CN101993828B - 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(s)-羰基还原酶偶联提高(s)-苯基乙二醇转化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(S)-羰基还原酶偶联提高(S)-苯基乙二醇转化效率的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一株重组毕赤酵母CGMCC No.4198，及其多批次催化2-羟基苯乙酮，制备(S)-苯基乙二醇的方法。本发明将酿酒酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因与近平滑假丝酵母(S)-羰基还原酶基因同时整合至毕赤酵母基因组中，在5% (w/v) 葡萄糖的参与下，全细胞重复利用10个批次，不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率始终维持在100%和85%以上。该重组菌株利用多基因共表达提高全细胞转化(S)-苯基乙二醇的批次稳定性，不仅很好地解除了生物转化反应中辅酶再生循环的制约；同时也为工业上多批次、低成本制备(S)-苯基乙二醇提供了一种高效途径。
Description
技术领域
6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(S)-羰基还原酶偶联提高(S)-苯基乙二醇转化效率的方法，利用基因共表达提高全细胞不对称转化(S)-苯基乙二醇的效率和批次稳定性的方法，本发明涉及利用基因工程的手段，构建了(S)-羰基还原酶（SCRⅡ）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）共表达的重组毕赤酵母菌（Pichia pastoris）SCRⅡG，高效制备(S)-苯基乙二醇，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
光学纯的苯基乙二醇（PED）是液晶材料中不可缺少的手性添加剂，也是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。生物法转化制备光学纯(S)-苯基乙二醇，通常以微生物全细胞或酶为催化剂，采用不同的化学反应途径，如Bakers’酵母不对称还原2-羟基苯乙酮法，环氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物法，和萘双氧化酶（NDO）选择性氧化苯乙烯法等，这些方法存在底物浓度低，需要昂贵的辅酶，产物光学纯度低等缺点。氧化还原酶催化的不对称还原反应中，辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。
全细胞体系辅酶再生主要有两种策略：一是在反应体系中添加醇或糖类辅助底物，构成底物耦联再生系统；二是通过基因工程手段在细胞中构建酶耦联再生系统。如Degussa公司利用该辅酶再生的原理催化三甲基丙酮酸不对称还原合成L-叔亮氨酸，大大提高了产物的转化率。ω-转氨酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶组成的耦联体系用于高效转化(R)-苯乙醇。
本实验室已经利用重组菌株催化不对称还原反应，制备(S)-苯基乙二醇，在此基础上，利用基因工程技术，将酿酒酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）基因ZWF1与近平滑假丝酵母(S)-羰基还原酶基因scrⅡ整合至毕赤酵母基因组中，构建了共表达偶联体系Pichia pastoris/SCRⅡG，在5% (w/v) 葡萄糖的参与下，Pichiapastoris/SCRⅡG不对称还原2-羟基苯乙酮的催化效率大大提高，反应十个批次后，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度和产率分别高达100%和85%以上。
发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种基因工程方法构建多酶偶联体系，实现了多种酶功能的成功整合。利用酶偶联后的重组菌株Pichiapastoris/SCRⅡG (菌种保藏号：CGMCC No.4198)高效不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法。本发明根据酿酒酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶和近平滑假丝酵母(S)-羰基还原酶的功能，利用基因工程技术，构建双酶偶联毕赤氏酵母体系，以酶偶联重组菌为催化剂，实现了从2-羟基苯乙酮到(S)-苯基乙二醇的高效转化。在5% (w/v) 葡萄糖的参与下，当底物浓度为6 mg/mL 时，经过十批次的催化反应，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度高达100％，产率维持在85%以上。本发明为解除辅酶再生循环的限制，成功整合双酶功能，提高手性醇制备效率提供了一条崭新的思路。
（2）技术方案
一株不对称制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SCRⅡG ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4198。
利用重组菌CGMCC No.4198不对称转化制备 (S)-苯基乙二醇的方法，不对称转化反应条件：在0.1 mol/L pH 5.5的醋酸缓冲液中，加质量/体积比5%葡萄糖，底物2-羟基苯乙酮的浓度为6 mg/mL，重组菌细胞浓度为0.1 g/mL，不加辅助底物，反应温度为35℃，反应时间为24 h，转速150 r/min，重组菌菌体重复利用十个批次。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100) 进
行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流动相为正己烷/异丙醇（9/1，V/V），流速0.5 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(S)-苯基乙二醇对映过量值的计算：对映过量值( e.e.%)=[(C S-C R)/(C R+C S)]*100%
产物(S)-苯基乙二醇产率的计算：产率（%）= C S/C 0*100%
式中C R为反应后(R)-对映体的浓度，C S为反应后(S)-对映体的浓度，C 0为反应前底物(R)-苯基乙二醇的浓度。
以全细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(S)-苯基乙二醇。
重组菌的培养：
BMGY（Buffered Glycerol-complex Medium）培养基，以质量/体积%计：酵母膏1%，蛋白胨2%，甘油1%，pH 6.0、100 mmol/L磷酸缓冲液10%，YNB1.34%，生物素4×10-5%，用去离子水补足至100%；
BMMY（Buffered Methanol-complex Medium）培养基，以质量/体积%计：酵母膏1%，蛋白胨2%，甲醇0.5%，pH 6.0、100 mmol/L磷酸缓冲液10%，YNB1.34%，4×10-5% 生物素，用去离子水补足至100%；
培养条件：将重组菌CGMCC No.4198按1%的接种量接种于装有25 mL BMGY培养基的100 mL摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下，培养至菌浓OD 600=2-6；室温3000 g离心5 min，收集菌体，用100 mL BMMY重悬菌体，使OD 600为1.0，置于500 mL的摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下培养，每12 h，按培养基质量/体积%计添加甲醇0.5%至培养基中，培养96h，10,000 rpm离心10 min，沉淀用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。
所述重组菌 CGMCC No.4198的构建方法，将scrⅡ基因插入pPIC3.5K中构建重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ，电击转化毕赤氏酵母GS115感受态细胞，获得重组菌Pichia pastoris/ pPIC3.5K-SCRⅡ；同时将基因ZWF1插入载体pPICZα，获得重组质粒pPICZα-ZWF1，用SacI对 pPICZα-ZWF1进行单酶切线性化，电转化感受态重组毕赤酵母Pichia pastoris/ pPIC3.5K-SCRⅡ的感受态细胞，涂布含有100 μg/mL Zeocin（博来霉素）的YPD平板，挑取阳性单克隆得到重组菌Pichia pastoris/SCRⅡG。质粒pPIC3.5K和质粒pPICZα均购自Invitrogen公司。
重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ的构建：利用限制性内切酶BamH I和Not I分别对载体pPIC3.5K和基因片段scrⅡ进行酶切，纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接，获得重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ。
重组质粒pPICZα-ZWF1的构建，利用限制性内切酶BstB I 和Xho I分别对载体pPICZα和基因片段ZWF1进行酶切，纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接，获得重组质粒pPICZα-ZWF1。
基因片段scrⅡ的获取：实验室已知scrⅡ基因全序列，以近平滑假丝酵母的基因组为模板，设计含有BamH I酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和含有NotI酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_R，通过PCR，获得scrⅡ基因全长，全长为837 bp。
SCRⅡ_pPIC3.5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCATAGC AGTGGCATGGGCGAAATCGAATC (BamH I)
SCRⅡ_pPIC3.5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATCGAC (Not I)
PCR反应体系：10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和SCRⅡ_pPIC3.5K_R 各1 μL，近平滑假丝酵母DNA
5 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL；PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；获得scrⅡ基因。
基因片段ZWF1的获取：通过NCBI检索得到ZWF1基因全长，以酿酒酵母基因组为模板，利用含BstB I酶切位点的引物pPIC_G6PDH_F和含XhoI 酶切位点的引物pPIC_G6PDH_R，通过PCR，获得ZWF1基因的全长为1518 bp；
pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAATTTG AAAAAAATACCG (BstB I)
pPIC_G6PDH_R: CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (XhoI)
PCR反应体系： 10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的 dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物pPIC_G6PDH_F和 pPIC_G6PDH_R各1 μL，酿酒酵母基因组5 μL，
5 U/μL的 Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL；PCR反应条件：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，55℃ l min，72℃ 1 min，进行30个循环，72℃延伸10 min；获得ZWF1基因。
具体操作如下：
一、近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC M203011（中国专利03132140.2，已公开）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养
近平滑假丝酵母的培养基组成以g/L计：葡萄糖40，酵母膏5，(NH4)2HPO4 13，KH2PO4 7，ZnSO4·7H2O 0.3，NaCl 0.1，pH 7.0；将近平滑假丝酵母菌种CCTCC M203011接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、150 rpm振荡培养48h；
酿酒酵母的培养基组成以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，葡萄糖10，pH 7.0；将酿酒酵母菌种接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、150 rpm振荡培养48h；
二、近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M 203011基因组和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组的获取
近平滑假丝酵母CCTCC M203011和酿酒酵母培养结束后，分别将菌体于6,000 g离心20 min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取近平滑假丝酵母基因组和酿酒酵母的基因组。
三、scrⅡ基因的获得
以近平滑假丝酵母（C. parapsilosis)CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板，利用含有BamH I酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和含有NotI酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_R，通过PCR扩增获得scrⅡ基因，全长为837 bp。
SCRⅡ_pPIC3.5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCAT AGCAGTGGCATGGGCGAAATCGAATC (BamH I)
SCRⅡ_pPIC3.5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCAT CGAC (Not I)
PCR反应体系：10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和SCRⅡ_pPIC3.5K_R 各1 μL，近平滑假丝酵母DNA 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL。PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min，获得scrⅡ基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化scrⅡ基因。
四、ZWF1基因的获得
以酿酒酵母基因组为模板，利用含BstB I酶切位点的引物pPIC_G6PDH_F和含XhoI 酶切位点的引物pPIC_G6PDH_R，通过PCR获得ZWF1基因，全长为1518 bp。
pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAAT TTGAAAAAAATACCG (BstB I)
pPIC_G6PDH_R: CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (XhoI)
PCR反应体系： 10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的 dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物pPIC_G6PDH_F和 pPIC_G6PDH_R各1 μL，酿酒酵母基因组5 μL，5 U/μL的 Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL；PCR反应条件：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，55℃ l min，72℃ 1 min，进行30个循环，72℃延伸10 min；获得ZWF1基因。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化ZWF1基因。
五、重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ的构建
用BamH I和Not I分别对载体pPIC3.5K和基因片段scrⅡ进行酶切，纯化后的基因片段scrⅡ与载体pPIC3.5K通过粘性末端连接，获得带有目标基因片段scrⅡ的重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ。
六、重组质粒pPICZα-ZWF1的构建
利用限制性内切酶XhoI和BstB I分别对载体pPICZα和基因片段ZWF1进行酶切，纯化后的基因片段ZWF1与载体pPICZα通过粘性末端连接，获得带有目标基因片段ZWF1的重组质粒pPICZα-ZWF1。
七、重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ转化毕赤氏酵母
取20 μL重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ，用限制性内切酶SacI单酶切线性化后，电击转化感受态毕赤酵母GS115，30℃静置1 h，涂布于MD平板上，挑取克隆经PCR验证，获得重组菌Pichiapastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ。
PCR验证反应体系：10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和SCRⅡ_pPIC3.5K_R 各1 μL，毕赤氏酵母DNA 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL。PCR验证反应条件：95℃预变性4 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。
八、重组质粒pPICZα-ZWF1转化重组菌Pichiapastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ
将Pichia pastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ涂布MD平板，两天后挑取单克隆，制备感受态，采用SacI单酶切后的质粒pPICZα-ZWF1，电转化Pichiapastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ感受态细胞，通过 100 μg/mL Zeocin的YPD平板筛选，获得重组菌Pichia pastoris/SCRⅡG，即CGMCC No.4198。
九、重组菌 CGMCC No.4198的培养
BMGY（Buffered Glycerol-complex Medium）培养基：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，1% 甘油，10% 100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 6.0，1.34% YNB，4×10-5% 生物素;
BMMY（Buffered Methanol-complex Medium）：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，0.5% 甲醇，10% 100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 6.0，1.34% YNB，4×10-5% 生物素，以去离子水补足至100%。
培养条件：将重组菌 CGMCC No.4198按1%接种量接种于装有25 mL BMGY培养基的100 mL摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下，培养至菌浓OD 600为2-6；以3,000 g离心5 min，收集菌体，用100 mL BMMY重悬菌体，使菌体OD 600达1.0左右，转至500 mL的摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下进行培养；每隔12 h，添加0.5%甲醇于培养基中，菌体连续培养96h后，于10,000 rpm离心10 min，收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，重新收集菌体细胞。
（3）有益效果
通过将(S)-羰基还原酶SCRⅡ(编码基因的GenBank登记号FJ939563)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDH (编码基因的GenBank登记号 BK006947.2)进行偶联，共表达于毕赤酵母细胞中。利用成功构建的重组菌CGMCC No.4198（P. pastoris/SCRⅡG）不对称催化2-羟基苯乙酮，转化(S)-苯基乙二醇。通过反应条件优化，在pH5.5的0.1 mol/L醋酸缓冲液中，利用0.1 g/mL重组菌CGMCC No.4198催化6 mg/mL底物2-羟基苯乙酮，35℃下反应24h，连续反应十个批次，最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为86.2%。这些工作为从2-羟基苯乙酮到(S)-苯基乙二醇的转化提供了有效途径，为辅酶再生循环途径耦合入(S)-苯基乙二醇的生物转化途径提供了新的研究思路，而且通过菌体多批次循环使用，大大降低了(S)-苯基乙二醇制备成本，为手性醇工业化生产奠定了坚实的基础。
生物材料样品保藏
巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）SCRⅡG，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.4198。保藏日期：2010年9月26日。
具体实施方式
实施例1
近平滑假丝酵母和酿酒酵母的培养。
近平滑假丝酵母培养基组成：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，(NH4)2HPO4 1.3%，KH2PO4 0.7%，ZnSO4·7H2O 0.03%，NaCl 0.01%，pH7.0。将菌种CCTCC NO：M 203011接种于50 mL培养基的250mL摇瓶中，30℃、150 rpm振荡培养48 h。
酿酒酵母培养基组成：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，葡萄糖1%，pH 7.0；将酿酒酵母菌种接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、150 rpm振荡培养48h。
实施例2
近平滑假丝酵母和酿酒酵母的基因组的获得：近平滑假丝酵母和酿酒酵母培养结束后，分别将菌体于6,000 g离心20 min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取近平滑假丝酵母基因组及酿酒酵母的基因组。
实施例3
scrⅡ基因的获得。以近平滑假丝酵母基因组为模板，利用含有BamH I酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和含有NotI酶切位点的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_R，通过PCR，获得SCRⅡ基因全长。
SCRⅡ_pPIC3.5K_F: CGGGATCCACCATGGGCCATCATCATCATCATCA TAGCAGTGGCATGGGCGAAATCGAATC (BamH I)
SCRⅡ_pPIC3.5K_R: TTGCGGCCGCCTATGGACAAGTGTAACCACCATC GAC (Not I)
PCR反应体系：10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和SCRⅡ_pPIC3.5K_R 各1 μL，近平滑假丝酵母DNA 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL。PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。获得scrⅡ基因片段。
实施例4
ZWF1基因的获得。以酿酒酵母的基因组为模板，利用含利用含BstB I酶切位点的引物pPIC_G6PDH_F和含XhoI 酶切位点的引物pPIC_G6PDH_R，PCR获得ZWF1基因。
pPIC_G6PDH_F: ACTGTTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAAT TTGAAAAAAATACCG (BstB I)
pPIC_G6PDH_R:CACGCTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTCTGGC (XhoI)
PCR反应体系： 10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的 dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物pPIC_G6PDH_F和 pPIC_G6PDH_R各1 μL，酿酒酵母基因组5 μL，
5 U/μL的 Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL；PCR反应条件：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，55℃ l min，72℃ 1 min，进行30个循环，72℃延伸10 min；获得ZWF1基因。
实施例5
重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ的获得。利用限制性内切酶BamH I和NotI分别对载体pPIC3.5K和基因片段SCRⅡ进行酶切，纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接，获得重组质粒pPIC3.5K-SCRⅡ。采用SacI对其进行单酶切线性化，电转化感受态毕赤酵母GS115, 30℃静置1 h，涂布于MD平板上，挑取单克隆，经PCR验证后获得重组菌P. pastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ。
基因scrⅡ及质粒pPIC3.5K的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pPIC3.5K。
分别按照水、缓冲液、基因scrⅡ和酶的顺序，及水、缓冲液、质粒pPIC3.5K和酶的顺序分别加到不同的Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收和浓缩目的片段。
反应体系组成：10×Buffer H 4 μL，基因scrⅡ或质粒pPIC3.5K 10 μL，BamHI 2 μL，NotI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。
基因scrⅡ及质粒pPIC3.5K的连接
连接反应体系组成：质粒pPIC3.5K 0.8 μL，基因scrⅡ 4.2 μL，Ligation Solution 5 μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16 h。
实施例6
重组质粒pPICZα-ZWF1的获得。利用限制性内切酶XhoI 和BstB I分别对载体pPICZα和ZWF1基因进行酶切，纯化后的基因片段与载体通过粘性末端进行连接，获得重组质粒pPICZα-ZWF1。
基因ZWF1及质粒pPICZα的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pPICZα。
分别按照水、缓冲液、基因ZWF1和酶的顺序，及水、缓冲液、质粒pPICZα和酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收和浓缩目的片段。
反应体系组成：10×Buffer H 4 μL，基因ZWF1或质粒pPICZα 10 μL，XhoI 2 μL，BstB I 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。
基因ZWF1与质粒pPICZα的连接
连接反应体系组成：质粒pPICZα 0.8 μL，基因ZWF1 4.2 μL，Ligation Solution 5 μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16 h。
实施例7
重组菌P. pastoris/ pPIC3.5K- SCRⅡ的获得。
毕赤酵母感受态细胞的制备：将毕赤酵母单克隆接种于5 mL YPD液体培养基，30℃，200 r/min，培养过夜；取50 ??L过夜培养物至100 mL YPD液体培养基中，30℃，200 r/min，培养至OD 600为2-6；于4℃，5000 r/min离心5 min收集菌液，用100 mL冰预冷的无菌水洗涤两次，收集菌体；分别用10 mL和1 mL冰预冷的1 mol/L的山梨醇溶液洗涤菌体，并收集菌体，每80 ??L分装保存。
重组质粒电击转化毕赤氏酵母感受态细胞：
（1）质粒线性化：提取pPIC3.5k- SCRⅡ质粒，酶切体系为10×buffer 5 μL，质粒（约20 ??g）43 μL，SacI 2 μL，37℃ 4 h，1%琼脂糖凝胶电泳酶切产物，检测酶切是否完全，胶回收酶切产物；
（2）取10 ??L（约5 ??g～10 ??g）的线性化质粒与80 μL的感受态GS115菌体混匀，转至0.2 cm冰预冷的电击杯中；
（3）冰上放置5 min，电压1500 V，电容25 ??F，电阻200 Ω，电击时间为5 ms，进行电击；
（4）电击完毕后，立即加入1 mL冰预冷的1 mol/L的山梨醇溶液，混匀；
（5）30℃静置1 h，涂布于MD平板上，30℃培养2 d。
重组巴斯德毕赤酵母的鉴定：
以提取的近平滑假丝酵母基因组DNA为模板，用引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和SCRⅡ_pPIC3.5K_R进行PCR，PCR反应体系：10×Taq buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 4 μL，50 pmol/μL的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和SCRⅡ_pPIC3.5K_R 各1 μL，毕赤氏酵母DNA 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 33.5 μL，反应总体积 50 μL。PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳酶切产物检测PCR结果。并保藏阳性克隆P. pastoris/ pPIC3.5K- SCRⅡ。
实施例8
重组菌P. pastoris/SCRⅡG的获得。将P. pastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ涂布MD平板，两天后挑取单克隆，制备感受态，采用Sal I单酶切后的质粒pPICZα-ZWF1，电转化P. pastoris/ pPIC3.5K- SCRⅡ感受态毕赤酵母，涂布含有100 μg/ml Zeocin的YPD平板，挑取阳性单克隆得到重组菌P. pastoris/SCRⅡG。
实施例9
重组毕赤氏酵母的诱导表达。将重组菌P. pastoris/SCRⅡG按1%的接种量接种于装有25 mL BMGY培养基的100 mL摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下，培养至菌浓OD 600为2-6；室温3000 g离心5 min，收集菌体，用100 mL BMMY重悬菌体，使OD 600为1.0左右，置于500 mL的摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下培养；每12 h，添加培养体系体积0.5%的甲醇至培养基中，共培养96h，10,000 rpm离心10 min，用生理盐水洗涤两次，收集重组菌细胞。
实施例10
用实施例9中收集的菌体细胞进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 mg/mL底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1 g/mL重组毕赤酵母P. pastoris/SCRⅡG菌体，混匀后于35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为97.2%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第二批次的转化。
实施例11
用实施例10中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 mg/mL底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1g/mL实施例10中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为93.4%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次再用于第三批次的转化
实施例12
用实施例11中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6mg/mL底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1g/mL实施例11中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，离心取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为91.7%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次，用于第四批次的转化。
实施例13
用实施例12中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1g/mL实施例12中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为90.2%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第五批次的转化。
实施例14
用实施例13中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1 g/mL实施例13中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为89.2%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第六批次的转化。
实施例15
用实施例14中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1 g/mL实施例14中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为88.9%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第七批次的转化。
实施例16
用实施例15中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1 g/mL实施例15中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为88.0%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第八批次的转化。
实施例17
用实施例16中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1 g/mL实施例16中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为87.6%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第九批次的转化。
实施例18
用实施例17中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1g/mL实施例17中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为87.2%。离心收集的菌体，用生理盐水洗两次用于第十批次的转化。
实施例19
用实施例18中生理盐水洗涤后的菌体进行生物转化试验。在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.5），分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，5% (w/v) 葡萄糖和0.1g/mL实施例18中收集的菌体细胞，混匀后在35℃恒温摇床上振荡反应24 h，混合物离心取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为100%e.e.，产率为86.2%。
Claims (3)
1.一株不对称制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SCRⅡG ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4198。
2.利用重组菌CGMCC No.4198不对称转化制备 (S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于不对称转化反应条件：在0.1 mol/L pH 5.5的醋酸缓冲液中，加质量/体积比5%葡萄糖，底物2-羟基苯乙酮的浓度为6 mg/mL，重组菌细胞浓度为0.1 g/mL，不加辅助底物，反应温度为35℃，反应时间为24 h，转速150 r/min，重组菌菌体重复利用十个批次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于重组菌的培养
BMGY培养基，以质量/体积%计：酵母膏1%，蛋白胨2%， 甘油1%，pH 6.0、100 mmol/L磷酸缓冲液10%，YNB 1.34%，生物素4×10-5 %，用去离子水补足至100%；
BMMY培养基，以质量/体积%计：酵母膏1%，蛋白胨2%，甲醇0.5%， pH 6.0、100 mmol/L磷酸缓冲液10%，YNB 1.34%，生物素4×10-5 %，用去离子水补足至100%；
培养条件：将重组菌CGMCC No.4198按1%的接种量接种于装有25 mL BMGY培养基的100 mL摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下，培养至菌浓OD 600=2-6；室温3000 g离心5 min，收集菌体，用100 mL BMMY重悬菌体，使OD 600为1.0，置于500 mL的摇瓶中，在28℃、250 r/min的条件下培养，每12 h，按培养基质量/体积%计添加甲醇0.5%至培养基中，培养96h，10,000 rpm离心10 min，沉淀用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞。
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