CN111118077A - 一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法 - Google Patents
一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5‑戊二胺的方法，所述的方法为构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5‑戊二胺。与现有技术中直接以木糖为碳源，1,5‑戊二胺产量为8.82g/L，木糖与戊二胺的质量转化率为0.44g/g，本发明以玉米芯水解液作为碳源，1,5‑戊二胺产量为15.7g/L，水解液中的木糖与戊二胺的质量转化率为0.36g/g。玉米芯比木糖价格低廉，相同成本下使用玉米芯水解液替代木糖具有客观的经济效益，且利用废弃农作物对环境友好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法。
背景技术
1,5-戊二胺，即尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成。在农业上，其可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量；在医学上，其可作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上，将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料新型尼龙，被广泛应用于航空航天,汽车部件、机械零部件、电子电器、包装材料、胶粘剂及化妆品等领域。
目前生物法生产戊二胺主要集中于两条途径：一种是酶法生产戊二胺，即用赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞来催化L-赖氨酸生成戊二胺；另一种是选择合适的微生物，以葡萄糖为原料，直接发酵生产戊二胺。酶法生产戊二胺条件复杂，需要添加多种辅因子，难以投入大规模生产。利用微生物直接发酵生产戊二胺成本低廉，有利于大规模生产。目前利用生物法转化可再生资源或废弃资源来生产1,5-戊二胺具有污染小、环境友好、可持续发展等优点。木质纤维素原料充足而廉价，如果能将之利用，不仅改善了农作物废物燃烧对大气的环境污染，也提高了废弃物的经济价值，同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。玉米芯中含有丰富的半纤维素主要成分为木糖，将玉米芯经过酸处理水解能得到大量木糖。
目前1,5-戊二胺的发酵生产方面的研究主要集中在以葡萄糖等单糖为原料上，还未有利用大肠杆菌以木糖为单一碳源发酵生产戊二胺的技术，同时以利用废弃玉米芯中木糖为碳源大肠杆菌发酵生产戊二胺还未见报道。木糖相比于葡萄糖价格低廉，且在废弃农作物中储存量大，利用玉米芯中木糖生产戊二胺不仅能大大降低1,5-戊二胺的生产成本，还可以提高废弃农作物的利用率，对环境十分友好。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，打通了大肠杆菌中以木糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺的途径，利用玉米芯水解液中的木糖为碳源，降低了1,5-戊二胺的发酵成本。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，其包括如下步骤：构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5-戊二胺。
其中，所述的表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌中，木糖脱氢酶，Gene ID:7329904；赖氨酸脱羧酶，Gene ID:948643。
其中，所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
(1)构建重组质粒pCDFduet-CadA和重组质粒pTRC99a-xylb；
(2)构建大肠杆菌。
步骤(1)中，所述重组质粒pCDFduet-CadA的构建方法为将来源于大肠杆菌MG1655的赖氨酸脱羧酶的基因CadA，两端设计酶切位点NotIII和BglII，亚克隆到载体pCDFduet上，获得重组质粒pCDFduet-CadA。
步骤(1)中，所述重组质粒pTRC99a-xylb的构建方法为将来源于Caulobactercrescentus的木糖脱氢酶的基因xylb，两端设计酶切位点SacI和SalI，亚克隆到载体pTRC99a上，得到重组质粒pTRC99a-xylb；
步骤(2)中，重组大肠杆菌的构建方法为将重组质粒pCDFduet-CadA和pTRC99a-xylb通过氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主Ecoli.NT1003，得到表达木糖脱氢酶和赖氨酸脱羧酶的基因工程菌。
其中，所述的玉米芯水解液的制备方法为将玉米芯与稀硫酸混合后高温灭菌，再加入Ca(OH)2调节pH至7.0～7.5(优选7.2)，第一次过滤，向第一滤液中加入活性炭，加热，第二次过滤，所得第二滤液即为玉米芯水解液。
其中，稀硫酸的体积分数为0.5％～3％(优选1％)，玉米芯与稀硫酸的质量体积比为150～200g/L(优选180g/L)；所述的高温灭菌为110～130℃灭菌15～30min(优选121℃灭菌20min)；活性炭与第一滤液的质量体积比为10～20g/L(优选20g/L)；所述的加热为40～60℃下加热20～40min(优选50℃加热30min)。
其中，含有玉米芯水解液的发酵培养基中各组分的浓度为2g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，10g/L硫酸铵，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸亚铁32mg/L，硫酸锰32mg/L，硫酸铜77mg/L，硫酸锌86mg/L，维生素B160 mg/L，烟酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸钙10g/L；溶剂为玉米芯水解液，灭菌备用。
其中，种子液的制备方法为挑取单菌落，接入5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养7-10h。
其中，将基因工程菌制得的种子液按5％的体积比接种到含有玉米芯水解液的发酵培养基中。
其中，，所述的发酵为37℃下发酵32～40h(优选26h)，发酵至10h时，向发酵培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol/L。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明在大肠杆菌中构建了能够利用木糖作为单一碳源发酵生产1,5-戊二胺的途径，且所用木糖来自于玉米芯水解液，节约了生产成本，提高了1,5-戊二胺的产量，有应用于大规模生产的潜力。
(2)直接以木糖为碳源，1,5-戊二胺产量为8.82g/L，木糖与戊二胺的质量转化率为0.44g/g。以玉米芯水解液作为碳源，1,5-戊二胺产量为15.7g/L，水解液中的木糖与戊二胺的质量转化率为0.36g/g。玉米芯比木糖价格低廉，相同成本下使用玉米芯水解液替代木糖具有客观的经济效益，且利用废弃农作物对环境友好。
附图说明
图1为以木糖为唯一碳源一步发酵生产1,5-戊二胺的产量。
图2为利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产戊二胺的产量。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中如无特别说明，所用酶及质粒均为购买所得。
实施例1：构建重组大肠杆菌
(1)重组质粒pCDFduet-CadA的构建：将来源于大肠杆菌MG1655(购于武汉淼灵生物科技有限公司)的赖氨酸脱羧酶基因CadA，通过质粒小提试剂盒(TianGen)获取质粒，在酶切位点处酶切从而得到目的片段CadA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。核酸胶验证且证明为目的条带并通过胶回收试剂盒(TianGen)回收目的基因。将质粒pCDFduet进行酶切(酶切位点为Not III和Bgl II)，见表1；利用T4DNA连接酶将目的片段CadA与酶切好的质粒pCDFduet连接起来得到重组质粒pCDFduet-CadA，见表3，重组质粒的抗性为链霉，CadA的启动子为Trc，终止密码子为rrnB。
(2)重组质粒pTRC99a-xylb的构建：将来源于Caulobacter crescentus(购于武汉淼灵生物科技有限公司)的木糖脱氢酶基因xylb，通过质粒小提试剂盒(TianGen)获取质粒，在SacI和SalI酶切位点处酶切从而得到目的片段xylb，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。核酸胶验证且证明为目的条带并通过胶回收试剂盒(TianGen)回收目的基因。将质粒pTRC99a进行酶切(酶切位点为SacI和SalI)，见表2；利用T4DNA连接酶将目的片段xylb与酶切好的质粒pTRC99a连接起来得到重组质粒pTRC99a-xylb，见表4；重组质粒的抗性为氨苄，xylb的启动子为Trc，终止密码子为rrnB。
表1 pCDFduet的酶切体系和酶切条件
表2 pTRC99a的酶切体系和酶切条件
表3 CadA片段和pCDFduet片段的连接
表4 CadA片段和pCDFduet片段的连接
(3)重组大肠杆菌的构建：将重组质粒pCDFduet-CadA(10μL)和pTRC99a-xylb(10μL)与大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr(该菌株已公开于中国专利201310285525X中，保藏编号为CCTCCNO:M 2013239)感受态细胞(20μL)混合并置于冰上25-30min，然后热激42-45s，热激完成后于超净台中加入800μL的LB培养基，置于摇床上37℃培养1h。培养完成后离心机4000g离心4min，离心完成后吸去上清(700μL)，将剩余的100μL进行涂布(平板为LB，抗性为链霉，链霉素浓度为0.5mM)并置于30-37℃的培养箱中培养10-18h，得到重组大肠杆菌。
LB培养基的配方如下：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L氯化钠。。
实施例2：以木糖为唯一碳源一步发酵生产1,5-戊二胺
将实施例1得到的重组大肠杆菌在LB平板(链霉抗性)上划线活化，然后转接至摇瓶发酵培养基中，37℃、250rpm、pH7.0条件下发酵10h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续在37℃、250rpm、pH7.0条件下发酵26h，每隔4h取一次样，测定木糖余量及戊二胺产量。发酵36h后测得戊二胺浓度为8.82g/L，见图1。
其中，发酵培养基的配方如下：木糖20g/L，硫酸铵10g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸亚铁32mg/L，硫酸锰32mg/L，硫酸铜77mg/L，硫酸锌86mg/L，维生素B1 60mg/L，烟酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸钙10g/L。
实施例3利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产戊二胺
将玉米芯与2％(v/v)的硫酸按照200g/L混合后的悬浮水解液，在高压灭菌锅121℃灭菌20min。加入碱性试剂Ca(OH)2中和硫酸，加入Ca(OH)2的浓度等于相同硫酸浓度的摩尔数，再加入NaOH调节pH至7.2。最后用滤纸过滤掉玉米芯水解液预处理方法中的固体物质，再分别加入活性炭至玉米芯水解液中，活性炭的浓度为20g/L，50℃加热30分钟，再用滤纸过滤掉活性炭，得到澄清的玉米芯水解液。
得到的玉米芯水解液中木糖的浓度为44g/L，每升玉米芯水解液中加入2g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，10g/L硫酸铵，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸亚铁32mg/L，硫酸锰32mg/L，硫酸铜77mg/L，硫酸锌86mg/L，维生素B1 60mg/L，烟酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸钙10g/L，灭菌，作为发酵培养基。
重组菌种子液的制备方法为挑取单菌落，接入5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养7-10h。
以按5％的体积比的接种量接入重组菌种子液，37℃、250rpm、pH7.0条件下发酵10h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续在37℃、250rpm、pH7.0条件下发酵26h，戊二胺产量为15.7g/L，见图2。
检测结果：1,5-戊二胺检测方法为HPLC，检测条件为Agilgent 1260InfinitySystem；示差检测器；色谱柱：YMC Carotenoid色谱柱，250×4.6mmL.D.S-5μm(产品货号：CT99S05-2546WT)；流动相成分：50mL乙腈+5mL三氟乙酸加水定容到1L；流速：0.8mL/min；进样量：10μL，柱温：35℃。
将实施例2和实施例3的发酵产物按照上述方法检测，结果分别如图1和图2所示，在大肠杆菌中以20g/L木糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺，产量为8.82g/L，以玉米芯水解液中木糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺，产量为15.7g/L。
本发明提供了一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1644
<212> DNA
<213> 赖氨酸脱羧酶基因(CadA)
<400> 1
atgtatacag taggagatta cctgttagac cgattacacg agttgggaat tgaagaaatt 60
tttggagttc ctggtgacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc acgcgaagat 120
atgaaatgga ttggaaatgc taatgaatta aatgcttctt atatggctga tggttatgct 180
cgtactaaaa aagctgccgc atttctcacc acatttggag tcggcgaatt gagtgcgatc 240
aatggactgg caggaagtta tgccgaaaat ttaccagtag tagaaattgt tggttcacca 300
acttcaaaag tacaaaatga cggaaaattt gtccatcata cactagcaga tggtgatttt 360
aaacacttta tgaagatgca tgaacctgtt acagcagcgc ggactttact gacagcagaa 420
aatgccacat atgaaattga ccgagtactt tctcaattac taaaagaaag aaaaccagtc 480
tatattaact taccagtcga tgttgctgca gcaaaagcag agaagcctgc attatcttta 540
gaaaaagaaa gctctacaac aaatacaact gaacaagtga ttttgagtaa gattgaagaa 600
agtttgaaaa atgcccaaaa accagtagtg attgcaggac acgaagtaat tagttttggt 660
ttagaaaaaa cggtaactca gtttgtttca gaaacaaaac taccgattac gacactaaat 720
tttggtaaaa gtgctgttga tgaatctttg ccctcatttt taggaatata taacgggaaa 780
ctttcagaaa tcagtcttaa aaattttgtg gagtccgcag actttatcct aatgcttgga 840
gtgaagctta cggaccgctc aacaggtgca ttcacacatc atttagatga aaataaaatg 900
atttcactaa acatagatga aggaataatt ttcaataaag tggtagaaga ttttgatttt 960
agagcagtgg tttcttcttt atcagaatta aaaggaatag aatatgaagg acaatatatt 1020
gataagcaat atgaagaatt tattccatca agtgctccct tatcacaaga ccgtctatgg 1080
caggcagttg aaagtttgac tcaaagcaat gaaacaatcg ttgctgaaca aggaacctca 1140
ttttttggag cttcaacaat tttcttaaaa tcaaatagtc gttttattgg acaaccttta 1200
tggggttcta ttggatatac ttttccagcg gctttaggaa gccaaattgc ggataaagag 1260
agcagacacc ttttatttat tggtgatggt tcacttcaac ttaccgtaca agaattagga 1320
ctatcaatca gagaaaaact caatccaatt tgttttatca taaataatga tggttataca 1380
gttgaaagag aaatccacgg acctactcaa agttataacg acattccaat gtggaattac 1440
tcgaaattac cagaaacatt tggagcaaca gaagatcgtg tagtatcaaa aattgttaga 1500
acagagaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa gaagcccaag cagatgtcaa tagaatgtat 1560
tggatagaac tagttttgga aaaagaagat gcgccaaaat tactgaaaaa aatgggtaaa 1620
ttatttgctg agcaaaataa ataa 1644
<210> 2
<211> 744
<212> DNA
<213> 木糖脱氢酶基因(xylb)
<400> 2
atgtcttctg ctatctaccc gtctctgaaa ggtaaacgtg ttgttatcac cggtggtggt 60
tctggtatcg gtgctggtct gaccgctggt ttcgctcgtc agggtgctga agttatcttc 120
ctggacatcg ctgacgaaga ctctcgtgct ctggaagctg aactggctgg ttctccgatc 180
ccgccggttt acaaacgttg cgacctgatg aacctggaag ctatcaaagc tgttttcgct 240
gaaatcggtg acgttgacgt tctggttaac aacgctggta acgacgaccg tcacaaactg 300
gctgacgtta ccggtgctta ctgggacgaa cgtatcaacg ttaacctgcg tcacatgctg 360
ttctgcaccc aggctgttgc tccgggtatg aaaaaacgtg gtggtggtgc tgttatcaac 420
ttcggttcta tctcttggca cctgggtctg gaagacctgg ttctgtacga aaccgctaaa 480
gctggtatcg aaggtatgac ccgtgctctg gctcgtgaac tgggtccgga cgacatccgt 540
gttacctgcg ttgttccggg taacgttaaa accaaacgtc aggaaaaatg gtacaccccg 600
gaaggtgaag ctcagatcgt tgctgctcag tgcctgaaag gtcgtatcgt tccggaaaac 660
gttgctgctc tggttctgtt cctggcttct gacgacgctt ctctgtgcac cggtcacgaa 720
tactggatcg acgctggttg gcgt 744
Claims (10)
1.一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法为构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5-戊二胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
(1)构建重组质粒pCDFduet-CadA和重组质粒pTRC99a-xylb；
(2)构建大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pCDFduet-CadA的构建方法为将来源于大肠杆菌MG1655的赖氨酸脱羧酶的基因CadA，两端设计酶切位点NotIII和BglII，亚克隆到载体pCDFduet上，获得重组质粒pCDFduet-CadA。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pTRC99a-xylb的构建方法为将来源于Caulobacter crescentus的木糖脱氢酶的基因xylb，两端设计酶切位点SacI和SalI，亚克隆到载体pTRC99a上，得到重组质粒pTRC99a-xylb。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，重组大肠杆菌的构建方法为将重组质粒pCDFduet-CadA和pTRC99a-xylb通过氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主Ecoli.NT1003，得到表达木糖脱氢酶和赖氨酸脱羧酶的基因工程菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玉米芯水解液的制备方法为将玉米芯与稀硫酸混合后高温灭菌，再加入Ca(OH)2调节pH至7.0～7.5，第一次过滤，向第一滤液中加入活性炭，加热，第二次过滤，所得第二滤液即为玉米芯水解液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，稀硫酸的体积分数为0.5％～3％，玉米芯与稀硫酸的质量体积比为150～200g/L；所述的高温灭菌为110～130℃灭菌15～30min；活性炭与第一滤液的质量体积比为10～20g/L；所述的加热为40～60℃下加热20～40min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有玉米芯水解液的发酵培养基中各组分的浓度为2g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，10g/L硫酸铵，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸亚铁32mg/L，硫酸锰32mg/L，硫酸铜77mg/L，硫酸锌86mg/L，维生素B160mg/L，烟酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸钙10g/L；溶剂为玉米芯水解液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将基因工程菌制得的种子液按5％的体积比的接种量接种到含有玉米芯水解液的发酵培养基中。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵为37℃下发酵32～40h，发酵至10h时，向发酵培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol/L。
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| KENTA IMAO ET AL.: "1,5-Diaminopentane production from xylooligosaccharides using metabolically engineered Corynebacterium glutamicum displaying beta-xylosidase on the cell surface", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| MA WEICHAO ET AL.: "Advances in Cadaverine Bacterial Production and Its Applications", 《ENGINEERING》 * |
| NELE BUSCHKE等: "Metabolic engineering of corynebacterium glutamicum for production of 1,5-diaminopentane from hemicelluloses", 《BIOTECHNOLOGY JOURNAL》 * |
| QIAN ZG ET AL.: "Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine：A five carbon diamine", 《BIOTECHNOL BIOENG》 * |
| 姚嘉旻等: "稀酸水解玉米芯制备丁二酸", 《生物加工过程》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112795599A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-05-14 | 南京工业大学 | 一种利用玉米芯同步糖化发酵生产d-1,2,4-丁三醇的方法 |
| CN114774342A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-07-22 | 江南大学 | 一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4-丁二胺的方法 |
| CN114774342B (zh) * | 2022-05-17 | 2023-07-25 | 江南大学 | 一种利用木糖及含木糖水解液发酵生产1，4-丁二胺的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111118077B (zh) | 2022-03-29 |
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