CN101469318B - (r)-羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联促进(r)-苯基乙二醇的合成 - Google Patents
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Abstract
(R)-羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联促进(R)-苯基乙二醇的合成，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一株重组大肠杆菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh，保藏编号CCTCC NO：M208123；将(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶通过共表达方式进行偶联，利用培养后的重组菌株，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应，通过优化生物转化反应条件，产物(R)-苯基乙二醇光学纯度达到100％e.e.，产率为85.9％。本发明利用双酶偶联技术解决了高浓度底物条件下的辅酶再生循环的限制性问题，为高效、低成本制备(R)-苯基乙二醇提供了有效途径，为生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。
Description
技术领域
利用(R)-羰基还原酶基因与甲酸脱氢酶基因共表达的重组大肠杆菌，在高底物浓度下，高效制备(R)-苯基乙二醇，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
手性化合物在医药、农药、激素、食品添加剂等精细化工品的生产上得到了越来越广泛的应用，如光学纯苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。
氧化还原酶催化的不对称还原反应常用于手性化合物的制备，这类反应需要辅酶作为氢或电子的传递体，常用辅酶有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，NADH)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+，NADPH)。辅酶一般不太稳定，价格昂贵，且不能用一般的合成物质替代。生物催化的不对称还原反应中，辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。全细胞可以通过自身代谢为反应提供一定量的辅酶，但按照化学当量平衡，当底物浓度提高，反应所需的辅酶量增加时，辅酶的供给就成为主要的限制因素。
甲酸脱氢酶(FDH)被广泛应用于NADH的循环再生，它使甲酸氧化生成CO2，同时使氧化态辅酶NAD+还原为NADH。工业化应用的实例是Degussa公司利用亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化三甲基丙酮酸不对称还原合成L-叔亮氨酸，使用FDH再生辅酶NADH，该产物的转化率为74％。通过在Klebsiella.pneumoniae菌株中构建NADH再生系统使1，3-丙二醇的产量提高12.5％。利用Bakers’酵母不对称还原2-羟基苯乙酮得到(R)-苯基乙二醇，产物光学纯度92％，产率85％，但底物浓度只有0.6g/L。将嘧啶核苷转氢酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达来生产(R)-苯乙醇。由ω-转氨酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶组成的耦联体系用于转化生产(R)-苯乙醇。
本实验室已经利用(R)-专一性羰基还原酶的重组菌株催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇，在此基础上，从博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)克隆出甲酸脱氢酶基因fdh，同时根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(R)-专一性羰基还原酶基因rcr进行了密码子优化。然后利用两个基因在E.coli Rosetta宿主细胞中的共表达来实现两个酶的耦联。酶偶联的重组菌进行生物转化时，不仅不需要添加任何辅酶，而且菌体对底物的耐受性和转化效率均获得了明显提高。通过酶系偶联解决了辅酶限制性的问题，从而实现了重组菌在较高底物浓度下高效不对称转化制备(R)-苯基乙二醇。
发明内容
(1)要解决的技术问题：根据大肠杆菌的密码子偏好性，对近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)中的(R)-专一性羰基还原酶基因rcr进行密码子优化，将优化的rcr基因与博伊丁假丝酵母(C.boidinii)的甲酸脱氢酶基因fdh共表达，实现两个酶的偶联，利用酶偶联后的重组菌催化2-羟基苯乙酮高效制备具有光学活性的(R)-苯基乙二醇，解决催化反应中辅酶限制性的问题，大大促进酶的催化功能，提高菌体对底物的耐受性，因而显著提高催化效率。博伊丁假丝酵母(C.boidinii)巳在Biochem.J.(2001)354，455±463(Printed in Great Britain)公开。
(2)技术方案
一、基因组的获得
近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011(CN1477203A)和博伊丁假丝酵母(C.boidinii)的培养基组成为：葡萄糖4％，酵母膏0.5％，(NH4)2HPO41.3％，KH2PO40.7％，ZnSO4.7H2O0.03％，NaCl0.01％，pH7.0。
将两种酵母菌接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h。培养结束后，将菌体于6,000rpm，20min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System(VIOGENE公司)提取基因组。
二、rcr基因的密码子优化
合成两端引物
Rcr-F1:5’-ATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGACTTAAGTTGCGT-3’((Nde I)，
Rcr-F2:5’-GCATTGCGTGAAATTCGTATCTTG-3’
Rcr-R1:5’-CAAGATACGAATTTCACGCAATGC-3’
Rcr-R2:5’-TGACTCTCGAGCTATGGATTAAAAACAACACGACCTTCATAAGCATTGTTACGCAA-3’(Xho I)。采用SOE-PCR的方法，将突变位点引入。
具体方法如下：
上游和下游cDNA片段的获得：
以近平滑假丝酵母基因组为模板，分别以引物Rcr-F1和Rcr-R1，引物Rcr-F2和Rcr-R2进行PCR反应，PCR反应体系：ddH2O37μL，10×ReactionBuffer5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物Rcr-F1和Rcr-R1、或引物Rcr-F2和Rcr-R2(50pmol/μL)各1μL，基因组DNA5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。PCR反应：94℃预变性5min；94℃1min，52℃-62℃1min，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸10min。该基因组为模板PCR反应获得上游和下游cDNA片段。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
密码子优化后rcr全长基因的获得：
模板的获得：将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNA Polymerase延伸10min补成双链，用作下一轮PCR的模板。
PCR反应：用引物Rcr-F1和Rcr-R2按以下PCR扩增条件：94℃3min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min进行反应，即获得密码子优化后的rcr基因，全长为1008bp。利用3S Spin Agarose Gel DNAPurification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h。12,000rpm于4℃离心30min。加入75％乙醇500μL洗涤，12,000rpm于4℃离心30min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存。
三、fdh基因的获得：以博伊丁假丝酵母基因组为模板，以引物Fdh-F和Fdh-R进行PCR反应，获得fdh全长片段。合成两端引物：
Fdh-F:5’-CCACCGAATTCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(EcoRI)
Fdh-R:5’-TGACTGCGGCCGCTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Not I)。
PCR反应体系：ddH2O37μL，10×Reaction Buffer5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物Fdh-F和Fdh-R(50pmol/μL)各1μL，基因组DNA5μL，Taq DNApolymerase(5U/μL)0.5μL。
PCR反应：94℃预变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸10min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
四、含rcr和fdh基因的重组大肠杆菌的构建
基因rcr及质粒pETDuetTM-1(来源于Novagen公司)的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETDuetTM-1。
按照水、缓冲液、基因或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
反应体系组成：10×Buffer H4μL，DNA10μL，Nde I2μL，XhoI2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因rcr与质粒pETDuetTM-1的连接
反应体系组成如下：质粒pETDuetTM-10.8μL，基因rcr4.2μL，LigationSolution5μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌E.coli Top10
在每管的100μLE.coli Top10感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中冷却2min。每管中加入700μLLB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H2μL，DNA5μL，Nde I0.5μL，XhoI0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pETDuet-rcr。
基因fdh及质粒pETDuet-rcr的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETDuet-rcr。
按照水、缓冲液、基因fdh或质粒pETDuet-rcr、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段并浓缩。
反应体系组成：10×H Buffer4μL，DNA10μL，EcoRI2μL，NotI2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因fdh与质粒pETDuet-rcr的连接
基因fdh与质粒pETDuet-rcr连接反应体系：质粒pETDuet-rcr0.8μL，基因fdh4.2μL，Ligation Solution5μL，混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌E.coli Rosetta
在每管100μLE.coli Rosetta感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μLLB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid RapidIsolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H2μL，质粒DNA5μL，EcoR I0.5μL，NotI0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pETDuet-rcr-fdh和阳性克隆E.coliRosetta/pETDuet-rcr-fdh。
重组菌的诱导表达培养
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于10mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10mL培养液转接于1L含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养10h。
五、重组菌株催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇
利用重组大肠杆菌催化不对称还原反应。
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养10h。
培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集。在以下体系中进行检测：1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0～6.5)，或1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)或1mL0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，加入6g/L底物2-羟基苯乙酮和0～5mmol/L ZnCl，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(R)-苯基乙二醇对映过量值的计算：对映过量值(e.e.％)＝[(CR-CS)/(CR+CS)]×100％
产物(R)-苯基乙二醇产率的计算：产率(％)＝CR/C0×100％
式中CR为反应后(R)-对映体的浓度，CS为反应后(S)-对映体的浓度，C0为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。
以全细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(R)-苯基乙二醇。
(3)有益效果
成功改造了近平滑假丝酵母的(R)-专一性羰基还原酶(其编码基因GenBank登记号DQ675534)中的5个稀有密码子，该基因全长1008bp，编码336个氨基酸。成功从博伊丁假丝酵母基因组中克隆了fdh基因(GenBank登记号为AJ011046)。
将fdh和密码子优化后的rcr基因有序插入到表达载体pETDuetTM-1中，转化到密码子优化型菌株E.coli Rosetta，成功构建同时含有两个目的基因的重组菌株E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。
重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh全细胞催化转化底物2-羟基苯乙酮，获得高光学纯度和高产率的产物(R)-苯基乙二醇。通过优化反应条件，在pH7.0的磷酸缓冲液中，加入5mmol/L ZnCl，利用0.1g/mL重组细胞对6g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为85.9％。这些工作很好地解决了高底物浓度下辅酶的限制作用，为高效制备(R)-苯基乙二醇提供了有效途径，为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。
生物材料样品保藏
大肠杆菌Rosetta/pETDuet-rcr-fdh Escherichia coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh，保藏日期2008年8月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 208123。
具体实施方式
实施例1
近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011和博伊丁假丝酵母(C.boidinii)的菌体培养，其培养基组成为：葡萄糖4％，酵母膏0.5％，(NH4)2HPO41.3％，KH2PO40.7％，ZnSO4.7H2O 0.03％，NaCl 0.01％，pH7.0。
将两种酵母接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h。
实施例2
近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和博伊丁假丝酵母(C.boidinii)基因组的提取：将实施例1培养的菌体于6,000rpm，20min下离心，用生理盐水洗涤两次后，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System(VIOGENE公司)提取基因组。
实施例3
rcr基因的密码子优化引物设计：
Rcr-F1:5’-ATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGACTTAAGTTGCGT-3’(Nde I)，
Rcr-F2:5’-GCATTGCGTGAAATTCGTATCTTG-3’
Rcr-R1:5’-CAAGATACGAATTTCACGCAATGC-3’，
Rcr-R2:5’-TGACTCTCGAGCTATGGATTAAAAACAACACGACCTTCATAAGCATTGTTACGCAA-3’(Xho I)。突变点设计时分别将第61～63，829～831，838～840，970～972，991～993的CGA或AGA均突变为CGT。
实施例4
密码子优化后rcr基因的获得：采用PCR反应体系：ddH2O37μL，10×Reaction Buffer5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物(50pmol/μL)1μL，基因组DNA5μL，Taq DNApolymerase(5U/μL)0.5μL。PCR反应：94℃预变性5min；94℃1min，52℃-62℃1min，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸10min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，分别以引物Rcr-F1和Rcr-R1，引物Rcr-F2和Rcr-R2进行PCR反应，获得上游和下游cDNA片段。利用3S SpinAgarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
采用SOE-PCR的方法将突变位点引入，获得rcr密码子优化后的全长基因。先将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNAPolymerase延伸10min补成双链，作下一轮PCR的模板。通过以下PCR反应：用Rcr-F1和Rcr-R2作全长基因的引物，94℃3min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min，获得密码子优化后的rcr基因，其全长为1008bp。
实施例5
pETDuet-rcr重组质粒的获得：基因rcr及质粒pETDuetTM-1(pETDuetTM-1质粒来源于Novagen公司)的酶切反应体系：10×Buffer H4μL，DNA10μL，Nde I2μL，XhoI2μL，ddH2O将体系补足40μL。37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收并浓缩。采用以下连接反应体系：质粒pETDuetTM-10.8μL，基因rcr4.2μL，Ligation Solution5μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16h。
在每管100μLE.coli Rosetta感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴冷却2min。每管中加入700μLLB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid RapidIsolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H2μL，质粒DNA5μL，Nde I0.5μL，XhoI0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pETDuet-rcr。
实施例6
重组质粒pETDuet-rcr-fdh的获得：基因fdh和pETDuet-rcr酶切反应：10×Buffer H4μL，DNA10μL，EcoRI2μL，NotI2μL，ddH2O将体系补足40μL，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
将基因fdh与质粒pETDuet-rcr连接，反应为：质粒pETDuet-rcr0.8μL，基因fdh4.2μL，Ligation Solution5μL，。混合连接液10μL于16℃培养箱中连接12-16h。
按照实施例5中的细胞转化和阳性克隆选择方法，筛选获得阳性质粒pETDuet-rcr-fdh，挑选阳性克隆E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。
实施例7
重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh的培养：LB培养基组成成分为：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH7.0。培养时加入氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)。固体培养基添加1.5％琼脂粉。挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。保藏甘油菌，每管1mL，甘油含量为15％。次日取1mL培养液转接于75mL含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养3-4h，至OD600约为0.6～0.8，向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养10h。
实施例8
诱导表达：LB培养基组成同实施例7，挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。保藏甘油菌两支(每支含有1mL菌液，10％的甘油)，同时取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6～0.8。向培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷至1mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh10h。收集菌体，溶解于20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，超声破碎20min，工作时间2s，间歇时间6s。将破碎后的菌体16,000rpm，40min。分别取上清和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白表达。
实施例9
在1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.0)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为72.7％e.e.，产率为26.2％。
实施例10
在1mL0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.5)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为91.7％e.e.，产率为49.7％。
实施例11
在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为98.5％e.e.，产率为66.2％。
实施例12
在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为83.2％e.e.，产率为43.7％。
实施例13
在1mL0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为61.8％e.e.，产率为29.7％。
实施例14
在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，1mmol/L ZnCl，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为68.1％。
实施例15
在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，3mmol/L ZnCl，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为77.5％。
实施例16
在1mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，分别加入6g/L底物2-羟基苯乙酮，5mmol/L ZnCl，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度为100％e.e.，产率为85.9％。
Claims (9)
1.一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的双酶共表达重组菌，其分类命名为大肠杆菌Rosetta/pETDuet-rcr-fdh(Escherichia coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 208123。
2.利用权利要求1所述的双酶共表达重组菌不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，其特征是将(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶相偶联，利用培养后的重组菌株，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L pH6.0～6.5的醋酸缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 7.0～7.5的磷酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入1～5mmol/L ZnCl，细胞浓度为0.1g/mL，2-羟基苯乙酮底物浓度为6g/L，反应温度30℃，反应时间48h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌株的培养
LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体培养基添加1.5％琼脂粉；
培养条件：挑取重组菌株的单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养12h；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至OD600为0.6～0.8后，培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷至1mmol/L，30℃下诱导培养10h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌株的构建
将目的基因rcr和fdh有序插入表达载体pETDuetTM-1中，构建重组质粒pETDuet-rcr-fdh，重组质粒转化大肠杆菌E.coli Rosetta感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coliRosetta/pETDuet-rcr-fdh。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是重组质粒pETDuet-rcr-fdh的构建
利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ，对密码子优化后的rcr与载体pETDuetTM-1分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pETDuet-rcr；利用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对扩增得到的fdh基因与载体pETDuet-rcr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因片断的重组质粒pETDuet-rcr-fdh。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是rcr密码子优化基因的获得
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Nde Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的引物：含Nde Ⅰ的Rcr-F1，Rcr-F2，Rcr-R1，含Xho Ⅰ的Rcr-R2：
Rcr-F1：5’-ATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGACTTAAGTTGCGT-3’，
Rcr-F2：5’-GCATTGGTGAAATTCGTATCTTG-3’，
Rcr-R1：5’-CAAGATACGAATTTCACGCAATGC-3’，
Rcr-R2：5’-TGACTCTCGAGCTATGGATTAAAAACAACACGACCTTCATAAGCATTGTTACGCAA-3’，
采用SOE-PCR的方法，将突变位点引入，将第61～63，829～831，838～840，970～972，991～993的CGA或AGA均突变为CGT；步骤为：
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以近平滑假丝酵母基因组为模板，分别以引物Rcr-F1和Rcr-R1，引物Rcr-F2和Rcr-R2进行PCR反应；PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物Rcr-F1和Rcr-R1、或引物Rcr-F2和Rcr-R2各1μL，基因组DNA 5μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.5μL；
密码子优化后基因rcr全长的获得：PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min、52℃～62℃1min、72℃1min，进行25个循环；72℃延伸10min；
将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNAPolymerase延伸10min补成双链，作下一轮PCR的模板，通过PCR反应：用Rcr-F1和Rcr-R2作引物，94℃3min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环；72℃延伸10min，获得密码子优化后的rcr基因，全长为1008bp。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是用于获得密码子优化后rcr基因所需要提取的基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCCM203011。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征是fdh基因的获得
以博伊丁假丝酵母基因组为模板，利用含有EcoR Ⅰ限制性酶切位点的引物
Fdh-F：5’-CCACCGAATTCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’，
和含有Not Ⅰ限制性酶切位点的引物
Fdh-R：5’-TGACTGCGGCCGCTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’，通过PCR反应扩增fdh基因；PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物Fdh-F和Fdh-R各1μL，基因组DNA 5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；
PCR反应过程：94℃预变性5min；94℃1min、56℃1min、72℃1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是用于获得fdh基因所需要提取的基因组的菌种为博伊丁假丝酵母(C.boidinii)。
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