CN111718883A

CN111718883A - 一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111718883A
Application number: CN202010595081.XA
Authority: CN
Inventors: 徐美娟; 饶志明; 王怡; 许家钰; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-09-29

Abstract

本发明公开了一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5‑5/pXMJ19‑speA，将此重组钝齿棒杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中摇瓶发酵72h，即可使发酵液中胍基丁胺的产量高达9.7g/L，同时，副产物L‑精氨酸的含量仅为0.23g/L，将此重组钝齿棒杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中发酵罐发酵72h，即可使发酵液中胍基丁胺的产量高达37.44g/L，同时，副产物L‑精氨酸的含量仅为0.76g/L，并且，整个发酵过程均无需添加L‑精氨酸。

Description

一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

胍基丁胺是是精氨酸的衍生物。研究表明，胍基丁胺有降血糖、降血压、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制细胞增生等生物活性，并且，研究表明，胍基丁胺对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的拮抗作用强而持久，具有对动物吗啡依赖性的戒断作用，是一种极具开发价值的戒毒类药物。因此，胍基丁胺在医药领域市场十分广阔。

目前，工业上主要使用化学合成法和酶转化法这两种方法生产胍基丁胺。其中，化学合成法一般以1,4-丁二胺、己二酸二乙酯、1,4-二溴丁烷和邻苯二甲酰亚胺钾等化合物作为底物，通过还原、取代、胺解和胍基化等化学途径合成胍基丁胺。但是，由于使用化学合成法合成胍基丁胺具有步骤繁琐、产量低下、副产物多以及副产物具有毒性等缺陷，因此，使用化学合成法合成胍基丁胺越来越不被现代工业所接受。

酶转化法则主要是利用精氨酸脱羧酶将L-精氨酸转化为胍基丁胺。与化学合成法相比，利用酶转化法生产胍基丁胺具有步骤简单、副产物少以及绿色环保等优势，但是，由于酶转化法需要以L-精氨酸为底物，而L-精氨酸的市场价高达5～8万元/吨，因此，酶转化法具有成本高的缺陷，这大大阻碍了使用酶转化法生产胍基丁胺的工业化进程。

急需找到一种产量高、成本低、副产物少且步骤简单的生产胍基丁胺的方法以解决现有胍基丁胺生产方法存在的缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种产量高、成本低、副产物少且步骤简单的生产胍基丁胺的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌为宿主，表达编码精氨酸脱羧酶的基因speA。

在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码精氨酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌SYPA5-5为宿主，以pXMJ-19质粒、pDXW-8质粒、pDXW-10质粒或pJCtac质粒载体，表达编码精氨酸脱羧酶的基因speA。

本发明还提供了一种生产胍基丁胺的方法，所述方法为先将上述重组钝齿棒杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，获得含有胍基丁胺的发酵液，然后将含有胍基丁胺的发酵液进行分离，获得胍基丁胺。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为28～32℃、转速为180～250rpm、pH为7.0～7.5。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为220rpm、pH为。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/L、(NH₄)₂SO₄ 35～45g/L、酵母粉浸10～12g/L、KH₂PO₄1.3～1.5g/L、KCl 0.8～1g/L、MgS0₄·7H₂O 1.0～1.2g/L、MnS0₄·H₂O 0.3～0.4g/L、FeS0₄·7H₂O 0.01～0.02g/L以及CaCO₃15～20g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120g/L、(NH₄)₂SO₄40g/L、酵母粉浸12g/L、KH₂PO₄1.5 g/L、KCl 1g/L、MgS0₄·7H₂O 1.0g/L、MnS0₄·H₂O0.3g/L、FeS0₄·7H₂O 0.02g/L以及CaCO₃20 g/L。

本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌或上述方法在生产胍基丁胺中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一株重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA，将此重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA接种至含有葡萄糖的发酵培养基中摇瓶发酵72h，即可使发酵液中胍基丁胺的产量高达9.7g/L，同时，副产物L-精氨酸的含量仅为0.23g/L，将此重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA接种至含有葡萄糖的发酵培养基中发酵罐发酵72h，即可使发酵液中胍基丁胺的产量高达37.44g/L，同时，副产物L-精氨酸的含量仅为0.76g/L，并且，整个发酵过程均无需添加L-精氨酸，可见，使用此重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA发酵生产胍基丁胺具有产量高、成本低、副产物少且步骤简单的优势。

(2)本发明提供了一种生产胍基丁胺的方法，此方法为将重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA接种至含有葡萄糖的发酵培养基中进行诱导发酵；使用此方法，仅需将重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA接种至含有葡萄糖的发酵培养基中摇瓶发酵72h，即可使发酵液中胍基丁胺的产量高达9.7g/L，同时，副产物L-精氨酸的含量仅为0.23g/L，仅需将重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA接种至含有葡萄糖的发酵培养基中发酵罐发酵72h，即可使发酵液中胍基丁胺的产量高达37.44g/L，同时，副产物L-精氨酸的含量仅为0.76g/L，并且，整个发酵过程均无需添加L-精氨酸，可见，使用此方法发酵生产胍基丁胺具有产量高、成本低、副产物少且步骤简单。

附图说明

图1：重组质粒pXMJ19-speA的质粒图谱。

图2：重组质粒pXMJ19-speA的PCR验证结果；其中，1为重组质粒pXMJ19-speA，2为Marker。

图3：重组质粒pXMJ19-speA的酶切验证结果；其中，1为Marker，2为经酶切的pXMJ19质粒，3为经酶切的重组质粒pXMJ19-speA。

具体实施方式

下述实施例中涉及的L-精氨酸购自麦克林公司；下述实施例中涉及的曲拉通X-100购自国药集团；下述实施例中涉及的PLP购自阿拉丁公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的pXMJ19质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5记载于公开号为CN1441055A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC NO.0890(此菌株在专利申请文本中的菌株编号为SDNN403，发明人在实验过程中将其重新编号为SYPA5-5)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

BHI液体培养基：脑心浸液肉汤37g/L。

BHI固体培养基：脑心浸液肉汤37g/L、琼脂15g/L。

种子培养基：葡萄糖50g/L、(NH₄)₂SO₄20 g/L、酵母浸粉20g/L、KH₂PO₄1.5 g/L、MgS0₄·7H₂O 1.0g/L、MnS0₄·H₂O 0.3g/L、CaCO₃1 g/L，氨水调节pH为7.0。

发酵培养基：葡萄糖120g/L、(NH₄)₂SO₄40 g/L、酵母粉浸12g/L、KH₂PO₄1.5 g/L、KCl1g/L、MgS0₄·7H₂O 1.0g/L、MnS0₄·H₂O 0.3g/L、FeS0₄·7H₂O 0.02g/L、CaCO₃20 g/L，氨水调节pH为7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

L-精氨酸和胍基丁胺含量的测定：高效液相色谱法；安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL/min；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃；B相：称取6.0g乙酸钠于200mL水溶解，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。

实施例1：重组钝齿棒杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21的基因组为模板，以F和R为引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的编码精氨酸脱羧酶的基因speA；

其中，PCR扩增引物为：

F:5’-ggtcgactctagaggatccAAAGGAGGAAAATCatgtctgacgacatgtctatg-3’(BamHI)(SEQ ID No.3)；

R:5’-gccaaaacagccaagctgaattcttaGTGGTGGTGGTGGTGGTGctcatcttcaagataagtataaccgtacaaacctgcctcg-3’(EcoR I)(SEQ ID No.4)；

PCR扩增条件为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸5min；

PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，灭菌的双蒸水22μL，2×Phanta MaxMaster Mix 25μL。

(2)将步骤(1)获得的编码精氨酸脱羧酶的基因speA与pXMJ19质粒经限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有10μg·mL^-1氯霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组大肠杆菌Escherichia coli/pXMJ19-speA以及重组质粒pXMJ19-speA(质粒图谱见图1)。

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pXMJ19-speA电击转化钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5，得到转化产物；将转化产物涂布于BHI固体培养基(含有10μg·mL^-1氯霉素)，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；挑取转化子接种至BHI液体培养基中，于30℃恒温培养箱中、120～180rpm的条件下摇瓶培养36h后提取质粒进行PCR验证(验证结果见图2)、酶切验证(验证结果见图3)以及测序验证，验证正确即获得重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA。

实施例2：胍基丁胺的生产(全细胞转化法)

具体步骤如下：

(1)以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5为对照，挑取钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5的单菌落接种至BHI液体培养基中，将实施例1获得的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA的单菌落接种至含有10μg·mL^-1氯霉素的BHI液体培养基中，分别于温度为30℃、转速为180rpm的条件下摇床培养24h，得到种子液1～2；将种子液1以2％(v/v)接种量接种至BHI液体培养基中，将种子液2以2％(v/v)接种量接种至含有10μg·mL^-1氯霉素的BHI液体培养基中，分别于温度为30℃、转速为180rpm的条件下摇床培养10h后，在培养基中添加终浓度为0.1mM的IPTG，于温度为30℃、转速为180rpm的条件下继续诱导发酵12h，得到发酵液1～2；将发酵液1～2离心取菌体1～2；其中，钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5在BHI液体培养基中发酵获得的为菌体1，重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA在含有10μg·mL^-1氯霉素的BHI液体培养基中发酵获得的为菌体2。

(2)构建成分为L-精氨酸10g/L、MgSO₄4 mmol/L、曲拉通X-1002％(v/v)、PLP7mmol/L的转化体系；用浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液将转化体系的pH调节为8.5后，将菌体1～2按照30g/L的添加量分别添加至转化体系中，于温度为30℃的条件下转化12h，得到转化液1～2；将转化液1～2离心取上清，得到上清液1～2。

检测上清液1～2中胍基丁胺的含量，检测结果为：上清液1中检测不到胍基丁胺，可见，钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5不具备转化L-精氨酸生产胍基丁胺的能力；上清液2中胍基丁胺的含量为8.31g/L，可见，重组钝齿棒杆菌C.crenatumSYPA5-5/pXMJ19-speA具备转化L-精氨酸生产胍基丁胺的能力。

实施例3：胍基丁胺的生产(生物发酵法+摇瓶)

具体步骤如下：

挑取实施例1获得的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA的单菌落接种至种子培养基中，于温度为30℃、转速为180rpm的条件下摇床培养24h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至发酵培养基中，于温度为30℃、转速为220rpm的条件下摇床培养24h后，在培养基中添加终浓度为0.1mM的IPTG，于温度为30℃、转速为220rpm的条件下继续诱导发酵72h，获得发酵液。

检测发酵液中L-精氨酸和胍基丁胺的含量，检测结果为：C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA发酵获得的发酵液中胍基丁胺的含量为9.7g/L、L-精氨酸的含量仅为0.23g/L。

实施例4：胍基丁胺的生产(生物发酵法+发酵罐)

具体步骤如下：

挑取实施例1获得的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA的单菌落接种至种子培养基中，于温度为30℃、转速为180rpm的条件下摇床培养24h，得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量接种至装有1.5L发酵培养基的5L发酵罐中，于温度为30℃、600r/min、1vvm的条件下发酵72h，获得发酵液；发酵过程中，通过自动添加50％(v/v)的氨水控制pH值维持在7.0，通过流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不小于30g/L。

检测发酵液中L-精氨酸和胍基丁胺的含量，检测结果为：C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA发酵获得的发酵液中胍基丁胺的含量为37.44g/L、L-精氨酸的含量为0.76g/L。

对比例1：重组钝齿棒杆菌的构建

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的编码精氨酸脱羧酶的基因speA分别替换为来源于来源于大肠杆菌(Escherichia coli)BL21的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的编码精氨酸脱羧酶的基因adiA、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的编码精氨酸脱羧酶的基因bsA或来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的核苷酸序列如SEQID No.7所示的编码精氨酸脱羧酶的基因ppA，得到重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-adiA、C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-bsA或C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-ppA；

其中，PCR扩增引物为：

adiA-F:5’-gcaggtcgactctagaggatccAAAGGAGGAAAATCatgaaagtattaattgttgaaagcg-3’(BamH I)(SEQ ID No.8)；

adiA-R:5’-caaaacagccaagctgaattcttaGTGGTGGTGGTGGTGGTGcgctttcacgcacataacgtggtaaataccgtcaataatt-3’(EcoR I)(SEQ ID No.9)；

bsA-F:5’-gcaggtcgactctagaggatccAAAGGAGGAAAATCttgtcgcaacatgaaacacccttatacacaggactgaaaaa-3’(BamH I)(SEQ ID No.10)；

bsA-R:5’-caaaacagccaagctgaattcttaGTGGTGGTGGTGGTGGTGttgaattgctttttgttctttgatgactcggatcatatgtaaagtcgagtcctcaggtc-3’(EcoR I)(SEQ ID No.11)；

ppA-F:5’-ggtcgactctagaggatccAAAGGAGGAAAATCatgtccgtacgacgcacacgcaaagacgat-3’(BamH I)(SEQ ID No.12)；

ppA-R:5’-gccaaaacagccaagctgaattcttaGTGGTGGTGGTGGTGGTGcgacgacaggtacgaagaccgggtcagcccaagg-3’(EcoR I)(SEQ ID No.13)。

对比例2：胍基丁胺的生产(生物发酵法+摇瓶)

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将实施例1获得的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA分别替换为对比例1获得的重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-adiA、C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-bsA或C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-ppA，得到发酵液3～5。

检测发酵液3～5中L-精氨酸和胍基丁胺的含量，检测结果为：发酵液3中胍基丁胺含量为9.83g/L，副产物精氨酸含量为8.98g/L；发酵液4中胍基丁胺含量为19.34g/L，副产物精氨酸含量为2.29g/L；发酵液5中胍基丁胺含量为6.49g/L，副产物精氨酸含量为12.47g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Asp Met Ser Met Gly Leu Pro Ser Ser Ala Gly Glu His

1 5 10 15

Gly Val Leu Arg Ser Met Gln Glu Val Ala Met Ser Ser Gln Glu Ala

20 25 30

Ser Lys Met Leu Arg Thr Tyr Asn Ile Ala Trp Trp Gly Asn Asn Tyr

35 40 45

Tyr Asp Val Asn Glu Leu Gly His Ile Ser Val Cys Pro Asp Pro Asp

50 55 60

Val Pro Glu Ala Arg Val Asp Leu Ala Gln Leu Val Lys Thr Arg Glu

65 70 75 80

Ala Gln Gly Gln Arg Leu Pro Ala Leu Phe Cys Phe Pro Gln Ile Leu

85 90 95

Gln His Arg Leu Arg Ser Ile Asn Ala Ala Phe Lys Arg Ala Arg Glu

100 105 110

Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Asp Tyr Phe Leu Val Tyr Pro Ile Lys Val

115 120 125

Asn Gln His Arg Arg Val Ile Glu Ser Leu Ile His Ser Gly Glu Pro

130 135 140

Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ser Lys Ala Glu Leu Met Ala Val Leu Ala

145 150 155 160

His Ala Gly Met Thr Arg Ser Val Ile Val Cys Asn Gly Tyr Lys Asp

165 170 175

Arg Glu Tyr Ile Arg Leu Ala Leu Ile Gly Glu Lys Met Gly His Lys

180 185 190

Val Tyr Leu Val Ile Glu Lys Met Ser Glu Ile Ala Ile Val Leu Asp

195 200 205

Glu Ala Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Arg

210 215 220

Leu Ala Ser Gln Gly Ser Gly Lys Trp Gln Ser Ser Gly Gly Glu Lys

225 230 235 240

Ser Lys Phe Gly Leu Ala Ala Thr Gln Val Leu Gln Leu Val Glu Thr

245 250 255

Leu Arg Glu Ala Gly Arg Leu Asp Ser Leu Gln Leu Leu His Phe His

260 265 270

Leu Gly Ser Gln Met Ala Asn Ile Arg Asp Ile Ala Thr Gly Val Arg

275 280 285

Glu Ser Ala Arg Phe Tyr Val Glu Leu His Lys Leu Gly Val Asn Ile

290 295 300

Gln Cys Phe Asp Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Asp Tyr Glu Gly Thr

305 310 315 320

Arg Ser Gln Ser Asp Cys Ser Val Asn Tyr Gly Leu Asn Glu Tyr Ala

325 330 335

Asn Asn Ile Ile Trp Ala Ile Gly Asp Ala Cys Glu Glu Asn Gly Leu

340 345 350

Pro His Pro Thr Val Ile Thr Glu Ser Gly Arg Ala Val Thr Ala His

355 360 365

His Thr Val Leu Val Ser Asn Ile Ile Gly Val Glu Arg Asn Glu Tyr

370 375 380

Thr Val Pro Thr Ala Pro Ala Glu Asp Ala Pro Arg Ala Leu Gln Ser

385 390 395 400

Met Trp Glu Thr Trp Gln Glu Met His Glu Pro Gly Thr Arg Arg Ser

405 410 415

Leu Arg Glu Trp Leu His Asp Ser Gln Met Asp Leu His Asp Ile His

420 425 430

Ile Gly Tyr Ser Ser Gly Ile Phe Ser Leu Gln Glu Arg Ala Trp Ala

435 440 445

Glu Gln Leu Tyr Leu Ser Met Cys His Glu Val Gln Lys Gln Leu Asp

450 455 460

Pro Gln Asn Arg Ala His Arg Pro Ile Ile Asp Glu Leu Gln Glu Arg

465 470 475 480

Met Ala Asp Lys Met Tyr Val Asn Phe Ser Leu Phe Gln Ser Met Pro

485 490 495

Asp Ala Trp Gly Ile Asp Gln Leu Phe Pro Val Leu Pro Leu Glu Gly

500 505 510

Leu Asp Gln Val Pro Glu Arg Arg Ala Val Leu Leu Asp Ile Thr Cys

515 520 525

Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp His Tyr Ile Asp Gly Asp Gly Ile Ala

530 535 540

Thr Thr Met Pro Met Pro Glu Tyr Asp Pro Glu Asn Pro Pro Met Leu

545 550 555 560

Gly Phe Phe Met Val Gly Ala Tyr Gln Glu Ile Leu Gly Asn Met His

565 570 575

Asn Leu Phe Gly Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Phe Val Phe Pro Asp

580 585 590

Gly Ser Val Glu Val Glu Leu Ser Asp Glu Gly Asp Thr Val Ala Asp

595 600 605

Met Leu Gln Tyr Val Gln Leu Asp Pro Lys Thr Leu Leu Thr Gln Phe

610 615 620

Arg Asp Gln Val Lys Lys Thr Asp Leu Asp Ala Glu Leu Gln Gln Gln

625 630 635 640

Phe Leu Glu Glu Phe Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu

645 650 655

Asp Glu

<210> 2

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctgacg acatgtctat gggtttgcct tcgtcagcgg gcgaacacgg tgtactacgc 60

tccatgcagg aggttgcaat gagctcccag gaagccagca agatgctgcg tacttacaat 120

attgcctggt ggggcaataa ctactatgac gttaacgagc tgggccacat tagcgtgtgc 180

ccggacccgg acgtcccgga agctcgcgtc gatctcgcgc agttagtgaa aactcgtgaa 240

gcacagggcc agcgtctgcc tgcactgttc tgtttcccac agatcctgca gcaccgtttg 300

cgttccatta acgccgcgtt caaacgtgcg agggaatcct acggctataa cggcgattac 360

ttccttgttt atccgatcaa agttaaccag caccgccgcg tgattgagtc cctgattcat 420

tcgggcgaac cgctgggtct ggaagccggt tccaaagccg agttgatggc agtactggca 480

catgctggca tgacccgtag cgtcatcgtc tgcaacggtt ataaagaccg cgaatatatc 540

cgcctggcat taattggcga gaagatgggg cacaaggtct atctggtcat tgagaagatg 600

tcagaaatcg ccattgtgct ggatgaagca gaacgtctga atgtcgttcc tcgtctgggc 660

gtgcgtgcac gtctggcttc gcagggttcg ggtaaatggc agtcctccgg cggggaaaaa 720

tcgaagttcg gcctggctgc gactcaggta ctgcaactgg ttgaaaccct gcgtgaagcc 780

gggcgtctcg acagcctgca actactgcac ttccacctcg gttcgcagat ggcgaatatt 840

cgcgatatcg cgacaggcgt tcgtgaatcc gcgcgtttct atgtggaact gcacaagctg 900

ggcgtcaata ttcagtgctt cgacgtcggc ggcggtctgg gcgtggatta tgaaggtact 960

cgttcgcagt ccgactgttc ggtgaactac ggcctcaatg aatacgccaa caacattatc 1020

tgggcgattg gcgatgcgtg tgaagaaaac ggtctgccgc atccgacggt aatcaccgaa 1080

tcgggtcgtg cggtgactgc gcatcacacc gtgctggtgt ctaatatcat cggcgtggaa 1140

cgtaacgaat acacggtgcc gaccgcgcct gcagaagatg cgccgcgcgc gctgcaaagc 1200

atgtgggaaa cctggcagga gatgcacgaa ccgggaactc gccgttctct gcgtgaatgg 1260

ttacacgaca gtcagatgga tctgcacgac attcatatcg gctactcttc cggcatcttt 1320

agcctgcaag aacgtgcatg ggctgagcag ctttatttga gcatgtgcca tgaagtgcaa 1380

aagcagctgg atccgcaaaa ccgtgctcat cgtccgatta tcgacgagct gcaggaacgt 1440

atggcggaca aaatgtacgt caacttctcg ctgttccagt cgatgccgga cgcatggggg 1500

atcgaccagt tgttcccggt tctgccgctg gaagggctgg atcaagtgcc ggaacgtcgc 1560

gctgtgctgc tggatattac ctgtgactct gacggtgcta tcgaccacta tattgatggt 1620

gacggtattg ccacgacaat gccaatgccg gagtacgatc cagagaatcc gccgatgctc 1680

ggtttcttta tggtcggcgc atatcaggag atcctcggca acatgcacaa cctgttcggt 1740

gataccgaag cggttgacgt gttcgtcttc cctgacggta gcgtagaagt agaactgtct 1800

gacgaaggcg ataccgtggc ggacatgctg caatatgtac agctcgatcc gaaaacgctg 1860

ttaacccagt tccgcgatca agtgaagaaa accgatcttg atgctgaact gcaacaacag 1920

ttccttgaag agttcgaggc aggtttgtac ggttatactt atcttgaaga tgagtaa 1977

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtcgactct agaggatcca aaggaggaaa atcatgtctg acgacatgtc tatg 54

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccaaaacag ccaagctgaa ttcttagtgg tggtggtggt ggtgctcatc ttcaagataa 60

gtataaccgt acaaacctgc ctcg 84

<210> 5

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaagtat taattgttga aagcgagttt ctccatcaag acacctgggt cggtaacgcc 60

gttgagcgtc tggcagatgc tttaagccag caaaatgtta ccgtgattaa atccacctcc 120

tttgatgatg gttttgccat tctctcttca aacgaagcca ttgactgcct gatgttcagc 180

tatcaaatgg aacatccgga cgaacatcaa aacgtcagac aattgatcgg taagcttcat 240

gagcgccaac aaaacgtgcc ggtcttcctg ttgggcgatc gggaaaaagc cctcgccgca 300

atggatcgcg acctgctgga gcttgtcgat gaattcgcct ggattctgga agataccgcc 360

gactttatcg ccggacgcgc cgttgccgcg atgacccgct accgccagca gctgttgccg 420

ccactgttca gcgcgctgat gaaatatagt gacatccatg aatattcctg ggcagcgcca 480

ggccaccagg gcggcgttgg ttttaccaaa acacccgccg gacgtttcta ccatgactac 540

tatggtgaaa atctgttccg caccgacatg ggcatcgaac gaacttccct cggttctttg 600

cttgaccata ctggcgcatt tggcgaaagc gaaaaatatg ccgcacgcgt atttggtgcc 660

gatcgctcct ggtcggtagt cgtcggtact tccggctcta accgcaccat catgcaggct 720

tgcatgaccg ataacgatgt cgtggtcgtt gaccgtaact gccataaatc catcgaacaa 780

ggtttgatgc tgacaggcgc gaaaccggtc tatatggtgc caagccgcaa ccgctacggc 840

attatcgggc caatctatcc gcaggaaatg caacctgaaa ccttgcagaa gaaaatcagt 900

gaaagcccgc tgaccaaaga caaagccggg caaaaaccgt cttactgcgt ggtgaccaac 960

tgcacctatg acggcgtgtg ttataacgct aaagaagcgc aggatctgct ggaaaaaacc 1020

tccgatcgtc tgcactttga cgaagcctgg tacggctatg cacgtttcaa cccgatctat 1080

gccgatcact atgccatgcg cggcgaacct ggcgatcaca acggtcctac cgttttcgcc 1140

acccactcca cccacaaact gctgaatgcg ctgtcacagg cttcttatat tcatgtacgt 1200

gaaggtcgtg gggcgattaa cttctcccgc ttcaaccagg cctacatgat gcatgccacc 1260

acctccccgc tgtatgccat ctgcgcatcc aacgacgtgg cggtgtcgat gatggacggc 1320

aacagcggcc tgtcactgac acaggaagtg attgacgaag cggttgattt ccgtcaggcg 1380

atggcgcggc tatataaaga gttcaccgct gacggtagct ggttcttcaa accgtggaac 1440

aaagaagtcg tcaccgaccc acaaaccggc aaaacctatg actttgctga cgcaccaacc 1500

aaactgctga ccaccgttca ggactgctgg gtaatgcatc cgggcgaaag ctggcacggc 1560

ttcaaagata ttccggataa ctggagtatg ctcgacccga ttaaagtcag catccttgct 1620

ccgggaatgg gtgaagatgg tgaactggaa gaaaccggtg ttccggcggc gctggtcact 1680

gcctggcttg gtcgccacgg cattgtacct acccgcacca ctgacttcca aattatgttc 1740

ctgttctcta tgggcgtaac ccgtgggaaa tggggaactc tggttaacac cctttgctcc 1800

ttcaaacgcc actatgacgc caacacaccg ctggcgcagg tgatgccgga acttgttgaa 1860

caatatcctg acacttacgc gaacatgggg attcacgatc tgggtgacac catgtttgcc 1920

tggctgaaag aaaacaaccc tggcgcacgg ttgaacgaag cctattccgg cctgccggtg 1980

gcggaagtca ccccgcgtga agcgtacaac gcgattgtcg acaacaatgt cgaactggta 2040

tccattgaaa atctgccagg acgcatcgcg gcaaactcag ttatcccgta tccgccagga 2100

atcccgatgc tgctgtctgg tgaaaacttc ggcgataaaa acagtccgca agtaagttat 2160

ttacgctcgc tgcaatcctg ggaccaccat ttccctggat ttgaacacga aactgaaggg 2220

actgaaatta ttgacggtat ttaccacgtt atgtgcgtga aagcgtaa 2268

<210> 6

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgtcgcaac atgaaacacc cttatacaca ggactgaaaa agcatgcaag cagacagcct 60

gttcaattcc acattcccgg ccataaaaaa ggggcaggaa tggacccaga attcagacaa 120

tttatcggtg aaaacgcgtt aagcatagat ttaattaata ttgaaccatt agacgatctg 180

cacgcgccaa aaggcattat taaacaagca caagatctgg ctgctgaagc atttggagcg 240

gatcatacat ttttttctgt tcaaggaaca agcggcgcca ttatgacaat ggtaatggct 300

gtttgcggac ctggtgataa aattattatt ccaagaaatg ttcataaatc aattatgaca 360

gctattgtat tttccggagc ggttccaatt tttattcatc ctgaaattga caatgaattg 420

ggcatctccc acggcattac acttgaatct gctaaacggg cgcttaccga acatccggat 480

gcaaaagggc ttctcgtcat caacccgaca tatttcggtg ttgcagccga cttaaaaagc 540

atcgtagaac tcgctcattc gtttgatgtg ccagtgcttg tggatgaagc acacggcgtt 600

cacattcatt ttcacgacga attgccgcta tcggctatgc aggcaggagc ggacatagca 660

gcgacaagtg tacacaagct gggcggatca ctcacgcaaa gttcgatttt aaacatgaga 720

gagggccttg tatcaaaaga cagagtgcaa tccatcctga gcatgctgac aactacgtca 780

acttcttact tgcttcttgc ttctttggat gttgccagaa aacgccttgc aacagaaggc 840

caccagcttg ctgaggaaac actaaagctt gccaatcaga cgagagatcg cctcaaccag 900

attgaaggca tttattgtgt cggttctgag attcttgggt cgaaagcagc ttacagctat 960

gatccgacaa aattgattat ctctgtgaaa agtcttggcc tgacaggaca tgacgtggaa 1020

aagtggcttc gtgaatcctt taatattgag gttgaacttt ctgatctgta caatattttg 1080

tgtattttca ctcctggtga cagccaaaat gatgcagacc ggcttgtaga ggctttaact 1140

gagatcgcac agcaaatgtc agaacaagat gtaacacatc agcaaactga ggttctgctt 1200

ccagaaatac ctttattggc aatgactccg cgtgatgctt tctatgcaaa tacggaagtc 1260

atcccattaa aagaagcatc cggacggatt attgctgaat ttgtcatggt atatccgcct 1320

ggtattccaa tcttcatccc aggagaaatt attacagaag aaaacatcag ctacattttt 1380

aaaaaccttg acgcaggcct ccctgttcaa ggacctgagg actcgacttt acatatgatc 1440

cgagtcatca aagaacaaaa agcaattcaa taa 1473

<210> 7

<211> 1914

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtccgtac gacgcacacg caaagacgat ggtagccagt ggaccgtggc cgacagccgc 60

agtgtttatg gcatccgcca ttggggcgct ggttatttcg ccatcaatga agccgggcgc 120

gtcgaagtgc gccccaacgg gcccgacagc gcgccgatcg acctgtacga gcaggttgac 180

gaattgcgcc agagcggcct gtcgctgccc ttgctggtgc gcttccccga cattctgcag 240

gaccgcgtac gccagctgac cggtgcgttc gatgccaata tcgcgcgcct ggagtaccag 300

agccagtaca ccgcgctgta cccgatcaag gtcaaccagc aagaagcggt ggtggaaaac 360

atcatcgcca cgcaaaacgt ttccatcggc cttgaagccg gctccaagcc cgagctgctg 420

gctgtgctgg cgctggcgcc gaagggcggt accatcgtct gcaacggcta caaggaccgt 480

gagttcattc gcctggcgct gatgggccag aagcttggcc acaacgtgtt catcgtcatc 540

gagaaagagt cggaagtggc tctggtgatc gacgaggccg ccgagctcaa ggtaaaaccg 600

caggtcggcc tgcgcgtgcg cctgtcgtcg ctggcctcca gcaaatgggc cgacaccggt 660

ggtgagaagt ccaagttcgg gttgtctgct gcccagctga tctcggtggt gcagcgcttc 720

cgcgatgccg gcctggacca gggcatccgc ctgctgcact tccacatggg ctcgcagatc 780

gccaacctgg ccgactacca gcacggtttc aaggaagcca tccgttacta cggcgaactg 840

cgtgcgctgg gcctgccggt cgaccacatc gacgttggcg gtggcctggg cgtggactac 900

gacggcaccc actcgcgcaa tgccagctcg atcaactacg acatggatga ctacgccggc 960

gtggtggtgg gcatgctcaa ggagttctgc gacgcgcagg gcctgccgca cccgcacatc 1020

ttctccgaga gtggccgctc gctgaccgcg caccacgcca tgctggtgat ccaggtcacc 1080

gacgtcgaga agcacaacga cgacgtgccg accatcgaga acaaggaagc cctgcccgag 1140

accgtgcagt ggctggccga cctgcttggc ccgaccgaca tcgagatggt gaccgagact 1200

tactggcgcg ccacccacta catgggtgac gtggccgcgc agtacgccga tggcaagatc 1260

agcctgagcg agaaggcctt ggccgagcag tgctactttg ccgtgtgccg ccgcctgcat 1320

aactcgctga aagcccgcca gcgctcgcac cgccaggtgc tggacgagct gaacgacaag 1380

ctggccgaca agtacatctg caacttctcg gtgttccaga gccttccgga cacctgggcc 1440

attggccagg tgctgccgat catcccgttg caccgcctgg acgaagagcc gctgcgccgc 1500

gccgtactgc aggacctgac ctgcgactcg gacggcaaga tcaaccagta cgtcgacgag 1560

cagagcatcg aaaccagcat gccggtgcat gcgctgaagg acggcgagga ctatctgctg 1620

ggcgtgttcc tggtcggtgc ctaccaggaa atcctgggtg acatgcacaa cctgttcggt 1680

gacaccgact cggtgaacat ctaccagaac gccgacggca gcgtgtacca cgccggcatc 1740

gagacccacg acaccatcga agacatgctg cgctacgtgc acctgtcgcc ggaggagttg 1800

atgacccact accgcgacaa ggtcgccagc gccaagatca ctgcgcgcga gcgcacgcag 1860

tacctggatg ccttgcgcct tgggctgacc cggtcttcgt acctgtcgtc gtaa 1914

<210> 8

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcaggtcgac tctagaggat ccaaaggagg aaaatcatga aagtattaat tgttgaaagc 60

g 61

<210> 9

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caaaacagcc aagctgaatt cttagtggtg gtggtggtgg tgcgctttca cgcacataac 60

gtggtaaata ccgtcaataa tt 82

<210> 10

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaggtcgac tctagaggat ccaaaggagg aaaatcttgt cgcaacatga aacaccctta 60

tacacaggac tgaaaaa 77

<210> 11

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caaaacagcc aagctgaatt cttagtggtg gtggtggtgg tgttgaattg ctttttgttc 60

tttgatgact cggatcatat gtaaagtcga gtcctcaggt c 101

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtcgactct agaggatcca aaggaggaaa atcatgtccg tacgacgcac acgcaaagac 60

gat 63

<210> 13

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gccaaaacag ccaagctgaa ttcttagtgg tggtggtggt ggtgcgacga caggtacgaa 60

gaccgggtca gcccaagg 78

Claims

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌为宿主，表达编码精氨酸脱羧酶的基因speA。

2.如权利要求1所述的一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述编码精氨酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌SYPA5-5为宿主，以pXMJ-19质粒、pDXW-8质粒、pDXW-10质粒或pJCtac质粒为载体，表达编码精氨酸脱羧酶的基因speA。

5.一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1-4任一所述的重组钝齿棒杆菌接种至含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵，获得含有胍基丁胺的发酵液，然后将含有胍基丁胺的发酵液进行分离，获得胍基丁胺。

6.如权利要求5所述的一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为28～32℃、转速为180～250rpm、pH为7.0～7.5。

7.如权利要求5或6所述的一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为220rpm。

8.如权利要求5-7任一所述的一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/L、(NH₄)₂SO₄35～45g/L、酵母粉浸10～12g/L、KH₂PO₄1.3～1.5g/L、KCl 0.8～1g/L、MgS0₄·7H₂O 1.0～1.2g/L、MnS0₄·H₂O 0.3～0.4g/L、FeS0₄·7H₂O0.01～0.02g/L以及CaCO₃15～20g/L。

9.如权利要求5-8任一所述的一种生产胍基丁胺的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120g/L、(NH₄)₂SO₄40 g/L、酵母粉浸12g/L、KH₂PO₄1.5 g/L、KCl 1g/L、MgS0₄·7H₂O 1.0g/L、MnS0₄·H₂O 0.3g/L、FeS0₄·7H₂O 0.02g/L以及CaCO₃20 g/L。

10.权利要求1-4任一所述的重组钝齿棒杆菌或权利要求5-9任一所述的方法在生产胍基丁胺中的应用。