KR20070021732A - 푸마레이트 하이드라타제 ｃ를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 - Google Patents

푸마레이트 하이드라타제 ｃ를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C를 코딩하는 신규 유전자 및 이를 이용한 숙신산 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 사과산을 푸마르산으로 전환하는 효소인 푸마레이트 하이드라타제 C, 이를 코딩하는 신규 유전자(fumC), 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 숙신산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
맨하이미아, 푸마레이트 하이드라타제, 숙신산, 사과산

Description

푸마레이트 하이드라타제 Ｃ를 코딩하는 신규 유전자 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법{Novel Gene Encoding Fumarate Hydratase C and Method for Preparing Succinic Acid Using the Same}
도 1은 개량된 맨하이미아 균주에서 숙신산이 합성되는 경로를 나타내는 모식도이다.
도 2는 재조합 플라스미드 pMEfumC의 유전자 지도이다.
도 3은 재조합 플라스미드 pMEfumC를 함유하는 재조합 맨하이미아 LPK7pMEfumC의 단백질 발현을 보여주는 SDS-PAGE 사진이다.
본 발명은 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C를 코딩하는 신규 유전자 및 이를 이용한 숙신산 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 사과산(malic acid; malate)을 푸마르산(fumaric acid; fumarate)으로 전환하는 효소인 푸마레이트 하이드라타제 C, 이를 코딩하는 신규 유전자(fumC), 상기 유전자를 함 유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 숙신산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
숙신산은 호박수지(amber resin)로부터 분리된 4개의 탄소로 이루어진 다이카르복실산의 하나(HOOCCH2CH2COOH)로서 산업적인 용도가 매우 다양하다 (Zeikus et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 51: 545, 1999). 특히 최근 생분해성 고분자의 주요 원료물질로서 숙신산의 사용가능성이 증명됨에 따라 급격한 수요 증대가 예상되고 있다 (Willke et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 66:131, 2004).
숙신산은 화학적 합성 및 발효에 의하여 생산할 수 있다. 현재 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 BASF, DuPont 그리고 BP Chemicals 등 화학회사들에 의하여 LNG 혹은 원유에서 유래한 n-부탄(butane)과 아세틸렌(acetylene)으로부터 생산되고 있다. 숙신산의 화학적 합성법은 제조시에 다량의 유해성 폐기물, 폐용액 및 폐가스(일산화탄소 포함)를 배출한다는 문제점을 가지고 있으며, 특히 화석원료를 기초물질로서 사용한다는 한계를 가지고 있다. 의약품 등 특수한 용도로 사용되어지는 소량의 숙신산만이 고전적인 미생물 발효법에 의하여 생산되고 있다.
상기에서 기술한 화학적 숙신산 합성공정에 따른 문제점들을 해결하기 위하여 발효법에 의한 숙신산 생산 연구가 많은 연구자들에 의해 수행되어 왔다. 발효에 의한 숙신산 생산 방법은 미생물을 이용하여 재생 가능한 원료로부터 숙신산을 생산하는 방법이다. 숙신산 생산에 사용되어지는 균주는 크게 재조합 대장균(recombinant E. coli)과 루멘 박테리아(ruminal bacteria: Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio 등)로 나눌 수 있다.
시카고 대학 연구팀은 대장균의 젖산(lactic acid) 및 포름산(formic acid) 생산에 관여하는 유전자들(ldh, pfl)을 제거함과 동시에 글루코스 전달시스템 유전자(ptsG)를 조작한 변이균주인 AFP111 (ATCC No. 202021)을 제작하여 숙신산 생산 증가를 시도하였다 (미국특허 5,770,435).
루멘 박테리아 중에서는 Actinobacillus, Anaerobiospirillum, 및 Mannheimia 균주에 대하여 상대적으로 많은 연구가 진행되어 왔다. Michigan Biotechnology Institute(MBI)는 Actinobacillus succinogenes 130Z 균주 (ATCC No. 55618) 및 이를 이용한 고농도의 숙신산 생산 공정을 개발하였다 (미국특허 5,504,004). 또한 이들 연구 그룹은 Anaerobiospirillum succiniciproducens 및 변이균주들을 개발하고 숙신산 생산과 정제공정을 개발하였다 (미국특허 5,521,075; 미국특허 5,168,055; 미국특허 5,143,834).
하지만 상기에서 기술한 균주들을 이용한 숙신산 제조공정은 생산성이 낮고, 숙신산 이외의 부산물이 다량 생성되어 막대한 분리 및 정제 비용을 필요로 한다. 따라서 높은 생산성을 가지면서, 동시에 부산물의 생산을 억제할 수 있는 균주 시스템의 개발이 절실히 요구되어 왔다 (Hong et al., Biotechnol . Lett ., 22:871, 2000).
이를 위해서는 우수한 숙신산 생성 균주의 동정, 유전 정보(genome sequence)의 확보 및 이를 기초로 한 균주의 대사 특성 파악이 선행되어야 한다. 또한 이를 바탕으로, 신규 균주의 유전자 재조합 균주제작에 필요한 유전자 조작 기술의 확보가 필요하다. 비록, Anaerobiospirillum succiniciproducens의phosphoenolpyruvate carboxykinase (pckA) 유전자를 이용한 숙신산의 생산증대가 시도되었으나(Laivenieks et al., Appl . Environ. Microbiol ., 63:2273, 1997), full genome sequence를 바탕으로 한 유전자 재조합 균주의 개발이 시도된 적이 없다.
한편, 본 발명자들은 한우로부터 다양한 기질을 이용하여 숙신산을 고효율로 생산하는 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 균주를 동정하여, 이의 full genome sequence를 발표하였다 (Hong et al., Nature Biotechnol ., 22:1275, 2004). 특히 상기 균주는 숙신산 합성시 이산화탄소를 고정화하는 특징을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 출원인은 루멘 박테리아의 일종인 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E에서 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)를 결실시켜 변이균주인 Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)를 제작하고, 상기 LPK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나제 유전자(ackA) 및 포스포피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)를 각각 결실시켜 변이균주들(Mannheimia sp. LPK7 및 LPK4)을 제작한 다음, 이를 혐기적 조건에서 배양하여 고수율로 숙신산을 제조한 바 있다 (WO 05/052135 A1). 그러나, 상기 변이균주의 경우, 배양시 부산물로 생성되는 사과산의 농도가 높다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 숙신산 합성경로(도 1)를 토대로 사과산의 생성을 최소 화하고, 높은 수율로 숙신산을 제조할 수 있는 미생물을 개발하기 위하여 숙신산 대사에 관여하는 핵심 유전자를 규명하고자 노력한 결과, 상기 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 (Mannheimia succiniciproducens) MBEL55E 유래의 푸마레이트 하이드라타제 C를 코딩하는 유전자(fumC)를 클로닝하고, 그 기능을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 숙신산 생산에 관여하는 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 (Mannheimia succiniciproducens) MBEL55E 유래의 푸마레이트 하이드라타제 C를 코딩하는 신규 유전자(fumC)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 미생물을 이용한 숙신산의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고, 사과산을 푸마르산으로 전환하는 활성을 가지는 푸마레이트 하이드라타제 (fumarate hydratase) C 및 이를 코딩하는 유전자(fumC)를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 fumC 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 fumC 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 pMVDfumC, pMV19fumC, 또는pMEfumC인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한 상기 숙주세포는 숙신산 생성 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다. 숙신산 생성 미생물은 맨하이미아 속 미생물, 바람직하게는, 아세트산 생성회로, 젖산 생성회로, 포름산 생성회로, 에탄올 생성회로 및 옥살로아세트산 생성회로로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 회로가 차단된 맨하이미아 속 미생물, 더욱 바람직하게는, 맨하이미아 sp. LPK(KCTC 10558BP), LPK4 또는 LPK7인 것을 특징으로 할 수 있다.
도 1의 숙신산 합성경로에 나타난 바와 같이, fumC는 말레이트를 푸마레이트로 전환시킬 수 있어, fumC 유전자를 overexpression시킬 경우, fumarate 및 숙신산의 생성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 부산물인 사과산의 생성을 최소화 할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법을 제공한다. 재조합 미생물의 배양 및 숙신산의 수득 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 숙신산의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C 존재하에 사과산을 푸마레이트로 전환시키는 것을 특징으로 하는 푸마레이트의 제조방 법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 푸마레이트 하이드라타제 (fumarate hydratase)는 일반적으로 사용되는 푸마라제(fumarase)로 명명되며, 이와 동일한 기능을 가지는 효소이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 특정 발현벡터와 숙신산 생성 미생물로 맨하이미아 속 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 발현벡터와 숙주세포를 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 맨하이미아 /대장균 셔틀벡터 pME 의 제조
맨하이미아로부터 분리 보고된 pMVSCS1 (Kehrenberg et al., J. Antimicrob . Chemother., 49:383, 2002)과 대장균 발현벡터 pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech)으로부터 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME를 제조하였다. 먼저 pKK223-3을 BamHI과 AccI으로 부분 제한(partial digestion)하여 pBR322 ori와 암피실린 내성유전자를 포함하는 2.7kb 단편을 회수한 다음, T4 DNA polymerase를 이용하여 단일가닥 부분을 채워 blunt end로 만든 후, 접합하여 pKKD (2.7kb)를 제조하였다. pMVSCS1 (5.6kb)을 XhoII로 제한한 후, BamHI 제한효소자리를 제한한 pKKD와 접합하여 퓨전 벡터 pMVD (8.3kb)를 제조하였다. 다시 pMVD를 NcoI으로 제한한 다음, 5.9kb 단편을 회수하고 재접합하여 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME를 제작하였다.
실시예 2: 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 유래의 신규 유전자( fum C )의 동정 및 fum C 유전자가 도입된 재조합 플라스미드의 제조
서열번호 3의 염기서열을 가지는 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E(KCTC 0769BP)의 푸마레이트 하이드라타제 C를 코드하는 fumC 유전자를 프로모터와 전사종료 서열을 포함하여 클로닝하였다. 먼저, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E의 염색체를 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 표 1과 같은 조건으로 PCR을 수행한 다음, 수득된 fumC 유전자를 제한효소 BamHI로 절단하고, 맨하이미아/대장균 셔틀벡터 pME의 ClaI과 BamHI 제한효소자리를 제한하여 T4 DNA polymerase로 끝부분을 각각 채운 후 접합하여 플라스미드 pMEfumC를 제작하였다 (도 2). 이로써 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E 유래의 푸마레이트 하이드라타제 C를 코딩하는 유전자(fumC)가 클로닝되었다.
fumC 유전자 증폭 조건
유전자 프라이머 프라이머에 포함된 제한 효소 자리 반응 조건
fumC fumC-F(서열번호 1), fumC-R(서열번호 2) BamHI Cycle I: 94℃, 5 min Cycle II: (30 cycles) 94℃, 40 sec 65℃, 30 sec 72℃, 3 min Cycle III: 72℃, 5 min Cycle IV: 4℃, forever
상기에서 클로닝된 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E의 fumC 유전자의 염기서열을 분석하고, 푸마레이트 하이드라타제 C의 아미노산 서열을 추정하였다. 그 결과, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E의 fumC 유전자는 1,395bp(서열번호 3)의 염기를 가지고 있었고, 푸마레이트 하이드라타제 C는 465 아미노산 잔기(서열번호 4)로 구성되어 있었다.
맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E의 fumC 염기서열의 상동성 분석 결과, Haemophilus influenza 86-028NP의 fumC와 가장 높은 82% (score:565)의 상동성을 보였으며, Haemophilus influenza Rd KW20의 fumC와 81% (score:535), Pasteurella multocida subsp. multocida Pm70의 fumC와 82% (score:375)의 상동성을 나타내었다. 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E fumC 유전자의 G+C 양은 43.8%로, Haemophilus influenza 86-028NP fumC 39.1% 및 Pasteurella multocida Pm70 fumC 유전자의 40.9%에 비하여 약간 높은 것으로 밝혀졌다.
한편, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E fumC 유전자의 아미노산 코돈 사용빈도를 조사한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 일반적으로 알려진 대장균의 사용빈도와는 차이를 보였다. 예를 들면, 리신(lysine) 코돈의 사용빈도는 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E fumC 유전자는 AAA가 100% 사용되었으나, 일반적으로 알려진 대장균은 각각 AAA가 76% 및 AAG가 24%의 빈도로 사용되었다. 글루탐산(glutamate) 코돈의 사용빈도는, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E fumC 유전자는 GAA가 96% 사용되었으나, 대장균은 GAA가 96% 그리고 GAG가 30%의 빈도로 사용되었다. 또한 글루타민(glutamine) 코돈의 사용빈도는, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E fumC 유전자는 CAA 84% 및 CAG 16%의 빈도로 사용되었으나, 대장균은 CAA 31% 및 CAG 69%의 빈도로 사용되었다.
Figure 112005045753429-PAT00001
실시예 3: 형질전환된 맨하이미아를 이용한 숙신산 생산
상기 실시예 2에서 제작된 재조합 플라스미드 pMEfumC를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 맨하이미아 LPK7(KCTC 10626BP)에 도입하여 LPK7pMEfumC를 제조하였다. 또한, pME를 맨하이미아 LPK7(KCTC 10626BP)에 도입하여 LPK7pME를 제조하였다.
그리고, 상기 제조된 재조합 균주를 9 g/L 포도당(glucose)을 포함한 10 ml의 복합배지에 접종하여 혐기조건으로 39℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이를 다시 9 g/L의 포도당을 포함한 250 ml의 복합배지에 옮겨 39℃에서 배양하였다. 이때, 항생제로 100 μg/L 암피실린을 첨가하였다. 발효는 250 ml의 맨하이미아 배양액을 2.5 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 20 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.8, 배양 온도 39℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 암모니아수를 사용하였으며, 항생제 암피실린의 농도는 상기의 경우와 같다. 상기 재조합 맨하이미아 각각에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 숙신산 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다 (표 3).
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 재조합 맨하이미아 LPK7에 MBEL55E의 fumC 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pMEfumC를 도입한 경우, 말레이트의 축적이 감소하였다. 이 결과로부터 MBEL55E의 fumC 유전자는 숙신산 생산경로의 여러 단계 중 말레이트의 푸마레이트 전환에 관여하는 효소를 코딩한다는 것을 확인할 수 있었다. 이때, 대조균 대비 말레이트의 감소율은 151%로 기존 연구에 비해 현저히 높았다.
형질전환된 맨하이미아 발효에서 말레이트의 농도
균주 플라스미드 발효 시간 (hrs.) 세포 농도 (OD600) 말레이트 농도 (g/L) 대조구 (LPK7pME)대비 말레이트 감소율 (%) 숙신산 농도 (g/L)
LPK7 pME 25 3.08 2.58 100 12.98
LPK7 pMEfumC 50 2.22 1.26 151 12.47
한편, SDS-PAGE 확인 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 재조합 플라스미드 pMEfumC로 형질전환된 재조합 맨하이미아 LPK7pMEfumC의 경우, pME로 형질전환된 재조합 맨하이미아 LPKpME(대조군)에 비해 푸마레이트 하이드라타제C의 발현이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 푸마레이트 하이드라타제 C의 활성 측정
상기 실시예 3에서 제조된 맨하이미아 LPK7pMEfumC의 배양액을 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 침전된 세포를 버퍼용액 (100 mM Tris-HCl (pH 7.0), 20 mM KCl, 5 mM MnSO4, 2 mM DTT, 0.1 mM EDTA)을 이용하여 2번 세척한 후, 동일한 버퍼에 세포를 현탁하여 초음파로 세포막을 파쇄하였다. 원심분리기를 이용하여 세포잔해를 제거하고 세포추출 상등액은 효소활성 측정에 이용하였다.
효소 활성은 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였으며, 반응버퍼 (0.1 M Hepes-KOH buffer (pH 8.0), 50 mM L-malate)를 1 cm 길이 셀에 분주한 후 최종 부피가 1 ml이 되도록 세포 추출물을 첨가함으로써 반응을 시작시켜 240 nm에서 푸마레이트의 생성을 측정하였다 (표 4).
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, LPKpMEfumC 세포추출물의 경우, LPK7pME 세포추출물 보다 푸마레이트 하이드라타제 C의 활성이 282% 증가되었다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 fumC는 사과산을 푸마르산으로 전환하는 효소인 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C를 코딩하는 유전자라는 것을 확인할 수 있었다.
형질전환된 맨하이미아를 이용한 효소활성 측정
균주 플라스미드 효소활성* (U) 효소활성 증가율 (%)
LPK7 pME 186.7 100
LPK7 pMEfumC 526.6 282
*효소활성은 1 mg 토탈 단백질에 포함된 푸마레이트 하이드라타제 C의 역가를 나타냄. 효소활성 단위 1.0 U은 37℃에서 1분 동안 1 nmole의 기질을 특정 산물로 전환시키는데 필요한 효소의 양으로 정의됨.
본 발명에 따른 푸마레이트 하이드라타제의 활성을 공지의 효소와 비교한 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 fumC 유전자로 형질전환된 맨하이미아의 푸마레이트 하이드라타제는 대장균 K12의 푸마레이트 하이드라타제(Gray et al., Biochim . Biophys . Acta, 117:33, 1966)에 비해 매우 높은 활성을 보였다.
형질전환된 맨하이미아와 대장균의 푸마레이트 하이드라타제 활성 비교
균주 효소활성 (U) 유전자 상동성 (%)
LPK7pMEfumC 526.7 62.5
E. coli K12 160
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C를 코딩하는 신규 유전자(fumC)를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 신규 유전자는 숙신산 생성시 부산물로 생산되는 사과산을 효율적으로 줄일 수 있는 재조합 미생물을 제조하는데 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C는 사과산으로부터 푸마레이트를 제조하는데 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 fumC 유전자는 중앙 대사회로(central metabolic pathways)의 조작시 적절한 대사경로와의 조합에 의해 다양한 대사산물의 생산성을 증진시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
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Claims (12)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 푸마레이트 하이드라타제 (fumarate hydratase) C를 코딩하는 유전자(fumC).
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 가지는 유전자.
  3. 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지고, 사과산을 푸마르산으로 전환하는 활성을 가지는 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C.
  4. 제1항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, pMEfumC인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제1항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구 성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 숙주세포는 숙신산 생성 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 숙신산 생성 미생물은 맨하이미아 속인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 숙신산 생성 미생물은 아세트산 생성회로, 젖산 생성회로, 포름산 생성회로, 에탄올 생성회로 및 옥살로아세트산 생성회로로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 회로가 차단된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 맨하이미아 sp. LPK, LPK4 및 LPK7로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제7항의 재조합 미생물을 배양한 다음, 상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법.
  12. 제3항의 푸마레이트 하이드라타제(fumarate hydratase) C 존재하에 사과산을 푸마레이트로 전환시키는 것을 특징으로 하는 푸마레이트의 제조방법.
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