CN105018439B - 一种羰基还原酶及其在合成手性羟基化合物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰基还原酶进行不对称还原的方法。相对于其它酶催化的不对成酮还原反应，该酶具有宽泛的底物选择性，可以催化苯环、萘环、吡啶、苯并吡啶等多种取代芳香酮的还原，在催化浓度高达100g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99%以上,使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。

Description

一种羰基还原酶及其在合成手性羟基化合物中的应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种羰基还原酶，含有编码该酶的核苷酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基还原酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。
背景技术
含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成药物、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。而其中的手性芳香醇是合成手性药物、生物碱和其它手性化合物的重要中间体，是一大类有着重要工业潜力的有机化合物，在当今制药领域里有着重要的作用。比如，(S)-(+)-1,1-二苯基-2-丙醇及(R)-(-)-1,1-二苯基-2-丙醇可以通过氨化反应制成有用的手性芳香胺化合物，进而合成手性农用化学品和手性医用药物；再比如，(S)-4-(1-羟基乙基)喹啉-2-羧酸是硫链丝霉肽(Thiostrepton)的重要中间体；再比如，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟代苯基)乙醇是合成克唑替尼的重要中间体；又如(S)-2-(2-氯代苯基)-2-羟基乙酸甲酯是合成用于治疗脑卒中、心肌梗死的畅销药氯吡格雷的重要中间体。这样的用作药物中间体的手性芳香醇在制药领域中很多。
对于手性芳香醇的合成主要有两种途径：一是通过对潜手性芳香酮的对映选择性还原，二是可以通过对外消旋体的拆分实现。
针对第一种途径，目前发展得比较成熟的有三种方法：第一是使用手性配体修饰的金属氢化物试剂，在这些化合物中，将活泼氢的数目减至最小以获得高度的化学选择性，引入的手性配体则为对映面选择性做出贡献，应用比较广泛的试剂是一种联萘酚修饰的氢化铝试剂，简称BINAL-H；第二种方法是在氢化反应中使用过渡金属络合物进行催化，常用的过渡金属有钌和铑；第三种方法是使用硼杂噁唑烷催化体系，在使用硼烷还原羰基化合物的过程中，引入手性的硼杂恶唑烷，使前两者在反应面的某一侧足够靠近发生反应，该体系被命名为CBS体系。目前，对于潜手性芳香酮的不对称还原已经发展得比较成熟，但是上述几种方法都需采用一些比较昂贵不易获得的试剂或配体，不适合大规模的制备手性醇。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的制备手性芳香醇的反应中收率低、反应条件苛刻等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的羰基还原酶，以及使用该羰基还原酶催化合成手性芳香醇的方法。还提供了编码该羰基还原酶的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该羰基还原酶的制备方法，以及该羰基还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。
本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供了一种羰基还原酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质由来源于链霉菌Sreptacidiphilusalbus的基因编码，具有羰基还原酶的功能，是一种新的羰基还原酶。
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有羰基还原酶活性的蛋白质。
其中，所述的“几个”是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明人发现这样的融合蛋白同样具有羰基还原酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有羰基还原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持羰基还原酶活性。
SEQ ID No:1所示的羰基还原酶和其他已知羰基还原酶之间的同一性为50％。本发明的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的羰基还原酶与已知羰基还原酶的氨基酸序列的同一性低于90％，具有显著差异性。
在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。
本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的羰基还原酶。优选地，所述核酸是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。
由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成的核酸来源于链霉菌Sreptacidiphilusalbus基因组，其可以从基因组DNA中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
本发明中，SEQ ID No:2所示的基因命名为ABY-KRED-SA，全长828bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第825个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No:1的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID No:2。本发明的羰基还原酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列SEQ ID No:2的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。
SEQ ID No:2的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
SEQ ID No:2的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:2所示序列的核酸进行杂交的核苷酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC；20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码羰基还原酶的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码羰基还原酶或其突变体的核苷酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET28a分别用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的编码羰基还原酶的核苷酸序列的重组表达质粒pABI-ADH-SA或含有编码其突变体的核苷酸序列的重组表达质粒。
本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.Coli)，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pABI-ADH-SA或其突变体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即sABI-ADH-SA或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等；较佳地选择热击法进行转化，热击条件较佳的是：42℃，热击90秒。
本发明的第五方面提供一种重组羰基还原酶的制备方法，包括培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组羰基还原酶。
其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并表达本发明的羰基还原酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并表达本发明的羰基还原酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠杆菌(优选BL21(DE3)或其突变体)接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度20～40℃(更佳地是30℃)，即可高效表达本发明所述重组羰基还原酶。
本发明中催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性手性醇的催化剂，可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的羰基还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
本发明的第六个方面提供了一种本发明的羰基还原酶或重组羰基还原酶在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用。
所述的前手性羰基化合物为芳基酮类化合物。
所述芳基酮选自或
其中，
X表示被卤素、烷基、烷氧基、羟基或取代烷基中的任一取代基取代；
R选自H、C1～C8支链或直链烷基或含有2～8个碳原子的酯基；
Y为H、C1～C4烷基或含有2～8个碳原子的酯基；
Z为酰胺或含有2～8个碳原子的酯基。
所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳为10～100g/L。本发明的羰基还原酶或重组羰基还原酶的用量为催化量的，较佳的为1～100U/L。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为100～1000U/L。葡萄糖的用量较佳的为50～100g/L。NAD+的用量较佳的为0～1.0mmol/L。所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规的磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为50～100mM，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的在振荡条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的在20～40℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准，一般为1～12小时。不对称还原反应结束后，可按照本领域常规的方法从反应液中提取(S)-型手性醇产物。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明针对手性芳香族醇的立体选择性催化反应成本高、反应立体选择性差、反应条件苛刻等问题，提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰基还原酶进行不对称还原的方法。相对于其它酶催化的不对成酮还原反应，该酶具有宽泛的底物选择性，可以催化苯环、萘环、吡啶、苯并吡啶等多种取代芳香酮的还原，在催化浓度高达100g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99％以上,使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1羰基还原酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增的的羰基还原酶基因
图2羰基还原酶粗酶液的蛋白表达凝胶电泳图。M为分子量标准，泳道1为羰基还原酶的蛋白上清液。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中TLC条件：乙酸乙酯：乙醇：氨水＝10:3:1，碘缸显色。
GC检测反应进度，GC条件为：初始温度100℃，每分钟升高10℃，终温280℃。
实施例1羰基还原酶基因的克隆
根据序列已知的S.albus的3-oxoacyl-ACP还原酶(氨基酸序列见SEQ ID No:1)进行序列合成，得到了相应的DNA序列见SEQ ID No:2。将该基因克隆到pET28a的NdeI/HindIII位点，构建出相应的表达质粒pABI-ADH-SA，对该质粒进行PCR和电泳验证，所用的引物见SEQ ID No:3和4。转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到相应的重组菌株sABI-ADH-SA。
实施例2重组羰基还原酶的表达
将重组菌株sABI-ADH-SA接种至含有卡那霉素的LB摇瓶37℃培养过夜，并将过夜培养物按照5％的比例接种至1L LB摇瓶，37℃培养至OD600 0.6～0.8，加入IPTG至终浓度1mM，降温至30℃继续培养16小时。4000rpm离心收集菌体，用100mL PBS(pH 7.5)缓冲液重悬，超声破碎菌体，12000rpm离心30min，得到上清液即为粗酶液。
酶活(U)的测定方法是：在2mL反应液中，加入2mM苯乙酮作为底物，0.1mM NADH作为辅因子，再加入20μL粗酶液，测定1分钟内OD340的降低量为ΔA340。每mL酶液的比酶活U＝ΔA340×1000/(6220×20)，即每mL裂解液的比酶活力。
酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。
羰基还原酶每单位酶活定义为在上述条件下，每分钟消耗1μmol NADH所需的酶量。本实施例制备的重组羰基还原酶的酶活为25U/mg。
每单位葡萄糖脱氢酶酶活定义为在上述条件下，每分钟催化还原1μmol NAD+所需的酶量。
实施例3前手性羰基底物的不对称还原反应
将40g喹啉-3-甲酸甲酯悬浮于500mL磷酸钠缓冲液，用饱和Na2CO3溶液调节pH至6.0，加入实施例2制备的粗酶液200mL、葡萄糖100g和葡萄糖脱氢酶1000U(购自sigma)、以及0.2mmol/L的NAD+，添加磷酸钠缓冲液定容至1L，30℃搅拌反应24小时，饱和Na2CO3控制反应pH在6.0左右，TLC检测反应进程。反应结束后调pH至2.0，升温至70℃加热1小时使蛋白质变性，加硅藻土过滤除去变性蛋白质，后调pH至13.0；等体积正丁醇萃取2次，并用等体积正丁醇洗涤滤渣一次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，得到产物35.5g，摩尔收率88％。
通过核磁共振氢谱和ee值测定对产物结构进行确认：
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.67-7.42(6H,m,Ar-H),5.86(1H,s,-CHOH),3.24(3H,s,-CH3),2.0(1H,s,-OH)。
ee值测定：ChiralpakAD-H柱，正己烷:乙醇(0.1％DEA)＝90:10，0.8mL/min，220nm，Agilent 1260。
实施例4-12前手性羰基底物的不对称还原反应
参照实施例3的方法，结合表1中的参数，进行实施例4-12的化合物的制备。其中，当反应体系中使用NAD+时，NAD+与粗酶液同时加入反应体系中。
表1羰基还原酶催化前手性羰基底物发生不对称还原反应

Claims (7)

1.一种羰基还原酶在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用；其特征在于所述前手性羰基化合物为芳基酮类化合物，所述羰基还原酶是由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质；其中芳基酮类化合物为：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述羰基还原酶的编码核酸是由SEQ IDNo:2所示核苷酸序列组成的。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于所述的应用包括如下步骤：在pH为5.0～8.0的水溶液中，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的存在下，在权利要求1-2任一项所定义的羰基还原酶催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为10～1000g/L；所述的羰基还原酶的用量为1～100U/L；所述的葡萄糖脱氢酶的用量为100～1000U/L；所述的葡萄糖的用量为50～100g/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于不对称还原反应液中含有0～1.0mmol/L的NAD+。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的不对称还原反应在振荡条件下进行，反应温度为20～40℃。
7.根据权利要求4-5任一项所述的应用，其特征在于所述的不对称还原反应在振荡条件下进行，反应温度为20～40℃。
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