CN112176007B - 一种氨基醇手性中间体的制备方法 - Google Patents

一种氨基醇手性中间体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基醇手性中间体的制备方法,该方法包括以化合物X为底物,在辅酶存在的液态反应体系中,利用(R,S)‑羰基还原酶催化底物,进行式A所示的反应,获得化合物Y。本发明提供了一种新的合成路线以及适用于该路线的(R,S)‑羰基还原酶,不仅具有绿色,环保,经济的特点,而且显著提高了化合物Y的转化率、ee值和de值,转化率>98%,ee值>99%,de值>95%。
Figure DDA0002720737480000011

Description

一种氨基醇手性中间体的制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其涉及一种氨基醇手性中间体的制备方法。
背景技术
含有手性氨基醇类结构的化合物具有多样的生物活性,被广泛应用于医药化工领域。PCT国际专利申请公开文本WO2018191682中描述了一种形式如结构式Ⅰ的化合物,存在显著的抗炎抗感染活性。PCT国际专利申请公开文本WO2018141842展示了化合物Ⅱ对JAK的抑制作用,具有潜在治疗免疫疾病的能力。中国专利申请公开文本CN1649829A报道了一种结构如Ⅲ的新型氨基醇类抗菌药,有望弥补现有抗菌药耐药性的缺点。
Figure BDA0002720737460000011
本发明中的手性氨基醇含有多个重要的官能团,可以容易的通过已知的化学方法制备,如结构Ⅰ-Ⅲ的化合物。在已有的对手性氨基醇的合成方法中,普遍存在三废多,成本高和操作复杂等问题。
如下式所示的路线,以苯甲醛为起始物料,在催化剂作用下进行缩合;再将缩合得到的异构体进行拆分,得到最终带有两个手性中心的氨基醇化合物。该路线操作繁琐,收率低,且会产生大量废水。
Figure BDA0002720737460000012
因此,需要开发更为经济环保,操作简单,适合工业化生产的手性氨基醇合成路线。
发明内容
本发明提供了一种氨基醇手性中间体的制备方法,该方法涉及羰基还原酶参与的动态还原动力学拆分技术,可通过一步反应构建两个手性中心,合成路线简单且经济环保,化合物Y的转化率、ee值和de值均较高。
具体技术方案如下:
本发明提供了一种氨基醇手性中间体的制备方法,以化合物X为底物,在辅酶存在的液态反应体系中,利用(R,S)-羰基还原酶催化底物,进行式A所示的反应,获得化合物Y;
化合物Y即为所述的氨基醇手性中间体;
Figure BDA0002720737460000021
式A中,
R1和R2各自独立地选自:H、
Figure BDA0002720737460000022
Figure BDA0002720737460000023
R3
Figure BDA0002720737460000024
其中R5为C1-C6的烷基;
R4选自F、Cl、Br或I。
作为优选,R3选自下组:
Figure BDA0002720737460000025
作为优选,R1=H,
Figure BDA0002720737460000026
Figure BDA0002720737460000031
R4=F、Cl或Br。
进一步地,所述的辅酶选自下组:还原性辅酶,氧化性辅酶,或其组合;
所述氧化性辅酶为NAD+,NADP+,或其组合;所述还原性辅酶为NADH,NADPH或其组合。
其中,所述NADH、NADPH、NAD或NADP用量与底物用量比率为0.01%~1.0%(w/w)、较佳地0.01%~0.5%(w/w)。
进一步地,所述的液态反应体系中,还存在用于辅酶再生的酶和用于辅酶再生的共底物。
进一步地,所述的用于辅酶再生的酶选自下组:醇脱氢酶,甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。所述的共底物选自下组:异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合。
作为优选,在上述液态反应体系中,共底物的质量浓度为5-30%。
作为优选,式A所示的反应中,反应温度为10℃-50℃,较佳的为25℃-35℃。
作为优选,式A所示的反应中,反应时间为0.1-72小时,较佳3-24小时。
作为优选,式A所示的反应中,pH为6-10,较佳地7.0-9.0。
进一步地,式A所示的反应中,(R,S)-羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
进一步地,所述液态反应体系为磷酸缓冲盐体系。
进一步地,所述液态反应体系中还含有助溶剂。
进一步地,所述的助溶剂选自下组:二甲基亚砜、异丙醇、甲苯、或其组合,更优选为二甲基亚砜。
作为优选,所述助溶剂的体积浓度为5~30%。
进一步地,所述的制备方法还包括:从式A所示反应后的反应体系中分离出化合物Y。
所述的分离包括:加入甲叔醚或乙酸乙酯,加热使蛋白变性,离心菌体,甲叔醚或乙酸乙酯再萃取水层,合并有机层,水洗两次,合硫酸钠干燥,浓缩有机层得产物。
进一步地,式A所示反应后的反应体系中,化合物Y的ee值≥99%;de值≥95%,更佳地≥99%。
进一步地,式A所示反应后的反应体系中,化合物X被转化为化合物Y的转化率≥98%。
进一步地,所述(R,S)-羰基还原酶选自下组之一:
(i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;
(ii)在保持酶活性的范围内,对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加,所得到的氨基酸序列。
进一步地,码所述(R,S)-羰基还原酶的核苷酸序列选自下组之一:
(a)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列;
(b)与(a)限定的序列互补的核苷酸序列;或
(c)与(a)限定的序列具有至少70%,优选至少75%、80%、85%、90%,更优选至少95%、96%、97%、98%、99%以上的序列一致性的任一核苷酸序列或互补序列。
本发明还提供了一种(R,S)-羰基还原酶,所述(R,S)-羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述的(R,S)-羰基还原酶的编码基因;其中,优选所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明将(R,S)-羰基还原酶克隆至质粒载体中,并转入至大肠杆菌感受态细胞,获得了含(R,S)-羰基还原酶基因的工程菌。本发明提供了一种基因工程菌,包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因,所述目的基因包含如上所述的(R,S)-羰基还原酶的编码基因。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明提供了一种新的氨基醇手性中间体化合物Y的制备方法,该方法涉及了羰基还原酶介导的动态还原动力学拆分,转化率>98%,手性ee值>99%,手性de值>95%。该生物制备方法具有绿色,环保,经济的特点。
(2)本发明还提供了尤为适合催化化合物X制备化合物Y的(R,S)-羰基还原酶,显著提高了化合物Y的转化率、ee值和de值,转化率>98%,ee值>99%,de值>95%。
附图说明
图1为实施例3中消旋体化合物2的四个异构体的液相图。
图2为实施例3中酶转化反应制备化合物2的手性纯度的液相图。
图3为实施例5中消旋体化合物6的四个异构体的液相图。
图4为实施例5中酶转化反应制备化合物6的手性纯度的液相图。
图5为对比例1中酶转化反应制备化合物12的手性纯度的液相图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现一种化合物Y(例如化合物2)的生物制备方法。具体地,本发明的生物制备方法以化合物X(例如化合物1)为原料,以羰基还原酶为生物催化剂,在辅酶的存在下,高效地制备具有立体构象的化合物Y(还原收率>98%,手性ee值>99%,手性de值>95%),一步反应构建两个手性中心,从而极大地提高生产效率,降低生产成本。
术语
对映体过量(ee,enantiomeric excess):通常用来表征手性分子中一个对映异构体相对于另一个对映异构体的过量值。
非对映体过量(de,diastereomeric excess):通常用来表征两个及以上手性中心的分子中一个非对映体相对于另一个非对映体的过量值。
(R,S)-羰基还原酶
在本发明中,“立体选择性羰基还原酶”指能够立体选择性不对称催化还原潜手性酮为手性醇的酶。
典型地,在本发明中,所述的立体选择性羰基还原酶优选为(R,S)-羰基还原酶,立体选择性定义为对映体过量(ee)≥80%,非对映体过量(de)≥80%。
同理当(R,R)-羰基还原酶时,立体选择性定义为对映体过量(ee)≥80%,非对映体过量(de)≥80%,依此类推。
在本发明中,构型的定义以化合物Y为参照,其中羟基的构型为R,氨基的构型为S,凡是能立体选择性的识别化合物X中S-构型的氨基,且将化合物X中的羰基还原为R构型羟基的羰基还原酶,在本发明技术方案中定义为(R,S)-羰基还原酶。
Figure BDA0002720737460000051
在本发明中,所述的羰基还原酶可以是野生型的或突变型的。此外,可以分离的,也可以是重组的。
可用于本发明的羰基还原酶可以来自不同物种。一种典型的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其编码基因如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1:
MKYTVITGASSGIGYETAKLLAGKGKSLVLVARRTSELEKLRDEVKQISPDSDVILKSVDLADNQNVHDLYEGLKELDIETLINNAGFGDFDLVQDIELGKIEKMLRLNIEALTILSSLFARDHHDIEGTTLVNISSLGGYRIVPNAVTYCATKFYVSAYTEGLAQELQKGGAKLRAKVLAPAATETEFVDRARGEAGFDYSKNVHNYHTAAEMAGFLHQLIESDAIVGIVDGETYEFELRGPLFNYAG
SEQ ID No.2:
atgaaatacaccgttatcaccggtgcttcttctggtatcggttacgaaaccgctaaactgcttgctggtaaaggtaaatctctggttctggttgctcgtcgtacctctgaactggaaaaactgcgtgacgaagttaaacagatctctccggactctgacgttatcctgaaatctgttgacctggctgacaaccagaacgttcacgacctgtacgaaggtctgaaagaactggacatcgaaaccctgatcaacaacgctggtttcggtgacttcgacctggttcaggacatcgaactgggtaaaatcgaaaaaatgctgcgtctgaacatcgaagctctgaccatcctgtcttctctgttcgctcgtgaccaccacgacatcgaaggtaccaccctggttaacatctcttctctgggtggttaccgtatcgttccgaacgctgttacctactgcgctaccaaattctacgtttctgcttacaccgaaggtctggctcaggaactgcagaaaggtggtgctaaactgcgtgctaaagttctggctccggctgctaccgaaaccgaattcgttgaccgtgctcgtggtgaagctggtttcgactactctaaaaacgttcacaactaccacaccgctgctgaaatggctggtttcctgcaccagctgatcgaatctgacgctatcgttggtatcgttgacggtgaaacctacgaattcgaactgcgtggtccgctgttcaactacgctggttaa
由于密码子的简并性,编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID NO.2。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物,本发明涵盖这些同系物,只要其表达的重组酶保持对化合物X的催化还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO.2的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明的羰基还原酶还包括对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内,进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加,所得到的氨基酸序列。
在本发明中,所述的(R,S)-羰基还原酶可以各种形式使用。例如,可使用表达本发明所述羰基还原酶的静息细胞或湿菌体,也可以使用粗酶液、纯酶或者粗酶粉等各种不同形式,或者使用固定化酶。
优选地,为获得较高的转化效率和降低成本,优选使用粗酶液。
羰基还原酶用量与底物用量比率优选为0.1-20%,较佳地1%~6%(w/w)(按酶的质量和底物的质量计),或者静息细胞质量与底物质量比率为1-200%,较佳地10-100%。
辅酶
本发明中,“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。
典型地,本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶NAD+、NADP+。由于还原性辅酶的价格成本昂贵,优选氧化性辅酶NAD+、NADP+。
当选择氧化性辅酶时,需要选择实现辅酶再生的方法,主要包括三种(1)葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖;(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇;(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。
在一个优选实施例中,辅酶为NADP+,辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶,氧化性辅酶NADP+用量与底物用量比率为0.01%~0.5%(w/w),缓冲体系为0.1mol/L磷酸缓冲盐。缓冲液的pH为6.0-10。
助溶剂
本发明中,可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。
如本文所用,术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等,以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。
本发明中,底物化合物难溶于水,当底物浓度增大时,严重影响反应转化率。因此,需通过加入助溶剂提高底物溶解性,以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜,甲醇,乙醇,异丙醇,乙腈,甲苯,丙酮,浓度优选为5-30%(v/v),优选为二甲基亚砜。
动态还原动力学拆分反应原理
通过羰基还原酶立体选择性的还原单一构型的潜手性酮(如R-构型)的同时,另一构型的潜手性酮(如S-构型)通过羰基的烯醇互变,实现α-位手性构型的消旋化,还原与消旋化在同一反应条件下进行,实现高效构建含两个手性中心仲醇的目的。
Figure BDA0002720737460000071
注:EWG为吸电子基团
典型地,本发明中通过筛选获得仅识别X-R(R构型化合物X)的羰基还原酶,对羰基进行立体选择性的还原获得手性羟基,而不被识别的X-S(S构型化合物X)通过消旋化转化为X-R,消旋与还原过程衔接推进,以此转化,理论上便可100%的获得所需手性产物。通过羰基还原酶对潜手性羰基底物进行还原,同时经烯醇互变消旋,两者巧妙结合,一步反应高效经济构建两个手性中心,表现了良好的应用开发前景。
本发明的主要优点在于:
提供了氨基醇中间体的生物制备方法,该方法涉及了羰基还原酶介导的动态还原动力学拆分,还原收率>98%,手性ee值>99%,手性de值>95%。该生物制备方法具有绿色,环保,经济的特点。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
材料
基因全合成由上海百力格完成。
通过商业化的全基因合成得到编码基因,然后将编码基因构建入表达载体,导入宿主菌,诱导表达得到羰基还原酶。
酶还原底物化合物X的制备可参见Tetrahedron.2016,72:1787-1793所述方法。
方法
1.酶的制备方法
通过本领域常规技术,将上述实现辅酶再生的葡萄糖脱氢酶与目的基因构建在同一质粒pET28a(+)载体上,然后导入表达宿主大肠杆菌,通过诱导表达,获得含有目的双酶的菌体。可直接使用离心获得菌体,也可将其破壁获得粗酶液,粗酶粉用于后续的生物转化反应。
2.生物催化还原化合物X制备化合物Y的方法
本发明提供了一种羰基还原酶催化还原化合物X制备化合物Y的方法。反应式如下:
Figure BDA0002720737460000081
其中,所述的生物催化体系包括有羰基还原酶,辅酶。本发明中所述的羰基还原酶编码基因序列为SEQ ID NO.2,羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。根据本领域一般常识,上述羰基还原酶基因可通过商业化的全基因合成得到。
根据上述优选体系,所述制备方法的实施过程如下:将底物充分溶解在助溶剂,如二甲基亚砜或异丙醇,然后加入到磷酸缓冲液中,搅拌均匀后,加入菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶,加入辅酶NADP+,共底物葡萄糖,维持在20℃~40℃,TLC或HPLC监控,至原料剩余<2%,终止反应。向反应液中加入异丙醇,离心或过陶瓷膜,除去菌体,取上清液,上清液用有机溶剂萃取,有机溶剂可选为甲基叔丁基醚、甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、二氯甲烷,2-甲基四氢呋喃、正丁醇。萃取水层2-3次,合并有机相;用饱和食盐水洗涤2~3次,浓缩后得到浅黄色油状物。
体系中底物化合物X的终浓度为10-200g/L,反应温度为20-40℃,转速为200rpm/min,反应时间约3-10h,根据底物浓度而有所变化或通过HPLC监控原料转化情况,当原料剩余<2%,终止反应。
3.化合物Y的手性正相监测方法:
HPLC条件:Daicel OJ-H(250×4.6mm,10μm);流速1.0ml/min;流动相:正己烷:异丙醇=95:5;紫外检测波长225nm;柱温30℃;样品溶于甲醇,浓度10mg/ml;进样体积2μl。
4.化合物Y的反相监测方法:
HPLC条件:phenomenex Gemini 5u C18 110A,250×4.6mm,5μm;流速:1ml/min;流动相梯度如下表;紫外检测波长:260nm;柱温:30℃;样品浓度:10mg/ml;进样体积10μl。
流动相梯度:
时间(min) H<sub>2</sub>O-0.1%TFA(%) ACN-0.1%TFA(%)
0 80 20
15 20 80
35 20 80
35.1 80 20
40 20 80
实施例1羰基还原酶工程菌的构建
将KRED207羰基还原酶(核苷酸序列为SEQ ID NO.2,氨基酸序列为SEQ ID NO.1)目的基因,葡萄糖脱氢酶目的基因委托商业化公司进行全基因合成,克隆入pET28a(+)载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,平板培养,挑取阳性转化子单菌落并提取质粒测序确定后,提取重组质粒,导入BL21(DE3)菌株中,LB培养,获得可以诱导表达重组羰基还原酶与醇脱氢酶的基因工程菌KRED207。
实施例2重组羰基还原酶,葡萄糖脱氢酶的制备
将上一步保存于甘油中的基因工程菌,接种到含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,220rpm,培养13h,得到种子培养基,将种子培养液按1.5%的比例接种到含50ug/ml卡那霉素抗性的液体培养基上,然后37℃,220rmp培养至OD600值>2.0,加入终浓度为1.0%乳糖,降温至25℃,继续培养3h,加入终浓度为0.5%的乳糖,培养20h,放罐,离心得菌体,为生物转化做准备。
发酵配方如下:
原材料 质量含量(%)
酵母提取物 2.4
大豆蛋白胨 1.2
氯化钠 0.3
甘油 0.5
磷酸氢二钾 0.2
七水硫酸镁 0.05
实施例3生物催化法制备化合物Y(化合物2)
Figure BDA0002720737460000101
其中R1为H;R2
Figure BDA0002720737460000102
R3
Figure BDA0002720737460000103
X为化合物1,Y为化合物2。
取0.1M的磷酸盐缓冲液(100ml),加入NADP+(0.1g),加入葡萄糖25g,加入上述发酵所得菌体KRED207(5g),加入葡萄糖脱氢酶(GDH)(1g),调节pH至剧烈搅拌分批加化合物1(10g)的DMSO(30ml)溶液,30℃,间隔0.5h,5%碳酸钾水溶液调节pH7.5-8.0,HPLC监控反应转化率>98%时,终止反应。
加入甲叔醚(100ml)萃取,加热至60℃保温1h,蛋白失活,加入10%的硅藻土,过滤菌体,甲叔醚(50ml)萃取水层,合并有机层,水洗(50ml×2),5%食盐水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得浅黄色油状物得化合物2(9.1g),ee值99.9%,de值99.9%。
为了获得高立体选择性,高反应转化率的羰基还原酶,发明人采用实施例3所示的反应条件进行催化反应,对羰基还原酶进行筛选。
Figure BDA0002720737460000104
Figure BDA0002720737460000111
实施例4生物催化法制备化合物Y(化合物4)
Figure BDA0002720737460000112
其中,R1为H;R2
Figure BDA0002720737460000113
R3
Figure BDA0002720737460000114
X为化合物3,Y为化合物4。
取0.1M的磷酸盐缓冲液(25ml),加入NADP+(0.01g),加入上述发酵所得菌体KRED207(1g),加入葡萄糖脱氢酶(GDH)(0.2g),剧烈搅拌分批加化合物3(2g)的DMSO(3ml)溶液,30℃,间隔0.5h,5%碳酸钾水溶液调节pH7.5-8.0,HPLC监控反应转化率>98%时,终止反应。
加入甲叔醚(30ml)萃取,加热至60℃保温1h,蛋白失活,加入10%的硅藻土,过滤菌体,甲叔醚(15ml)萃取水层,合并有机层,水洗(10ml×2),5%食盐水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得浅黄色油状物得化合物4(1.7g),ee值99.9%,de值99.2%。
实施例5生物催化法制备化合物Y(化合物6)
Figure BDA0002720737460000115
其中,R1为H;R2
Figure BDA0002720737460000116
R3
Figure BDA0002720737460000117
X为化合物5,Y为化合物6。
取0.1M的磷酸盐缓冲液(100ml),加入NADP+(0.1g),加入上述发酵所得菌体KRED207(10g),加入葡萄糖脱氢酶(GDH)(2g),剧烈搅拌分批加化合物5(5g)的DMSO(30ml)溶液,30℃,间隔0.5h,5%碳酸钾水溶液调节pH7.5-8.0,HPLC监控反应转化率>98%时,终止反应。
加入甲叔醚(200ml)萃取,加热至60℃保温1h,蛋白失活,加入10%的硅藻土,过滤菌体,甲叔醚(100ml)萃取水层,合并有机层,水洗(100ml×2),5%食盐水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得浅黄色油状物得化合物6(4.7g),ee值99.9%,de值95.1%。
实施例6生物催化法制备化合物Y(化合物8)
Figure BDA0002720737460000121
其中R1为H;R2
Figure BDA0002720737460000122
R3
Figure BDA0002720737460000123
X为化合物7,Y为化合物8。
取0.1M的磷酸盐缓冲液(10ml),加入NADP+(0.01g),加入上述发酵所得菌体KRED207(1g),加入葡萄糖脱氢酶(GDH)(0.2g),剧烈搅拌分批加化合物7(0.5g)的DMSO(3ml)溶液,30℃,间隔0.5h,5%碳酸钾水溶液调节pH7.5-8.0,HPLC监控反应转化率>98%时,终止反应。
加入甲叔醚(20ml)萃取,加热至60℃保温1h,蛋白失活,加入10%的硅藻土,过滤菌体,甲叔醚(10ml)萃取水层,合并有机层,水洗(10ml×2),5%食盐水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得浅黄色油状物得化合物8(0.42g),ee值99.9%,de值97.3%。
实施例7生物催化法制备化合物Y(化合物10)
Figure BDA0002720737460000124
其中R1为H;R2
Figure BDA0002720737460000125
R3
Figure BDA0002720737460000126
X为化合物9,Y为化合物10。
取0.1M的磷酸盐缓冲液(10ml),加入NADP+(0.01g),加入上述发酵所得菌体KRED207(1g),加入葡萄糖脱氢酶(GDH)(0.2g),剧烈搅拌分批加化合物9(0.5g)的DMSO(3ml)溶液,30℃,间隔0.5h,5%碳酸钾水溶液调节pH7.5-8.0,HPLC监控反应转化率>98%时,终止反应。
加入甲叔醚(20ml)萃取,加热至60℃保温1h,蛋白失活,加入10%的硅藻土,过滤菌体,甲叔醚(10ml)萃取水层,合并有机层,水洗(10ml×2),5%食盐水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩得浅黄色油状物得化合物10(0.45g),ee值99.9%,de值95.8%。
对比例1生物催化法制备化合物Y(化合物12)
Figure BDA0002720737460000131
其中R1为H;R2
Figure BDA0002720737460000132
R3
Figure BDA0002720737460000133
X为化合物11,Y为化合物12。
取0.1M的磷酸盐缓冲液(10ml),加入NADP+(0.01g),加入上述发酵所得菌体KRED207(2g),加入葡萄糖脱氢酶(GDH)(0.4g),剧烈搅拌分批加化合物11(1g)的DMSO(30ml)溶液,30℃,间隔0.5h,5%碳酸钾水溶液调节pH7.5-8.0,HPLC监控反应转化率为66%,终止反应。
加入甲叔醚(200ml)萃取,加热至60℃保温1h,蛋白失活,加入10%的硅藻土,过滤菌体,甲叔醚(100ml)萃取水层,合并有机层,水洗(100ml×2),5%食盐水洗,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩至干得浅黄色油状物得化合物12(0.1g),检测手性纯度基本无立体选择性,ee值0.23%,de值0.26%。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海医药工业研究院
<120> 一种氨基醇手性中间体的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Tyr Thr Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Ala Lys Leu Leu Ala Gly Lys Gly Lys Ser Leu Val Leu Val Ala
20 25 30
Arg Arg Thr Ser Glu Leu Glu Lys Leu Arg Asp Glu Val Lys Gln Ile
35 40 45
Ser Pro Asp Ser Asp Val Ile Leu Lys Ser Val Asp Leu Ala Asp Asn
50 55 60
Gln Asn Val His Asp Leu Tyr Glu Gly Leu Lys Glu Leu Asp Ile Glu
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asn Asn Ala Gly Phe Gly Asp Phe Asp Leu Val Gln Asp
85 90 95
Ile Glu Leu Gly Lys Ile Glu Lys Met Leu Arg Leu Asn Ile Glu Ala
100 105 110
Leu Thr Ile Leu Ser Ser Leu Phe Ala Arg Asp His His Asp Ile Glu
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Val Asn Ile Ser Ser Leu Gly Gly Tyr Arg Ile Val
130 135 140
Pro Asn Ala Val Thr Tyr Cys Ala Thr Lys Phe Tyr Val Ser Ala Tyr
145 150 155 160
Thr Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Gln Lys Gly Gly Ala Lys Leu Arg
165 170 175
Ala Lys Val Leu Ala Pro Ala Ala Thr Glu Thr Glu Phe Val Asp Arg
180 185 190
Ala Arg Gly Glu Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Lys Asn Val His Asn Tyr
195 200 205
His Thr Ala Ala Glu Met Ala Gly Phe Leu His Gln Leu Ile Glu Ser
210 215 220
Asp Ala Ile Val Gly Ile Val Asp Gly Glu Thr Tyr Glu Phe Glu Leu
225 230 235 240
Arg Gly Pro Leu Phe Asn Tyr Ala Gly
245
<210> 2
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaataca ccgttatcac cggtgcttct tctggtatcg gttacgaaac cgctaaactg 60
cttgctggta aaggtaaatc tctggttctg gttgctcgtc gtacctctga actggaaaaa 120
ctgcgtgacg aagttaaaca gatctctccg gactctgacg ttatcctgaa atctgttgac 180
ctggctgaca accagaacgt tcacgacctg tacgaaggtc tgaaagaact ggacatcgaa 240
accctgatca acaacgctgg tttcggtgac ttcgacctgg ttcaggacat cgaactgggt 300
aaaatcgaaa aaatgctgcg tctgaacatc gaagctctga ccatcctgtc ttctctgttc 360
gctcgtgacc accacgacat cgaaggtacc accctggtta acatctcttc tctgggtggt 420
taccgtatcg ttccgaacgc tgttacctac tgcgctacca aattctacgt ttctgcttac 480
accgaaggtc tggctcagga actgcagaaa ggtggtgcta aactgcgtgc taaagttctg 540
gctccggctg ctaccgaaac cgaattcgtt gaccgtgctc gtggtgaagc tggtttcgac 600
tactctaaaa acgttcacaa ctaccacacc gctgctgaaa tggctggttt cctgcaccag 660
ctgatcgaat ctgacgctat cgttggtatc gttgacggtg aaacctacga attcgaactg 720
cgtggtccgc tgttcaacta cgctggttaa 750

Claims (7)

1.一种氨基醇手性中间体的制备方法,其特征在于,包括:
以化合物X为底物,在辅酶存在的液态反应体系中,利用(R,S)-羰基还原酶催化底物,进行式A所示的反应,获得化合物Y;
化合物Y即为所述的氨基醇手性中间体;
Figure FDA0003637505720000011
式A中,
R1=H,
Figure FDA0003637505720000012
Figure FDA0003637505720000013
R4=F、Cl或Br;
所述(R,S)-羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的氨基醇手性中间体的制备方法,其特征在于,所述的辅酶选自下组:还原性辅酶,氧化性辅酶,或其组合;
所述氧化性辅酶为NAD+,NADP+,或其组合;所述还原性辅酶为NADH,NADPH或其组合。
3.根据权利要求1所述的氨基醇手性中间体的制备方法,其特征在于,所述的液态反应体系中,还存在用于辅酶再生的酶和用于辅酶再生的共底物。
4.根据权利要求1所述的氨基醇手性中间体的制备方法,其特征在于,编码所述(R,S)-羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种(R,S)-羰基还原酶,其特征在于,所述(R,S)-羰基还原酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
6.如权利要求5所述的(R,S)-羰基还原酶的编码基因,其特征在于,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种基因工程菌,包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因,其特征在于,所述目的基因为权利要求6所述的(R,S)-羰基还原酶的编码基因。
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