CN109852593B - 一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用 - Google Patents
一种重组酮还原酶及在制备r-3-羟基丁酸及其盐中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种重组蛋白，具体涉及一种重组酮还原酶及在制备R‑3‑羟基丁酸及其盐中的应用。所述的重组酮还原酶，包含：(1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中，第176位氨基酸、191位氨基酸和第195位氨基酸中的至少1个相当的氨基酸残基被取代；或者(2)如(1)所述的氨基酸序列，其中位点176、191、195之外的一个或更多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；且与野生型酮还原酶相比，该重组酮还原酶的酶活力提高。上述重组酮还原酶对乙酰乙酸乙酯底物的活力较野生型提高至少300％，其中，CmCR‑186突变体对乙酰乙酸乙酯底物的活力较野生型提高了879％。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组蛋白，具体涉及一种重组酮还原酶及在制备R-3-羟基丁酸及其盐中的应用。
背景技术
R-3-羟基丁酸(R-3HB，图1)，也称为β-羟基丁酸，其英文名称为(R)-3-hydroxybutyric acid或(R)-3-hydroxybutyrate。R-3-羟基丁酸为吸湿性单斜晶，熔点49-50℃，比旋光度为-24.9°，溶于水、乙醇、乙醚，不溶于苯；由于3HB公示存在羟基和羧基，因此可进行两种基团的各种典型反应。
3-羟基丁酸不仅是合成PHA的一种重要单体，在生物体内它也具有重要的意义，它是哺乳动物体内酮体(ketone bodies)的重要组成之一，其约占脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成酮体的70％。3HB就被发现与体内能连代谢紊乱、糖尿病等重大疾病密切相关。文献报道使用外源的3HB(口服或者注射)来治疗一些疾病及损伤，例如，Katayama等人报道了采用注射3HB治疗小鼠模型的出血性休克症状；日本清水制药公司Suzuki等人2001年报道了在小鼠模型中利用3HB治疗脑供氧不足、缺氧症以及缺血症。另外，Kashiwaya Y等人的文章证明了3HB能够对帕金森症及老人痴呆症(Alzheimer Disease)模型的神经细胞有影响作用。
3HB的生理作用如下：(1)可以治疗许多得益于酮体水平提高的疾病(如包括癫痫和肌阵挛的神经紊乱疾病以及包括阿尔兹默症和痴呆等的神经退化性疾病)；(2)通过氧化辅酶Q来减少自由基伤害(如缺血症)；(3)加强代谢效率(提高训练效率以及运动成绩，治疗供氧不足、心绞痛、心肌梗塞等)；(4)治疗如癌症尤其是脑癌(如星细胞瘤等)相关的疾病；(5)对于糖代谢紊乱(如Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、低血糖低酮体症等)具有很好的疗效。
3HB分子中既含有羟基，又含有羧基官能团，具有醇和羧酸的综合性能，是一种重要的制药原料和药理学试剂。Chiba等人采用3HB作为中间体，制备出碳青霉素烯类抗生素。Seebach等人报道可作为手性中间体合成大环类物质，如核球壳菌素等。
3HB现在主要制备方法有两种：化学法和生物法，化学法主要有β-丁内酯的水解制备3-羟基丁酸，由乙醛与烯酮在Zn盐存在下反应，生成β-丁内脂，然后在酸性条件下水解；利用Reformatsky反应是通过将Zn加到α-卤代酯(通常是α-溴代酯)与乙醛的乙醚(或芳烃)溶液中，然后在酸性条件下水解，可制得3-羟基丁酸；丁烯酸在酸性或碱性条件下水合可制备3-羟基丁酸：用HCN处理环氧丙烷，得到中间产物羟基腈，然后水解可制得3-羟基丁酸。众多化学制备方法中，使用金属离子或者氰化物，反应条件严苛，而且对环境污染比较大，成本相对来说比较高，因此，工业化应用前景一直不是好。
生物法制备R-3HB主要为直接发酵法。深圳意可曼生物利用基因工程大肠杆菌发酵法制备R-3HB(CN200910106660.7)，但是其发酵单位低，成本高，分离纯化难度大，难以工业化应用。尽管这方面的研究报到还没有，但是以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物还原获得R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯研究非常多。
本发明通过发明一种新型的制备R-3HB以及其各种盐的衍生物的工艺，以乙酰乙酸乙酯或者乙酰乙酸甲酯为底物，通过酮基还原酶还原后获得R-3-羟基丁酸乙酯或者R-3-羟基丁酸甲酯，再经过水解获得R-3-羟基丁酸，然后成盐反应制备R-3-羟基丁酸钠盐、R-3-羟基丁酸镁盐、R-3-羟基丁酸钙盐等化合物。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种重组酮还原酶。
本发明的另一目的在于提供上述重组酮还原酶的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述重组酮还原酶在制备R-3-羟基丁酸及其盐中的应用。
为了达到上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种重组酮还原酶，包含：
(1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中，第176位氨基酸、191位氨基酸和第195位氨基酸中的至少1个相当的氨基酸残基被取代；
或者(2)如(1)所述的氨基酸序列，其中位点176、191、195之外的一个或更多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；
且与野生型酮还原酶相比，该重组酮还原酶的酶活力提高；
所述的重组酮还原酶，优选为如下突变中的至少一种：
如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C；
如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第191位氨基酸替换为A；
如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第191位氨基酸替换为T；
如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第195位氨基酸替换为Y；
如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第195位氨基酸替换为R；
所述的的重组酮还原酶，进一步优选为如下突变中的至少一种：
(1)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C；
(2)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C、第191位氨基酸替换为A和第195位氨基酸替换为Y；
(3)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C、第191位氨基酸替换为A；
(4)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第191位氨基酸替换为T和第195位氨基酸替换为R；
(5)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第191位氨基酸替换为T；
编码所述的重组酮还原酶的核苷酸序列为如下突变中的至少一种：
(1)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的核苷酸序列中第527位核苷酸C替换为G；
(2)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的核苷酸序列中第527位核苷酸C替换为G，第571～572位核苷酸替换为GC，第583～585位核苷酸替换为TAT；
(3)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的核苷酸序列中第527位核苷酸C替换为G，第571～572位核苷酸替换为GC
(4)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的核苷酸序列中第571～573位核苷酸替换为ACC，第583～585位核苷酸替换为CGT；
(5)如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的核苷酸序列中第571～573位核苷酸替换为ACC；
一种重组载体，为将上述编码重组酮还原酶的核苷酸序列与载体连接得到；
所述的载体为T7启动子表达系列载体；
所述的载体优选为pET28a；
一种表达上述重组酮还原酶的菌株，是通过将上述重组载体转化到表达宿主菌得到；
所述的表达宿主菌为大肠杆菌、酵母菌(毕赤酵母或酿酒酵母等)、枯草芽孢杆菌、谷棒杆菌等；
所述的表达宿主菌优选为大肠杆菌或谷棒杆菌；
所述的表达宿主菌进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)；
所述的重组酮还原酶在制备R-3-羟基丁酸及其盐中的应用；
所述的重组酮还原酶的反应底物为乙酰乙酸甲酯和乙酰乙酸乙酯中的至少一种；
所述的R-3-羟基丁酸盐为R-3-羟基丁酸钠盐、R-3-羟基丁酸钾盐、R-3-羟基丁酸钙盐和R-3-羟基丁酸镁盐中的至少一种；
所述的重组酮还原酶的反应底物优选为乙酰乙酸乙酯；
一种制备R-3-羟基丁酸及其盐的方法，包含如下步骤：
(1)利用上述表达重组酮还原酶的菌株表达得到重组酮还原酶，然后以乙酰乙酸乙酯为底物，以甲酸铵为氢供体，在重组酮还原酶和甲酸脱氢酶作用下，通过酶法转化，得到R-3-羟基丁酸乙酯；
(2)R-3-羟基丁酸乙酯水解成盐；
(3)R-3-羟基丁酸盐的提纯；
所述的制备R-3-羟基丁酸及其盐的方法，优选包含如下步骤：
(1)发酵上述表达重组酮还原酶的菌株并收集菌体，破壁后，得到重组酮还原酶粗酶液；在pH为6.5～7.0的条件下，以乙酰乙酸乙酯为底物，以甲酸铵为氢供体，在重组酮还原酶粗酶液和甲酸脱氢酶粗酶液作用下，28～30℃反应至乙酰乙酸乙酯少于1 g/L时停止反应，得到R-3-羟基丁酸乙酯；
(2)将步骤(1)制得的R-3-羟基丁酸乙酯水解；
(3)将步骤(2)水解后的反应体系进行过滤和减压浓缩，得到R-3-羟基丁酸盐，R-3-羟基丁酸盐进一步纯化，得到R-3-羟基丁酸；
所述的pH优选采用硫酸或者氢氧化钾调控；
所述的乙酰乙酸乙酯的初始浓度优选为100～200g/L(反应起始时浓度)；
所述的重组酮还原酶粗酶液或甲酸脱氢酶粗酶液优选通过如下方法制备得到：
将菌体按照质量比1:4加水重悬，然后超声波破碎，得到重组酮还原酶粗酶液或甲酸脱氢酶粗酶液；
所述的重组酮还原酶粗酶液或甲酸脱氢酶粗酶液的用量优选为乙酰乙酸乙酯质量的1～10％；
所述的重组酮还原酶粗酶液和甲酸脱氢酶粗酶液的质量比优选为2：1；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过蛋白同源建模技术，找出三个潜在的酮还原酶氨基酸位点：176位丝氨酸、191位酪氨酸、195位赖氨酸，将具有序列表中序列1的基因序列通过三位点组合饱和突变，获得一个或多个氨基酸位点取代的酮还原酶突变体，该组突变体对乙酰乙酸乙酯底物的活力较野生型提高至少300％，其中，CmCR-186突变体对乙酰乙酸乙酯底物的活力较野生型提高了879％。
(2)本发明使用酮还原酶突变体的方法制备3-羟基丁酸钠、3-羟基丁酸钾、3-羟基丁酸钙盐，其中，获得的基因工程菌稳定、高效，完全适合产业化生产，可以大大地降低生产成本，从而突破了产业化成本高以及手性纯度低的技术瓶颈。
(3)本发明提高了生产效率，降低了传统化学合成和发酵法成本高，使R-3-羟基丁酸钠、R-3-羟基丁酸钾、R-3-羟基丁酸钙盐的生产成本得到大幅度降低。
(4)本发明使用酮还原酶突变体的方法制备R-3-羟基丁酸钠盐，R-3-羟基丁酸钾盐，R-3-羟基丁酸钙盐，R-3-羟基丁酸镁盐手性纯度高，达99.5％以上，省去了手性拆分的复杂过程，且收率达85％以上。
附图说明
图1是R-3-羟基丁酸化学结构示意图。
图2是CmCR结构示意图，其中，(a)CmCR三维结构；(b)底物、催化三联体S176-Y191-K195及辅因子NADPH空间构象。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，含0.17mol/L KH2PO4和0.17mol/L K2HPO4的混合溶液的配制方法为：用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和2.96g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100mL，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。
重组载体pBTac1-FDH已在参考文献(Kratzer R,Pukl M,Egger S,et al.Whole-cell bioreduction of aromatic alpha-keto esters using Candida tenuis xylosereductase and Candida boidinii formate dehydrogenase co-expressed inEscherichia coli[J].Microbial Cell Factories,2008,7(1):37-37.)中公开；
实施例1
(1)野生CmCR酮还原酶工程菌
通过全基因序列合成如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶(GenBank:AB036927，来源于木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的核苷酸序列，然后与质粒pET28a(市购)连接，得到重组载体pET28a-CmCR；然后将重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建表达酮还原酶的大肠杆菌基因工程菌pET28a-CmCR/BL21(DE3)。
野生酮还原酶的氨基酸序列如下所示：
MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTASMSGHIVNVPQFQATYNAAKAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP
野生酮还原酶的核苷酸序列如下所示：
ATGGCTAAGAACTTCTCCAACGTCGAGTACCCCGCCCCGCCTCCGGCCCACACCAAGAACGAGTCGCTGCAGGTCCTTGACCTGTTCAAGCTGAATGGCAAGGTTGCCAGCATCACTGGCTCGTCCAGCGGTATTGGCTACGCTCTGGCTGAGGCCTTCGCGCAGGTCGGCGCTGACGTCGCCATCTGGTACAACAGCCACGACGCTACTGGCAAGGCTGAGGCCCTCGCCAAGAAGTACGGCGTCAAGGTCAAGGCCTACAAGGCGAACGTGAGCAGCTCTGACGCCGTGAAGCAGACGATCGAGCAGCAGATCAAGGACTTCGGCCACCTCGACATTGTCGTGGCGAACGCCGGCATTCCCTGGACGAAGGGTGCCTACATCGACCAGGACGACGACAAGCACTTCGACCAGGTCGTTGACGTCGATCTGAAGGGTGTTGGATACGTCGCGAAGCACGCTGGCCGTCACTTCCGCGAGCGCTTCGAGAAGGAGGGCAAGAAGGGCGCCCTTGTGTTCACGGCCTCCATGTCTGGCCACATTGTGAACGTGCCCCAGTTCCAGGCCACGTACAACGCGGCCAAGGCTGGCGTGCGCCACTTCGCGAAGTCGCTGGCCGTCGAGTTCGCGCCGTTCGCGCGCGTGAACTCTGTGTCGCCGGGCTACATCAACACGGAGATCTCGGACTTCGTGCCCCAGGAGACGCAGAACAAGTGGTGGTCGCTCGTGCCCCTTGGCCGCGGCGGAGAGACGGCCGAGCTCGTTGGCGCCTACCTGTTCCTTGCATCTGACGCCGGCTCGTACGCCACTGGTACGGACATCATTGTTGACGGTGGCTACACGCTTCCCTAA
(2)野生CmCR酮还原酶工程菌发酵
①发酵培养基配制：将12g胰蛋白胨、24g酵母提取物、和甘油4mL加入到900mL去离子水中，摇动容器使溶质完全溶解，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min；然后冷却至60℃以下时加入100mL无菌的含0.17mol/L KH2PO4和0.17mol/L K2HPO4的混合溶液；
②从含有CmCR工程菌种的平板挑选单克隆，接种到5mL LB培养基中，37℃培养过夜；1mL种子液接种到含有100mL发酵培养基的1000mL摇瓶中培养5h，OD达到1.25，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃培养15h，离心获得菌体，-80℃冻存24h备用。
(3)野生CmCR酮还原酶活力测定
粗酶液的制备：菌体按200g/L加纯化水重悬，然后超声波破碎(电压400W，超声时间3s，间隔时间5s，工作次数80次，超声过程中悬浮菌体用冰浴冷却)，破碎后即得粗酶液；
在5mL离心管中，加入2mL纯化水、10mM乙酰乙酸乙酯、1mM NADH，混合均匀后用氨水调pH至7.0，升温至30℃；加入0.1mL酮基还原酶粗酶液，放入水浴摇床中开始反应，250rpm，30℃，反应10min，结束反应，液相检测生成的产物。1酶活定义为每分钟催化生成1微摩尔产物所需要的酶量。
经检测，野生型CmCR酮还原酶活力为200U/g。
实施例2酮还原酶饱和突变库的构建
(1)计算机模拟CmCR酮还原酶结构建模
木兰假丝酵母(Candida magnoliae)来源的CmCR与近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)来源的羰基还原酶(PDB：3CTM)(简称CACR)同源。经Sybyl软件进行同源建模，获得其3D结构(图2a)。根据同源建模的3D结构图，发现CmCR中S176、Y191、K195三个位点，在以乙酰乙酸乙酯为底物的反应中起到了重要作用(图2b)。
(2)饱和突变库的分子构建
根据计算机三维结构模拟结果，对S176、Y191、K195进行饱和组合突变，建立饱和突变基因库。具体方法如下所示：
①引物设计
以SEQ ID NO：1序列为模板，设计简并引物，其序列如下所示；
引物CmCR-F：5’-GCCCTTGTGTTCACGGCCNNKATGTCTGGCCACATTGTGAA-3’；
引物CmCR-R：5’-TGGCGCACGCCAGCMNNGGCCGCGTTMNNCGTGGCCTGGAACT-3’；
其中，M＝A/C，K＝G/T，N＝A/C/G/T；
②以重组质粒pET28a-CmCR(实施例1制得)为模板，以引物CmCR-F和CmCR-R为扩增引物，进行PCR扩增，得到小片段PCR产物并进行胶回收，回收后的片段记作mCmCR；其中，PCR反应体系(50μL)为：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1×KOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶；PCR反应条件为：95℃1min；98℃10s，57℃30s，68℃1min/kbp；30个循环；68℃10min；
③以上述步骤②中获得的胶回收到小片段mCmCR作为引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR。其中，PCR反应体系(50μL)为：10ng质粒模板(重组质粒pET28a-CmCR)，250ng mCmCR切胶回收片段，1×KOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶；PCR反应条件为：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。Dpn I消化PCR产物，然后电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
(3)突变体库的高通量筛选
①培养：96孔板中，每个孔中加入600μL含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基，将步骤(2)获得的突变体单菌落接入培养基中，37℃、290rpm培养过夜；然后取60μL过夜培养菌液转接至含有600μL TB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96孔深孔板中，37℃，290rpm培养6h，然后每个孔加入终浓度0.2mM IPTG，25℃、290rpm培养24h，其中，阳性菌对照为pET28a-CmCR/BL21(DE3)(实施例1制得)，阴性菌对照为pET28a/BL21(DE3)(空载)；
②冻融：4000rpm、4℃离心10min去培养基，然后-80℃冻存1h，之后室温解冻30min；
③测活：每孔加入200μL底物反应液(10g乙酰乙酸甲酯，1mM NADH，10mL异丙醇)，调节pH至7.5，定容至100mL，迅速放入30℃反应3h，反应结束后加入200μL终止反应液(2MHCl)；然后样品在4000rpm，4℃离心20min取40μL离心上清加入160μL纯水中混匀，然后读取OD250数值。
(4)CmCR酮还原酶的饱和组合突变库筛选数据
根据对CmCR酮还原酶饱和突变库进行高通量筛选，获得了5株活性明显高于野生型CmCR的突变菌株，筛选结果见表1，其中，CmCR-186突变体对乙酰乙酸乙酯底物的活力较野生型提高了879％。
表1 CmCR重组酮还原酶的乙酰乙酸甲酯还原反应活力
*酶比活力:以野生酶酶的发酵活力(U/mL)与菌体浓度OD(OD/mL)的比值为100％。
CmCR-186突变体的氨基酸序列如下所示：
MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTACMSGHIVNVPQFQATANAAKAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP
CmCR-186突变体的核苷酸序列如下所示：
ATGGCTAAGAACTTCTCCAACGTCGAGTACCCCGCCCCGCCTCCGGCCCACACCAAGAACGAGTCGCTGCAGGTCCTTGACCTGTTCAAGCTGAATGGCAAGGTTGCCAGCATCACTGGCTCGTCCAGCGGTATTGGCTACGCTCTGGCTGAGGCCTTCGCGCAGGTCGGCGCTGACGTCGCCATCTGGTACAACAGCCACGACGCTACTGGCAAGGCTGAGGCCCTCGCCAAGAAGTACGGCGTCAAGGTCAAGGCCTACAAGGCGAACGTGAGCAGCTCTGACGCCGTGAAGCAGACGATCGAGCAGCAGATCAAGGACTTCGGCCACCTCGACATTGTCGTGGCGAACGCCGGCATTCCCTGGACGAAGGGTGCCTACATCGACCAGGACGACGACAAGCACTTCGACCAGGTCGTTGACGTCGATCTGAAGGGTGTTGGATACGTCGCGAAGCACGCTGGCCGTCACTTCCGCGAGCGCTTCGAGAAGGAGGGCAAGAAGGGCGCCCTTGTGTTCACGGCCTGCATGTCTGGCCACATTGTGAACGTGCCCCAGTTCCAGGCCACGGCCAACGCGGCCAAGGCTGGCGTGCGCCACTTCGCGAAGTCGCTGGCCGTCGAGTTCGCGCCGTTCGCGCGCGTGAACTCTGTGTCGCCGGGCTACATCAACACGGAGATCTCGGACTTCGTGCCCCAGGAGACGCAGAACAAGTGGTGGTCGCTCGTGCCCCTTGGCCGCGGCGGAGAGACGGCCGAGCTCGTTGGCGCCTACCTGTTCCTTGCATCTGACGCCGGCTCGTACGCCACTGGTACGGACATCATTGTTGACGGTGGCTACACGCTTCCCTAA
CmCR-27突变体的氨基酸序列如下所示：
MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTACMSGHIVNVPQFQATYNAAKAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP
CmCR-27突变体的核苷酸序列如下所示：
ATGGCTAAGAACTTCTCCAACGTCGAGTACCCCGCCCCGCCTCCGGCCCACACCAAGAACGAGTCGCTGCAGGTCCTTGACCTGTTCAAGCTGAATGGCAAGGTTGCCAGCATCACTGGCTCGTCCAGCGGTATTGGCTACGCTCTGGCTGAGGCCTTCGCGCAGGTCGGCGCTGACGTCGCCATCTGGTACAACAGCCACGACGCTACTGGCAAGGCTGAGGCCCTCGCCAAGAAGTACGGCGTCAAGGTCAAGGCCTACAAGGCGAACGTGAGCAGCTCTGACGCCGTGAAGCAGACGATCGAGCAGCAGATCAAGGACTTCGGCCACCTCGACATTGTCGTGGCGAACGCCGGCATTCCCTGGACGAAGGGTGCCTACATCGACCAGGACGACGACAAGCACTTCGACCAGGTCGTTGACGTCGATCTGAAGGGTGTTGGATACGTCGCGAAGCACGCTGGCCGTCACTTCCGCGAGCGCTTCGAGAAGGAGGGCAAGAAGGGCGCCCTTGTGTTCACGGCCTGCATGTCTGGCCACATTGTGAACGTGCCCCAGTTCCAGGCCACGTACAACGCGGCCAAGGCTGGCGTGCGCCACTTCGCGAAGTCGCTGGCCGTCGAGTTCGCGCCGTTCGCGCGCGTGAACTCTGTGTCGCCGGGCTACATCAACACGGAGATCTCGGACTTCGTGCCCCAGGAGACGCAGAACAAGTGGTGGTCGCTCGTGCCCCTTGGCCGCGGCGGAGAGACGGCCGAGCTCGTTGGCGCCTACCTGTTCCTTGCATCTGACGCCGGCTCGTACGCCACTGGTACGGACATCATTGTTGACGGTGGCTACACGCTTCCCTAA
CmCR-59突变体的氨基酸序列如下所示：
MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTACMSGHIVNVPQFQATANAAYAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP
CmCR-59突变体的核苷酸序列如下所示：
ATGGCTAAGAACTTCTCCAACGTCGAGTACCCCGCCCCGCCTCCGGCCCACACCAAGAACGAGTCGCTGCAGGTCCTTGACCTGTTCAAGCTGAATGGCAAGGTTGCCAGCATCACTGGCTCGTCCAGCGGTATTGGCTACGCTCTGGCTGAGGCCTTCGCGCAGGTCGGCGCTGACGTCGCCATCTGGTACAACAGCCACGACGCTACTGGCAAGGCTGAGGCCCTCGCCAAGAAGTACGGCGTCAAGGTCAAGGCCTACAAGGCGAACGTGAGCAGCTCTGACGCCGTGAAGCAGACGATCGAGCAGCAGATCAAGGACTTCGGCCACCTCGACATTGTCGTGGCGAACGCCGGCATTCCCTGGACGAAGGGTGCCTACATCGACCAGGACGACGACAAGCACTTCGACCAGGTCGTTGACGTCGATCTGAAGGGTGTTGGATACGTCGCGAAGCACGCTGGCCGTCACTTCCGCGAGCGCTTCGAGAAGGAGGGCAAGAAGGGCGCCCTTGTGTTCACGGCCTGCATGTCTGGCCACATTGTGAACGTGCCCCAGTTCCAGGCCACGGCCAACGCGGCCTATGCTGGCGTGCGCCACTTCGCGAAGTCGCTGGCCGTCGAGTTCGCGCCGTTCGCGCGCGTGAACTCTGTGTCGCCGGGCTACATCAACACGGAGATCTCGGACTTCGTGCCCCAGGAGACGCAGAACAAGTGGTGGTCGCTCGTGCCCCTTGGCCGCGGCGGAGAGACGGCCGAGCTCGTTGGCGCCTACCTGTTCCTTGCATCTGACGCCGGCTCGTACGCCACTGGTACGGACATCATTGTTGACGGTGGCTACACGCTTCCCTAA
CmCR-635突变体的氨基酸序列如下所示：
MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTASMSGHIVNVPQFQATTNAARAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP
CmCR-635突变体的核苷酸序列如下所示：
ATGGCTAAGAACTTCTCCAACGTCGAGTACCCCGCCCCGCCTCCGGCCCACACCAAGAACGAGTCGCTGCAGGTCCTTGACCTGTTCAAGCTGAATGGCAAGGTTGCCAGCATCACTGGCTCGTCCAGCGGTATTGGCTACGCTCTGGCTGAGGCCTTCGCGCAGGTCGGCGCTGACGTCGCCATCTGGTACAACAGCCACGACGCTACTGGCAAGGCTGAGGCCCTCGCCAAGAAGTACGGCGTCAAGGTCAAGGCCTACAAGGCGAACGTGAGCAGCTCTGACGCCGTGAAGCAGACGATCGAGCAGCAGATCAAGGACTTCGGCCACCTCGACATTGTCGTGGCGAACGCCGGCATTCCCTGGACGAAGGGTGCCTACATCGACCAGGACGACGACAAGCACTTCGACCAGGTCGTTGACGTCGATCTGAAGGGTGTTGGATACGTCGCGAAGCACGCTGGCCGTCACTTCCGCGAGCGCTTCGAGAAGGAGGGCAAGAAGGGCGCCCTTGTGTTCACGGCCTCCATGTCTGGCCACATTGTGAACGTGCCCCAGTTCCAGGCCACGACCAACGCGGCCCGTGCTGGCGTGCGCCACTTCGCGAAGTCGCTGGCCGTCGAGTTCGCGCCGTTCGCGCGCGTGAACTCTGTGTCGCCGGGCTACATCAACACGGAGATCTCGGACTTCGTGCCCCAGGAGACGCAGAACAAGTGGTGGTCGCTCGTGCCCCTTGGCCGCGGCGGAGAGACGGCCGAGCTCGTTGGCGCCTACCTGTTCCTTGCATCTGACGCCGGCTCGTACGCCACTGGTACGGACATCATTGTTGACGGTGGCTACACGCTTCCCTAA
CmCR-832突变体的氨基酸序列如下所示：
MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTASMSGHIVNVPQFQATTNAAKAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP
CmCR-832突变体的核苷酸序列如下所示：
ATGGCTAAGAACTTCTCCAACGTCGAGTACCCCGCCCCGCCTCCGGCCCACACCAAGAACGAGTCGCTGCAGGTCCTTGACCTGTTCAAGCTGAATGGCAAGGTTGCCAGCATCACTGGCTCGTCCAGCGGTATTGGCTACGCTCTGGCTGAGGCCTTCGCGCAGGTCGGCGCTGACGTCGCCATCTGGTACAACAGCCACGACGCTACTGGCAAGGCTGAGGCCCTCGCCAAGAAGTACGGCGTCAAGGTCAAGGCCTACAAGGCGAACGTGAGCAGCTCTGACGCCGTGAAGCAGACGATCGAGCAGCAGATCAAGGACTTCGGCCACCTCGACATTGTCGTGGCGAACGCCGGCATTCCCTGGACGAAGGGTGCCTACATCGACCAGGACGACGACAAGCACTTCGACCAGGTCGTTGACGTCGATCTGAAGGGTGTTGGATACGTCGCGAAGCACGCTGGCCGTCACTTCCGCGAGCGCTTCGAGAAGGAGGGCAAGAAGGGCGCCCTTGTGTTCACGGCCTCCATGTCTGGCCACATTGTGAACGTGCCCCAGTTCCAGGCCACGACCAACGCGGCCAAGGCTGGCGTGCGCCACTTCGCGAAGTCGCTGGCCGTCGAGTTCGCGCCGTTCGCGCGCGTGAACTCTGTGTCGCCGGGCTACATCAACACGGAGATCTCGGACTTCGTGCCCCAGGAGACGCAGAACAAGTGGTGGTCGCTCGTGCCCCTTGGCCGCGGCGGAGAGACGGCCGAGCTCGTTGGCGCCTACCTGTTCCTTGCATCTGACGCCGGCTCGTACGCCACTGGTACGGACATCATTGTTGACGGTGGCTACACGCTTCCCTAA
实施例3重组菌株的发酵罐发酵
(1)重组酮还原酶突变体菌株CmCR-186/BL21(DE3)7升发酵罐发酵
将重组酮还原酶突变体菌株CmCR-186/BL21(DE3)单克隆接种至4mL含有50mg/L卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、200rpm培养20h，然后取2mL过夜培养菌体转接至200mL种子培养基中，37℃，200rpm培养4h后，将200mL培养菌体全部接种至含有4.8L发酵培养基的7L发酵罐中进行发酵。发酵罐培养条件：罐温37℃，通气比2.5vvm，搅拌350rpm，罐压0.05MPa，当发酵液中菌体OD600＝5～6时，加入终浓度0.2mM的ITPG诱导，温度降低至25℃，罐压、通气量等不变，继续培养16h，结束发酵。发酵液8000rpm离心，去上清，收集菌体备用。其中，培养基组成如下：
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；
种子培养基：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾16.43g/L，卡那霉素50mg/L，氨水调pH7.0～7.2；
发酵培养基：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾16.43g/L，氨水调pH7.0～7.2；
(2)甲酸脱氢酶菌体的发酵罐发酵
将重组载体pBTac1-FDH导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组甲酸脱氢酶菌株FDH/BL21(DE3)，然后进行7L发酵罐发酵，发酵方案按照实施案例3中的(1)的发酵培养基及发酵步骤进行。
实施例4突变酶催化反应
(1)CmCR-186粗酶液和FDH粗酶液的制备
将实施案例3中制备的CmCR-186/BL21(DE3)和FDH/BL21(DE3)发酵离心得到的菌体分别按200g/L加纯化水重悬，然后超声波破碎(电压400W，超声时间3s，间隔时间5s，工作次数80次，超声过程中悬浮菌体用冰浴冷却)，破碎后即得粗酶液。
(2)突变酶催化
在1L转化罐中，加入600mL纯化水、100g乙酰乙酸乙酯、53g甲酸铵和0.5gNAD+，搅拌均匀后用氨水调pH至7.0，升温至30℃，加入100mL CmCR-186酮基还原酶粗酶液和50mLFDH两个酶粗酶液，进行转化，转化期间用4M甲酸控制pH＝7.0，反应20小时，反应至乙酰乙酸乙酯少于1 g/L时停止反应。
实施例5制备R-3-羟基丁酸钠盐
(1)在实施例4中的酶转化液中3h内分批缓慢加入30.77克氢氧化钠，控制温度不高于25℃，加完继续反应2h，至反应完毕。
(2)将1升转化液在4500rpm下离心，弃去菌体。上清液中加1％(w/v)硅藻土后过滤。然后加入1％(w/v)活性炭，搅拌脱色30min后过滤，得清澈的滤液。用纳滤膜对滤液进行纳滤处理。清液浓缩至120mL，此时有大量固体析出，降至室温，搅拌析晶1h，离心，真空干燥，得白色固体R-3-羟基丁酸钠82.4g，收率85.0％，ee值为99.9％。
实施例6制备R-3-羟基丁酸钾盐
(1)在实施例4中的酶转化液中3h内分批缓慢加入47.9克氢氧化钾(90％含量)，控制温度不高于25℃，加完继续反应2h，至反应完毕。
(2)将1升转化液在4500rpm下离心，弃去菌体；上清液中加1％(w/v)硅藻土后过滤；然后加入1％(w/v)活性炭，搅拌脱色30min后过滤，得清澈的滤液，用纳滤膜对滤液进行纳滤处理；清液浓缩至130mL，此时有大量固体析出，降至室温，搅拌析晶1h，离心，真空干燥，得白色固体R-3-羟基丁酸钾盐95g，收率87.0％，ee值为99.9％。
实施例7制备R-3-羟基丁酸钙盐
(1)在实施例4中的酶转化液中3h内分批缓慢加入28.5克氢氧化钙，控制温度不高于25℃，加完继续反应2h，至反应完毕。
(2)将1升转化液在4500rpm下离心，弃去菌体；上清液中加1％(w/v)硅藻土后过滤；然后加入1％(w/v)活性炭，搅拌脱色30min后过滤，得清澈的滤液，用纳滤膜对滤液进行纳滤处理；清液浓缩至115mL，此时有大量固体析出，降至室温，搅拌析晶1h，离心，真空干燥，得白色固体R-3-羟基丁酸钙盐80.4g，收率85.0％，ee值为99.9％。
实施例8制备R-3-羟基丁酸镁盐
(1)在实施例2中的酶转化液中3h内分批缓慢加入22.3克氢氧化镁，控制温度不高于25℃，加完继续反应2h，至反应完毕。
(2)将1升转化液在4500rpm下离心，弃去菌体；上清液中加1％(w/v)硅藻土后过滤；然后加入1％(w/v)活性炭，搅拌脱色30min后过滤，得清澈的滤液，用纳滤膜对滤液进行纳滤处理；清液浓缩至135mL，此时有大量固体析出，降至室温，搅拌析晶1h，离心，真空干燥，得白色固体R-3-羟基丁酸镁76.07g，收率86.0％，ee值为99.9％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 一种重组酮还原酶及在制备R-3-羟基丁酸及其盐中的应用
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<160> 14
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<223> 野生酮还原酶的氨基酸序列
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Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu
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<223> 野生酮还原酶的核苷酸序列
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<223> CmCR-27突变体的氨基酸序列
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<223> CmCR-59突变体的氨基酸序列
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<223> CmCR-59突变体的核苷酸序列
<400> 10
atggctaaga acttctccaa cgtcgagtac cccgccccgc ctccggccca caccaagaac 60
gagtcgctgc aggtccttga cctgttcaag ctgaatggca aggttgccag catcactggc 120
tcgtccagcg gtattggcta cgctctggct gaggccttcg cgcaggtcgg cgctgacgtc 180
gccatctggt acaacagcca cgacgctact ggcaaggctg aggccctcgc caagaagtac 240
ggcgtcaagg tcaaggccta caaggcgaac gtgagcagct ctgacgccgt gaagcagacg 300
atcgagcagc agatcaagga cttcggccac ctcgacattg tcgtggcgaa cgccggcatt 360
ccctggacga agggtgccta catcgaccag gacgacgaca agcacttcga ccaggtcgtt 420
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ggctacatca acacggagat ctcggacttc gtgccccagg agacgcagaa caagtggtgg 720
tcgctcgtgc cccttggccg cggcggagag acggccgagc tcgttggcgc ctacctgttc 780
cttgcatctg acgccggctc gtacgccact ggtacggaca tcattgttga cggtggctac 840
acgcttccct aa 852
<210> 11
<211> 283
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CmCR-635突变体的氨基酸序列
<400> 11
Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala
1 5 10 15
His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn
20 25 30
Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr
50 55 60
Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala
85 90 95
Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp
100 105 110
Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile
115 120 125
Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu
145 150 155 160
Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser
165 170 175
Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr Thr Asn
180 185 190
Ala Ala Arg Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu
195 200 205
Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr Ile Asn
210 215 220
Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Lys Trp Trp
225 230 235 240
Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr
260 265 270
Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro
275 280
<210> 12
<211> 852
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CmCR-635突变体的核苷酸序列
<400> 12
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cgcttcgaga aggagggcaa gaagggcgcc cttgtgttca cggcctccat gtctggccac 540
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ggctacatca acacggagat ctcggacttc gtgccccagg agacgcagaa caagtggtgg 720
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<210> 13
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CmCR-832突变体的氨基酸序列
<400> 13
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> CmCR-832突变体的核苷酸序列
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acgcttccct aa 852
Claims (8)
1.一种重组酮还原酶，其特征在于为如下突变中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C；
（2）如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C、第191位氨基酸替换为A和第195位氨基酸替换为Y；
（3）如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第176位氨基酸替换为C、第191位氨基酸替换为A；
（4）如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第191位氨基酸替换为T和第195位氨基酸替换为R；
（5）如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的氨基酸序列中的第191位氨基酸替换为T。
2.编码权利要求1所述的重组酮还原酶的核苷酸序列，其特征在于为如下突变中的至少一种：
（1）如SEQ ID NO：2所示的酮还原酶的核苷酸序列中第527位核苷酸C替换为G；
（2）如SEQ ID NO：2所示的酮还原酶的核苷酸序列中第527位核苷酸C替换为G，第571~572位核苷酸替换为GC，第583~585位核苷酸替换为TAT；
（3）如SEQ ID NO：2所示的酮还原酶的核苷酸序列中第527位核苷酸C替换为G，第571~572位核苷酸替换为GC；
（4）如SEQ ID NO：2所示的酮还原酶的核苷酸序列中第571~573位核苷酸替换为ACC，第583~585位核苷酸替换为CGT；
（5）如SEQ ID NO：2所示的酮还原酶的核苷酸序列中第571~573位核苷酸替换为ACC。
3.一种重组载体，其特征在于为将权利要求2所述的编码重组酮还原酶的核苷酸序列与载体连接得到。
4.一种表达重组酮还原酶的菌株，其特征在于是通过将权利要求3所述的重组载体转化到表达宿主菌得到。
5.根据权利要求4所述的表达重组酮还原酶的菌株，其特征在于：
所述的表达宿主菌为大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌或谷棒杆菌。
6.权利要求1所述的重组酮还原酶在制备R-3-羟基丁酸及其盐中的应用。
7.根据权利要求6所述的重组酮还原酶在制备R-3-羟基丁酸及其盐中的应用，其特征在于：
所述的重组酮还原酶的反应底物为乙酰乙酸甲酯和乙酰乙酸乙酯中的至少一种。
8.一种制备R-3-羟基丁酸及其盐的方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）利用权利要求4或5所述的表达重组酮还原酶的菌株表达得到重组酮还原酶，然后以乙酰乙酸乙酯为底物，以甲酸铵为氢供体，在重组酮还原酶和甲酸脱氢酶作用下，通过酶法转化，得到R-3-羟基丁酸乙酯；
（2）R-3-羟基丁酸乙酯水解成盐；
（3）R-3-羟基丁酸盐的提纯。
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Denomination of invention: A kind of recombinant ketoreductase and its application in the preparation of R-3-hydroxybutyric acid and its salts Effective date of registration: 20220728 Granted publication date: 20201020 Pledgee: Postal Savings Bank of China Co., Ltd. Luoyang Branch Pledgor: LUOYANG HUARONG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022980011565 |
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