CN114774342A

CN114774342A - 一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4-丁二胺的方法

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Publication number: CN114774342A
Application number: CN202210540955.0A
Authority: CN
Inventors: 徐美娟; 饶志明; 杨凤玉; 宋云海; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN114774342B

Abstract

本发明公开了一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4‑丁二胺的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过采用大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pEC‑XK99E，将来源于Escherichia coli K‑12的木糖异构酶和木酮糖激酶编码基因簇在先前构建的1,4‑丁二胺高产菌株PC0中表达。摇瓶发酵结果表明，原始菌PC0不具有代谢利用木糖的能力，而重组钝齿棒杆菌具有此能力，可以直接利用木糖及含木糖水解液直接进行1,4‑丁二胺的生产。最终在5‑L发酵罐72h发酵可以积累33.4g·L^‑11,4‑丁二胺。本发明方法生产1,4‑丁二胺，具有效率高、副产物L‑精氨酸、胍基丁胺和其他杂酸含量低的优点，后期对于产物1,4‑丁二胺的分离纯化更加容易。

Description

一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4-丁二胺的方法

技术领域

本发明涉及一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4-丁二胺的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,4-丁二胺(也称1,4-二氨基丁烷或腐胺)是一种含有两个氨基的四碳化合物，是自然界中生物多胺的一种。1,4-丁二胺作为一种具有多种应用的化合物，在聚合物和药物等农业领域、工业领域具有重要作用。

目前，工业发酵生产氨基酸及衍生物主要以葡萄糖为底物，但是为了减少与其他工业应用形成竞争，以更低值的生物质原料替代葡萄糖进行发酵是一种前景广阔的生产方式。然而，在各种生物质水解液中除了富含葡萄糖外，还含有大量以木糖为主的五碳糖。因此，利用水解液发酵生产1,4-丁二胺的主要难题转化为开发高效利用木糖的重组菌株。

虽然在现有报道中，木糖已被用于生产1,4-丁二胺，但是其具有最终产量低的缺点，例如：Volker F.Wendisch等人研究公开的方法中，是通过过表达野油菜黄单胞菌来源的木糖异构酶和谷氨酸棒杆菌来源的木酮糖激酶构建木糖代谢途径，但是最终生成的1,4-丁二胺的产量仅有15.1mM(公开于“Accelerated pentose utilization byCorynebacterium glutamicum for accelerated production of lysine,glutamate,ornithine and putrescine”论文当中)。

因此，如何构建高效利用木糖的重组菌株，开发以生物质原料为底物进行发酵合成1,4-丁二胺的高效生产菌株成为研究的难点。

发明内容

本发明提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌同时表达了木糖异构酶和木酮糖激酶。

所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌CGMCC NO.0890为表达宿主，以质粒pEC-XK99E和pXMJ19为表达载体，过表达了精氨酸脱羧酶突变体、胍丁胺酶、木糖异构酶和木酮糖激酶；所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的精氨酸脱羧酶第533位的丙氨酸突变成脯氨酸得到的；其中，采用pXMJ19载体表达了精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶；采用pEC-XK99E载体表达了木糖异构酶和木酮糖激酶。

所述钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)CGMCC NO.0890记载于公开号为CN1441055A的专利申请文本中，此菌株在专利申请文本中的菌株编号为SDNN403，发明人在本发明的实验过程中将其重新编号为SYPA5-5。

在本发明的一种实施方式中，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，所述木糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，所述木酮糖激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO 4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述胍丁胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，编码所述木糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，编码所述木酮糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌还包括，采用组成型启动子P52取代pEC-XK99E载体上的诱导型启动子trc；所述组成型启动子P52的核苷酸序列如SEQ IDNO 8所示。

本发明还提供了一种制备1,4-丁二胺的方法，其特征在于，所述方法为，将上述重组钝齿棒杆菌的种子液接种至发酵培养基中发酵制备得到。

在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌种子液的制备方法为：将上述重组钝齿棒杆菌接种至种子培养基中，在28-32℃，180-250rpm条件下培养24h，制备得到种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：碳源100～150g·L^-1，(NH₄)₂SO₄30～40g·L^-1，酵母粉10～20g·L^-1，KH₂PO₄ 1.5g·L^-1，KCl 1.0g·L^-1，MgS0₄·7H₂O 0.5g·L^-1，MnS0₄·H₂O 0.02g·L^-1，FeS0₄·7H₂O 0.02g·L^-1，CaCO₃ 20g·L^-1；所述碳源为木糖、木糖水解液或者木糖与葡萄糖的混糖。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：碳源150g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 40g·L^-1，酵母粉10g·L^-1，KH₂PO₄ 1.5g·L^-1，KCl 1.0g·L^-1，MgS0₄·7H₂O 0.5g·L^-1，MnS0₄·H₂O0.02g·L^-1，FeS0₄·7H₂O 0.02g·L^-1，CaCO₃ 20g·L^-1；所述碳源为木糖、含木糖水解液或者木糖与葡萄糖的混糖。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖水解液包括：5-羟甲基糠醛0.01g·L^-1，糠醛0.04g·L^-1，甲酸0.07g·L^-1，乙酸1.3g·L^-1，木糖37.5～93.75g·L^-1，葡萄糖112.5～56.25g·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖水解液包括：5-羟甲基糠醛0.01g·L^-1，糠醛0.04g·L^-1，甲酸0.07g·L^-1，乙酸1.3g·L^-1，木糖37.5g·L^-1，葡萄糖112.5g·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述混糖中，葡萄糖、木糖按照(1：1)～(3：5)比例进行混合。

在本发明的一种实施方式中，将重组钝齿棒杆菌的种子液按照10％～20％(v/v)的比例添加至发酵培养基中发酵制备1,4-丁二胺。

在本发明的一种实施方式中，所述制备得到的种子液按照10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，在28～32℃，180～250rpm条件下发酵培养72～96h。

在本发明的一种实施方式中，将种子液接种至发酵培养基进行发酵培养时，接种24h后加入IPTG，终浓度为0.5mM。

本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌，或上述1,4-丁二胺的制备方法在制备含有1,4-丁二胺的产品中的应用。

本发明还提供了上述重组钝齿棒杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)Escherichia coli K-12全基因组为模板，将扩增的木糖异构酶基因xylA或木糖异构酶和木酮糖激酶基因簇xylAB(在Escherichia coli K-12基因组上，木糖异构酶和木酮糖激酶是相邻的，将两者利用引物同时扩增下来，命名为木糖异构酶和木酮糖激酶基因簇xylAB)连接到带有诱导型启动子trc或组成型启动子P52的表达载体pEC-XK99E上，构建重组质粒；

(2)将步骤(1)制备得到的重组质粒转化到PC0中，制备得到重组钝齿棒杆菌。

所述PC0为C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-A533P-speB，构建方法记载于公开号为CN113061562A的中国发明专利申请文本中。

有益效果

(1)本发明本发明通过采用大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pEC-XK99E，将来源于Escherichia coli K-12的木糖异构酶和木酮糖激酶编码基因簇在先前构建的1,4-丁二胺高产菌株PC0(C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA_A533P-speB)中表达，构建了一种以木糖及含木糖水解液为底物一步发酵法合成1,4-丁二胺的公认安全菌株PC0/pEC-XK99E-xylAB，能够拓展碳源，利用木糖及含木糖水解液为原料进行1,4-丁二胺的生产。

(2)发酵生产1,4-丁二胺时，以木糖为碳源，带有组成型启动子的重组菌PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB能够生产5.4g·L^-1的1,4-丁二胺，而含有诱导型启动子PC0/pEC-XK99E-xylAB发酵液中积累到7.8g·L^-1的1,4-丁二胺；以混糖为碳源，具有较优结果的重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB在葡萄糖与木糖为3:1比例的混糖发酵培养基中积累到18.5g·L^-1的1,4-丁二胺；以含木糖水解液为碳源积累17.0g·L^-1的1,4-丁二胺。

(3)采用本发明提供的方法进行混糖及含木糖水解液为碳源的发酵罐培养时，重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB以混糖为碳源可积累36.8g·L^-1的1,4-丁二胺，以含木糖水解液为碳源可积累33.4g·L^-1的1,4-丁二胺，实现以含木糖水解液为碳源，一步发酵法合成1,4-丁二胺，并且发酵后无副产物精氨酸生成，仅含有少量中间产物胍基丁胺。

附图说明

图1：木糖异构酶和木酮糖激酶粗酶液蛋白胶图。

图2：单一木糖的生长性能测试图。

图3：摇瓶发酵产量图，其中，A为PC0/pEC-XK99E-xylAB和PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB以木糖为碳源发酵制备1,4-丁二胺的产量；B为PC0/pEC-XK99E-xylAB以混糖为碳源发酵制备1,4-丁二胺的产量；C为以木糖水解液为碳源发酵制备1,4-丁二胺的产量；。

图4：以混糖为碳源发酵罐发酵产量图。

图5：以含木糖水解液为碳源发酵罐发酵产量图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的PC0为C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-speA_A533P-speB，构建方法记载于公开号为CN113061562A的中国发明专利申请文本中。下述实施例中所涉及的pEC-XK99E、pXMJ19购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉20.0g·L^-1。

BHI液体培养基：脑心浸液肉汤37.0g·L^-1。

BHI固体培养基：脑心浸液肉汤37.0g·L^-1、琼脂20.0g·L^-1。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量的检测：高效液相色谱法；安捷伦C18，5μm，4.6×250mm色谱柱；流速为1.0mL·min^-1；柱温40℃；检测波长338nm；流动相：A相：8.0g乙酸钠(13.3g三水合乙酸钠)溶于1000mL水，加入225μL三乙胺，用5％的乙酸将pH调到7.20±0.05，最后加入5mL四氢呋喃，混合；B相：称取6.0g乙酸钠溶于200mL水，用5％乙酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入400mL的HPLC级甲醇和400mL的HPLC级乙腈，混合。

实施例1：重组菌PC0/pEC-XK99E-xylA、PC0/pEC-XK99E-xylAB和PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB的构建

(1)引物设计

根据NCBI中Escherichia coli K-12全基因组核酸序列中xylA(编码所述木糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示)和xylB的基因序列(编码所述木酮糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示)，设计质粒pEC-XK99E-xylA的PCR引物F₁和R₁，pEC-XK99E-xylAB的PCR引物F₂和R₂、pEC-XK99E-P52-xylAB的PCR引物F₃和R₃及F₄和R₄。

F₁：5’-caggaaacagaccatggaattcaaaggaggacaaccatgcaagcctattttgaccagc-3’；

R₁：5’-gcaggtcgactctagaggatccttatttgtcgaacagataatggtttaccag-3’；

F₂：5’-caggaaacagaccatggaattcaaaggaggacaaccatgcaagcctattttgaccagc-3’；

R₂：5’-gcaggtcgactctagaggatccttacgccattaatggcagaagttgc-3’；

F₃：5’-tgtggaattgtgagcggataac-3’；

R₃：5’-cagctcatttcagaatatttgccagaac-3’；

F₄：5’-gttctggcaaatattctgaaatgagctgttgtcgtgttcctttctgtttccg-3’；

R₄：5’-gttatccgctcacaattccacaccttcttaagcttgtctctggtttcc-3’。

(2)木糖异构酶基因xylA及木糖异构酶和木酮糖激酶基因簇xylAB的克隆

以Escherichia coli K-12全基因组为模板，利用上述引物做PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性，10min；95℃变性，30s，55℃退火，30s，72℃延伸，120s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，灭菌的双蒸馏水22μL，2×Phanta MaxMaster Mix 25μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

(3)重组质粒pEC-XK99E-xylA、pEC-XK99E-xylAB和pEC-XK99E-P52-xylAB的构建

提取保存于E.coli JM109中的质粒pEC-XK99E，并用BamH I和EcoR I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后与(2)中获得的基因片段进行连接，连接体系：ExnaseⅡ2μL，5×CEⅡBuffer 4μL，载体及片段分别按照连接酶ExnaseⅡ说明书计算后添加，灭菌的双蒸馏水将总体积补齐至20μL，之后在37℃条件下酶连30min。

分别将连接好的pEC-XK99E-xylA、pEC-XK99E-xylAB重组质粒转化到E.coli BL21感受态中，并用加入浓度为50μg·mL^-1卡那霉素抗性的LB固体培养基筛选阳性转化子。

挑取验证正确的转化子接种于加入浓度为50μg·mL^-1卡那霉素抗性的10ml LB液体培养基，于37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证，测序正确后，得到正确的重组菌株Escherichia coli BL21/pEC-XK99E-xylA、Escherichia coli BL21/pEC-XK99E-xylAB提取重组质粒pEC-XK99E-xylA、pEC-XK99E-xylAB并将验证正确的重组菌加入甘油至终浓度15％～20％(v/v)，-80℃冰箱保藏备用。

以重组质粒pEC-XK99E-xylAB为模板，以F₃和R₃为引物将重组质粒线性化，以F₄和R₄为引物，以C.crenatum SYPA 5-5为模板克隆组成型启动子P52，将线性化质粒pEC-XK99E-xylAB与启动子P52以同源重组的方式连接(取代诱导型启动子trc)，经筛选得到重组质粒pEC-XK99E-P52-xylAB。

(4)重组质粒pEC-XK99E-xylA、pEC-XK99E-xylAB和pEC-XK99E-P52-xylAB转化钝齿棒杆菌PC0

感受态制备：挑取PC0(C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-speA_A533P-speB)接种于10mLBHI液体培养基，30℃摇床培养24h，取培养后的菌液转接入含3g·L^-1甘氨酸和0.1％吐温-80的100mL液体LBG培养基中。30℃，200rpm条件下培养到细胞OD₆₀₀达到0.9。细胞培养结束后将菌液预冷30min，然后离心收集菌体。用预冷的10％甘油洗涤菌体3次，最后用0.2mL10％甘油重悬细胞，用1.5mL管分装，每管80μL直接用于电转化。

电转：1850V电转5ms，电转后加入800μL BHI培养基30℃，200rpm培养2-3h。

重组菌获得：分别将步骤(3)提取得到的重组质粒转化至PC0感受态细胞中，得到转化子，并将转化子涂布于含有浓度为10μg·mL^-1氯霉素和50μg·mL^-1卡那霉素双抗性BHI固体培养基，30℃培养，挑取阳性菌落，菌落PCR验证，分别得到重组菌PC0/pEC-XK99E-xylA、PC0/pEC-XK99E-xylAB、PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB，将正确的重组菌加入甘油至终浓度15％～20％(v/v)，-80℃冰箱保藏备用。

实施例2：重组菌PC0/pEC-XK99E-xylA、PC0/pEC-XK99E-xylAB、PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB在唯一木糖碳源的培养基中的生长测定

(1)配制培养基：

种子培养基(g·L^-1)：葡萄糖50，(NH₄)₂SO₄ 20，酵母粉20，KH₂PO₄ 1.5，MgS0₄·7H₂O1.0，MnS0₄·H₂O 0.3，CaCO₃ 1.0；

发酵培养基(g·L^-1)：木糖100，(NH₄)₂SO₄ 40，酵母粉10，KH₂PO₄ 1.5，KCl 1.0，MgS0₄·7H₂O 0.5，MnS0₄·H₂O 0.02，FeS0₄·7H₂O 0.02，CaCO₃ 20。

(2)分别将实施例1构建的重组菌PC0/pEC-XK99E-xylA、PC0/pEC-XK99E-xylAB、PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB与出发菌株PC0分别于含有浓度为10μg·mL^-1氯霉素或10μg·mL^-1氯霉素和50μg·mL^-1卡那霉素抗性BHI固体培养基划线活化后，挑取单菌落接种于步骤(1)配制的种子培养基中，培养24h，分别制备得到种子液；

(3)将制备得到的种子液以10％(v/v)的转接量转接到250mL装有30mL的步骤(1)配制的发酵培养基的摇瓶中，在30℃，220rpm的往复式摇床中进行培养72h，其中在发酵培养24h后加入IPTG，终浓度为0.5mM；在摇瓶发酵过程中每隔12h取样测定菌株OD₆₀₀。其中，这三个重组菌株发酵产酶的粗酶液的蛋白胶图如图1所示。

结果如图2所示，在发酵过程中，出发菌株PC0在上述条件下无法正常生长，单独过表达木糖异构酶xylA的重组菌在前24h生长缓慢，原因是诱导型质粒未经诱导无法利用木糖，添加IPTG后快速增长，但是生长速率远低于共同过表达木糖异构酶xylA和木酮糖激酶xylB的重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB和PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB，带有诱导型启动子的重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB在前24h的生长低于PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB，但是在诱导之后的生长速率迅速增加，最终生物量明显高于PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB。

实施例3：重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB和PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB摇瓶发酵生产1,4-丁二胺

(1)配制培养基：

发酵培养基(g·L^-1)：碳源150，(NH₄)₂SO₄ 40，酵母粉10，KH₂PO₄ 1.5，KCl 1.0，MgS0₄·7H₂O 0.5，MnS0₄·H₂O 0.02，FeS0₄·7H₂O 0.02，CaCO₃ 20。

其中：碳源为将木糖和葡萄糖分别按照质量比为1：1，1：2，2：1，3：1，3：2，3：4，3：5的比例混合后，分别制备得到浓度为150g·L^-1的混糖作为碳源。

(2)分别将实施例1构建的重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB和PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB分别于含有浓度为10μg·mL^-1氯霉素和50μg·mL^-1卡那霉素抗性BHI固体培养基划线活化后，挑取单菌落接种于步骤(1)配制的种子培养基中，培养24h，制备得到种子液；

(3)将制备得到的种子液以10％(v/v)的转接量转接到250mL装有30mL的步骤(1)配制的发酵培养基的摇瓶中，在30℃，220rpm的往复式摇床中进行培养96h；其中，带有诱导型质粒PC0/pEC-XK99E-xylAB的重组菌在发酵培养24h后加入IPTG，终浓度为0.5mM；

待发酵96h，发酵结束后收集发酵液，用HPLC分别检测精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量，结果如表1和图3A～C所示。

表1：不同碳源摇瓶发酵生产1,4-丁二胺的含量

其中，NT表示未检出。

结果表明，重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB在单一木糖发酵培养基中可积累7.8g·L^-1的1,4-丁二胺，高于PC0/pEC-XK99E-P52-xylAB的5.4g·L^-1，表明利用诱导型启动子的PC0/pEC-XK99E-xylAB具有更好的木糖利用效果。

以PC0/pEC-XK99E-xylAB在葡萄糖与木糖不同比例的混糖中进行发酵，结果显示葡萄糖与木糖为3:1时，1,4-丁二胺产量最高，达到18.5g·L^-1。

(4)碳源为木糖水解液发酵制备1,4-丁二胺

具体实施方式同步骤(1)～(3)，区别在于：

将步骤(1)中的发酵培养基的碳源更换为含木糖的水解液，木糖水解液的成分为：5-羟甲基糠醛0.01g·L^-1，糠醛0.04g·L^-1，甲酸0.07g·L^-1，乙酸1.3g·L^-1，木糖37.5g·L^-1，葡萄糖112.5g·L^-1。按照步骤(3)的方法进行发酵，待发酵96h，发酵结束后收集发酵液，用HPLC分别检测精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量，结果如表2和图3C所示。

表2：不同碳源摇瓶发酵生产1,4-丁二胺的含量

结果显示，采用碳源为木糖水解液发酵制备1,4-丁二胺，1,4-丁二胺产量达到17.0g·L^-1。发酵过程中没有副产物精氨酸积累，且最终仅有少量胍基丁胺生成。

实施例4：重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB发酵罐发酵产1,4-丁二胺

(1)配制培养基

种子培养基(g·L^-1)：葡萄糖40，玉米浆50，(NH₄)₂SO₄ 10，酵母粉10，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄ 1.5，MgS0₄·7H₂O 0.4，尿素1；

发酵培养基(g·L^-1)：碳源120，玉米浆10，酵母粉20，(NH₄)₂SO₄ 30，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ ^.7H₂O 0.5，KCl 1，尿素1，FeSO₄·7H₂O 0.02，MnSO₄·H₂O 0.02，ZnSO₄·7H₂O 0.02。

以混糖或含木糖水解液为碳源；其中：混糖：木糖30g·L^-1，葡萄糖90g·L^-1。含木糖水解液：5-羟甲基糠醛0.01g·L^-1，糠醛0.04g·L^-1，甲酸0.07g·L^-1，乙酸1.3g·L^-1，木糖30g·L^-1，葡萄糖90g·L^-1。

补料培养基(g·L^-1)：800g·L^-1的混糖(葡萄糖600g·L^-1，木糖200g·L^-1)或含木糖水解液(葡萄糖600g·L^-1，木糖200g·L^-1，5-羟甲基糠醛0.07g·L^-1，糠醛0.27g·L^-1，甲酸0.47g·L^-1，乙酸8.7g·L^-1)。

(2)将实施例1构建的重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB在含有浓度为10μg·mL^-1氯霉素和50μg·mL^-1卡那霉素抗性BHI固体培养基中划线活化后，挑取单菌落接种于20mL/250mL步骤(1)制备得到的种子培养基中，在30℃，200rpm摇床中培养24h，制备得到一级种子液；

将一级种子液全部转接到200ml/1L步骤(1)制备得到的种子培养基中，在30℃，200rpm摇床中培养12h，制备得到二级种子液；

(3)分别将步骤(2)制备得到的二级种子液转接到2L/5L步骤(1)制备得到的不同碳源的发酵培养基中，以30℃，600rpm，通气量3L/min，pH 7.0的条件下发酵72h；其中在培养13h时添加终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，发酵培养基中残糖根据实际测定数据进行补加。

(4)发酵结束后收集发酵液，用HPLC分别检测精氨酸、胍基丁胺和1,4-丁二胺含量。

结果显示，如图4所示，重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB在混糖培养基中发酵可积累36.8g·L^-1的1,4-丁二胺；

如图5所示，重组菌PC0/pEC-XK99E-xylAB在含木糖水解液培养基中发酵可积累33.4g·L^-1的1,4-丁二胺；

本发明实现一步发酵法由混糖到1,4-丁二胺的直接合成，并且发酵后测得无精氨酸残留，仅生成少量胍基丁胺。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4-丁二胺的方法

<130> BAA220588A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Asp Met Ser Met Gly Leu Pro Ser Ser Ala Gly Glu His

1 5 10 15

Gly Val Leu Arg Ser Met Gln Glu Val Ala Met Ser Ser Gln Glu Ala

20 25 30

Ser Lys Met Leu Arg Thr Tyr Asn Ile Ala Trp Trp Gly Asn Asn Tyr

35 40 45

Tyr Asp Val Asn Glu Leu Gly His Ile Ser Val Cys Pro Asp Pro Asp

50 55 60

Val Pro Glu Ala Arg Val Asp Leu Ala Gln Leu Val Lys Thr Arg Glu

65 70 75 80

Ala Gln Gly Gln Arg Leu Pro Ala Leu Phe Cys Phe Pro Gln Ile Leu

85 90 95

Gln His Arg Leu Arg Ser Ile Asn Ala Ala Phe Lys Arg Ala Arg Glu

100 105 110

Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Asp Tyr Phe Leu Val Tyr Pro Ile Lys Val

115 120 125

Asn Gln His Arg Arg Val Ile Glu Ser Leu Ile His Ser Gly Glu Pro

130 135 140

Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ser Lys Ala Glu Leu Met Ala Val Leu Ala

145 150 155 160

His Ala Gly Met Thr Arg Ser Val Ile Val Cys Asn Gly Tyr Lys Asp

165 170 175

Arg Glu Tyr Ile Arg Leu Ala Leu Ile Gly Glu Lys Met Gly His Lys

180 185 190

Val Tyr Leu Val Ile Glu Lys Met Ser Glu Ile Ala Ile Val Leu Asp

195 200 205

Glu Ala Glu Arg Leu Asn Val Val Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Arg

210 215 220

Leu Ala Ser Gln Gly Ser Gly Lys Trp Gln Ser Ser Gly Gly Glu Lys

225 230 235 240

Ser Lys Phe Gly Leu Ala Ala Thr Gln Val Leu Gln Leu Val Glu Thr

245 250 255

Leu Arg Glu Ala Gly Arg Leu Asp Ser Leu Gln Leu Leu His Phe His

260 265 270

Leu Gly Ser Gln Met Ala Asn Ile Arg Asp Ile Ala Thr Gly Val Arg

275 280 285

Glu Ser Ala Arg Phe Tyr Val Glu Leu His Lys Leu Gly Val Asn Ile

290 295 300

Gln Cys Phe Asp Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Asp Tyr Glu Gly Thr

305 310 315 320

Arg Ser Gln Ser Asp Cys Ser Val Asn Tyr Gly Leu Asn Glu Tyr Ala

325 330 335

Asn Asn Ile Ile Trp Ala Ile Gly Asp Ala Cys Glu Glu Asn Gly Leu

340 345 350

Pro His Pro Thr Val Ile Thr Glu Ser Gly Arg Ala Val Thr Ala His

355 360 365

His Thr Val Leu Val Ser Asn Ile Ile Gly Val Glu Arg Asn Glu Tyr

370 375 380

Thr Val Pro Thr Ala Pro Ala Glu Asp Ala Pro Arg Ala Leu Gln Ser

385 390 395 400

Met Trp Glu Thr Trp Gln Glu Met His Glu Pro Gly Thr Arg Arg Ser

405 410 415

Leu Arg Glu Trp Leu His Asp Ser Gln Met Asp Leu His Asp Ile His

420 425 430

Ile Gly Tyr Ser Ser Gly Ile Phe Ser Leu Gln Glu Arg Ala Trp Ala

435 440 445

Glu Gln Leu Tyr Leu Ser Met Cys His Glu Val Gln Lys Gln Leu Asp

450 455 460

Pro Gln Asn Arg Ala His Arg Pro Ile Ile Asp Glu Leu Gln Glu Arg

465 470 475 480

Met Ala Asp Lys Met Tyr Val Asn Phe Ser Leu Phe Gln Ser Met Pro

485 490 495

Asp Ala Trp Gly Ile Asp Gln Leu Phe Pro Val Leu Pro Leu Glu Gly

500 505 510

Leu Asp Gln Val Pro Glu Arg Arg Ala Val Leu Leu Asp Ile Thr Cys

515 520 525

Asp Ser Asp Gly Ala Ile Asp His Tyr Ile Asp Gly Asp Gly Ile Ala

530 535 540

Thr Thr Met Pro Met Pro Glu Tyr Asp Pro Glu Asn Pro Pro Met Leu

545 550 555 560

Gly Phe Phe Met Val Gly Ala Tyr Gln Glu Ile Leu Gly Asn Met His

565 570 575

Asn Leu Phe Gly Asp Thr Glu Ala Val Asp Val Phe Val Phe Pro Asp

580 585 590

Gly Ser Val Glu Val Glu Leu Ser Asp Glu Gly Asp Thr Val Ala Asp

595 600 605

Met Leu Gln Tyr Val Gln Leu Asp Pro Lys Thr Leu Leu Thr Gln Phe

610 615 620

Arg Asp Gln Val Lys Lys Thr Asp Leu Asp Ala Glu Leu Gln Gln Gln

625 630 635 640

Phe Leu Glu Glu Phe Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu

645 650 655

Asp Glu

<210> 2

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Thr Leu Gly His Gln Tyr Asp Asn Ser Leu Val Ser Asn Ala

1 5 10 15

Phe Gly Phe Leu Arg Leu Pro Met Asn Phe Gln Pro Tyr Asp Ser Asp

20 25 30

Ala Asp Trp Val Ile Thr Gly Val Pro Phe Asp Met Ala Thr Ser Gly

35 40 45

Arg Ala Gly Gly Arg His Gly Pro Ala Ala Ile Arg Gln Val Ser Thr

50 55 60

Asn Leu Ala Trp Glu His Asn Arg Phe Pro Trp Asn Phe Asp Met Arg

65 70 75 80

Glu Arg Leu Asn Val Val Asp Cys Gly Asp Leu Val Tyr Ala Phe Gly

85 90 95

Asp Ala Arg Glu Met Ser Glu Lys Leu Gln Ala His Ala Glu Lys Leu

100 105 110

Leu Ala Ala Gly Lys Arg Met Leu Ser Phe Gly Gly Asp His Phe Val

115 120 125

Thr Leu Pro Leu Leu Arg Ala His Ala Lys His Phe Gly Lys Met Ala

130 135 140

Leu Val His Phe Asp Ala His Thr Asp Thr Tyr Ala Asn Gly Cys Glu

145 150 155 160

Phe Asp His Gly Thr Met Phe Tyr Thr Ala Pro Lys Glu Gly Leu Ile

165 170 175

Asp Pro Asn His Ser Val Gln Ile Gly Ile Arg Thr Glu Phe Asp Lys

180 185 190

Asp Asn Gly Phe Thr Val Leu Asp Ala Cys Gln Val Asn Asp Arg Ser

195 200 205

Val Asp Asp Val Ile Ala Gln Val Lys Gln Ile Val Gly Asp Met Pro

210 215 220

Val Tyr Leu Thr Phe Asp Ile Asp Cys Leu Asp Pro Ala Phe Ala Pro

225 230 235 240

Gly Thr Gly Thr Pro Val Ile Gly Gly Leu Thr Ser Asp Arg Ala Ile

245 250 255

Lys Leu Val Arg Gly Leu Lys Asp Leu Asn Ile Val Gly Met Asp Val

260 265 270

Val Glu Val Ala Pro Ala Tyr Asp Gln Ser Glu Ile Thr Ala Leu Ala

275 280 285

Ala Ala Thr Leu Ala Leu Glu Met Leu Tyr Ile Gln Ala Ala Lys Lys

290 295 300

Gly Glu

305

<210> 3

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gln Ala Tyr Phe Asp Gln Leu Asp Arg Val Arg Tyr Glu Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ser Ser Asn Pro Leu Ala Phe Arg His Tyr Asn Pro Asp Glu Leu

20 25 30

Val Leu Gly Lys Arg Met Glu Glu His Leu Arg Phe Ala Ala Cys Tyr

35 40 45

Trp His Thr Phe Cys Trp Asn Gly Ala Asp Met Phe Gly Val Gly Ala

50 55 60

Phe Asn Arg Pro Trp Gln Gln Pro Gly Glu Ala Leu Ala Leu Ala Lys

65 70 75 80

Arg Lys Ala Asp Val Ala Phe Glu Phe Phe His Lys Leu His Val Pro

85 90 95

Phe Tyr Cys Phe His Asp Val Asp Val Ser Pro Glu Gly Ala Ser Leu

100 105 110

Lys Glu Tyr Ile Asn Asn Phe Ala Gln Met Val Asp Val Leu Ala Gly

115 120 125

Lys Gln Glu Glu Ser Gly Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Cys

130 135 140

Phe Thr Asn Pro Arg Tyr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Asn Pro Asp Pro

145 150 155 160

Glu Val Phe Ser Trp Ala Ala Thr Gln Val Val Thr Ala Met Glu Ala

165 170 175

Thr His Lys Leu Gly Gly Glu Asn Tyr Val Leu Trp Gly Gly Arg Glu

180 185 190

Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Leu Arg Gln Glu Arg Glu Gln

195 200 205

Leu Gly Arg Phe Met Gln Met Val Val Glu His Lys His Lys Ile Gly

210 215 220

Phe Gln Gly Thr Leu Leu Ile Glu Pro Lys Pro Gln Glu Pro Thr Lys

225 230 235 240

His Gln Tyr Asp Tyr Asp Ala Ala Thr Val Tyr Gly Phe Leu Lys Gln

245 250 255

Phe Gly Leu Glu Lys Glu Ile Lys Leu Asn Ile Glu Ala Asn His Ala

260 265 270

Thr Leu Ala Gly His Ser Phe His His Glu Ile Ala Thr Ala Ile Ala

275 280 285

Leu Gly Leu Phe Gly Ser Val Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala Gln Leu

290 295 300

Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Asn Ser Val Glu Glu Asn Ala Leu

305 310 315 320

Val Met Tyr Glu Ile Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Thr Gly Gly Leu

325 330 335

Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Gln Ser Thr Asp Lys Tyr Asp Leu

340 345 350

Phe Tyr Gly His Ile Gly Ala Met Asp Thr Met Ala Leu Ala Leu Lys

355 360 365

Ile Ala Ala Arg Met Ile Glu Asp Gly Glu Leu Asp Lys Arg Ile Ala

370 375 380

Gln Arg Tyr Ser Gly Trp Asn Ser Glu Leu Gly Gln Gln Ile Leu Lys

385 390 395 400

Gly Gln Met Ser Leu Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ala Gln Glu His His

405 410 415

Leu Ser Pro Val His Gln Ser Gly Arg Gln Glu Gln Leu Glu Asn Leu

420 425 430

Val Asn His Tyr Leu Phe Asp Lys

435 440

<210> 4

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Tyr Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Val Lys Val Ile Leu

1 5 10 15

Leu Asn Glu Gln Gly Glu Val Val Ala Ala Gln Thr Glu Lys Leu Thr

20 25 30

Val Ser Arg Pro His Pro Leu Trp Ser Glu Gln Asp Pro Glu Gln Trp

35 40 45

Trp Gln Ala Thr Asp Arg Ala Met Lys Ala Leu Gly Asp Gln His Ser

50 55 60

Leu Gln Asp Val Lys Ala Leu Gly Ile Ala Gly Gln Met His Gly Ala

65 70 75 80

Thr Leu Leu Asp Ala Gln Gln Arg Val Leu Arg Pro Ala Ile Leu Trp

85 90 95

Asn Asp Gly Arg Cys Ala Gln Glu Cys Thr Leu Leu Glu Ala Arg Val

100 105 110

Pro Gln Ser Arg Val Ile Thr Gly Asn Leu Met Met Pro Gly Phe Thr

115 120 125

Ala Pro Lys Leu Leu Trp Val Gln Arg His Glu Pro Glu Ile Phe Arg

130 135 140

Gln Ile Asp Lys Val Leu Leu Pro Lys Asp Tyr Leu Arg Leu Arg Met

145 150 155 160

Thr Gly Glu Phe Ala Ser Asp Met Ser Asp Ala Ala Gly Thr Met Trp

165 170 175

Leu Asp Val Ala Lys Arg Asp Trp Ser Asp Val Met Leu Gln Ala Cys

180 185 190

Asp Leu Ser Arg Asp Gln Met Pro Ala Leu Tyr Glu Gly Ser Glu Ile

195 200 205

Thr Gly Ala Leu Leu Pro Glu Val Ala Lys Ala Trp Gly Met Ala Thr

210 215 220

Val Pro Val Val Ala Gly Gly Gly Asp Asn Ala Ala Gly Ala Val Gly

225 230 235 240

Val Gly Met Val Asp Ala Asn Gln Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Ser

245 250 255

Gly Val Tyr Phe Ala Val Ser Glu Gly Phe Leu Ser Lys Pro Glu Ser

260 265 270

Ala Val His Ser Phe Cys His Ala Leu Pro Gln Arg Trp His Leu Met

275 280 285

Ser Val Met Leu Ser Ala Ala Ser Cys Leu Asp Trp Ala Ala Lys Leu

290 295 300

Thr Gly Leu Ser Asn Val Pro Ala Leu Ile Ala Ala Ala Gln Gln Ala

305 310 315 320

Asp Glu Ser Ala Glu Pro Val Trp Phe Leu Pro Tyr Leu Ser Gly Glu

325 330 335

Arg Thr Pro His Asn Asn Pro Gln Ala Lys Gly Val Phe Phe Gly Leu

340 345 350

Thr His Gln His Gly Pro Asn Glu Leu Ala Arg Ala Val Leu Glu Gly

355 360 365

Val Gly Tyr Ala Leu Ala Asp Gly Met Asp Val Val His Ala Cys Gly

370 375 380

Ile Lys Pro Gln Ser Val Thr Leu Ile Gly Gly Gly Ala Arg Ser Glu

385 390 395 400

Tyr Trp Arg Gln Met Leu Ala Asp Ile Ser Gly Gln Gln Leu Asp Tyr

405 410 415

Arg Thr Gly Gly Asp Val Gly Pro Ala Leu Gly Ala Ala Arg Leu Ala

420 425 430

Gln Ile Ala Ala Asn Pro Glu Lys Ser Leu Ile Glu Leu Leu Pro Gln

435 440 445

Leu Pro Leu Glu Gln Ser His Leu Pro Asp Ala Gln Arg Tyr Ala Ala

450 455 460

Tyr Gln Pro Arg Arg Glu Thr Phe Arg Arg Leu Tyr Gln Gln Leu Leu

465 470 475 480

Pro Leu Met Ala

<210> 5

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagcacct taggtcatca atacgataac tcactggttt ccaatgcctt tggtttttta 60

cgcctgccga tgaacttcca gccgtatgac agcgatgcag actgggtgat tactggcgtg 120

ccgttcgata tggccacttc tggtcgtgcg ggtggtcgcc acggtccggc agcgatccgt 180

caggtttcga cgaatctggc ctgggaacac aaccgcttcc cgtggaattt cgacatgcgt 240

gagcgtctga acgtcgtgga ctgcggcgat ctggtatatg cctttggcga tgcccgtgag 300

atgagcgaaa agctgcaggc gcacgccgag aagctgctgg ctgccggtaa gcgtatgctc 360

tctttcggtg gtgaccactt tgttacgctg ccgctgctgc gtgctcatgc gaagcatttc 420

ggcaaaatgg cgctggtaca ctttgacgcc cacaccgata cctatgcgaa cggttgtgaa 480

tttgaccacg gcactatgtt ctataccgcg ccgaaagaag gtctgatcga cccgaatcat 540

tccgtgcaga ttggtattcg taccgagttt gataaagaca acggctttac cgtgctggac 600

gcctgccagg tgaacgatcg cagcgtggat gacgttatcg cccaagtgaa acagattgtg 660

ggtgatatgc cggtttacct gacttttgat atcgactgcc tggatcctgc ttttgcacca 720

ggcaccggta cgccagtgat tggcggcctg acctccgatc gcgctattaa actggtacgc 780

ggcctgaaag atctcaacat tgttgggatg gacgtagtgg aagtggctcc ggcatacgat 840

cagtcggaaa tcactgctct ggcagcggca acgctggcgc tggaaatgct gtatattcag 900

gcggcgaaaa agggcgagta a 921

<210> 6

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60

ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggtaagcg tatggaagag 120

cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct ggaacggggc ggatatgttt 180

ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240

cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300

cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360

caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420

acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480

gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540

ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt acgaaacgct gttaaatacc 600

gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc agatggtggt tgagcataaa 660

cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga aaccgcaaga accgaccaaa 720

catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc tgaaacagtt tggtctggaa 780

aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc tggcaggtca ctctttccat 840

catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt ctgtcgacgc caaccgtggc 900

gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca gtgtggaaga gaatgcgctg 960

gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg gtggtctgaa cttcgatgcc 1020

aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt acggtcatat cggcgcgatg 1080

gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga ttgaagatgg cgagctggat 1140

aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat tgggccagca aatcctgaaa 1200

ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg aacatcattt gtctccggtg 1260

catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa accattatct gttcgacaaa 1320

taa 1323

<210> 7

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtatatcg ggatagatct tggcacctcg ggcgtaaaag ttattttgct caacgagcag 60

ggtgaggtgg ttgctgcgca aacggaaaag ctgaccgttt cgcgcccgca tccactctgg 120

tcggaacaag acccggaaca gtggtggcag gcaactgatc gcgcaatgaa agctctgggc 180

gatcagcatt ctctgcagga cgttaaagca ttgggtattg ccggccagat gcacggagca 240

accttgctgg atgctcagca acgggtgtta cgccctgcca ttttgtggaa cgacgggcgc 300

tgtgcgcaag agtgcacttt gctggaagcg cgagttccgc aatcgcgggt gattaccggc 360

aacctgatga tgcccggatt tactgcgcct aaattgctat gggttcagcg gcatgagccg 420

gagatattcc gtcaaatcga caaagtatta ttaccgaaag attacttgcg tctgcgtatg 480

acgggggagt ttgccagcga tatgtctgac gcagctggca ccatgtggct ggatgtcgca 540

aagcgtgact ggagtgacgt catgctgcag gcttgcgact tatctcgtga ccagatgccc 600

gcattatacg aaggcagcga aattactggt gctttgttac ctgaagttgc gaaagcgtgg 660

ggtatggcga cggtgccagt tgtcgcaggc ggtggcgaca atgcagctgg tgcagttggt 720

gtgggaatgg ttgatgctaa tcaggcaatg ttatcgctgg ggacgtcggg ggtctatttt 780

gctgtcagcg aagggttctt aagcaagcca gaaagcgccg tacatagctt ttgccatgcg 840

ctaccgcaac gttggcattt aatgtctgtg atgctgagtg cagcgtcgtg tctggattgg 900

gccgcgaaat taaccggcct gagcaatgtc ccagctttaa tcgctgcagc tcaacaggct 960

gatgaaagtg ccgagccagt ttggtttctg ccttatcttt ccggcgagcg tacgccacac 1020

aataatcccc aggcgaaggg ggttttcttt ggtttgactc atcaacatgg ccccaatgaa 1080

ctggcgcgag cagtgctgga aggcgtgggt tatgcgctgg cagatggcat ggatgtcgtg 1140

catgcctgcg gtattaaacc gcaaagtgtt acgttgattg ggggcggggc gcgtagtgag 1200

tactggcgtc agatgctggc ggatatcagc ggtcagcagc tcgattaccg tacggggggg 1260

gatgtggggc cagcactggg cgcagcaagg ctggcgcaga tcgcggcgaa tccagagaaa 1320

tcgctcattg aattgttgcc gcaactaccg ttagaacagt cgcatctacc agatgcgcag 1380

cgttatgccg cttatcagcc acgacgagaa acgttccgtc gcctctatca gcaacttctg 1440

ccattaatgg cgtaa 1455

<210> 8

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgtcgtgtt cctttctgtt tccgagggag ttaatatttg aacccccggt tgttaacctg 60

atgtttactt tagtttactt cctatcaacc tacaagcagt ccaggtgaaa agtagtggga 120

ttgagccaac taatttcgat ccacccccac aaaatcctta aatcggcaca tgttatgcca 180

agccccgaaa acacataacc gcagctcagg gctacttaac ctgtctaaat agcaatctaa 240

gacaccttag ctaaacttag tgactggaat cacccccagg gtgtgaataa aacttgtttc 300

ttggtcattt cccctactga actgcgctta tgcctatgct tggaaaccag agacaagctt 360

aagaagg 367

Claims

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌以钝齿棒杆菌CGMCCNO.0890为表达宿主，以pEC-XK99E质粒和pXMJ19质粒为表达载体，过表达了精氨酸脱羧酶突变体、胍丁胺酶、木糖异构酶和木酮糖激酶；所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的精氨酸脱羧酶第533位的丙氨酸突变成脯氨酸得到的；

其中，所述重组钝齿棒杆菌采用pXMJ19质粒表达了精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶；采用pEC-XK99E质粒表达了木糖异构酶和木酮糖激酶。

2.如权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，所述木糖异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，所述木酮糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。

3.如权利要求1或2所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，编码所述胍丁胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，编码所述木糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，编码所述木酮糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。

4.一种制备1,4-丁二胺的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～3任一所述的重组钝齿棒杆菌的种子液接种至发酵培养基中发酵制备得到。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：碳源100～150g·L^-1，(NH₄)₂SO₄ 30～40g·L^-1，酵母粉10～20g·L^-1，KH₂PO₄ 1.5g·L^-1，KCl 1.0g·L^-1，MgS0₄·7H₂O 0.5g·L^-1，MnS0₄·H₂O 0.02g·L^-1，FeS0₄·7H₂O 0.02g·L^-1，CaCO₃ 20g·L^-1；其中，所述碳源为木糖、木糖水解液或者木糖与葡萄糖的混糖。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述木糖水解液包括：5-羟甲基糠醛0.01g·L^-1，糠醛0.04g·L^-1，甲酸0.07g·L^-1，乙酸1.3g·L^-1，木糖37.5～93.75g·L^-1，葡萄糖112.5～56.25g·L^-1。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混糖中，葡萄糖、木糖按照质量比为(1：1)～(3：5)比例进行混合。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将重组钝齿棒杆菌的种子液按照体积比为10％～20％的比例添加至发酵培养基中发酵制备1,4-丁二胺。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：在28～32℃，180～250rpm条件下发酵培养72～96h。

10.权利要求1～3任一所述的重组钝齿棒杆菌或权利要求4～9任一所述的方法在制备含有1,4-丁二胺的产品中的应用。