 III-17의 조 효소 용액을 버퍼 용액과 조합하는 단계 및 2-피리딜-1-피롤린을 버퍼 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 III-28. 양상 III-25 내지 27 중 어느 한 양상에 있어서, pH 값을 7.0 초과로 조정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 III-29. 양상 III-25 내지 28 중 어느 한 양상에 있어서, 방법이 약 20℃ 내지 약 40℃의 반응 온도 및 약 200 rpm의 회전 속도에서 일어나는 것인 방법.
양상 III-30. 양상 III-25 내지 29 중 어느 한 양상에 있어서, 방법이 약 6.0 이상의 pH에서 일어나는 것인 방법.
양상 III-31. 양상 III-26 내지 30 중 어느 한 양상에 있어서, 버퍼 용액이 약 6.0 내지 약 10.0의 pH 값을 갖는 것인 방법.
양상 III-32. 양상 III-26 내지 31 중 어느 한 양상에 있어서, 버퍼 용액이 물에 첨가된 포스페이트 버퍼, 트리스 히드로클로라이드, 바이카보네이트 버퍼, 및 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 버퍼를 포함하는 것인 방법.
양상 III-33. 양상 III-25 내지 32 중 어느 한 양상에 있어서, 반응 시스템이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 글루코스, 및 글루코스 데히드로게나제를 포함하는 것인 방법.
양상 III-34. 미오스민을 양상 III-15 또는 16의 박테리아 숙주 세포 또는 양상 III-17의 조 효소 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 노르니코틴을 제조하는 방법.
양상 III-35. 양상 III-34에 있어서, 글루코스 데히드로게나제를 추가로 포함하는 것인 방법.
양상 III-36. 양상 III-34 또는 35에 있어서, 글루코스 및 NAD(P)-2Na를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
양상 III-37. 양상 III-34 내지 36 중 어느 한 양상에 있어서, 노르니코틴이 (S)-노르니코틴인 방법.
양상 III-38. 양상 III-34 내지 37 중 어느 한 양상에 있어서, 약 20℃ 내지 약 40℃ 또는 약 22℃ 내지 약 37℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
양상 III-39. 양상 III-34 내지 38 중 어느 한 양상에 있어서, 노르니코틴을 메틸화하여 니코틴을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
양상 III-40. 양상 III-39에 있어서, 메틸화가 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 수행되는 것인 방법.
양상 III-41. 양상 III-39 또는 40에 있어서, 약 50℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 65℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
양상 III-42. 양상 III-39 내지 41 중 어느 한 양상에 있어서, 니코틴이 정제되는 것인 방법.
양상 III-43. 양상 III-42에 있어서, 정제가, 임의적으로 감압 하의, 증류를 포함하는 것인 방법.
양상 III-44. 양상 III-43에 있어서, 증류가 약 110℃ 내지 약 125℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
양상 III-45. 양상 III-39 내지 44 중 어느 한 양상에 있어서, 니코틴이 단리되는 것인 방법.
양상 III-46. 양상 III-39 내지 45 중 어느 한 양상에 있어서, 니코틴이 (S)-니코틴인 방법.
양상 III-47. 양상 III-46에 있어서, (S)-니코틴이 적어도 약 95% ee, 바람직하게는 적어도 약 99% ee의 광학 순도를 갖는 것인 방법.
양상 III-48. 양상 III-34 내지 47 중 어느 한 양상에 있어서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염을 희산과 접촉시켜 미오스민을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
양상 III-49. 양상 III-48에 있어서, 희산이 과염소산, 황산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 트리플루오로메탄술폰산, 클로로술폰산, 술팜산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 벤젠술폰산, 및 피크르산, 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 염산인 방법.
양상 III-50. 양상 III-48 또는 49에 있어서, 희산이 약 3 M 내지 약 6 M의 농도를 갖는 방법.
양상 III-51. 양상 III-48 내지 50 중 어느 한 양상에 있어서, 약 90℃ 내지 약 110℃, 바람직하게는 약 95℃ 내지 약 105℃의 온도로 가열하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 III-52. 양상 III-48 내지 51 중 어느 한 양상에 있어서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염이 나트륨, 칼륨 또는 리튬 염인 방법.
양상 III-53. 양상 III-48 내지 52 중 어느 한 양상에 있어서, 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염이 칼륨 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 또는 리튬 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트인 방법.
양상 III-54. 양상 III-48 내지 53 중 어느 한 양상에 있어서, 미오스민의 pH가 약 10 내지 약 12로 조정되는 것인 방법.
양상 III-55. 양상 III-48 내지 54 중 어느 한 양상에 있어서, 니코틴산 에스테르 및 N-비닐-2-피롤리돈, 및 알칼리 금속 염기를 조합하여 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
양상 III-56. 양상 III-55에 있어서, 니코틴산 에스테르가 메틸 니코티네이트, 에틸 니코티네이트, 또는 tert-부틸 니코티네이트, 바람직하게는 메틸 니코티네이트인 방법.
양상 III-57. 양상 III-55에 있어서, 알칼리 금속 염기가 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨, 나트륨 tert-부톡사이드, 칼륨 tert-부톡사이드, 또는 리튬 tert-부톡사이드, 또는 이들의 조합인 방법.
양상 III-58. 양상 III-55 내지 57 중 어느 한 양상에 있어서, 약 50 내지 70℃, 바람직하게는 약 55 내지 약 65℃의 온도로 가열하는 단계를 포함하는 것인 방법.
양상 III-59. 니코틴을 제조하는 방법으로서,
(i) 니코틴산 에스테르 및 N-비닐-2-피롤리돈, 및 알칼리 금속 염기를 조합하여 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염을 제공하는 단계;
(ii) 3-니코티노일-1-비닐-4,5-디히드로-1H-피롤-2-올레이트 염을 희산과 접촉시켜 미오스민을 제공하는 단계;
(iii) 미오스민을 양상 III-15 또는 16의 박테리아 숙주 세포 또는 양상 III-17의 조 효소 용액과 접촉시켜 노르니코틴을 제공하는 단계; 및
(iv) 노르니코틴을 메틸화시켜 니코틴을 제공하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
양상 III-60. 양상 III-59에 있어서, 노르니코틴이 (S)-노르니코틴인 방법.
양상 III-61. 양상 III-34 내지 60의 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 니코틴.
양상 III-62. 양상 III-34 내지 60의 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 (S)-니코틴.
하기 실시예는 본 개시내용 내에서 설명된 개념의 일부를 설명하기 위해 제공된다. 각각의 실시예는 조성물, 제조 방법 및 용도의 특정한 개별 실시양태를 제공하는 것으로 고려되지만, 실시예 중 어느 것도 본원에 기재된 보다 일반적인 실시양태를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
하기 실시예에서는 사용된 숫자(예: 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 약간의 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 온도는 ℃이며 압력은 대기압 또는 그 부근이다.
실시예
실시예 1: 유전자 조작된 고발현 박테리아의 수득
전체 유전자 합성은 제너럴 바이오시스템스 (안후이) 코. 엘티디.(General Biosystems (Anhui) Co., Ltd.)에 의해 완료되었다.
박테리아(믹소코쿠스 풀부스)의 이민 리덕타제 MsIR1(WP_074958336.1)에 대해 코돈 최적화를 수행하여 유전자가 에쉐리키아 콜리 발현 숙주에서 발현될 수 있었다. pET-28a(+) 벡터에 삽입하기 위해 Nde I 및 EcoR I 제한 효소 절단 부위를 유전자의 양 말단에 추가하여 유전자 조작된 박테리아 M1을 수득하였다.
제조된 재조합 벡터를 통상적인 방법을 이용하여 에쉐리키아 콜리 BL21, ROSETTA™, 또는 ORIGAMI™에 형질전환하여 재조합 이민 리덕타제가 가용성 형태로 존재하는 유전자 조작된 박테리아를 생산하고, 성공적으로 구축된 유전자 조작된 박테리아를 확인하였다. 에쉐리키아 콜리 BL21이 숙주 박테리아인 재조합 박테리아의 표적 단백질이 더 잘 발현되었다. 20% 이상의 표적 단백질 발현 수준을 갖는 조작된 박테리아를 생산을 위한 조작된 박테리아 균주로 사용하고, 글리세롤 또는 동결 건조된 밀크에 저장하였다.
실시예 2: 유전자 조작된 박테리아 배양 및 조 효소 용액 제조
실시예 1의 재조합 박테리아의 단일 플레이팅된 콜로니를 상응하는 항생제를 함유하는 5 ml 발효 배양 배지에 접종하고 약 15시간 동안 배양하여 시드 용액을 수득하였다. 시드 용액을 1%의 접종량으로 600 ml 발효 배양 배지에 접종한 후, 200 rpm 진탕기에서 37℃에서 OD600=0.6 내지 0.8이 되도록 배양하였다. IPTG를 0.1 mM의 최종 농도로 첨가하여 10시간 초과 동안 유도하였다. 배양 용액을 8000 rpm으로 원심분리하여 박테리아를 수집하고, 고압 파쇄하여 이민 리덕타제의 조 효소 용액을 수득하였다.
실시예 3: 이민 리덕타제 전체 세포 촉매작용을 통한 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 합성
10 ml 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.5), 30 mg/ml의 실시예 1로부터의 재조합 박테리아, 2eq 글루코스, 0.2 mg/ml NADP+, 및 10 mg 글루코스 데히드로게나제(GDH) 분말을 50 mg/ml의 기질 농도와 함께 28℃에서 반응시켰다. TLC 도트 플레이트를 사용하여 반응 과정을 결정하였다. 12시간 후, 포화된 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 값을 10 초과로 조정하고, 원심분리를 통해 변성된 단백질을 제거하였다. 상청액을 디클로로메탄으로 추출하고, 건조시키고, 원심 탈수하여 생성물을 수집한 후, HPLC 검출을 수행하였다. 표 1을 참조한다.
표 1은 버퍼 용액의 pH가 7.0 내지 9.0의 범위일 때 전환율이 더 높았다는 것을 보여준다. 또한, pH가 7.5 내지 8.0 범위일 때 전환율이 상당히 더 높았다.
실시예 4: 이민 리덕타제 전체 세포 촉매작용을 통한 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 합성
10 ml 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.5), 60 mg/ml의 실시예 1로부터의 재조합 박테리아, 2eq 글루코스, 0 mg/ml 내지 0.8 mg/ml NADP+, 및 10 mg GDH 분말을 10 mg/ml 내지 90 mg/ml의 기질 농도와 함께 28℃에서 반응시켰다. TLC 도트 플레이트를 사용하여 반응 과정을 결정하였다. 24시간 후, 포화된 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 값을 10 초과로 조정하고, 원심분리를 통해 변성된 단백질을 제거하였다. 상청액을 디클로로메탄으로 추출하고, 건조시키고, 원심 탈수하여 생성물을 수집한 후, HPLC 검출을 수행하였다. 표 2를 참조한다.
표 2는 기질 농도 및 보조효소 NADP+ 백분율이 각각 10 내지 20 및 0.2일 때 전환율이 더 높았다는 것을 나타낸다. 또한, 기질 농도 및 보조효소 NADP+ 백분율이 각각 30 내지 60 및 0.4 내지 0.6일 때 전환율이 상당히 더 높았다.
실시예 5: 이민 리덕타제의 조 효소 용액의 촉매작용을 통한 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 합성
10 ml 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.5), 60 mg/ml의 이민 리덕타제 박테리아를 파쇄하여 수득된 조 효소 용액(즉, 실시예 1의 재조합 박테리아를 발효시키고, 농축시키고, 버퍼와 함께 재현탁시키고, 고압 균질화기로 압궤시켜 조 효소 용액을 수득함), 2eq 글루코스, 0 mg/ml 내지 0.8 mg/ml NADP+, 및 10 mg GDH 분말을 10 mg/ml 내지 90 mg/ml의 기질 농도와 함께 30℃에서 반응시켰다. TLC 도트 플레이트를 사용하여 반응 과정을 결정하였다. 24시간 후, 포화된 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 값을 10 초과로 조정하고, 원심분리를 통해 변성된 단백질을 제거하였다. 상청액을 디클로로메탄으로 추출하고, 건조시키고, 원심 탈수하여 생성물을 수집한 후, HPLC 검출을 수행하였다. 표 3을 참조한다.
실시예 6: 이민 리덕타제 전체 세포 촉매작용을 통한 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 합성
1 L 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.5), 40 mg/ml의 실시예 1의 이민 리덕타제 재조합 박테리아, 2eq 글루코스, 0.4 mg/ml NADP+, 및 100 mg GDH 분말을 50 mg/ml의 최종 기질 농도를 만들도록 회분식으로 첨가되는 기질과 함께 28℃에서 반응시켰다. TLC 도트 플레이트를 사용하여 반응 과정을 결정하였다. 반응 완료 후, 포화된 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 값을 10 초과로 조정하고, 원심분리를 통해 변성된 단백질을 제거하고, 상청액을 디클로로메탄으로 추출하고, 건조시키고, 원심 건조시켜 생성물을 수집하였다. 수율은 96%, 순도는 98%, e.e. 값은 99.8%였다.
실시예 7: 이민 리덕타제 전체 세포 촉매작용을 통한 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 합성
1 L 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.5), 40 mg/ml의 실시예 1의 이민 리덕타제 재조합 박테리아, 2eq 글루코스, 0.5 mg/ml NADP+, 및 100 mg GDH 분말을 70 mg/ml의 최종 기질 농도를 만들도록 회분식으로 첨가되는 기질과 함께 30℃에서 반응시켰다. TLC 도트 플레이트를 사용하여 반응 과정을 결정하였다. 반응 완료 후, 포화된 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 값을 10 초과로 조정하고, 원심분리를 통해 변성된 단백질을 제거하고, 상청액을 디클로로메탄으로 추출하고, 건조시키고, 원심 건조시켜 생성물을 수집하였다. 수율은 93%, 순도는 98%, e.e. 값은 99.6%였다.
실시예 8: 이민 리덕타제의 조 효소 용액의 촉매작용을 통한 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘의 합성
1 L 포스페이트 버퍼 용액(pH 7.5), 60 mg/ml의 이민 리덕타제 박테리아를 파쇄하여 수득된 조 효소 용액(실시예 1의 재조합 박테리아를 발효시키고, 농축시키고, 버퍼와 함께 재현탁시키고, 고압 균질화기로 압궤시켜 조 효소 용액을 수득함), 2eq 글루코스, 0.5 mg/ml NADP+, 및 100 mg GDH 분말을 50 mg/ml의 최종 기질 농도를 만들도록 회분식으로 첨가되는 기질과 함께 30℃에서 반응시켰다. TLC 도트 플레이트를 사용하여 반응 과정을 결정하였다. 반응 완료 후, 포화된 수산화나트륨 용액을 첨가하여 pH 값을 10 초과로 조정하고, 원심분리를 통해 변성된 단백질을 제거하고, 상청액을 디클로로메탄으로 추출하고, 건조시키고, 원심 건조시켜 생성물을 수집하였다. 수율은 94%, 순도는 98%, e.e. 값은 99.7%였다.
실시예 9: 대규모 발효 과정 및 전체 세포 촉매작용
1. 균주 보존
선별된 단일 콜로니를 LB 배지를 함유하는 플레이트에 코팅하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 플레이트 상의 콜로니를 긁어내고, LB 배지를 갖는 진탕 플라스크에 접종하였다. 진탕 플라스크를 37℃, 200 rpm의 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하였다. 박테리아 액체를 40% 글리세롤과 동일한 부피로 혼합하고, OD600이 2.0 초과일 때 -20℃에서 저장하였다. (LB 배지는 하기 표 4에 나타나 있다).
Figure 112021098890472-pat00019
2. 시드 배양
글리세롤 스톡으로부터 1 ml의 박테리아 액체를 취하고, 400 ml LB 배지를 갖는 진탕 플라스크에 접종한 후, 플라스크를 인큐베이터에서 배양하였다. 배지의 포뮬러 및 배양 조건은 하기 표 5 및 6에 나타나 있다.
Figure 112021098890472-pat00020
3. 발효
시드 액체를 OD600이 2.0 초과일 때 25 L 배양 배지를 갖는 생물 반응기에 접종하였다. 발효 배지의 포뮬러 및 멸균 및 배양 조건은 하기 표 7에 나타나 있다. 발효 액체를 OD600이 2.0 초과일 때 28℃로 냉각하였다. 이 작업은 표 8에 나타낸 발효 기록에서 볼 수 있듯이 접종 후 약 4시간에 발생하였다.
실시예 9: 유전자 조작된 고발현 박테리아의 수득
전체 유전자 합성은 제너럴 바이오시스템스 (안후이) 코. 엘티디.에 의해 완료되었다.
박테리아(믹소코쿠스 풀부스)의 이민 리덕타제 MsIR1 (WP_074958336.1)(서열번호 2)에 대해 코돈 최적화를 수행하여 유전자가 에쉐리키아 콜리 발현 숙주에서 발현될 수 있었다. pET-28a(+) 벡터에 삽입하기 위해 Nde I 및 EcoR I 제한 효소 절단 부위를 유전자의 양 말단에 추가하여 유전자 조작된 박테리아 M1을 수득하였다.
제조된 재조합 벡터를 통상적인 방법을 이용하여 에쉐리키아 콜리 BL21, ROSETTA™, 또는 ORIGAMI™에 형질전환하여 재조합 이민 리덕타제가 가용성 형태로 존재하는 유전자 조작된 박테리아를 생산하고, 성공적으로 구축된 유전자 조작된 박테리아를 확인하였다. 표적 단백질은 재조합 에쉐리키아 콜리 BL21 숙주에서 더 잘 발현되었다. 20% 이상의 표적 단백질 발현 수준을 갖는 조작된 박테리아를 생산을 위한 조작된 박테리아 균주로 사용하고, 글리세롤 또는 동결 건조된 밀크에 저장하였다.
실시예 10: 유전자 조작된 박테리아 배양 및 조 효소 용액 제조
실시예 1의 재조합 박테리아의 단일 플레이팅된 콜로니를 상응하는 항생제를 함유하는 5 ml 발효 배양 배지에 접종하고 약 15시간 동안 배양하여 시드 용액을 수득하였다. 시드 용액을 1%의 접종량으로 600 ml 발효 배양 배지에 접종한 후, 200 rpm 진탕기에서 37℃에서 OD600=0.6 내지 0.8이 되도록 배양하였다. IPTG를 0.1 mM의 최종 농도로 첨가하여 10시간 초과 동안 유도하였다. 배양 용액을 8000 rpm으로 원심분리하여 박테리아를 수집하고, 고압 파쇄하여 이민 리덕타제의 조 효소 용액을 수득하였다.
실시예 11
건조 n-헥산에 메틸니코티네이트 300 g, 비닐피롤리돈 300 g 및 칼륨 tert-부톡사이드 340 g을 첨가한 후, 3시간 동안 환류 교반하였다. 냉각을 통해 실온에 도달한 후, 여과하고, 생성된 필터 케이크를 묽은 염산에 첨가하고, 9시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후, 염기를 첨가하여 pH를 10으로 조정하고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 농축 후, 실시예 2의 효소 시스템을 사용하여 14시간 동안 촉매 반응을 수행하였다. 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 메틸화 반응 후, pH를 10으로 조정하고, 에틸아세테이트로 추출하고, 농축 및 증류 후, (S)-니코틴 283.8 g을 수득하였다. 총 수율 80.6%, GC 순도 99.69%, 및 광학 순도 99% e.e.의 (S)-니코틴을 수득하였다.
실시예 12
건조 n-헥산에 에틸 니코티네이트 150 g, 비닐피롤리돈 132.4 g 및 수소화나트륨 35.8 g을 첨가한 후, 5시간 동안 환류 교반하였다. 냉각을 통해 실온에 도달한 후, 여과하고, 생성된 필터 케이크를 묽은 염산에 첨가하고, 16시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후, 염기를 첨가하여 pH를 14로 조정하고, n-헥산으로 추출하였다. 농축 후, 실시예 2의 효소 시스템을 사용하여 8시간 동안 촉매 반응을 수행하였다. 이어서, 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 메틸화 반응 후, pH를 14로 조정하고, n-헥산으로 추출하고, 농축 및 증류 후, (S)-니코틴 136.7 g을 수득하였다. 총 수율 85%, GC 순도 99.7%, 및 광학 순도 99% e.e.의 (S)-니코틴을 수득하였다.
실시예 13
건조 n-헥산에 에틸 니코티네이트 300 g, 비닐피롤리돈 200 g 및 칼륨 tert-부톡사이드 300 g을 첨가한 후, 3시간 동안 환류 교반하였다. 냉각을 통해 실온에 도달한 후, 여과하고, 생성된 필터 케이크를 묽은 염산에 첨가하고, 21시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후, 염기를 첨가하여 pH를 12로 조정하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 농축 후, 실시예 2의 효소 시스템을 사용하여 12시간 동안 촉매 반응을 수행하고, 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 메틸화 반응 후, pH를 12로 조정하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 농축 및 증류 후, (S)-니코틴 261 g을 수득하였다. 총 수율 81.1%, GC 순도 99.7%, 및 광학 순도 99% e.e.의 (S)-니코틴을 수득하였다.
실시예 14
건조 n-헥산에 tert-부틸 니코티네이트 200 g, 비닐피롤리돈 175 g 및 나트륨 tert-부톡사이드 160.9 g을 첨가한 후, 2시간 동안 환류 교반하였다. 냉각을 통해 실온에 도달한 후, 여과하고, 생성된 필터 케이크를 묽은 염산에 첨가하고, 30시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후, 염기를 첨가하여 pH를 9로 조정하고, 클로로포름으로 추출하였다. 농축 후, 효소 시스템을 사용하여 16시간 동안 촉매 반응을 수행하고, 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 메틸화 반응 후, pH를 9로 조정하고, 클로로포름으로 추출하고, 농축 및 증류 후, (S)-니코틴 143 g을 수득하였다. 총 수율 79.1%, GC 순도 99.62%, 및 광학 순도 99% e.e.의 (S)-니코틴을 수득하였다.
실시예 15
건조 n-헥산에 메틸니코티네이트 200 g, 비닐피롤리돈 190.7 g 및 리튬 tert-부톡사이드 120 g을 첨가한 후, 5시간 동안 환류 교반하였다. 냉각을 통해 실온에 도달한 후, 여과하고, 생성된 필터 케이크를 묽은 염산에 첨가하고, 30시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후, 염기를 첨가하여 pH를 11로 조정하고, n-헥산으로 추출하였다. 농축 후, 실시예 2의 효소 시스템을 사용하여 8시간 동안 촉매 반응을 수행하고, 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 메틸화 반응 후, pH를 11로 조정하고, n-헥산으로 추출하고, 농축 및 증류 후, (S)-니코틴 190 g을 수득하였다. 총 수율 80%, GC 순도 99.69%, 및 광학 순도 99% e.e.의 (S)-니코틴을 수득하였다.
실시예 16
건조 톨루엔에 tert-부틸 니코티네이트 300 g, 비닐피롤리돈 242g 및 칼륨 tert-부톡사이드 288g을 첨가한 후, 5시간 동안 환류 교반하였다. 냉각을 통해 실온에 도달한 후, 여과하고, 생성된 필터 케이크를 묽은 염산에 첨가하고, 30시간 동안 환류 교반하였다. 냉각 후, 염기를 첨가하여 pH를 9로 조정하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 농축 후, 실시예 2의 효소 시스템을 사용하여 16시간 동안 촉매 반응을 수행하고, 포름알데히드 및 포름산을 사용하여 메틸화 반응 후, pH를 9로 조정하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 농축 및 증류 후, (S)-니코틴 215 g을 수득하였다. 총 수율 79.1%, GC 순도 99.62%, 및 광학 순도 99% e.e.의 (S)-니코틴을 수득하였다.
실시예 17: 니코틴의 제조 방법
(i) 축합 단계
반응 플라스크를 질소로 대체한 후, n-헥산(325 g), 에틸 니코티네이트(225 g) 및 N-비닐-2-피롤리돈(198 g)을 차례로 첨가하여 혼합 용액을 제조하고, 혼합 용액을 나중에 사용하기 위해 25-30℃로 가열하였다. 또 다른 반응 플라스크를 질소로 대체한 후, n-헥산(1625 g) 및 t-BuOK(250 g)를 첨가한 후, 혼합물을 45-50℃로 가열하였다. t-BuOK를 함유하는 혼합물에 니코티네이트 및 피롤리돈을 포함하는 혼합 용액을 적가한 후, 반응 용액을 55-65℃로 3시간 동안 가열하였다. 반응 용액을 40℃ 미만으로 냉각시키고, 여과하여 중간체 1을 수득하였다.
(ii) 고리화 단계
반응 플라스크에 물(1300 g) 및 염산(1200 g)을 첨가하고, 교반하면서 중간체 1을 첨가하였다. 혼합물을 95-105℃로 12시간 동안 가열한 후, 혼합물을 50℃ 미만으로 냉각시켰다. pH가 10-12로 조정될 때까지 수산화나트륨 용액을 반응 용액에 첨가하였다. 추출을 위해 디클로로메탄(2500 g)을 첨가한 후, 유기상을 진공에서 농축시켜 중간체 2를 수득하였다.
(iii) 환원 단계
글루코스(270 g) 및 NADP-2Na(1.2 g)를 실시예 2의 효소 용액(4200 g)에 첨가하였다. 완전히 교반한 후, 혼합물을 28-35℃로 가열하였다. 중간체 2를 혼합물에 11시간 동안 적가하고, 온도를 1시간 더 유지하였다. 반응 용액을 다음 반응에 사용하였다.
(iv) 메틸화 단계
단계 (iii)의 반응 용액에 포름알데히드 수용액(180g) 및 포름산 수용액(95.5g)을 첨가하였다. 완전히 교반한 후, 혼합물을 교반하면서 3시간 동안 60-65℃로 가열하였다. 반응액을 40℃ 미만으로 냉각시키고, 여과한 후, 추출을 위해 디클로로메탄(2400 g)을 첨가하였다. 유기상을 진공에서 농축시켜 조(crude) 니코틴을 수득하였다.
(v) 증류 단계
반응 플라스크에 조 니코틴을 첨가하고, 온도를 60℃로 올렸다. 조 니코틴을 감압 하에 증류하였다. 온도가 110℃에 도달할 때까지 전면 절단 분획을 수집하였다. 온도가 110℃에 도달하면 온도가 125℃에 도달할 때까지 감압 하에 니코틴을 수집하였다.
전술된 설명은 단지 본 개시내용의 바람직한 실시양태일 뿐이고 특정 바람직한 구현을 참조하여 본 개시내용에 대해 이루어진 추가의 상세한 설명이다. 본 개시내용의 특정 구현은 이러한 설명으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 개시내용의 취지 및 원리를 벗어나지 않으면서 이루어진 모든 변형, 동등한 대체, 또는 개선은 본 개시내용의 보호 범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> SHENZHEN HANGSEN STAR TECHNOLOGY CO., LTD <120> METHODS FOR PREPARING NICOTINE AND INTERMEDIATES THEREOF <130> 120262.000004 <140> 17/380,777 <141> 2021-07-20 <150> CN 2020114670856 <151> 2020-12-14 <150> CN 2020112954567 <151> 2020-11-18 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atgaagccgc atattagtat tctgggtgca ggtcgtatgg gcagtgccct ggtgaaagca 60 tttctgcaga atgaatatac caccaccgtt tggaatcgta cccgtgcacg ttgtgaaccg 120 ctggcagcag caggcgcccg tattgccgat agcgttcgcg atgcagtgca gaccgccagc 180 gtggttattg tgaatgtgaa tgattatgat accagcgatg ccctgctgcg ccaggatgaa 240 gtgacccagg aactgcgcgg taaagttctg gtgcagctga ccagcggcag tccgaaactg 300 gcccgcgaac aggccacctg ggccagacgt catggtattg attatctgga tggtgcaatt 360 atggccaccc cggatctgat tggtcgtccg gattgtaccc tgctgtatgc cggcccgaaa 420 gcactgtatg ataaacatca ggccgttctg gcagcactgg gtggcaatac ccagcatgtt 480 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Met Lys Pro His Ile Ser Ile Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ala Phe Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Thr Thr Val Trp Asn 20 25 30 Arg Thr Arg Ala Arg Cys Ala Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Ile 35 40 45 Ala Asp Ser Val Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Ser Val Val Ile Val 50 55 60 Asn Val Asn Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Ala Leu Leu Arg Gln Asp Glu 65 70 75 80 Val Thr Gln Glu Leu Arg Gly Lys Val Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly 85 90 95 Ser Pro Lys Leu Ala Arg Glu Gln Ala Thr Trp Ala Arg Arg His Gly 100 105 110 Ile Trp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Leu Ile Gly 115 120 125 Arg Pro Asp Cys Thr Leu Leu Tyr Ala Gly Pro Lys Ala Leu Tyr Asp 130 135 140 Lys His Gln Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Gly Asn Thr Gln His Val 145 150 155 160 Ser Glu Asp Glu Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ser Ala Ile Leu Phe 165 170 175 Gln Leu Trp Gly Ser Leu Phe Ser Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ile Cys 180 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agcgcaatcc cctcggcgcg 300 gcagatggcc gcggcctgca gcccgctgaa cagcgaaccc cacagctgga acaggatggc 360 gctgtcgagc gcggacgcgt ggccctcgtc ctcgctcacg tgctgcgtgt ttccaccgag 420 cgccgccagc acggcctggt gcttgtcgta cagggccttc gggcccgcgt acaggagcgt 480 gcagtcgggc cggccgatga ggtccggcgt ggccatgatg gcgccgtcca ggtagtcgat 540 gccgtgccgt cgtgcccacg tcgcctgctc gcgcgccagc ttcggtgagc cggacgtgag 600 ctgcaccagc accttgcccc ggagctcctg cgtcacctcg tcctggcgca gcagcgcgtc 660 gctggtgtcg tagtcattca cgttcacgat gacgacgctg gctgtctgca ccgcgtctcg 720 cacggagtcg gcgatgcgcg cgcccgctgc cgccaacggc tcgcaccgcg cccgggtgcg 780 attccagacc gtggtcgtgt actcgttctg gaggaacgcc ttgaccagcg cggagcccat 840 gcggcccgcg ccgaggatgc tgatgtgtgg cttcat 876 <210> 21 <211> 876 <212> DNA <213> Myxococcus fulvus <400> 21 atgaagccac acatcagcat cctcggcgcg ggccgcatgg gctccgcgct ggtcaaggcg 60 ttcctccaga acgagtacac gaccacggtc tggaatcgca cccgggcgcg gtgcgagccg 120 ttggcggcag cgggcgcgcg catcgccgac tccgtgcgag acgcggtgca gacagccagc 180 gtcgtcatcg tgaacgtgaa tgactacgac accagcgacg cgctgctgcg ccaggacgag 240 gtgacgcagg agctccgggg caaggtgctg gtgcagctca cgtccggctc accgaagctg 300 gcgcgcgagc aggcgacgtg ggcacgacgg cacggcatcg actacctgga cggcgccatc 360 atggccacgc cggacctcat cggccggccc gactgcacgc tcctgtacgc gggcccgaag 420 gccctgtacg acaagcacca ggccgtgctg gcggcgctcg gtggaaacac gcagcacgtg 480 agcgaggacg agggccacgc gtccgcgctc gacagcgcca tcctgttcca gctgtggggt 540 tcgctgttca gcgggctgca ggccgcggcc atctgccgcg ccgaggggat tgcgctcgac 600 gcgctcggcc cgcatctgga ggccgtcgcg gccatgattc agttcagcat gaaggacctc 660 ctccagcgca tccagaagga gcagttcggc gcggacaccg agagccccgc cacgctcgac 720 acgcacaacg tggcgttcca gcacctgctg cacctgtgcg aggagcgcaa catccaccgc 780 gctctccccg aggccatgga tgcactcatc cagaccgccc ggaaggcggg gcatggccag 840 gacgacttct cggtcctcgc gcgcttcctg cgctga 876 <210> 22 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 atggccagta tttgtgtggt gggtgcaggt cgtatgggta gcgccctggc acgtgcattt 60 ctgcgcgcag gttatgtgac ccatgtttgg aatcgtaccc cggcaaaagg tgaagccctg 120 gcagcactgg gtgcccgttt tgttccgagt ctgcatcagg caattgccgc cagcgatatt 180 gttgttgtga atgtgattga ttacgccgcc gccgatgcac atctgcgcag tgccagcgtg 240 acccgcgcct taggtcgtaa actgctggtg cagctgacca gtggcagccc gagtcaggcc 300 cgccagaccg gtgaatgggc caaaggtcat ggcgtgggtt atctggatgg cgccattatg 360 gccaccccga attttattgg cgaaccgagt gcaaccattc tgtatagcgg tagtcagcat 420 gcctttgatg aaaatcgcga tgtgtttctg gcactgggcg gtaatgccgt tcatgttggt 480 gacgattttg gccatgccag cgccctggat attgccctgc tgagccagct gtggggtacc 540 ctgtttggta ccctgcaggc aattgcggtg agccaggccg aaggtattga actggatgcc 600 tatgcccgct atctgcagcc gtttaaaccg accattgatg gtgccgttgc cgatctggtt 660 acccgtgccc gtgatggtcg ttatcgcggc gatgatcaga ccctggcagc aattgccgca 720 cattatagtg cctttcagcc gctgctggaa gttagccgcg aacgtggcct gaatcgcgca 780 gtgccggatg catttgatag tatttttaaa gccgccattg ccgcaggcca tctgcaggat 840 gattttgccg ccctgacccg ttttatgcgc taa 873 <210> 23 <211> 290 <212> PRT <213> Bosea sp. <400> 23 Met Ala Ser Ile Cys Val Val Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala Leu 1 5 10 15 Ala Arg Ala Phe Leu Arg Ala Gly Tyr Val Thr His Val Trp Asn Arg 20 25 30 Thr Pro Ala Lys Gly Glu Ala Leu Ala Ala Leu Gly Ala Arg Phe Val 35 40 45 Pro Ser Leu His Gln Ala Ile Ala Ala Ser Asp Ile Val Val Val Asn 50 55 60 Val Ile Asp Tyr Ala Ala Ala Asp Ala His Leu Arg Ser Ala Ser Val 65 70 75 80 Thr Arg Ala Leu Gly Arg Lys Leu Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly Ser 85 90 95 Pro Ser Gln Ala Arg Gln Thr Gly Glu Trp Ala Lys Gly His Gly Val 100 105 110 Gly Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asn Phe Ile Gly Glu 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Gln His Ala Phe Asp Glu 130 135 140 Asn Arg Asp Val Phe Leu Ala Leu Gly Gly Asn Ala Val His Val Gly 145 150 155 160 Asp Asp Phe Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ile Ala Leu Leu Ser Gln 165 170 175 Leu Trp Gly Thr Leu Phe Gly Thr Leu Gln Ala Ile Ala Val Ser Gln 180 185 190 Ala Glu Gly Ile Glu Leu Asp Ala Tyr Ala Arg Tyr Leu Gln Pro Phe 195 200 205 Lys Pro Thr Ile Asp Gly Ala Val Ala Asp Leu Val Thr Arg Ala Arg 210 215 220 Asp Gly Arg Tyr Arg Gly Asp Asp Gln Thr Leu Ala Ala Ile Ala Ala 225 230 235 240 His Tyr Ser Ala Phe Gln Pro Leu Leu Glu Val Ser Arg Glu Arg Gly 245 250 255 Leu Asn Arg Ala Val Pro Asp Ala Phe Asp Ser Ile Phe Lys Ala Ala 260 265 270 Ile Ala Ala Gly His Leu Gln Asp Asp Phe Ala Ala Leu Thr Arg Phe 275 280 285 Met Arg 290

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  15. 박테리아 숙주 세포를 2-피리딜-1-피롤린과 반응 시스템에서 조합하는 단계를 포함하는, 2-(3-피리딜)-피롤리딘을 제조하는 방법으로서,
    박테리아 숙주 세포는 서열번호 2에 따른 믹소코쿠스 풀부스(Myxococcus fulvus)의 이민 리덕타제를 코딩하고 이종 발현에 최적화된 뉴클레오티드 서열 코돈을 포함하는 핵산 분자를 포함하고,
    핵산 분자는 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 2-(3-피리딜)-피롤리딘이 (S)-2-(3-피리딜)-피롤리딘인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 박테리아 숙주 세포를 버퍼 용액과 조합하는 단계 및 2-피리딜-1-피롤린을 버퍼 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 버퍼 용액이 포스페이트 버퍼, 트리스 히드로클로라이드, 바이카보네이트 버퍼, 및 물에 첨가된 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 버퍼를 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 반응 시스템이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 글루코스, 및 글루코스 데히드로게나제를 포함하는 것인 방법.
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