CN115109769A - 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用 - Google Patents

一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115109769A
CN115109769A CN202210550936.6A CN202210550936A CN115109769A CN 115109769 A CN115109769 A CN 115109769A CN 202210550936 A CN202210550936 A CN 202210550936A CN 115109769 A CN115109769 A CN 115109769A
Authority
CN
China
Prior art keywords
threonine aldolase
ala
mutant
threonine
serine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210550936.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115109769B (zh
Inventor
王华磊
郭蒙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China University of Science and Technology
Original Assignee
East China University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China University of Science and Technology filed Critical East China University of Science and Technology
Priority to CN202210550936.6A priority Critical patent/CN115109769B/zh
Publication of CN115109769A publication Critical patent/CN115109769A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115109769B publication Critical patent/CN115109769B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02005—L-Threonine aldolase (4.1.2.5)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/584—Recycling of catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种L‑苏氨酸醛缩酶突变体及其编码基因、重组表达载体、重组表达转化体以及在L‑丝氨酸合成中的应用。L‑苏氨酸醛缩酶突变体包括：以SEQ ID No.2所示野生型的L‑苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为丝氨酸或甘氨酸所形成的L‑苏氨酸醛缩酶突变体T202S、T202G。该L‑苏氨酸醛缩酶突变体与其他生物催化剂相比，可以在目前已知最高浓度的醛类底物下发挥催化活性，并且转化率>99％。同时本发明所提供的L‑苏氨酸醛缩酶催化甲醛和甘氨酸生成L‑丝氨酸的方法，具有原子经济性高、产品光学纯度高、反应条件温和、环境友好、产品后处理简单等优势，在L‑丝氨酸的合成中表现出良好的应用前景。

Description

一种L-苏氨酸醛缩酶突变体以及在L-丝氨酸合成中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地涉及一种L-苏氨酸醛缩酶突变体以及在L-丝氨酸合成中的应用。
背景技术
L-丝氨酸又名L-2-氨基-3-羟基丙酸，其在生物体内处于氨基酸代谢的中间位置，具有许多重要的生理作用。其可以用来合成多种氨基酸、核酸碱基以及磷脂等物质。目前普遍应用于医药、食品以及化妆品等领域，例如，在医药领域中，L-丝氨酸可以用来配置复方氨基酸输液以及作为营养增补剂，同时它也在稳定肝脏血糖浓度方面起着重要作用。L-丝氨酸常常添加在高级化妆品中以提高化妆品的保湿性，其还具有一定的抗菌和表面活性剂的作用。此外，L-丝氨酸可以和糖类在高温下发生美拉德反应使食物产生特殊的香味。同时其多种衍生物也具有很多重要的功能，例如环丝氨酸可以用来治疗结核病，偶氮丝氨酸可以用来治疗肿瘤以及急性白血病和柯杰金氏病。
L-丝氨酸的生产方法有多种，包括化学合成法、蛋白质水解法、发酵法以及生物酶法。化学合成法的缺点主要是反应步骤繁琐，还需要进行多步纯化才能获得光学纯的手性L-丝氨酸。蛋白质水解法过程较为繁琐，水解终点难以准确判断，L-丝氨酸损失率较高，同时对环境污染严重。当下L-丝氨酸的生产方法主要是前体发酵法，但此方法后续分离困难从而导致成本较高，同时对生产设备也有较高的要求。与以上三种方法相比较而言，生物酶法具有反应条件温和、立体选择性高和环境友好等优点，已广泛用于医药中间体、精细化学品等手性化学品的工业生产中。目前，L-丝氨酸生物合成涉及到的酶主要为丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)，它催化过程相对复杂，不仅需要PLP作为辅酶，还需要四氢叶酸的存在才能催化反应生成L-丝氨酸，导致后续分离纯化成本的增加。因此，仍需要寻求一个能够相对简单高效生产L-丝氨酸的方法。
魏江筛选出了一种新的利用甲醇的海洋细菌菌株Shewanella algae，显示出高SHMT活性。将该SHMT基因成功克隆至大肠杆菌(DE3)中进行表达，并对其酶学性质和催化活性进行了研究，发现该酶可以转化产生77.76mM的L-丝氨酸。Hsiao H Y采用Klebsiellaaerogenes GX1705(pGX 2236)重组菌株表达的SHMT的粗提物形式，研究了甘氨酸和甲醛(HCHO)生产L-丝氨酸的过程。通过仔细平衡甲醛进料速率与酶促生物转化速率，在保持甲醛浓度处于较低水平的条件下，丝氨酸总产率可以达到5.2g/L/h。最近，山东大学的马翠卿团队设计了一种体外酶级联反应，用于从甘油生产L-丝氨酸，涉及到的酶包括醛糖醇氧化酶、D-乳酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及过氧化氢酶。在优化各个酶的投量后，以18.51mM甘油制备了17.58mM L-丝氨酸。
苏氨酸醛缩酶(TA)是一种依赖5′磷酸吡哆醛(PLP)的酶，其可以在甘氨酸的次级合成途径中催化L-苏氨酸和L-别-苏氨酸生成甘氨酸和乙醛。苏氨酸醛缩酶的逆反应过程中涉及不对称碳-碳键的形成，在体外，其可以催化α-氨基酸和不同类型的醛生成β-羟基-α-氨基酸，产生两个新的相邻立体中心。β-羟基-α-氨基酸是许多复杂天然产物和药物的重要组成部分，这使得该酶在医药和精细化工等领域具有巨大的应用潜力。根据其对苏氨酸α-碳的立体特异性，可分为L--苏氨酸醛缩酶(L-TA)和D-苏氨酸醛缩酶(D-TA)。L-苏氨酸醛缩酶在α-碳上表现出很高的立体特异性，因此严格来说只生成L-型产物，其可以催化L-苏氨酸和非天然的L-β-羟基-α氨基酸的可逆裂解生成甘氨酸和相应的醛类。L-TA又可分为三类：(1)特异性裂解L-别-苏氨酸的L-alloTA(EC4.1.2.49)；(2)特异性裂解L-苏氨酸的L-TA(EC4.1.2.5)；(3)对L-苏氨酸和L-别-苏氨酸均具有裂解活性的低特异性L-TA(EC4.1.2.48)。
目前为止，研究较多的生产L-丝氨酸的酶是丝氨酸羟甲基转移酶，其反应过程复杂，且大部分是应用于发酵法来生产L-丝氨酸。此外，其他报道的生产L-丝氨酸的酶级联反应涉及到多个酶，此过程较为复杂，且产量较低。因此，仍需挖掘一个能够相对简单高效催化L-丝氨酸合成的酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种L-苏氨酸醛缩酶突变体以及在L-丝氨酸合成中的应用，从而解决现有L-丝氨酸的产量尚不能完全满足市场需求，且其现在主要生产方法为前体发酵法，其存在后续分离困难，纯化成本较高，对生产设备也有较高要求的问题。
为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，所述L-苏氨酸醛缩酶突变体包括：以SEQ ID No.2所示野生型的L-苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为丝氨酸所形成的L-苏氨酸醛缩酶突变体T202S，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；以及以SEQ ID No.2所示野生型的L-苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为甘氨酸所形成的L-苏氨酸醛缩酶突变体T202G，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述野生型的L-苏氨酸醛缩酶是一种来自于Agrobacterium菌株的L-苏氨酸醛缩酶，其NCBI登录号为WP_006313436.1。
根据本发明的第二方面，提供一种编码如前面所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因。
根据本发明的第三方面，提供一种包含如前面所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因的重组表达载体。
根据本发明的第四方面，提供一种包含如前面所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因的重组表达转化体。可通过将构建的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体。
根据本发明的第五方面，提供一种L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂，所述的重组L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：1)培养如前面所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的转化体细胞；2)培养如前面所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的粗酶液；3)培养如前面所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的粗酶液，干燥所制备的粗酶粉或纯化所制备的纯酶；4)培养如前面所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的转化体细胞，之后冷冻干燥得到的冻干菌粉。
根据本发明的第六方面，提供一种利用如前面所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体或如前面所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂在催化甲醛和甘氨酸生成L-丝氨酸中的应用。
使用所述L-苏氨酸醛缩酶突变体或所述L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂，催化甲醛和甘氨酸的羟醛缩合反应，获得L-丝氨酸。
优选地，所述L-苏氨酸醛缩酶突变体催化甲醛和甘氨酸的羟醛缩合反应在辅酶PLP的存在下进行。
L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂可以催化甲醛和甘氨酸发生羟醛缩合生成L-丝氨酸。在所述应用中，底物甲醛的浓度为10～300mM，底物甘氨酸的浓度为100～1500mM，所述L-苏氨酸醛缩酶的用量为冻干菌粉5～30g/L，辅酶磷酸吡哆醛的添加量为10～200μM。反应过程中所需的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液(但不限于磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液)为本领域常规缓冲液，其浓度为50～200mM。
所述反应在pH 6～10，例如pH 7～9或pH8～9的条件下进行。所述反应是在振荡或搅拌条件下进行。所述反应的温度为20～50℃，优选30℃。所述反应的时间以底物完全转化或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。
本发明的关键发明点在于，通过对酶进行半理性设计，提供一种在较高甲醛浓度下具有优良催化活性的L-苏氨酸醛缩酶突变体，解决了在高浓度甲醛下活性下降的问题，奠定其在L-丝氨酸合成中的应用。
具体而言，本发明涉及一种农杆菌属(Agrobacterium)来源的L-苏氨酸醛缩酶突变体及其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组L-苏氨酸醛缩酶或重组表达转化体催化甲醛和甘氨酸发生羟醛缩合反应生成L-丝氨酸的应用，该生物催化剂能够在高浓度甲醛下表现出优良的催化性能，在L-丝氨酸的合成中显示出良好的应用前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种催化性能更好的L-苏氨酸醛缩酶的突变体，可高效催化甲醛和甘氨酸的羟醛缩合反应制备L-丝氨酸。野生型L-苏氨酸醛缩酶催化甲醛和甘氨酸合成L-丝氨酸时，会受到高浓度甲醛的影响导致催化性能下降，然而，本发明提供的L-丝氨酸醛缩酶突变体具有催化活性高、可耐受底物浓度高、无其它副产物的优点，能够催化浓度高达200mM甲醛的底物转化，实现99％以上的转化率，且无副产物生成。同时，本发明所提供的L-苏氨酸醛缩酶催化甲醛和甘氨酸生成L-丝氨酸的方法，与其他制备方法相比，催化过程简单，且反应无副产物产生，后续分离简单，因此具有原子经济性高、产品光学纯度高、反应条件温和、环境友好、产品后处理简单等优势，在L-丝氨酸的合成中表现出良好的应用前景。
附图说明
图1为L-苏氨酸醛缩酶催化甲醛和甘氨酸生产L-丝氨酸的反应式。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
材料和方法
基因工程所用材料和试剂：E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)来自本实验室保藏。质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自TOROIVD科技有限公司；SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒购自上海雅酶生物科技；DNA marker购自北京全式金生物技术；以上试剂使用方法参考商品说明书。
引物合成，序列测序工作由北京擎科生物公司(上海)完成。
甘氨酸购自上海泰坦科技，其余均购自于国药集团化学试剂有限公司。
实施例1：菌株构建
将来源于农杆菌属(Agrobacterium)的注释为L-丝氨酸醛缩酶(Ag-LTA)的序列克隆出来，插入表达质粒pET-28a得到pET28a-Ag-LTA。L-苏氨酸醛缩酶Ag-LTA的基因序列如SEQ ID No.1所示。测序验证无误后将pET28a-Ag-LTA转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中用于后续重组酶的表达。
实施例2：突变体构建
以重组质粒Ag-LTA为母本，对拟突变位点分别设计引物，上下游引物序列如表1中所示。PCR体系：10μL的DNA聚合酶P515，正反向引物各1μL，1μL的模板，7μL的双蒸水，总体系为20μL。PCR程序：首先95℃预变形5min；之后按下列程序循环30次：95℃变性30s，Tm+5℃退火30s，72℃延伸5.5min；72℃终延伸3min，4℃维持。
表1 Ag-LTA突变体构建所使用的引物
Figure BDA0003655018940000051
通过突变获得系列L-苏氨酸醛缩酶Ag-LTA的突变体，包括：
1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位苏氨酸氨酸替换为丝氨酸所形成的衍生蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，命名为T202S；
2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位苏氨酸氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，命名为T202G。
实施例3：菌株培养
将重组表达转化子接种到装有含有抗性的5mL LB液体培养基的试管中，于37℃恒温摇床过夜培养。之后取500μL过夜培养的菌液加入到装有50mL LB液体培养基(含有抗性的)的250mL的摇瓶中，37℃恒温摇床培养2.5h左右，OD600达到0.6左右。加入终浓度0.1mMIPTG进行诱导，置于20℃恒温摇床诱导表达18-20h。诱导表达结束后，将菌液倒入50mL离心管中，配平后，4℃，8000rpm，离心10min。离心结束后，弃去上清，加入15mL的生理盐水，重悬菌体，配平后，4℃，8000rpm，离心10min。离心结束后，弃去上清，进行空转，当转速达到6000rpm时停止离心，使用移液枪吸去残留上清液体，将收集的菌体保存在-40℃的冰箱中备用。后续将收获的重组细胞加入一定体积的缓冲液进行超声破碎，离心收集上清液，即可获得粗酶液；使用真空冷冻干燥机冷冻干燥，即可得到冻干酶粉。用于催化甲醛和甘氨酸生成L-丝氨酸的反应。
实施例4：Ag-LTA突变体催化甲醛和甘氨酸反应生成L-丝氨酸
重组L-苏氨酸醛缩酶突变体或L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂催化甲醛和甘氨酸缩合反应生成L-丝氨酸原理示意图如图1所示。
在10mL的反应体系中加入100mg野生型/突变体的冻干菌粉、0.2M甲醛、1M甘氨酸以及磷酸钠缓冲液(0.1M pH8.0)，反应液置于30℃、转速250rpm条件下反应。反应结束后加入2M盐酸终止反应，离心取上清之后进行DNFB(2,4-二硝基氟苯)衍生进行HPLC分析。L-苏氨酸醛缩酶及突变体催化的甲醛和甘氨酸羟醛缩合反应结果如表2所示，当甲醛浓度为200mM时，Ag-LTA突变体T202S、T202G的转化率均大于99％，远高于野生型。
表2 L-苏氨酸醛缩酶及突变体催化的甲醛和甘氨酸羟醛缩合反应结果
Figure BDA0003655018940000061
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体以及在L-丝氨酸合成中的应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> Agrobacterium
<400> 1
atgttttttg cttcagacaa ttgggctggc gcccatccgg ccgtcaatga acggctgtcg 60
cgggaatcca cgcgttttgc cgccgcttac ggcaccagcg aactcgatct ctccatcgaa 120
aaacgcttca acgaaatctt cgaacgcgaa gtcgcggttt tttttgtcgc caccggcacg 180
gcggccaatt cgctttcgct ggccagcatc gcccgtcccg gcggcctgac cttctgtcat 240
tcggaagcgc atgtgatcga ggacgaatgt ggcgcgccgg atttcttttc aggcatgcgc 300
atggtcgccg tcgaggggcc tgatggcaag atgctgccgg agaacctcat cgagcgcatt 360
gcgcgctatc cgcaggatgc cgtgcaccat gggcgcgccg cagccattac catgacgcag 420
gcgactgaag ccggcaccgt ctatacgctt gatgaaatcg acgctatatc caaaatcgcc 480
aaggaaaacg gcctgccgtt gcatatggat ggcgcgcggt ttgccaatgc acttgccgca 540
ctcggcacga cgccggctga aatgacctgg aaacgcggcg tcgatgtcct gtctttcggc 600
ggcacgaaaa acggctgctg gtgcgcggaa gcgatcgtgt ttttcgatcc ttcgcttgcc 660
cgggacttct ccttcctgcg caagcgtacc gcccagcttt tttcgaaatc gcgtttcatc 720
gccgcgcaat tcgaagccta cctgcaggac gacctgtggc tcggtctcgc cggccacgcc 780
aatgccatgg ccaaccggct gcgcgccggt ttcggctcac tgaacagcgc ccgcctggca 840
tggccgacac aggccaacga ggttttcgcc attctgccca aggcagccgc tgaagcggcg 900
acgcaaaaag gcgcgaagtt ctatgactgg ctggagccgc gcgacatgcc ggaaaatgtc 960
ggcaaggacg aagtactgat ccgcatggtc acgagctttg cgacgaccga agctgatgtg 1020
gacgaattcc tgtcgatctg cgctgccgtc tga 1053
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> Agrobacterium
<400> 2
Met Phe Phe Ala Ser Asp Asn Trp Ala Gly Ala His Pro Ala Val Asn
1 5 10 15
Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ser Thr Arg Phe Ala Ala Ala Tyr Gly Thr
20 25 30
Ser Glu Leu Asp Leu Ser Ile Glu Lys Arg Phe Asn Glu Ile Phe Glu
35 40 45
Arg Glu Val Ala Val Phe Phe Val Ala Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ser
50 55 60
Leu Ser Leu Ala Ser Ile Ala Arg Pro Gly Gly Leu Thr Phe Cys His
65 70 75 80
Ser Glu Ala His Val Ile Glu Asp Glu Cys Gly Ala Pro Asp Phe Phe
85 90 95
Ser Gly Met Arg Met Val Ala Val Glu Gly Pro Asp Gly Lys Met Leu
100 105 110
Pro Glu Asn Leu Ile Glu Arg Ile Ala Arg Tyr Pro Gln Asp Ala Val
115 120 125
His His Gly Arg Ala Ala Ala Ile Thr Met Thr Gln Ala Thr Glu Ala
130 135 140
Gly Thr Val Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Asp Ala Ile Ser Lys Ile Ala
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Leu Pro Leu His Met Asp Gly Ala Arg Phe Ala Asn
165 170 175
Ala Leu Ala Ala Leu Gly Thr Thr Pro Ala Glu Met Thr Trp Lys Arg
180 185 190
Gly Val Asp Val Leu Ser Phe Gly Gly Thr Lys Asn Gly Cys Trp Cys
195 200 205
Ala Glu Ala Ile Val Phe Phe Asp Pro Ser Leu Ala Arg Asp Phe Ser
210 215 220
Phe Leu Arg Lys Arg Thr Ala Gln Leu Phe Ser Lys Ser Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ala Ala Gln Phe Glu Ala Tyr Leu Gln Asp Asp Leu Trp Leu Gly Leu
245 250 255
Ala Gly His Ala Asn Ala Met Ala Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Gly
260 265 270
Ser Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Trp Pro Thr Gln Ala Asn Glu Val
275 280 285
Phe Ala Ile Leu Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Thr Gln Lys Gly
290 295 300
Ala Lys Phe Tyr Asp Trp Leu Glu Pro Arg Asp Met Pro Glu Asn Val
305 310 315 320
Gly Lys Asp Glu Val Leu Ile Arg Met Val Thr Ser Phe Ala Thr Thr
325 330 335
Glu Ala Asp Val Asp Glu Phe Leu Ser Ile Cys Ala Ala Val
340 345 350
<210> 3
<211> 350
<212> PRT
<213> Agrobacterium
<400> 3
Met Phe Phe Ala Ser Asp Asn Trp Ala Gly Ala His Pro Ala Val Asn
1 5 10 15
Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ser Thr Arg Phe Ala Ala Ala Tyr Gly Thr
20 25 30
Ser Glu Leu Asp Leu Ser Ile Glu Lys Arg Phe Asn Glu Ile Phe Glu
35 40 45
Arg Glu Val Ala Val Phe Phe Val Ala Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ser
50 55 60
Leu Ser Leu Ala Ser Ile Ala Arg Pro Gly Gly Leu Thr Phe Cys His
65 70 75 80
Ser Glu Ala His Val Ile Glu Asp Glu Cys Gly Ala Pro Asp Phe Phe
85 90 95
Ser Gly Met Arg Met Val Ala Val Glu Gly Pro Asp Gly Lys Met Leu
100 105 110
Pro Glu Asn Leu Ile Glu Arg Ile Ala Arg Tyr Pro Gln Asp Ala Val
115 120 125
His His Gly Arg Ala Ala Ala Ile Thr Met Thr Gln Ala Thr Glu Ala
130 135 140
Gly Thr Val Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Asp Ala Ile Ser Lys Ile Ala
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Leu Pro Leu His Met Asp Gly Ala Arg Phe Ala Asn
165 170 175
Ala Leu Ala Ala Leu Gly Thr Thr Pro Ala Glu Met Thr Trp Lys Arg
180 185 190
Gly Val Asp Val Leu Ser Phe Gly Gly Ser Lys Asn Gly Cys Trp Cys
195 200 205
Ala Glu Ala Ile Val Phe Phe Asp Pro Ser Leu Ala Arg Asp Phe Ser
210 215 220
Phe Leu Arg Lys Arg Thr Ala Gln Leu Phe Ser Lys Ser Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ala Ala Gln Phe Glu Ala Tyr Leu Gln Asp Asp Leu Trp Leu Gly Leu
245 250 255
Ala Gly His Ala Asn Ala Met Ala Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Gly
260 265 270
Ser Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Trp Pro Thr Gln Ala Asn Glu Val
275 280 285
Phe Ala Ile Leu Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Thr Gln Lys Gly
290 295 300
Ala Lys Phe Tyr Asp Trp Leu Glu Pro Arg Asp Met Pro Glu Asn Val
305 310 315 320
Gly Lys Asp Glu Val Leu Ile Arg Met Val Thr Ser Phe Ala Thr Thr
325 330 335
Glu Ala Asp Val Asp Glu Phe Leu Ser Ile Cys Ala Ala Val
340 345 350
<210> 4
<211> 350
<212> PRT
<213> Agrobacterium
<400> 4
Met Phe Phe Ala Ser Asp Asn Trp Ala Gly Ala His Pro Ala Val Asn
1 5 10 15
Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ser Thr Arg Phe Ala Ala Ala Tyr Gly Thr
20 25 30
Ser Glu Leu Asp Leu Ser Ile Glu Lys Arg Phe Asn Glu Ile Phe Glu
35 40 45
Arg Glu Val Ala Val Phe Phe Val Ala Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ser
50 55 60
Leu Ser Leu Ala Ser Ile Ala Arg Pro Gly Gly Leu Thr Phe Cys His
65 70 75 80
Ser Glu Ala His Val Ile Glu Asp Glu Cys Gly Ala Pro Asp Phe Phe
85 90 95
Ser Gly Met Arg Met Val Ala Val Glu Gly Pro Asp Gly Lys Met Leu
100 105 110
Pro Glu Asn Leu Ile Glu Arg Ile Ala Arg Tyr Pro Gln Asp Ala Val
115 120 125
His His Gly Arg Ala Ala Ala Ile Thr Met Thr Gln Ala Thr Glu Ala
130 135 140
Gly Thr Val Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Asp Ala Ile Ser Lys Ile Ala
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Leu Pro Leu His Met Asp Gly Ala Arg Phe Ala Asn
165 170 175
Ala Leu Ala Ala Leu Gly Thr Thr Pro Ala Glu Met Thr Trp Lys Arg
180 185 190
Gly Val Asp Val Leu Ser Phe Gly Gly Gly Lys Asn Gly Cys Trp Cys
195 200 205
Ala Glu Ala Ile Val Phe Phe Asp Pro Ser Leu Ala Arg Asp Phe Ser
210 215 220
Phe Leu Arg Lys Arg Thr Ala Gln Leu Phe Ser Lys Ser Arg Phe Ile
225 230 235 240
Ala Ala Gln Phe Glu Ala Tyr Leu Gln Asp Asp Leu Trp Leu Gly Leu
245 250 255
Ala Gly His Ala Asn Ala Met Ala Asn Arg Leu Arg Ala Gly Phe Gly
260 265 270
Ser Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala Trp Pro Thr Gln Ala Asn Glu Val
275 280 285
Phe Ala Ile Leu Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Thr Gln Lys Gly
290 295 300
Ala Lys Phe Tyr Asp Trp Leu Glu Pro Arg Asp Met Pro Glu Asn Val
305 310 315 320
Gly Lys Asp Glu Val Leu Ile Arg Met Val Thr Ser Phe Ala Thr Thr
325 330 335
Glu Ala Asp Val Asp Glu Phe Leu Ser Ile Cys Ala Ala Val
340 345 350
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtctttcgg cggctcgaaa aacggctgc 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcagccgttt ttcgagccgc cgaaagaca 29
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgtctttcg gcggcgggaa aaacggctgc tg 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagcagccgt ttttcccgcc gccgaaagac ag 32

Claims (10)

1.一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶突变体包括：以SEQID No.2所示野生型的L-苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为丝氨酸所形成的L-苏氨酸醛缩酶突变体T202S，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；以及以SEQ ID No.2所示野生型的L-苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为甘氨酸所形成的L-苏氨酸醛缩酶突变体T202G，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.一种编码如权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因。
3.一种包含如权利要求2所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求2所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因的重组表达转化体。
5.一种L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
1)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的转化体细胞；
2)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的粗酶液；
3)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的粗酶液，干燥所制备的粗酶粉或纯化所制备的纯酶；
4)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的转化体细胞，之后冷冻干燥得到的冻干菌粉。
6.一种利用如权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体或如权利要求5所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂在催化甲醛和甘氨酸生成L-丝氨酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用权利要求1所述L-苏氨酸醛缩酶突变体或权利要求5所述L-苏氨酸醛缩酶突变体催化剂，催化甲醛和甘氨酸的羟醛缩合反应，获得L-丝氨酸。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶突变体催化甲醛和甘氨酸的羟醛缩合反应在辅酶磷酸吡哆醛的存在下进行。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，底物甲醛的浓度为10～300mM，底物甘氨酸的浓度为100～1500mM，所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的用量为冻干菌粉5～30g/L，辅酶磷酸吡哆醛的添加量为10～200μM。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述羟醛缩合反应在pH 6～10，20～50℃的条件下进行，反应时间小于24h。
CN202210550936.6A 2022-05-20 2022-05-20 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用 Active CN115109769B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210550936.6A CN115109769B (zh) 2022-05-20 2022-05-20 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210550936.6A CN115109769B (zh) 2022-05-20 2022-05-20 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115109769A true CN115109769A (zh) 2022-09-27
CN115109769B CN115109769B (zh) 2023-07-14

Family

ID=83326318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210550936.6A Active CN115109769B (zh) 2022-05-20 2022-05-20 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115109769B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747194A (zh) * 2022-10-28 2023-03-07 浙江大学 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005047472A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Boyce Thompson Institute For Plant Research Increasing seed threonine content through alteration of threonine aldolase activity
CN111394343A (zh) * 2020-04-22 2020-07-10 重庆大学 L-苏氨酸醛缩酶突变体r318l及其应用
WO2021080277A1 (ko) * 2019-10-23 2021-04-29 한국생명공학연구원 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 입체특이적 생산 방법
CN113481188A (zh) * 2018-11-06 2021-10-08 王喆明 苏氨酸醛缩酶的突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005047472A2 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Boyce Thompson Institute For Plant Research Increasing seed threonine content through alteration of threonine aldolase activity
CN113481188A (zh) * 2018-11-06 2021-10-08 王喆明 苏氨酸醛缩酶的突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用
WO2021080277A1 (ko) * 2019-10-23 2021-04-29 한국생명공학연구원 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 입체특이적 생산 방법
CN111394343A (zh) * 2020-04-22 2020-07-10 重庆大学 L-苏氨酸醛缩酶突变体r318l及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "NCBI Reference Sequence: WP_006313436.1", 《GENBANK》 *
余进海;吴婷;刘均忠;张宏娟;焦庆才;: "L-苏氨酸醛缩酶催化合成L-4-硝基苯基丝氨酸", 精细化工 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747194A (zh) * 2022-10-28 2023-03-07 浙江大学 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的方法
CN115747194B (zh) * 2022-10-28 2023-11-14 浙江大学 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115109769B (zh) 2023-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107267578B (zh) 微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法
US11220701B2 (en) Method for enzymatic preparation of R-3 aminobutyric acid
CN106929521B (zh) 一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用
CN114874964B (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
WO2023208146A1 (zh) 生物合成麦角硫因的方法及载体
CN115109769B (zh) 一种l-苏氨酸醛缩酶突变体以及在l-丝氨酸合成中的应用
CN111041018A (zh) 支链酮糖的生物合成方法
CN111394410B (zh) 一种高催化活性神经氨酸合酶及应用
CN110872593B (zh) 一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用
CN112646760B (zh) 生产肌醇的工程菌及其构建方法和应用
CN111718883A (zh) 一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用
CN114807078B (zh) 一种生物合成nmn的方法
CN115896081A (zh) 天冬氨酸酶突变体及其应用
CN115806923A (zh) 一种含有脂酰辅酶a氧化酶基因的工程菌及其在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用
CN114317631B (zh) 单胺氧化酶在制备托品酮中的应用
CN113667686B (zh) 一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用
CN114107270B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体
CN114085802B (zh) 重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法
WO2023198017A1 (zh) 一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用
CN116376995B (zh) 一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶a及乙酰辅酶a衍生物的方法
CN116179459A (zh) 一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用
CN114875087A (zh) 以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用
CN117965581A (zh) 编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的dna分子及其应用方法、重组载体
CN117965481A (zh) 一种重组o-琥珀酰-l-高丝氨酸巯基转移酶突变体及其应用
CN116286701A (zh) 一种不透明红球菌l-氨基酸氧化酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant