CN104774778A - 一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法 - Google Patents

一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法 Download PDF

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徐岩
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Abstract

一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一株近平滑假丝酵母重组菌Candida parapsilosis pCP-scrII，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2015107；本发明构建了外源蛋白在近平滑假丝酵母中的表达质粒，将(S)-羰基还原酶II整合到近平滑假丝酵母基因组，获得重组质粒pCP-scrII，电击转化近平滑假丝酵母，获得重组型近平滑假丝酵母菌株。通过优化生物转化反应条件，该重组菌催化转化2-羟基苯乙酮，获得产物(S)-苯基乙二醇，其光学纯度和产率均达到99.9%，为高效、低成本制备(S)-苯基乙二醇提供了有效途径，为生物催化手性醇的工业应用奠定了较坚实的基础。

Description

一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法
技术领域
一株近平滑假丝酵母重组菌高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，构建(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中的表达质粒，实现(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中的原位表达，高效制备(S)-苯基乙二醇的方法，本发明涉及基因工程手段构建(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母的重组菌，高效制备(S)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
手性化合物在医药、农药、激素、食品添加剂等精细化工领域应用广泛，如光学纯苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。
氧化还原酶催化的不对称还原反应常用于手性化合物的制备。目前常用的氧化还原酶大部分来源于重组大肠杆菌。然而在大肠杆菌中重组表达后的氧化还原酶功能由于缺乏后期的蛋白后修饰，催化转化手性化合物的效率不尽如人意。
本实验室前期已经利用(S)-羰基还原酶II的大肠杆菌重组菌催化不对称转化制备(S)-苯基乙二醇。(S)-羰基还原酶II在大肠杆菌中异源表达后，利用大肠杆菌全细胞不对称转化2-羟基苯乙酮，获得的(S)-苯基乙二醇的光学纯度和得率分别只有89.1%和82.6%。在此基础上，从近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)基因组中调取目的基因scrII，同时构建近平滑假丝酵母中的表达质粒pCP，在原有的(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中本底表达的水平上，通过同源重组将目的基因scrII整合入近平滑假丝酵母基因组，增强了(S)-羰基还原酶II的催化功能。通过优化生物转化反应条件，近平滑假丝酵母重组菌株催化底物2-羟基苯乙酮，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度和产率均达到99.9%。
发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明目的在于根据已经获得的近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) (S)-羰基还原酶II基因scrII (GenBank accession No.GQ411433)，通过将scrII整合入近平滑假丝酵母基因组，构建(S)-羰基还原酶II的近平滑假丝酵母重组菌株。利用该重组菌催化2-羟基苯乙酮高效制备具有光学活性的(S)-苯基乙二醇，该重组菌不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学活性(S)-苯基乙二醇，产物的光学纯度和产率高达99.9%，为利用新型重组酵母菌株高效制备手性化合物提供了有效途径。
（2）技术方案
一株不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的原位表达(S)-羰基还原酶II的近平滑假丝酵母重组菌，其分类命名为近平滑假丝酵母菌/(S)-羰基还原酶II（C parapsilosis pCP-scrII），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015107。
一、基因组的获得
野生型近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011生长培养基YPD组成质量百分为：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。将近平滑假丝酵母菌接种于培养基装液量为30% 的250 mL摇瓶中于28℃、200 r/min振荡培养16-18 h。培养结束后，将菌体于12,000 r/min离心5 min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞。利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Mini Preparation Kit（Takara公司）提取基因组。
二、scr II基因的调取
从近平滑假丝酵母中调取目的基因的同时，将目的基因中酶切位点Kpn I序列（GGTACC）同义突变为GGCACA。
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Sac I和Kpn I限制性酶切位点的引物SCRII_Sac I_F1和SCRII_Kpn I_R1，以及Kpn I突变点引物Mut_Kpn I_F2和Mut_Kpn I_R2：
合成两端引物：
SCRII_Sac I_F1: 5’-ttcgggagct catgcaccac caccaccacc acggcgaaat cgaatcttat t-3’ (Sac I)，
SCRII_Kpn I_R1: 5’-cggggtaccc tatggacaag tgtaaccacc a-3’(Kpn I)，
突变引物：
Mut_Kpn I_F2: 5’-atgtcgggca caattgttaa tgt-3’，
Mut_Kpn I_R2: 5’-acattaacaa ttgtgcccga cat-3’，
采用SOE-PCR的方法，将突变位点引入，将第523~525的GGT改为GGC，第526~528的ACC改为ACA，具体方法如下：
PCR反应体系：ddH2O 24.5 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，Mut_Kpn I_F2引物 5 μL，Mut_Kpn I_R2 引物5 μL，5×buffer 10 μL。
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以近平滑假丝酵母基因组为模板，分别以引物SCRII_Sac I_F1和Mut_Kpn I_R2，引物SCRII_Kpn I_R1和Mut_Kpn I_F2进行PCR反应，PCR 条件为：98℃热变性10 s； 98℃ 10 s，52℃ 15 s，72℃ 1 min。经过5-10个循环后，取出 PCR反应液，然后再加入引物SAT1_1 和URA3t_2 各 1 μL，再进行25个循环，最后72℃再延伸10 min，获得scrII，scrII基因全长为840 bp。
三、近平滑假丝酵母表达载体pCP的构建
质粒pCP包含以下几个元件：启动子基因MAL2p和ACT1p，终止子基因ACT1t和URA3t（同时作为下游同源臂）以及表达盒上游同源臂基因URA3p和抗性基因SAT1。
表达载体pCP是由pUC57为起始模板构建而来，表达质粒全长4.5 Kb，采用重叠延伸和酶切连接的方法构建：
载体pCP构建引物设计：
URA3p_1: 5’-ccggaattcg tattgcaaac aaacg-3’ (EcoR I)，
URA3p_2: 5’-cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca-3’ (Bgl II)，
MAL2p_1: 5’-gtcttcatac aagatctgaa tggatgcggg-3’ (Bgl II)，
MAL2p_2: 5’-attgacatga gctcccgcgg aatagttgta gta-3’ (Sac I)，
ACT1t_1: 5’-caccactagg gtaccgagtg aaattct-3’ (Kpn I)，
ACT1t_2: 5’-gtcttcctgc agattttatg atggaat-3’ (Pst I)，
ACT1p_1: 5’-aaaatctgca ggaagaccgt ccaac-3’ (Pst I)，
ACT1p_2: 5’-tttaagctta tctgcggccg caccgttatc gataactaaa-3’， (Not I)，
SAT1_1: 5’-cgataacggt gcggccgcat gaaaatttcg gtga-3’ (Not I)，
SAT1_2: 5’-gattaaatat tcggatcctt aggcgtcatc ct-3’ (BamH I)，
URA3t_1: 5’-gatgacgcct aaggatccga atatttaatc at-3’ (BamH I)，
URA3t_2: 5’-atcccaagct taacgatcaa gagaaa-3’ (Hind III)，
表达载体pCP全长4.5 Kb，采用重叠延伸和酶切连接的方法构建：
将act1p序列经TA克隆，连接到载体pMD19-T上，得到T-act1p质粒。使用引物SAT1_1和URA3t_2，以sat1和ura3t片段为模板，经过重叠延伸PCR扩增得到sat1-ura3t。
将T-act1p 质粒及sat1-ura3t片段分别用限制性内切酶Not I和Hind Ⅲ进行双酶切，经胶回收后，将sat1-ura3t片段连接到T-act1p质粒上，得到T-ASU质粒。
将T-ASU质粒及pUC57质粒分别用限制性内切酶Pst I和Hind Ⅲ进行双酶切，酶切片段经胶回收后，将act1p-sat1-ura3t片段连接到pUC57质粒上，得到pUC57-ASU质粒。
使用引物URA3p_1和MAL2p_2为引物，以ura3p和mal2p片段为模板，经过重叠延伸PCR扩增得到ura3p-mal2p。
将ura3p-mal2p片段及pUC57-ASU质粒分别用限制性内切酶EcoR I和SacI进行双酶切，经胶回收后，将ura3p-mal2p 片段连接到pUC57-ASU质粒上，得到pUC57-UMASU质粒。
将act1t片段及pUC57-UMASU质粒分别用限制性内切酶Kpn I和Pst I进行双酶切，经胶回收后，将act1t片段连接到pUC57-UMASU质粒上，得到大肠杆菌和近平滑假丝酵母中的穿梭表达载体pCP。
四、重组质粒pCP-scrII的构建
将目的基因scrII及表达载体pCP分别用限制性内切酶Sac I和Kpn I进行双酶切：
按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃金属浴1 h，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
酶切反应体系组成：10×QuickCut Buffer 5 μL，DNA 20 μL，Sac I 1.0 μL，Kpn I 1.0μL，ddH2O将体系补足50 μL，37℃水浴1 h，在管中加入1/10体积的10×QuickCut Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。
基因scrII与载体pCP的连接：
反应体系组成如下：载体pCP 1.5 μL，基因scrII7 μL， 10×Ligation buffer 1μL，T4 ligase 0.5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
重组质粒转化大肠杆菌（Escherich coli）JM109：
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却2 min。每管中加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 r/min摇床温育培养1 h。培养后菌液5000 r/min离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择：
挑取6个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L）中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5 μL，Sac I 0.5 μL，Kpn I0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。用Sac I和Kpn I进行双酶切验证，获得阳性质粒pCP-scrII。同时重组质粒pCP-scrII送至上海生工生物工程有限公司进行测序进一步确定。
五、含scrII基因的近平滑假丝酵母重组菌C parapsilosis pCP-scrII的构建
将带有Kpn I同义突变位点的目的基因scrII插入大肠杆菌和近平滑假丝酵母表达载体pCP中，构建重组质粒pCP-scrII，重组质粒pCP-scrII转化近平滑假丝酵母感受态细胞，通过含有40 μg/mL诺尔斯菌素的YPD平板筛选目的重组菌株C. parapsilosis pCP-scrII。
质粒pCP-scrII的单酶切：           
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）从E. coli JM109中提取质粒pCP-scrII。
按照水、缓冲液、基因或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心10 s使液体集中于管底，37℃水浴1 h，在管中加入1/10体积的10×QuickCut Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并过柱纯化。将纯化后的样品用真空干燥机浓缩至5 μL。
反应体系组成：10×QuickCut Buffer 5 μL，DNA 20 μL，QuickCut EcoR I1.5 μL，ddH2O将体系补足50 μL。
单酶切线性化质粒转化近平滑假丝酵母：
在每管的80 μL近平滑假丝酵母感受态细胞悬液中加入5-10 ng单酶切线性化产物，轻轻混匀后转入2 mm的电转杯中，冰上静置3 min。擦干水汽，置于电转仪上，选择酵母参数（电击参数：1500 V，200Ω，25 μF)，电转化。电击后立即加入1 mL冰浴的1 M 的山梨醇，转入1.5 mL离心管中，30℃，静置培养2 h。然后将培养液于5,000 r/min离心5 min，弃上清400 μL。重悬细胞后，涂布于含有40 μg/mL诺尔斯菌素的YPD筛选平板，于30℃培养箱倒置2 d。
阳性克隆的选择：
将弃上清后，重悬的菌液吸取100 μL涂布至含有40 μg/mL的诺尔斯菌素抗性平板上。培养2天后，挑选菌落较大的克隆转接入5 mL YPD液体培养基中，30℃，220 r/min培养24 h，取1 mL菌液提取基因组。以重组C. parapsilosis基因组为模板，使用引物SAT1_1和URA3t_2进行PCR验证，获得阳性克隆
C parapsilosis pCP-scrII。
六、重组菌株催化不对称转化制备(S)-苯基乙二醇
利用近平滑假丝酵母重组菌催化不对称还原反应：
将(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中表达后，利用培养后的重组菌株C parapsilosis pCP-scrII，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL 0.1 mol/L pH 4.5~5.5的醋酸缓冲液中，或1 mL 0.1 mol/L pH 6.0~7.0的磷酸缓冲液中，或1 mL 0.1 mol/L pH 7.5~9.0的Tris-HCl缓冲液中，加入重组菌细胞浓度为0.1 g/mL，底物2-羟基苯乙酮浓度为6 g/L，反应温度20-40℃，反应时间45 h。
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011发酵培养基组成为：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，(NH4)2HPO4 1.3%，KH2PO4 0.7%，ZnSO4·7H2O 0.03%，NaCl 0.01%，pH 7.0，以去离子水配制。
挑取阳性克隆单菌落接种于含有40 μg/mL的诺尔斯菌素5 mL YPD的酵母生长培养基中，于28℃，200 r/min振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL近平滑假丝酵母发酵培养基中，于28℃，200 r/min振荡培养36 h。
培养后的重组近平滑假丝酵母细胞8,000 r/min离心10 min，并用生理盐水洗涤三次后收集。在以下体系中进行不对称转化反应：1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 4.5~5.5）或1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0~7.0），或1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5~9.0），加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，和0.1 g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在20-40℃恒温摇床上振荡反应45 h。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100) 进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流动相为正己烷/异丙醇（9/1，v/v），流速0.4 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(S)-苯基乙二醇对映过量值的计算：
对映过量值( e.e.%)=[(C S-C R)/(C R+C S)]*100%，
产物(S)-苯基乙二醇产率的计算：产率（%）=（C S/C 0）*100%，
式中C S为反应后(S)-对映体的浓度，C R为反应后(R)-对映体的浓度，C 0为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。
以全细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(S)-苯基乙二醇。
（3）有益效果
成功构建了大肠杆菌和近平滑假丝酵母的表达质粒pCP-scrII，表达质粒转化近平滑假丝酵母感受态细胞，成功获得重组型近平滑假丝酵母
C. parapsilosis pCP-scrII。通过优化反应条件，在35℃，pH5.5的醋酸缓冲液中，利用0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母细胞催化转化6 g/L底物2-羟基苯乙酮，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率达到99.9%和99.9%。这些工作不仅为(S)-苯基乙二醇的高效制备提供了有效途径，而且有助于认识同一种酶在不同宿主中折叠方式对其立体选择性的影响，对开发新型优质手性生物催化剂具有重要的意义。
生物材料样品保藏：一株原位表达(S)-羰基还原酶II的近平滑假丝酵母重组菌，其分类命名为近平滑假丝酵母菌/(S)-羰基还原酶II（C parapsilosis pCP-scrII），已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M2015107；保藏日期：2015年3月12日。
附图说明
图1是本发明的近平滑假丝酵母穿梭质粒（pCP-scrII）构建流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011（已在专利号：CN 03102140.2中公开）的菌体培养，其生长培养基YPD组成为：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。将近平滑假丝酵母接种于5 mL试管中于28℃、200 r/min振荡培养16-18 h。
    实施例2
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)基因组的提取：将实施例1培养的菌体于12,000 r/min离心5 min，用生理盐水洗涤两次后，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Mini Preparation Kit（Takara公司）提取基因组。
实施例3
从近平滑假丝酵母中提取目的基因scrII，将scrII中酶切位点Kpn I序列（GGTACC）同义突变为GGCACA。
合成两端引物
SCRII_Sac I_F1: 5’-ttcgggagct catgcaccac caccaccacc acggcgaaat cgaatcttat t-3’ (Sac I)，
SCRII_Kpn I_R1:5’-cggggtaccc tatggacaag tgtaaccacc a-3’, (Kpn I)，
突变引物
Mut_Kpn I_F2: 5’-atgtcgggca caattgttaa tgt-3’，
Mut_Kpn I_R2: 5’-acattaacaa ttgtgcccga cat-3’，
含有Kpn I同义突变位点的scrII基因的获得：
PCR反应体系：ddH2O 24.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，Mut_Kpn I_F2 引物5 μL，Mut_Kpn I_R2引物 5 μL，5×buffer 10 μL。
PCR反应：98℃热变性10 s；98℃ 10 s，52℃ 15 s，72℃ 1 min。经过5-10 个循环后，取出PCR反应液，加入引物SAT1_1和 URA3t_2各1 μL，再进行25个循环，最后72℃再延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化DNA片断。
实施例4
表达载体pCP的构建：
载体pCP构建引物设计：
URA3p_1: 5’-ccggaattcg tattgcaaac aaacg -3’(EcoR I)，
URA3p_2: 5’-cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca-3’ (Bgl II)，
MAL2p_1: 5’-gtcttcatac aagatctgaa tggatgcggg -3’(Bgl II)，
MAL2p_2: 5’-attgacatga gctcccgcgg aatagttgta gta -3’(Sac I)，
ACT1t_1: 5’-caccactagg gtaccgagtg aaattct -3’(Kpn I)，
ACT1t_2: 5’-gtcttcctgca gattttatg atggaat -3’(Pst I)，
ACT1p_1: 5’-aaaatctgca ggaagaccgt ccaac -3’(Pst I)，
ACT1p_2: 5’-tttaagctta tctgcggccg caccgttatc gataactaaa-3’， (Not I)，
SAT1_1: 5’-cgataacggt gcggccgcat gaaaatttcg gtga -3’(Not I)，
SAT1_2: 5’-gattaaatat tcggatcctt aggcgtcatc ct -3’(BamH I)，
URA3t_1: 5’-gatgacgcct aaggatccga atatttaatc at -3’(BamH I)，
URA3t_2: 5’-atcccaagct taacgatcaa gagaaa -3’(Hind III)，
表达载体pCP全长4.5 Kb，采用重叠延伸和酶切连接的方法构建：
将act1p序列经TA克隆，连接到载体pMD19-T上，得到T -act1p质粒。使用引物SAT1_1和URA3t_2，以sat1和ura3t片段为模板，经重叠延伸PCR扩增得到sat1-ura3t。
将T-act1p 质粒及sat1-ura3t片段分别用限制性内切酶Not I和Hind Ⅲ进行双酶切，经胶回收后，将sat1-ura3t片段连接到T-act1p质粒上，得到T-ASU质粒。
将T-ASU质粒及pUC57质粒分别用限制性内切酶Pst I和Hind Ⅲ进行双酶切，经胶回收后，将act1p-sat1-ura3t片段连接到pUC57质粒上，得到pUC57-ASU质粒。
使用URA3p_1和MAL2p_2为引物，以ura3p和mal2p片段为模板，经过重叠延伸PCR扩增得到ura3p-mal2p。
将ura3p-mal2p片段及pUC57-ASU质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Sac I进行双酶切，经胶回收后，将ura3p-mal2p片段连接到pUC57-ASU质粒上，得到pUC57-UMASU 质粒。
将act1t片段及pUC57-UMASU质粒分别用限制性内切酶Kpn I和Pst I进行双酶切，经胶回收后，将act1t片段连接到pUC57-UMASU质粒上，得到大肠杆菌和近平滑假丝酵母中表达载体pCP。
实施例5
pCP-scrII重组质粒的获得：
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pCP。
反应体系组成：10×QuickCut Buffer 5 μL，DNA 20 μL，Sac I 1.0 μL，Kpn I1.0 μL，ddH2O将体系补足50 μL。按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴1h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
在每管100 μL E. coli DH 5α感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴冷却2 min。每管中加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 r/min摇床温育培养1 h。培养后菌液5,000 r/min离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB平板（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，2%琼脂）上，37℃倒置培养过夜。
挑取6个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L）中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×QuickCut Buffer 2 μL，质粒DNA 5 μL，QuickCut EcoR I 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pCP-scrII。
实施例6
(S)-羰基还原酶II的重组近平滑假丝酵母菌的获得：利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）从E.coli JM109中提取质粒pCP-scrII。提取的质粒进行单酶切线性化处理，反应为：10×QuickCut Buffer 5 μL，DNA 20 μL，QuickCut EcoR I 1.5μL，ddH2O补足至50 μL。37℃水浴1 h，在管中加入1/10体积的10×QuickCut Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并过柱纯化。将纯化后的样品用真空干燥机浓缩至5 μL以内。
在每管的80 μL近平滑假丝酵母感受态细胞悬液中加入5-10 ng浓缩后的单酶切线性化产物pCP-scrII，轻轻混匀后转入2 mm的电转杯中，冰上静置3 min。擦干水汽，置于电转仪上，选择酵母参数（电击参数：1500 V，200Ω，25 μF)，电转化。电击后立即加入1 mL冰浴的1 M 的山梨醇，转入1.5 mL离心管中，30℃，150 r/min 培养2 h。然后将培养液于5,000 r/min离心5 min，吸去上清400 μL。将离心管内的菌液混匀后涂至含有40 μg/mL诺尔斯菌素的YPD平板。培养2天后，挑选菌落较大的克隆转接入发酵培养基进行发酵摇瓶筛选。
实施例7
近平滑假丝酵母重组菌株的培养：近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011发酵培养基组成为：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，(NH4)2HPO4 1.3%，KH2PO4 0.7%，ZnSO4.7H2O 0.03%，NaCl 0.01%，pH 7.0。重组型近平滑假丝酵母培养还需添加40 μg/mL诺尔斯菌素。
挑取阳性克隆单菌落接种于5 mL含40 μg/mL诺尔斯菌素的YPD酵母生长培养基中，于28℃，200 r/min振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL近平滑假丝酵母发酵培养基中，于28℃，200 r/min振荡培养36 h。培养后的近平滑假丝酵母重组菌细胞于8,000 r/min离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集。
实施例8
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 4.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为90.2%，产率为95.4%。
实施例9
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为97.6%，产率为98.3%。
实施例10
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为98.4%，产率为91.3%。
实施例11
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为99.99%，产率为99.99%。
实施例12
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为95.0%，产率为95.8%。
实施例13
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在25℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为96.6%，产率为97.2%。
实施例14
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.5）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在20℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为96.6%，产率为95.7%。
实施例15
在1 mL 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为96.8%，产率为92.6%。
实施例16
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组近平滑假丝酵母湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为82.3%，产率为77.6%。
实施例17
在1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl冲液（pH 8.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为66.3%，产率为64.2%。
实施例18
在1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1 g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应45 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为56.3%，产率为34.5%。

Claims (8)

1.一株不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的原位表达(S)-羰基还原酶II的近平滑假丝酵母重组菌，其分类命名为近平滑假丝酵母菌/(S)-羰基还原酶II（Candida parapsilosis pCP-scrII），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015107。
2.利用权利要求1所述的原位表达近平滑假丝酵母重组菌不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是将(S)-羰基还原酶II在近平滑假丝酵母中表达后，利用培养后的重组菌株C parapsilosis pCP-scrII，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL 0.1 mol/L pH 4.5~5.5的醋酸缓冲液中，或1 mL 0.1 mol/L pH 6.0~7.0的磷酸缓冲液中，或1 mL 0.1 mol/L pH 7.5~9.0的Tris-HCl缓冲液中，加入重组菌细胞浓度为0.1 g/mL，底物2-羟基苯乙酮浓度为6 g/L，反应温度20-40℃，反应时间45 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌株C parapsilosis pCP-scrII的培养：
生长培养基YPD以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；固体培养基添加琼脂粉 20；
发酵培养基以g/L计：酵母提取物5，葡萄糖40，(NH4)2HPO4 13，KH2PO4 7，ZnSO4·7H2O 0.3，NaCl 0.1，pH 7.0，以去离子水配制；
培养条件：挑取重组菌株C parapsilosis pCP-scrII的单菌落接种于5 mL YPD液体培养基中，于28℃、200 r/min振荡培养12 h；取1 mL培养液转接于50 mL 发酵培养基中，于28℃、200 r/min振荡培养36 h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌株C parapsilosis pCP-scrII的构建：
将带有Kpn I同义突变位点的目的基因scrII插入大肠杆菌和近平滑假丝酵母表达载体pCP中，构建重组质粒pCP-scrII，重组质粒pCP-scrII转化近平滑假丝酵母感受态细胞，通过含有40 μg/mL诺尔斯菌素的YPD平板筛选目的重组菌株C. parapsilosis pCP-scrII。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是重组质粒pCP-scrII的构建：
目的基因scrII及表达载体pCP分别用限制性内切酶Sac I和Kpn I进行双酶切：
酶切反应体系：10×QuickCut Buffer 5 μL，DNA 20 μL，Sac I 1 μL，Kpn I 1μL，ddH2O将体系补足50 μL，37℃水浴1 h，在管中加入1/10体积的10×QuickCut Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应；
基因scrII与载体pCP的连接：
采用以下连接反应体系：载体pCP 1.5 μL，基因scrII 7.0 μL，10×Ligation buffer 1μL，T4 ligase 0.5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h；
重组质粒转化大肠杆菌（Escherich coli）JM109：
在每管100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min，转入42℃水浴中，热击90 s，快速转移至冰浴冷却2 min，每管中加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 r/min摇床温育培养1 h，培养后菌液5,000 r/min离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜；
阳性克隆的选择：
挑取6个克隆，转接入装有5mL的含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，LB培养基为蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L和NaCl 10 g/L，37℃培养12 h，利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit提取质粒，用Sac I和Kpn I进行双酶切验证，获得阳性质粒pCP-scrII。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是带有Kpn I同义突变位点的scrII基因的获得
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Sac I和Kpn I限制性酶切位点的引物SCRII_Sac I_F1和SCRII_Kpn I_R1，以及Kpn I突变点引物Mut_Kpn I_F2和Mut_Kpn I_R2：
SCRII_Sac I_F1: 5’-ttcgggagct catgcaccac caccaccacc acggcgaaat cgaatcttat t -3’，划线为Sac I，
SCRII_Kpn I_R1: 5’-cggggtaccc tatggacaag tgtaaccacc a-3’，划线为Kpn I，           
Mut_Kpn I_F2: 5’-atgtcgggca caattgttaa tgt-3’， 
Mut_Kpn I_R2: 5’-acattaacaa ttgtgcccga cat-3’， 
采用SOE-PCR的方法，将突变位点引入，将第523~525的GGT改为GGC，第526~528的ACC改为ACA，步骤为：
上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，分别以引物SCRII_Sac I_F1和Mut_Kpn I_R2，引物SCRII_Kpn I_R1和Mut_Kpn I_F2进行PCR反应，PCR 条件为：98℃热变性10 s；98℃ 10 s，52℃ 15 s，72℃ 1 min，经过5-10个循环后，取出PCR反应液，然后再加入引物 SAT1_1和URA3t_2各1 μL，再进行25个循环，最后72℃再延伸10 min，获得scrII，scrII基因全长为840 bp。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征是表达载体pCP的构建：
表达载体pCP是由pUC57为起始模板构建而来，表达载体全长4.5 Kb，采用重叠延伸和酶切连接的方法构建：
载体pCP构建引物设计：
URA3p_1: 5’-ccggaattcg tattgcaaac aaacg-3’，划线为EcoR I，
URA3p_2: 5’-cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca-3’，划线为Bgl II，
MAL2p_1: 5’-gtcttcatac aagatctgaa tggatgcggg-3’，划线为Bgl II，
MAL2p_2: 5’-attgacatga gctcccgcgg aatagttgta gta-3’，划线为Sac I，
ACT1t_1: 5’-caccactagg gtaccgagtg aaattct-3’，划线为Kpn I，
ACT1t_2: 5’-gtcttcctgc agattttatg atggaat-3’，划线为Pst I，
ACT1p_1: 5’-aaaatctgca ggaagaccgt ccaac-3’，划线为Pst I，
ACT1p_2: 5’-tttaagctta tctgcggccg caccgttatc gataactaaa-3’，划线为Not I，
SAT1_1: 5’-cgataacggt gcggccgcat gaaaatttcg gtga-3’，划线为Not I，
SAT1_2: 5’-gattaaatat tcggatcctt aggcgtcatc ct-3’，划线为BamH I，
URA3t_1: 5’-gatgacgcct aaggatccga atatttaatc at-3’，划线为BamH I，
URA3t_2: 5’-atcccaagct taacgatcaa gagaaa-3’，划线为Hind III，
表达载体pCP全长4.5 Kb，采用重叠延伸和酶切连接的方法构建：
将act1p序列经TA克隆，连接到载体pMD19-T上，得到T-act1p质粒；使用引物SAT1_1和URA3t_2，以sat1和ura3t片段为模板，经过重叠延伸PCR扩增得到sat1-ura3t；
将T-act1p质粒及sat1-ura3t片段分别用限制性内切酶Not I和Hind Ⅲ进行双酶切，经胶回收后，将sat1-ura3t片段连接到T-act1p质粒上，得到T-ASU质粒；
将T-ASU质粒及pUC57质粒分别用限制性内切酶Pst I和Hind Ⅲ进行双酶切，酶切片段经胶回收后，将act1p-sat1-ura3t片段连接到pUC57质粒上，得到pUC57-ASU质粒；
使用URA3p_1和MAL2p_2为引物，以ura3p和mal2p片段为模板，经过重叠延伸PCR扩增得到ura3p-mal2p；
将ura3p-mal2p片段及pUC57-ASU质粒分别用限制性内切酶EcoR I和SacI进行双酶切，经胶回收后，将ura3p-mal2p片段连接到pUC57-ASU质粒上，得到pUC57-UMASU质粒；
将act1t片段及pUC57-UMASU质粒分别用限制性内切酶Kpn I和Pst I进行双酶切，经胶回收后，将act1t片段连接到pUC57-UMASU质粒上，得到表达载体pCP。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征是用于获取带有Kpn I同义突变位点的基因scrII所需要提取的基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO：M203011。
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