CN112941114B - 一种酶法合成(s)-1,2,4-丁三醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶法合成(S)‑1,2,4‑丁三醇的方法，包括，在pH6.0～7.0的磷酸钾缓冲液中，添加1,4‑二羟基‑2‑丁酮、氢供体、辅酶、酮还原酶组成反应混合液，在25～35℃下进行反应16～24h，生成(S)‑1,2,4‑丁三醇。本发明方法反应转化率大于95％，产物收率最高达89％，产物手性纯度达到99.3％ee。本发明反应条件温和，有机溶剂用量小，反应体系更绿色环保，转化率高，大大提高了(S)‑1,2,4‑丁三醇的制备效率，具有较好的工业应用前景。

Description

一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法
技术领域
本发明属于医药中间体合成技术领域，具体涉及到一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法。
背景技术
(S)-1,2,4-丁三醇可作为许多天然产物、药物、中间体等合成中的重要合成砌块和多种手性化合物的合成前体，如用于药物传递的阳离子脂质体的合成前体，2型糖尿病药物恩格列净的中间体，非小细胞肺癌药物阿法替尼的中间体，还能用于降胆固醇类药物Lipitor、治疗皮肤病药物羟基二十碳四烯酸(12-HETE)等多种重要药物的制造。
目前，已报道的合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法主要有三种：
(1)L-苹果酸或L-苹果酸二甲酯在NaBH4和C2-C6醇催化下的还原反应，或是L-苹果酸在60～160℃、2,900～5,000PSI(197～340atm)条件下，以Cu-Cr、Cu-Al、Ru-Re等为催化剂，直接加氢生成(S)-1,2,4-丁三醇，得率为60％～80％。(J.Org.Chem,1983,48,2767-2769；Asymmetry,1991,2,191-194)
(2)专利CN201911336921.4报道了将(S)-苄氧甲基环氧乙烷与苄基卤甲醚的卤化镁格式试剂反应，得到(S)-1,4-二苄氧基-2-丁醇；然后在钯碳催化剂作用下，氢化脱去苄基保护基得到(S)-1,2,4-丁三醇。
(3)专利200780032753.9报道了(S)-1,2,4-丁三醇的微生物合成，D-木糖或L-阿拉伯糖在D-木糖脱氢酶或L-阿拉伯糖脱氢酶的作用下氧化生成D-木糖酸或L-阿拉伯糖酸，然后D-木糖酸或L-阿拉伯糖酸被转移至大肠杆菌进行脱水、脱羧和脱氢三步反应生成(S)-1,2,4-丁三醇。
其中方法1、2，应用较为严苛的生产条件，原料需要手性的苹果酸，成本较高，污染较大；方法3采取合成生物学原理，发酵手段，目前产量仍然较低，成本较高，不利于工业化。
因此，本领域亟需一种反应具有反应条件温和、效率高、立体选择性强、环境友好的(S)-1,2,4-丁三醇的合成方法，以期在工业上具有较好的应用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，包括，
在pH6.0～7.0的磷酸钾缓冲液中，添加1,4-二羟基-2-丁酮、氢供体、辅酶、酮还原酶组成反应混合液，在25～35℃下进行反应16～24h，生成(S)-1,2,4-丁三醇。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述酮还原酶，其基因碱基序列如SEQ ID No.1所示。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述酮还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述酮还原酶，其制备方法，包括，
制备包含基因碱基序列如SEQ ID No.1所示的酮还原酶重组表达载体，将所得还原酶重组表达载体转化至宿主微生物中制得的异源表达菌株，即获得酮还原酶重组表达转化体；
将所述酮还原酶重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB试管培养基中，37℃活化培养12h；
按1％接种量转接活化培养物至400mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养菌体浓度A600至0.6～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，终浓度0.1mmol/L，于25℃诱导培养16h，离心收集菌体，即得含重组酮还原酶的湿菌体。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述氢供体包括葡萄糖和异丙醇中的一种，所述氢供体浓度为100～400g/L。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述辅酶包括NAD+、NADH、NADP+、NADPH中的一种。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述反应混合液，其中，1,4-二羟基-2-丁酮浓度为50～200g/L。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述反应混合液，其中，1,4-二羟基-2-丁酮浓度为100g/L。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：所述反应混合液，其中，酮还原酶为表达酮还原酶的湿菌体，其浓度为20～80g/L，辅酶浓度为0.1～0.4g/L，缓冲液浓度为50～100mmol/L。
作为本发明所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法一种优选方案，其中：述反应混合液，还包括葡萄糖脱氢酶，葡萄糖脱氢酶浓度为2～8g/L。
本发明有益效果：
(1)本发明提供了一种生物酶催化1,4-二羟基-2-丁酮合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，所用酮还原酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌和发酵培养大量制备，相对廉价易得。
(2)本发明提供了一种生物酶催化1,4-二羟基-2-丁酮合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，反应转化率(95％以上)和产物手性纯度(99.3％ee)均较高，大大提高了(S)-1,2,4-丁三醇的制备效率；且反应为“一锅煮”式，所有原料同时加入，反应后直接得到终产物(S)-1,2,4-丁三醇，中间无需分离提纯，反应条件温和，有机溶剂用量小，反应体系更绿色环保，具有较好的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例3中酮还原酶催化1,4-二羟基-2-丁酮合成(S)-1,2,4-丁三醇反应的TLC检测结果图，其中，1、反应20h检测结果；2、反应12h检测结果；3、底物1,4-二羟基-2-丁酮。
图2为本发明实施例3中酮还原酶催化1,4-二羟基-2-丁酮合成(S)-1,2,4-丁三醇反应的产物手性纯度检测结果图。
图3为本发明实施例制备得到光学活性的(S)-1,2,4-丁三醇反应流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
重组酮还原酶的制备：
全基因合成基因序列如SEQ ID No.1所示。
将所得基因片段用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切12h；pET30a(+)载体用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切12h得到线性pET30a(+)载体；
将双酶切后的基因片段与线性pET30a(+)载体用DNA连接酶在16℃下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞；
在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取阳性转化子测序鉴定后，得到重组表达载体；
将含有目的基因的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，即可获得可以诱导表达重组酮还原酶的基因工程菌，菌落PCR验证阳性克隆。
将获得的基因工程菌接种至5mL含卡那霉素的LB试管培养基中活化培养(37℃培养12h)，按1％接种量转接活化培养物至400mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养菌体浓度A600至0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.1mmol/L)于25℃诱导培养16h，离心收集菌体，即得含重组酮还原酶的湿菌体。
实施例2
(S)-1,2,4-丁三醇的制备：
在pH6.5的磷酸钾缓冲液中，分别添加100g1,4-二羟基-2-丁酮、40g含重组酮还原酶的湿菌体、0.2g辅酶NAD+、4g葡萄糖脱氢酶酶粉、120g无水葡萄糖，定容至1L。在30℃水浴进行还原反应，反应过程补加3mol/L氢氧化钠溶液维持反应液pH 6.5，TLC检测原料点消失，即反应完毕。
反应液80℃保温1h后，冰水中放冷后析出大量固体，减压过滤。
固体用500ml无水乙醇洗涤滤渣2遍，合并滤液和洗涤液，减压蒸馏除去溶剂得118g黄褐色油状物，即为(S)-1,2,4-丁三醇粗品。
粗品在真空0.5-1mm汞柱、175-180℃条件下，减压蒸馏得(S)-1,2,4-丁三醇产品90.7g，计算收率为89％，GC检测产品手性纯度(S)为99.3％ee。
实施例3
(S)-1,2,4-丁三醇的制备：
在pH6.5的磷酸钾缓冲液中，分别添加150g 1,4-二羟基-2-丁酮、60g含重组酮还原酶的湿菌体、0.3g辅酶NAD+、6g葡萄糖脱氢酶酶粉、180g无水葡萄糖，定容至1L。在30℃水浴进行还原反应；
反应过程补加3mol/L氢氧化钠溶液维持反应液pH 6.5，TLC检测原料点消失，即反应完毕。
反应液80℃保温1h后，冰水中放冷后析出大量固体，减压过滤。
固体用500ml无水乙醇洗涤滤渣2遍，合并滤液和洗涤液，减压蒸馏除去溶剂得166g黄褐色油状物，即为(S)-1,2,4-丁三醇粗品。
粗品在真空0.5-1mm汞柱、175-180℃条件下，减压蒸馏得(S)-1,2,4-丁三醇产品131.2g，计算收率为86％，GC检测产品手性纯度(S)为99.3％ee。
实施例4
(S)-1,2,4-丁三醇的制备：
在pH6.5的磷酸钾缓冲液中，分别添加200g 1,4-二羟基-2-丁酮、80g含重组酮还原酶的湿菌体、0.4g辅酶NAD+、8g葡萄糖脱氢酶酶粉、240g无水葡萄糖，在30℃水浴进行还原反应，反应过程补加3mol/L氢氧化钠溶液维持反应液pH 6.5，TLC检测原料点消失，即反应完毕。
反应液80℃保温1h后，冰水中放冷后析出大量固体，减压过滤。
固体用500ml无水乙醇洗涤滤渣2遍，合并滤液和洗涤液，减压蒸馏除去溶剂得193g黄褐色油状物，即为(S)-1,2,4-丁三醇粗品。
粗品在真空0.5-1mm汞柱、175-180℃条件下，减压蒸馏得(S)-1,2,4-丁三醇产品159.1g，计算收率为78％，GC检测产品手性纯度(S)为99.3％ee。
实施例5
按照实施例1的方法制备Lactobacilus kefir来源的酮还原酶(NCBI登录号KRM21673.1)。
按实施例2所述在pH6.5的磷酸钾缓冲液中，分别添加1,4-二羟基-2-丁酮、辅酶NAD+、葡萄糖脱氢酶酶粉、无水葡萄糖以及含Lactobacillus kefir来源的重组酮还原酶的湿菌体，组成反应混合液，在25℃水浴进行反应，反应过程补加3mol/L氢氧化钠溶液维持反应液pH 6.5，通过TLC分析，无明显产物生成。
由此可知，并非所有的酮还原酶都能催化此反应，而本发明中公开的酮还原酶能有效催化1,4-二羟基-2-丁酮生成(S)-1,2,4-丁三醇。
实施例6
(1)与实施例2相比，调整pH为8.5，其余条件相同，最终收率仅为34％，详见如下：
在pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，分别添加1,4-二羟基-2-丁酮、辅酶NAD+、葡萄糖脱氢酶酶粉、无水葡萄糖以及含重组酮还原酶的湿菌体组成反应混合液，在25℃水浴进行还原反应24h，反应过程维持反应液pH8.5，经提取获得(S)-1,2,4-丁三醇纯品，计算产率为34％。
(2)与实施例2相比，调整反应体系pH，其余条件相同，条件和结果见表1。
表1
试验1 试验2 试验3
pH 5.5 7 8
(S)-1,2,4-丁三醇产率(％) 76％ 82％ 65％
实施例7
与实施例2相比，调整反应温度为50℃，其余条件相同，最终收率仅为11％，详见如下：
在pH6.5的磷酸钾缓冲液中，分别添加1,4-二羟基-2-丁酮、辅酶NAD+、葡萄糖脱氢酶酶粉、无水葡萄糖以及含重组酮还原酶的湿菌体组成反应混合液，在50℃水浴进行还原反应24h，反应过程维持反应液pH 6.5左右，经提取获得(S)-1,2,4-丁三醇纯品，计算产率为11％。
实施例8
(1)与实施例2相比，底物与氢供体(葡萄糖)的浓度比调整为1:1，其余条件相同，最终收率仅为46％，详见工艺如下：
在pH6.5的磷酸钾缓冲液中，分别添加1,4-二羟基-2-丁酮、辅酶NAD+、葡萄糖脱氢酶酶粉、无水葡萄糖以及含重组酮还原酶的湿菌体组成反应混合液，在30℃水浴进行还原反应24h，反应过程维持反应液pH 6.5左右，经提取获得(S)-1,2,4-丁三醇纯品，计算产率为46％。
(2)与实施例2相比，对底物与氢供体(葡萄糖)的浓度比调整，条件和结果见表2。
表2
试验1 试验2 试验3
底物与氢供体的浓度比 1:0.5 1：1.5 1:2
(S)-1,2,4-丁三醇产率(％) 32％ 64％ 67％
本发明提出了利用酮还原酶不对称催化合成(S)-1,2,4-丁三醇，最终反应转化率大于95％，产物收率达89％，产物手性纯度达到99.3％ee，本发明方法反应条件温和，有机溶剂用量小，反应体系更绿色环保，转化率高，大大提高了(S)-1,2,4-丁三醇的制备效率，具有较好的工业应用前景。
本发明提供了一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，以1,4-二羟基-2-丁酮为底物不对称催化合成(S)-1,2,4-丁三醇，在合适的温度、pH、生物催化剂、辅酶、氢供体和溶剂条件下，制备得到光学活性的(S)-1,2,4-丁三醇，反应流程如图3所示。该反应中生物催化剂为酮还原酶，来源于Leifsonia sp.strain S749，其基因序列经人工设计后如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江苏惠利生物科技有限公司
<120> 一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法
<141> 2021-04-15
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 859
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tggagttatc cgacaggtgt cggataactg aagggagatt ttcatggctc agtacgacgt 60
cgccgaccgg tccgcgatcg tgaccggagg cggctcgggc atcgggcgcg ccgtggcgct 120
cactctcgcg gcgagcggcg cagccgtcct cgtcaccgac ctgaacgagg agcacgcgca 180
ggccgtcgtg gccgagatcg aggccgcggg cggtaaggcc gccgcgctcg cgggcgacgt 240
gaccgacccc gcgttcggcg aggcgagcgt cgccggggcg aacgctctcg cgcccctcaa 300
gatcgcggtc aacaacgcgg gcatcggcgg cgaggccgcc acggtcggcg actactcgct 360
cgacagctgg cgcacggtga tcgaggtcaa cctcaacgcc gtgttctacg ggatgcagcc 420
gcagctgaag gccatggccg ccaacggcgg cggtgcgatc gtcaacatgg cgtccatcct 480
gggaagcgtc ggcttcgcca actcgtcggc ctacgtcacg gccaagcacg cgctgctcgg 540
tctcacccag aacgccgcgc tcgagtacgc cgccgacaag gtgcgcgtcg tcgcggtcgg 600
ccccggcttc atccgcaccc cgctcgtgga ggccaacctc tccgccgacg cgctggcgtt 660
cctcgagggc aagcacgccc tcggccgcct gggcgagccg gaagaggtcg cctcgctggt 720
cgcgttcctc gcctccgacg ccgcgagctt catcaccggc agctaccacc tggtggacgg 780
cggctacacc gcccagtgac cgggcgacag cccgtatcgt gcacggtcgc gctcccttag 840
gctgaggagc gtgaccccg 859
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Ala Gln Tyr Asp Val Ala Asp Arg Ser Ala Ile Val Thr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ala Ala Val Leu Val Thr Asp Leu Asn Glu Glu His Ala Gln Ala Val
35 40 45
Val Ala Glu Ile Glu Ala Ala Gly Gly Lys Ala Ala Ala Leu Ala Gly
50 55 60
Asp Val Thr Asp Pro Ala Phe Gly Glu Ala Ser Val Ala Gly Ala Asn
65 70 75 80
Ala Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly
85 90 95
Glu Ala Ala Thr Val Gly Asp Tyr Ser Leu Asp Ser Trp Arg Thr Val
100 105 110
Ile Glu Val Asn Leu Asn Ala Val Phe Tyr Gly Met Gln Pro Gln Leu
115 120 125
Lys Ala Met Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser
130 135 140
Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala Asn Ser Ser Ala Tyr Val Thr Ala
145 150 155 160
Lys His Ala Leu Leu Gly Leu Thr Gln Asn Ala Ala Leu Glu Tyr Ala
165 170 175
Ala Asp Lys Val Arg Val Val Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Arg Thr
180 185 190
Pro Leu Val Glu Ala Asn Leu Ser Ala Asp Ala Leu Ala Phe Leu Glu
195 200 205
Gly Lys His Ala Leu Gly Arg Leu Gly Glu Pro Glu Glu Val Ala Ser
210 215 220
Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Asp Ala Ala Ser Phe Ile Thr Gly Ser
225 230 235 240
Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (3)

1.一种酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于：包括，
在pH6.0~7.0的磷酸钾缓冲液中，添加1,4-二羟基-2-丁酮、氢供体、辅酶、酮还原酶和葡萄糖脱氢酶组成反应混合液，在25~35℃下进行反应16~24h，生成(S)-1,2,4-丁三醇；其中，
所述氢供体为葡萄糖；
所述辅酶为NAD+；
所述酮还原酶，其基因碱基序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述反应混合液中，1,4-二羟基-2-丁酮浓度为100g/L，氢供体浓度为120 g/L，葡萄糖脱氢酶浓度为4g/L，辅酶浓度为0.2 g/L。
2.如权利要求1所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶，其制备方法，包括，
制备包含基因碱基序列如SEQ ID No.1所示的酮还原酶重组表达载体，将所得还原酶重组表达载体转化至宿主微生物中制得的异源表达菌株，即获得酮还原酶重组表达转化体；
将所述酮还原酶重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB试管培养基中，37℃活化培养12 h；
按1%接种量转接活化培养物至400 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养菌体浓度A600至0.6~0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，终浓度0.1 mmol/L，于25℃诱导培养16h，离心收集菌体，即得含重组酮还原酶的湿菌体。
3.如权利要求2所述酶法合成(S)-1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于：所述反应混合液，其中，酮还原酶为表达酮还原酶的湿菌体，其浓度为20~80 g/L。
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