JP6367944B2 - トランスアミナーゼ及びその応用 - Google Patents
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Description
本発明は、キラル化合物の合成分野に関し、具体的に、トランスアミナーゼ及びその応用に関する。
キラルアミンは自然界に汎用されており、数多い重要な生物活性分子の構造ユニットで、天然産物やキラル薬物を合成する際の重要な中間体であって、多いキラルアミンは重要なキラル補助剤やキラル選択剤としても用いられる。その故、キラルアミン化合物の製造は重要な経済上の意味を持っている。
現在、キラルアミンの製造は主に、化学還元の方法を用いて、プロキラルケトンを利用して光学活性を持つアミンを製造している。Ｐｄ／Ｃ及びキニーネの触媒作用で、プロキラルケトンと蟻酸及び無機アンモニア／有機第一級アミンとが反応してキラルアミンを生成する。他の研究者は、ルテニウム配合物を触媒として、プロキラルケトンで非対称アミン化還元を行ってキラルアミンを得ている（Renat Kadyrov et al. Highly Enantioselective Hydrogen-Transfer Reductive Amination: Catalytic Asymmetric Synthesis of Primary Amines. Angewandte Chemie International Edition. 2003,42（44）、第5472〜5474頁）。このような反応において金属触媒はかなり重要な要素であって、かつ、金属触媒に対する要求も厳しく、反応は高圧条件で行わなければならなく、操作機器に対する要求も高く、同時に、金属触媒の価格が高く、環境に対する汚染も大きい（Ohkuma T et al. Trans-RuH（eta1-BH4）（binap）（1,2-diamine）:a catalyst for asymmetric hydrogenation of simple ketones under base-free conditions. Journal of the American Chemical Society.2002, 124（23）、第6508〜6509頁）。
アミノ基転移酵素はトランスアミナーゼとも呼ばれ、一つのアミノ基とカルボニル基とが交換する過程を触媒する。ω−トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼの中の一つであるが、若干の差異がある。ω−トランスアミナーゼは第１類の酵素を指し、それにより触媒するアミノ基転移反応における反応物質又は産物がα−アミノ酸を含有しない限り、当該酵素をω−トランスアミナーゼと称することができる。ω−トランスアミナーゼは、ケトン類化合物を原料として、立体選択性のアミノ基転移作用によって、効率的にキラルアミンを生産している。その反応物質が比較的に低価格で、産物の純度が高い特徴を有するので、研究者たちの注目を集めている。それを充分に潜在力を発揮させて、キラルアミンの産業化生産へ普及することを望んであるが、当該酵素の研究及び応用は少ないのが現状である。
本分野において、キラルアミン化合物を製造するための需要を満たすように、高度の立体選択性を持つＲ体触媒活性のω−トランスアミナーゼに対する需要が依然としてある。
Renat Kadyrov et al. Highly Enantioselective Hydrogen-Transfer Reductive Amination: Catalytic Asymmetric Synthesis of Primary Amines. Angewandte Chemie International Edition. 2003,42（44）、第5472〜5474頁
Ohkuma T et al. Trans-RuH（eta1-BH4）（binap）（1,2-diamine）:a catalyst for asymmetric hydrogenation of simple ketones under base-free conditions. Journal of the American Chemical Society.2002, 124（23）、第6508〜6509頁
本発明は、キラルアミンの産業化生産の需要を満たすように、新規のトランスアミナーゼ及びその応用を提供することをその目的とする。
上記目的を実現するため、本発明の一態様によると、トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を提供し、該トランスアミナーゼのアミノ酸配列は以下の配列から選ばれる一つである：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列であって、但し、該アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列により符号化されれたアミノ酸配列ではないアミノ酸配列、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠乏又は添加することで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２から派生され且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性の蛋白質であって、但し、該アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列により符号化されれたアミノ酸配列ではない蛋白質。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
さらに、上記トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列中の第３８位のロイシンをイソロイシンに置換したアミノ酸配列である。
本発明の他の一態様によると、上記トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体の符号化を行うヌクレオチドを提供する。
さらに、上記ヌクレオチドの配列は以下の配列から選ばれる一つである：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列、ｃ）厳密な条件でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
本発明の他の一態様によると、上記したヌクレオチドが有効に接続されている組換えベクターを提供する。
さらに、組換えベクターはｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２又はｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３である。
本発明の他の一態様によると、上記した組換えベクターにより形質転換又は形質導入される宿主細胞を提供する。
本発明の他の一態様によると、ケトン系化合物と、上記トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体と、ピリドキサールリン酸と、アミノ基供与体とを、反応系で反応させてキラルアミンを得るキラルアミンの合成方法を提供する。
さらに、上記ケトン系化合物は
で、ここで、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０ナフテン基、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であって、又は、Ｒ１とＲ２がカルボニル基の炭素と協同にＣ５〜Ｃ１０複素環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基とＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロ原子がそれぞれ独自に、窒素、酸素、硫黄から選ばれる少なくとも１種であって、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基がそれぞれ独自に、置換されていないか又はハロゲン、アルコキシル基又はアルキル基の中の少なくとも一つの基によって置換されたものであって、好ましくは、ケトン系化合物
が
から選ばれる。
さらに、上記反応系にカオトロピック剤をさらに含有し、カオトロピック剤はジメチルスルホキシド又はポリエチレングリコールであって、ここで、好ましくは、ポリエチレングリコールがＰＥＧ−４００である。
さらに、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基はＣ１〜Ｃ８直鎖アルキル基で、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基はピリジン基で、アルコキシル基はＣ１〜Ｃ６アルコキシル基で、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基はピペリジンで、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基の置換基ははそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル基であって、アミノ基供与体はイソプロピルアミン又はＤ−アラニンである。
本発明の技術案を応用すると、高度の立体選択性を有するＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を利用することで、効率的に高いキラル純度のＲ体のキラルアミンを合成することができ、キラルアミンの産業化生産へ応用できる。
本願の一部を構成する図面は本発明を一層理解させるためのもので、本発明における例示的な実施例及びその説明は本発明を解釈するが、本発明を不当に限定するものではない。
ここで、衝突しない限り、本願の実施例及び実施例中の特徴を互いに結合することができる。以下、図面を参照しつつ実施例を結合して本発明を説明する。
定義
用語「選択的／任意」又は「選択的に／任意に」はその後に記載の事件又は状況が発生する可能性があれば発生しない可能性もあることを表し、このような記載は該当事件又は状況が発生する場合と発生しない場合とを含む。例えば、以下の定義によって、「選択的に置換されたアルキル基」は「置換されていないアルキル基」（置換基によって置換されていないアルキル基）又は「置換されたアルキル基」（置換基によって置換されたアルキル基）とを表す。
用語「選択的／任意」又は「選択的に／任意に」はその後に記載の事件又は状況が発生する可能性があれば発生しない可能性もあることを表し、このような記載は該当事件又は状況が発生する場合と発生しない場合とを含む。例えば、以下の定義によって、「選択的に置換されたアルキル基」は「置換されていないアルキル基」（置換基によって置換されていないアルキル基）又は「置換されたアルキル基」（置換基によって置換されたアルキル基）とを表す。
本願に記載のＣ１〜ＣｎはＣ１〜Ｃ２、Ｃ１〜Ｃ３、……Ｃ１〜Ｃnを含む。例えば、前記「Ｃ１〜Ｃ４」基は該部分において１〜４個の炭素原子を含有することを表し、即ち、基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子又は４個の炭素原子を含有することを表す。
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「アルキル基」は選択的に置換された直鎖又は選択的に置換された枝分鎖の脂肪族炭化水素系を指す。本願の「アルキル基」は１〜２０個の炭素原子を含有することが好ましく、例えば、１〜１０個の炭素原子を有し、１〜約８個の炭素原子、又は１〜約６個の炭素原子、又は１〜約４個の炭素原子又は１〜約３個の炭素原子を含有する。本願において、単独に又は組み合わせて使用される用語「アルコキシル基」はアルキル基エーテル基（Ｏ−アルキル基）を指し、アルコキシル基の非限定性実施例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等を含む。
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「ハロゲン」又は「ハロゲン置換」は選択的に置換された基（例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基）の一つ又は複数の水素原子がフッ素、塩素、臭素、ヨウ素原子又はその組み合せに置換されたものを指す。
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「芳香基／アリール基」は選択的に置換された芳香炭化水素基を指し、６個〜約２０個の環炭素原子（環をなすための炭素原子）、例えば６〜１２個又は６〜１０個の環炭素原子を有する。縮合芳香環又は非縮合芳香環であることができる。
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「ヘテロアリール基」は、任意に置換されたの一価ヘテロアリール基を指し、約５〜約２０個の骨格環原子、例えば５〜１２個又は５〜１０個の骨格環原子を有し、ここで、一つ又は複数の（例えば、１〜４個、１〜３個、１〜２個）環原子はヘテロ原子で、前記ヘテロ原子は独立に、酸素、窒素、硫黄、リン、ケイ素、セレン、錫から選ばれるヘテロ原子であるが、これに限定されることはない。前記基の環は二つの隣り合うＯ又はＳ原子は含まない。ヘテロアリール基は、単一環ヘテロアリール基又は多環ヘテロアリール基（例えば双環ヘテロアリール基、三環ヘテロアリール基等）を含む。
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「複素環」又は「複素環基」は非芳香複素環を指し、ヘテロナフテン基とヘテロシクロアルケニル基を含む。ここで、一つ又は複数の（例えば、１〜４個、１〜３個、１〜２個）環原子はヘテロ原子であって、例えば酸素、窒素又は硫黄原子である。複素環基は、単一環複素環基（複素環基が一つの環を有する）又は多環複素環基（例えば、双環複素環基（複素環基が二つの環を有する）、三環複素環基等）を含む。
本願において単独に又は組み合わせて使用される用語「炭素環基」は非芳香族の炭素環を指し、ナフテン基とシクロアルケニル基とを含む。ナフテン基は単一環ナフテン基又は多環ナフテン基（例えば、２、３又は４個の環を有し、例えば双環ナフテン基である）であることができ、スピロ又はブリッジリングであることができる。炭素環基は３〜２０個の炭素原子を有することができ、例えば３〜１５個の環炭素原子又は３〜１０個の環炭素原子又は３〜６個の環炭素原子を有することができ、そして、０、１、２又は３個の二重結合及び／又は０、１又は２個の三重結合を有することができる。例えば、３〜８個又は３〜６個の環炭素原子のナフテン基を有する。
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を指し、フッ素、塩素、臭素を指すことが好ましい。シアノ基は「−ＣＮ」を指し、ヒドロキシ基は「−ＯＨ」を指し、メルカプト基は「−ＳＨ」を指し、アミノ基は「−ＮＨ２」を指す。
用語「置換された」は一つの特定の原子の一つ又は更に多い水素が所定の基によって取り替えられたことを言い、所定の原子の正常な原子価が今の状況で越えていないと、置換後の結果は安定的な化合物である。
背景技術部分に記載のように、既存技術におけるω−トランスアミナーゼには依然としてキラルアミン化合物の製造の需要を満たすことのできない欠陥が存在し、上記状況を改善するため、本発明においてＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体を提供する。該Ｒ型ω−トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、下記の配列から選ばれる一つを含み、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列であって、但し、該アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列で符号化されれたアミノ酸配列ではないアミノ酸配列、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列に一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠乏又は添加して且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４から派生された蛋白質。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
本発明の上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼは、高度のＲ体立体選択性を有するω−トランスアミナーゼを指し、一実施形態において、本発明のトランスアミナーゼは配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すようなトランスアミナーゼを指す。上記トランスアミナーゼは、本発明において分子生物学の技術を利用して、アスペルギルス・テレウスとヒポモナスネプチュニウムから由来のトランスアミナーゼ遺伝子ｔａＡＴとｔａＨＮを突然変異及び分子改善を行って新規のトランスアミナーゼを得る。
上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列と少なくとも、例えば８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％又は９９.７％の同一性を有し且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５に示すアミノ酸配列ではない配列を指す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列の中のトランスアミナーゼの触媒活性に核心作用を果たすアミノ酸配列を不変に保持した状況下、当業者であれば他の非活性位のアミノ酸配列を変更させて、得られるトランスアミナーゼのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％以上になるようにすることができる。このようにして得られたトランスアミナーゼはアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４であるトランスアミナーゼと同一なトランスアミナーゼ活性を具備する。
同じ理由により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列の中のトランスアミナーゼの触媒活性に核心作用を果たすアミノ酸配列を不変に保持した状況下、上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すアミノ酸配列の中のアミノ酸において一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠乏又は添加を行って、このようにしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４から派生された蛋白質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２又は４に示すトランスアミナーゼの高度の立体選択性を保持することができる。ここで、置換、欠乏又は添加を行う塩基性基は一つ又は複数であることができ、例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個又は５０個のアミノ酸であることができ、例えば保存アミノ酸（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の置換を行うことができ、ここで、該アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５に示すアミノ酸配列ではない。「保存アミノ酸の取り替え」とは、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒの組み合せを指す。
ここで、立体選択性とは、一つの反応を経てＡとＢの二つの立体異性体を得た時、Ａの生産高がＢより多いことを言う。高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指し、例えば少なくとも約１.２倍、少なくとも約１.３倍、少なくとも約１.４倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であることができ、又は更に高いことも可能である。
本発明において、上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼの修飾物は化学修飾物で、例えばアシル化、アルキル基化、ＰＥＧ化産物であることができ、これらの修飾物が上記高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性を保留していればよい。上記機能同等物は、Ｒ型ω−トランスアミナーゼ活性を実現できる他のポリペプチド破片を指す。上記機能破片は、高度の立体選択性を有する即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼ活性を保留した蛋白質破片を指す。上記変異体は、一つ又は複数（幾つかの）の位置の一つ又は複数のアミノ酸を変更させることで、即ち置換、挿入及び／又は欠乏を行うことでｐａｒｅｎｔａｌ蛋白質から派生されるポリペプチドを指す。
本発明の一好適な実施例において、上記トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列中の第３８位のロイシンをイソロイシンで置換したアミノ酸配列である。このように性質が類似するアミノ酸間の置換を行うことで、このような置換後のアミノ酸配列を有するトランスアミナーゼがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列を有するトランスアミナーゼの活性及び高度の立体選択性を有することになる。
本発明で得られる上記トランスアミナーゼは、高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼであって、効率的に高いキラル純度のＲ体のキラルアミンを合成することができ、キラルアミンの産業化生産へ応用できる。本発明によると、接合対象及び接合位を好適に選択することで、改善して得た新規のトランスアミナーゼ変異体が蛋白質の折り曲げに影響せず、トランスアミナーゼの活性を保留して高いトランスアミナーゼ活性を有し、且つ高度の立体選択性を有することになる。
他の典型的な実施形態において、ヌクレオチドを提供し、該ヌクレオチドによって上記Ｒ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体の符号化を行う。本発明の上記したＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体のヌクレオチドによる符号化ルールは通常のコドン使用テーブルに符合する。
本発明の一好適な実施例において、上記ヌクレオチドの配列は、以下の配列から選ばれた一つの配列を含む：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列；ｃ）厳密な条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列。ここで、高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指す。
上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列は、例えば少なくとも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％、９９.８％又は９９.９％の同一性を有し、ここで、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列ではない。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列に基づいて、トランスアミナーゼ触媒活性に核心作用を果たすヌクレオチド配列を不変に保持した状況下、当業者であれば他の非活性位のヌクレオチド配列を変更させることで、得られるトランスアミナーゼのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％以上になるようにすることができる。このようにして得たトランスアミナーゼはヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３であるトランスアミナーゼと同一なトランスアミナーゼ活性を具備する。
上記厳密な条件で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列と交雑し且つ高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列であって、但し、該ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５又は６に示すヌクレオチド配列ではないヌクレオチド配列、同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列に基づいて、厳密な条件で、それと交雑可能であると共に、高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの符号化を行うヌクレオチド配列を選別ことによって得られたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３に示すヌクレオチド配列の変異体配列は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１又は３であるトランスアミナーゼと同一なトランスアミナーゼ活性を具備する。
ここで、立体選択性とは、一つの反応を経てＡとＢの二つの立体異性体を生成した時、Ａの生産高がＢより多いことを指す。高度の立体選択性とは、その中の一つの立体異性体の含有量が他の一つの少なくとも約１.１倍であることを指し、例えば少なくとも約１.２倍、少なくとも約１.３倍、少なくとも約１.４倍、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍であることができ、又は更に高いこともできる。
一例示的な厳密な条件として、６ Ｘ ＳＳＣ、０.５％ ＳＤＳの溶液を利用して、６５℃で交雑し、その後２ Ｘ ＳＳＣ、０.１ ％ ＳＤＳ と １ Ｘ ＳＳＣ、０.１ ％ ＳＤＳを利用して膜をそれぞれ一回ずつ洗浄する。
本発明において使用される用語「同一性」は本分野の通常の既知の意味を持つことを指し、当業者であれば異なる配列間の同一性を測定するルール、標準を理解できる。本発明において異なるレベルの同一性で限定する配列は同時に高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの活性を有しなければならない。当業者であれば該高度の立体選択性即ちＲ体触媒活性を有するω−トランスアミナーゼの活性を利用して変異体配列を選別する方法及び手段を理解できる。当業者であれば本願に開示された内容から示唆を得てこのような変異体配列を容易に得ることができる。
当業者であれば、本発明において前記アミノ酸配列又はポリヌクレオチドを限定する際に「含む」を用いているが、上記アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の両端にその機能と関係ない他の配列を任意に追加できることを意味することではないことを理解できる。当業者であれば、組換え操作の要求を満たすため、前記ポリヌクレオチドの両端に適切な限定性エンドヌクレアーゼの酵素消化位を追加する、又は開始コドン、終了コドン等を別途に追加しなければならないので、閉鎖式の表現で上記配列を限定すると、このような状況をカバーできないことを理解できる。
当業者であれば、符号化されれたアミノ酸を変更させない状況下、上記ヌクレオチド配列の中の一つ又は複数のコドンを等同意義での取り替えを行うことが可能であることを理解でき、例えばＣＴＴにより符号化されれたロイシンＬｅｕをＣＴＡ、ＣＴＣ又はＣＴＧに取り替えることができる。取り替えられるコドン数量は一つ又は複数のコドンであることができ、例えば１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のコドンであることができる。コドン使用テーブルは本分野の周知のものである。
本発明の他の一態様によると組換えベクターを提供し、該組換えベクターに上記したいずれか一つのヌクレオチドが有効に接続されている。本発明の組換えベクターは組換え発現ベクターを含むがこれに限定されることはなく、組換えクローニングベクターを含むこともできる。組換えベクターは原核発現ベクター又は真核発現ベクターであることができ、本発明の一実施例において、上記組換えベクターは発現を誘導可能な組換え原核発現ベクターである。、例えば、ｐＥＴ２２ｂベクターのような、ＩＰＴＧを利用して遺伝子の発現を誘導したｐＥＴシリーズのベクターである。本発明において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１と ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：３に示すヌクレオチド配列を有する組換えベクターがｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２とｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３であることが好ましい。ここで、「有効に接続される」とは、このような接続方式、つまりポリヌクレオチドをベクターの適切な位置に置くことで、ポリヌクレオチドが正確且つ順調にコピー、転写及び／又は翻訳されるようにすることを指す。
本発明の他の一態様において宿主細胞を提供し、該宿主細胞は上記したいずれかの組換えベクターが形質転換又は形質導入されている。本発明の宿主細胞は原核宿主細胞と真核宿主細胞とを含み、本発明の一実施例において、上記宿主細胞は原核宿主細胞で、例えば大腸菌であって、大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）であることがさらに好ましい。
本発明の他の一態様においてキラルアミンの合成方法を提供し、該方法は、ケトン系化合物と、上記したいずれかのＲ型ω−トランスアミナーゼ又はその修飾物、機能同等物、機能破片又は変異体と、ピリドキサールリン酸と、アミノ基供与体とを反応系で反応させてキラルアミンを得ることを含む。本発明のキラルアミンの合成方法によると、本分野の通常の生物酵素触媒反応によってキラル化合物を製造する方法に基づいて、本発明のランスアミナーゼを利用して、反応系の各種の反応原料の成分、比例、使用量、ｐＨ値、温度、反応時間等のパラメータを適切に変更させている。
本発明の一好適な実施例において、上記ケトン系化合物は
であって、ここで、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０ナフテン基、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であって、又はＲ１とＲ２がカルボニル基の炭素と協同にＣ５〜Ｃ１０複素環基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基とＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロ原子はそれぞれ独自に、窒素、酸素、硫黄から選ばれる少なくとも一つであって、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基はそれぞれ独自に、置換されておらず又はハロゲン、アルコキシル基又はアルキル基の中の少なくとも一つの基によって置換され、そして、好ましくは、ケトン系化合物
が
から選ばれる。上記ケトン系化合物は商業化された原料又は簡単に製造できる原料であって価格が低く、大量生産の需要を満たすことができる。
本発明の他の一好適な実施例において、上記反応系にカオトロピック剤をさらに含有し、カオトロピック剤はジメチルスルホキシド又はポリエチレングリコールであって、好ましくは、ポリエチレングリコールがＰＥＧ−４００である。カオトロピック剤は反応が順調に行われるように上記原料を良好に溶解させる作用を果たし、ＰＥＧ−４００は溶解触媒効果が一層良好である。
本発明の他の好適な実施例において、上記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基はＣ１〜Ｃ８直鎖アルキル基で、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基はピリジン基で、アルコキシル基はＣ１〜Ｃ６アルコキシル基で、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基はピペリジンであって、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基の中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基の置換基はそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル基であって、アミノ基供与体はイソプロピルアミン又はＤ−アラニンである。上記原料は商業化された原料又は簡単に製造できる原料であって、価格が低く、大量生産の需要を満たすことができる。
本発明の一好適な実施例において、上記反応系は反応系のｐＨ値を７.０〜９.５の範囲に維持するための緩衝液を含有し、及び／又は、ケトン系化合物とカオトロピック剤の使用量の比例は１ｇ／１ｍＬ〜１５ｍＬであって、及び／又は、ケトン系化合物と緩衝液の使用量の比例は１ｇ／１５ｍＬ〜５０ｍＬであって、及び／又は、ケトン系化合物とピリドキサールリン酸の使用量の比例は１ｇ／０.０１ｇ〜０.１ｇであって、及び／又は、ケトン系化合物とアミノ基供与体の使用量の比例は１ｅｑ／１ｅｑ〜５ｅｑであって、及び／又は、ケトン系化合物とＲ型ω−トランスアミナーゼの使用量の比例は１ｇ／０.２ｇ〜１０ｇであって、及び／又は、反応系の温度は２０〜４５℃であって反応時間は１２ｈ〜４８ｈであって、及び／又は、緩衝液はリン酸塩緩衝液又はｐＨ＝９.３〜９.５のトリエタノールアミン緩衝液である。
本発明の他の一好適な実施例において、上記方法はさらに、塩基で反応系をｐＨ≧１０まで調節し、有機溶剤で水相中の製品であるキラルアミンを抽出する工程を含み、好ましくは、塩基が水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムで、有機溶剤が酢酸エチル、メチルtert−ブチルエーテル又は２−メチルテトラヒドロフランである。
本発明の他の一典型的な実施形態において、上記したいずれかの方法で合成されるＲ型キラルアミンを提供する。本発明の上記トランスアミナーゼを用いて製造したＲ型キラルアミンのキラルアミン純度は高く、９８％以上に達する。
以下、具体的な実施例を結合して本発明の有益な効果を説明する。
以下の実施例において、特別な説明がないと、いずれも通常の方法を利用していて、特別な説明がないと、用いられる実験材料はいずれも商業会社から容易に入手可能なものである。
実施例１：アスペルギルス・テレウスとヒポモナスネプチュニウムから由来のトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３３の製造
本発明のトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３３の製造方法の具体的な工程は以下のとおりである：
本発明のトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３３の製造方法の具体的な工程は以下のとおりである：
（１）鋳型の構築：
生工生物工程（上海）有限会社に依頼して、アスペルギルス・テレウスとヒポモナスネプチュニウムから由来のトランスアミナーゼ遺伝子ｔａＡＴ（アスペルギルス・テレウス）（そのヌクレオチド配列は配列表中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５に示す遺伝子配列であって、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２３に示すとおりである）とｔａＨＮ（ヒポモナスネプチュニウム）（そのヌクレオチド配列は配列表中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：６に示す遺伝子配列であって、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２４に示すとおりである）とを全遺伝子合成し、合成されたｔａＡＴ遺伝子とｔａＨＮをベクターｐＵＣ５７に接続して組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴとｐＵＣ５７−ｔａＨＮを得た。その後、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限性エンドヌクレアーゼを利用して、組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴとｐＵＣ５７−ｔａＨＮを同時に酵素消化を行って、ゲル回収を経て純化された回収破片ｔａＡＴとｔａＨＮを得て、後続のＰＣＲ の鋳型とした。
生工生物工程（上海）有限会社に依頼して、アスペルギルス・テレウスとヒポモナスネプチュニウムから由来のトランスアミナーゼ遺伝子ｔａＡＴ（アスペルギルス・テレウス）（そのヌクレオチド配列は配列表中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：５に示す遺伝子配列であって、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２３に示すとおりである）とｔａＨＮ（ヒポモナスネプチュニウム）（そのヌクレオチド配列は配列表中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：６に示す遺伝子配列であって、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２４に示すとおりである）とを全遺伝子合成し、合成されたｔａＡＴ遺伝子とｔａＨＮをベクターｐＵＣ５７に接続して組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴとｐＵＣ５７−ｔａＨＮを得た。その後、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限性エンドヌクレアーゼを利用して、組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴとｐＵＣ５７−ｔａＨＮを同時に酵素消化を行って、ゲル回収を経て純化された回収破片ｔａＡＴとｔａＨＮを得て、後続のＰＣＲ の鋳型とした。
（２）プライマーの設計：
アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子に基づいて設計した特異性プライマーは以下のとおりである：
ｔａＡＴ Ａ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＣＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＡＴTTＣ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：７)
ｔａＡＴ Ｓ： ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：８)
アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子に基づいて設計した特異性プライマーは以下のとおりである：
ｔａＡＴ Ａ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＣＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＡＴTTＣ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：７)
ｔａＡＴ Ｓ： ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：８)
ヒポモナスネプチュニウム由来のトランスアミナーゼ遺伝子に基づいて設計した特異性プライマーは以下のとおりである：
ｔａＨＮ Ａ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＧＣＡＴＡＧＧＴＴＡＣＣＧＧＴＴＣ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：９)
ｔａＨＮ Ｓ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡC−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１０)
ｔａＨＮ Ａ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＧＣＡＴＡＧＧＴＴＡＣＣＧＧＴＴＣ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：９)
ｔａＨＮ Ｓ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡC−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１０)
同時に異なる位に基づいて６対のプライマーを設計した：
ＣＭ３１Ａ：５’−ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１１)
ＣＭ３１Ｓ：５’− ＣＡＣＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１２)
ＣＭ３２Ａ：５’− ＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＣＧＡＣＧＡＡＣＧＧＴＡＣＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１３)
ＣＭ３２Ｓ：５’− ＴＴＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＡＣ −３’(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１４)
ＣＭ３３Ａ：５’− ＴＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧＧＴＧＡＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１５)
ＣＭ３３Ｓ：５’− ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１６)
ＣＭ３４Ａ：５’− ＣＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１７)
ＣＭ３４Ｓ：５’− ＴＴＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１８)
ＣＭ３５Ａ：５’− ＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＡＣＡＧＴＡＣＧＡＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１９)
ＣＭ３５Ｓ：５’− ＴＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２０)
ＣＭ３６Ａ：５’− ＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＧＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２１)
ＣＭ３６Ｓ：５’− ＧＡＣＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２２)
ＣＭ３１Ａ：５’−ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧ−３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１１)
ＣＭ３１Ｓ：５’− ＣＡＣＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１２)
ＣＭ３２Ａ：５’− ＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＣＧＡＣＧＡＡＣＧＧＴＡＣＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１３)
ＣＭ３２Ｓ：５’− ＴＴＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＡＣ −３’(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１４)
ＣＭ３３Ａ：５’− ＴＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧＧＴＧＡＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１５)
ＣＭ３３Ｓ：５’− ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＴＡＣＡＡＴＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１６)
ＣＭ３４Ａ：５’− ＣＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１７)
ＣＭ３４Ｓ：５’− ＴＴＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１８)
ＣＭ３５Ａ：５’− ＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＡＣＡＧＴＡＣＧＡＧ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：１９)
ＣＭ３５Ｓ：５’− ＴＡＣＧＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２０)
ＣＭ３６Ａ：５’− ＧＣＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＧＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２１)
ＣＭ３６Ｓ：５’− ＧＡＣＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣ −３’ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２２)
（３）新規のトランスアミナーゼの取得：
アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子に基づいて設計した特異性プライマーｔａＡＴ Ｓ（順方向プライマー）と上記６対のプライマーの中の三つの逆方向プライマー（ＣＭ３１Ａ、ＣＭ３２Ａ、ＣＭ３３Ａ）の中のいづれか一つの逆方向プライマーとを組み合せし、アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子の破片を拡張し、又は、ｔａＨＮ Ａ（逆方向プライマー）と上記６対のプライマーの中の三つの順方向プライマー（ＣＭ３６Ｓ、ＣＭ３５Ｓ、ＣＭ３４Ｓ）の中的いづれか一つとを組み合せして、ヒポモナスネプチュニウム由来のトランスアミナーゼ遺伝子の破片を拡張した。その後、上記拡張して得た出所の異なる二つの破片を整合させて、改善されたトランスアミナーゼ遺伝子を得た。
アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子に基づいて設計した特異性プライマーｔａＡＴ Ｓ（順方向プライマー）と上記６対のプライマーの中の三つの逆方向プライマー（ＣＭ３１Ａ、ＣＭ３２Ａ、ＣＭ３３Ａ）の中のいづれか一つの逆方向プライマーとを組み合せし、アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子の破片を拡張し、又は、ｔａＨＮ Ａ（逆方向プライマー）と上記６対のプライマーの中の三つの順方向プライマー（ＣＭ３６Ｓ、ＣＭ３５Ｓ、ＣＭ３４Ｓ）の中的いづれか一つとを組み合せして、ヒポモナスネプチュニウム由来のトランスアミナーゼ遺伝子の破片を拡張した。その後、上記拡張して得た出所の異なる二つの破片を整合させて、改善されたトランスアミナーゼ遺伝子を得た。
同様に、アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子に基づいて設計した特異性プライマーｔａＡＴ Ａ（逆方向プライマー）と上記６対のプライマーの中の三つの順方向プライマー（ＣＭ３３Ｓ、ＣＭ３２Ｓ、ＣＭ３１Ｓ）の中のいづれか一つの順方向プライマーとを組み合せして、アスペルギルス・テレウス由来のトランスアミナーゼ遺伝子の破片を拡張し、又は、ｔａＨＮ Ｓ（順方向プライマー）と上記６対のプライマーの中の三つの逆方向プライマー（ＣＭ３４Ａ、ＣＭ３５Ａ、ＣＭ３６Ａ）の中のいずれか一つとを組み合わせして、ヒポモナスネプチュニウム由来のトランスアミナーゼ遺伝子の破片を拡張した。その後、上記拡張して得た出所の異なる二つの破片を整合させて、改善されたトランスアミナーゼ遺伝子を得た。
具体的な改善ステップを、ｔａＡＴ Ｓ順方向プライマーとＣＭ３３Ａ逆方向プライマーにより拡張された破片とｔａＨＮ Ａ逆方向プライマーとＣＭ３３Ｓ順方向プライマーにより拡張された破片とを整合して得たトランスアミナーゼ及びｔａＡＴ Ｓ順方向プライマーとＣＭ３２Ａ逆方向プライマーにより拡張された破片とｔａＨＮ Ａ逆方向プライマーとＣＭ３２Ｓ順方向プライマーにより拡張された破片とを整合して得たトランスアミナーゼを例に詳しく説明する。
以下はトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３３を取得するプロセスである：
(1)破片Ａの取得：上記回収破片ｔａＡＴをＰＣＲ 鋳型とし、ｔａＡＴ ＳとＣＭ３３Ａをプライマーとして、ＰＣＲ 拡張を行って、産物をゲル回収して純化すると、破片Ａである。
(1)破片Ａの取得：上記回収破片ｔａＡＴをＰＣＲ 鋳型とし、ｔａＡＴ ＳとＣＭ３３Ａをプライマーとして、ＰＣＲ 拡張を行って、産物をゲル回収して純化すると、破片Ａである。
(2)破片Ｂの取得：上記回収破片ｔａＨＮをＰＣＲ 鋳型とし、ｔａＨＮ ＡとＣＭ３３Ｓをプライマーとして、ＰＣＲ 拡張を行って、産物をゲル回収して純化すると、破片Ｂである。
(3)破片ＣＭ３３の取得：上記取得した破片Ａと破片Ｂをそれぞれ鋳型及びプライマーとし、ＰＣＲ 拡張を５個循環行った後、直接にＰＣＲ体系にプライマーｔａＡＴ ＳとｔａＨＮ Ａを添加し、ＰＣＲ拡張を重ねて、産物をゲル回収して純化すると、破片ＣＭ３３である。
ＰＣＲ体系：破片Ａ １μＬ、破片Ｂ １μＬ、ＰＣＲ ＭＩＸ ５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ４.５μＬ；
ＰＣＲ プログラム：９５℃ ３ｍｉｎ；（９５℃ ３０ｓ、５７℃ ３０ｓ、７２℃ ９０ｓ、５個循環）；７２℃ １ｍｉｎ；
体系にプライマーｔａＡＴ ＳとｔａＨＮ Ａをそれぞれ ０.２μＬ添加する。
ＰＣＲ プログラム：９５℃ ３ｍｉｎ;（９５℃ ３０ｓ、５７℃ ３０ｓ、７２℃ ９０ｓ、３０個循環）；７２℃ １０ｍｉｎ。
ＰＣＲ体系：破片Ａ １μＬ、破片Ｂ １μＬ、ＰＣＲ ＭＩＸ ５μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ４.５μＬ；
ＰＣＲ プログラム：９５℃ ３ｍｉｎ；（９５℃ ３０ｓ、５７℃ ３０ｓ、７２℃ ９０ｓ、５個循環）；７２℃ １ｍｉｎ；
体系にプライマーｔａＡＴ ＳとｔａＨＮ Ａをそれぞれ ０.２μＬ添加する。
ＰＣＲ プログラム：９５℃ ３ｍｉｎ;（９５℃ ３０ｓ、５７℃ ３０ｓ、７２℃ ９０ｓ、３０個循環）；７２℃ １０ｍｉｎ。
(4)組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３の取得：ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて、上記破片ＣＭ３３とｐＥＴ−２２b（＋）とを同時に酵素消化を行って、Ｔ４ ＤＮＡ接続酵素で接続反応させ、接続産物を大腸菌ＤＨ５α菌株の受容性細胞に形質転換し、振分盤による復活を経て、アンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃の培養器で一夜培養する。上記ペトリ皿上のシングルコロニーを選択してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質に接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎで一夜振動培養し、プラスミドを抽出し、ＰＣＲ と酵素消化認定を行って、酵素消化認定結果は図３に示す。
図３はｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３プラスミドをＮｄｅＩ酵素とＸｈｏＩ酵素との二つの酵素消化を経た後の認定結果を示す図で、１はｐＥＴ２２ｂ空きベクターを表し、２はＤＮＡ分子サイズマークを表し（上から下へそれぞれ、１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ）、３はｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３−ＤＨ５αを表す。図３に示すように、酵素消化後の破片サイズが１０００ｂｐ程度である比較的に弱いストライプが目標破片であって（目標破片を切り出した後のプラスミドストライプは比較的に強い）、これにより、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３の挿入配列の挿入方向及びサイズは正確であることを確定することができ。
(5)ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３の取得：上記取得した組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３を直接に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、振分盤による復活を経てアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃で一夜培養する。上記ペトリ皿中のシングルコロニーを選択してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質５ｍＬに接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎ で一夜培養する。菌液を生工生物工程（上海）有限会社に持っていて測定し、遺伝子番号の測定を経て正確と検定された後、ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３と命名した。
ここで、番号の測定結果を図４に示した。図４に示すように、番号測定の結果においてＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３プラスミドが含む遺伝子配列は予期したものと完全に一致し、突然変異した塩基はなかった。番号測定を経て正確であると検定されると、該組換えプラスミドが目標プラスミド配列である。
(6)ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼの製造：上記ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３３菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質に接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、１６ｈ誘導した後、菌液を取り出し、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理して菌体を得た。菌体を細胞破砕し、４℃、１２０００r／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理を経て、上澄みを取得し、それが製造されたトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３３であって、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：４に示すとおりで、対応するヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.： ３に示すとおりであった。
実施例２：ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼの活性テスト１
反応瓶に１ｇ主原料（Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリドン、ＣＡＳ：９８９７７−３６−７）と１ｍＬ ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、５０ｍＬ ０.２ｍｏｌ／Lの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５まで調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.７６５ｇ イソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.０１ｇ上記ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃の恒温で１２h攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを用いて１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物を得て（中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は９０％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ−ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ４.００−３.７８（ｍ，２ｈ）、３.８０（ｍ，２ｈ）、３.６０（ｍ，１Ｈ）、１.９０（ｍ，１Ｈ）、１.７０（ｍ，１Ｈ）、１.６０−１.４０（ｍ，１２Ｈ）、１.３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍである。
反応瓶に１ｇ主原料（Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリドン、ＣＡＳ：９８９７７−３６−７）と１ｍＬ ジメチルスルホキシドを投入し、原料を分散させた後、５０ｍＬ ０.２ｍｏｌ／Lの氷浴条件で濃い塩酸でｐＨを９.３〜９.５まで調節したトリエタノールアミン緩衝液、０.７６５ｇ イソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.０１ｇ上記ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは９.５で、３０℃の恒温で１２h攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを用いて１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物を得て（中国語名称：（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノ基ピペリジン、ＣＡＳ：１８８１１１−７９−７）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は９０％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ−ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ４.００−３.７８（ｍ，２ｈ）、３.８０（ｍ，２ｈ）、３.６０（ｍ，１Ｈ）、１.９０（ｍ，１Ｈ）、１.７０（ｍ，１Ｈ）、１.６０−１.４０（ｍ，１２Ｈ）、１.３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍである。
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ−ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ４.００−３.７８（ｍ，２ｈ）、３.８０（ｍ，２ｈ）、３.６０（ｍ，１Ｈ）、１.９０（ｍ，１Ｈ）、１.７０（ｍ，１Ｈ）、１.６０−１.４０（ｍ，１２Ｈ）、１.３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍである。
実施例３：ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼの活性テスト２
反応瓶に０.１ｇ主原料（２,４−ジクロロアセトフェノン、ＣＡＳ： ２２３４−１６−４）と１.５ ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２３.５ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）、０.０３１ ｇイソプロピルアミン、０.００７５ｇピリドキサールリン酸、０.０２g 上記ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは８.０で、４５℃の恒温で２０ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物（［（Ｒ）−（＋）−１−（２,４−ジクロロフェニル）エチル］アミン、ＣＡＳ：１３３７７３−２９−２）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は８２％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
反応瓶に０.１ｇ主原料（２,４−ジクロロアセトフェノン、ＣＡＳ： ２２３４−１６−４）と１.５ ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２３.５ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）、０.０３１ ｇイソプロピルアミン、０.００７５ｇピリドキサールリン酸、０.０２g 上記ＡＨ−ＴＡＣＭ３３トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは８.０で、４５℃の恒温で２０ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物（［（Ｒ）−（＋）−１−（２,４−ジクロロフェニル）エチル］アミン、ＣＡＳ：１３３７７３−２９−２）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は８２％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ Ｄ６）：δ＝７.６７（ｄ １Ｈ）、７.６０（ｄ，１Ｈ）、７.４７（ｄｄ，１Ｈ）、７.３４（ｄｄ，４Ｈ）、７.２３−７.１２（ｍ，６Ｈ）、４.８４（ｓ，１Ｈ）、４.４７（ｑｕａｒｔｅｔ，１Ｈ）、１.３１（ｄ，３Ｈ）である。
実施例４：アスペルギルス・テレウスとヒポモナスネプチュニウム由来のトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３２の製造
本発明のトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３２の製造方法は以下の工程を含む。
本発明のトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３２の製造方法は以下の工程を含む。
（１）鋳型の構築：
実施例１に記載の方法に従って組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴ とｐＵＣ５７−ｔａＨＮを取得した。ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限性エンドヌクレアーゼを利用して、組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴとｐＵＣ５７−ｔａＨＮとを同時に酵素消化を行って、ゲル回収し純化して、回収破片ｔａＡＴとｔａＨＮを得て、次のＰＣＲの鋳型とした。
実施例１に記載の方法に従って組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴ とｐＵＣ５７−ｔａＨＮを取得した。ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限性エンドヌクレアーゼを利用して、組換えプラスミドｐＵＣ５７−ｔａＡＴとｐＵＣ５７−ｔａＨＮとを同時に酵素消化を行って、ゲル回収し純化して、回収破片ｔａＡＴとｔａＨＮを得て、次のＰＣＲの鋳型とした。
（２）プライマーの設計：
実施例１と同じである。
実施例１と同じである。
（３）新規のトランスアミナーゼの取得：
(1)破片Ｅの取得：上記回収破片ｔａＡＴをＰＣＲ 鋳型とし、ｔａＡＴ ＳとＣＭ３２Ａをプライマーとし、ＰＣＲ 拡張を行って、産物をゲル回収して純化すると、破片Ｅである。
(1)破片Ｅの取得：上記回収破片ｔａＡＴをＰＣＲ 鋳型とし、ｔａＡＴ ＳとＣＭ３２Ａをプライマーとし、ＰＣＲ 拡張を行って、産物をゲル回収して純化すると、破片Ｅである。
(2)破片Ｆの取得：上記回収破片ｔａＨＮをＰＣＲ 鋳型とし、ｔａＨＮ ＡとＣＭ３２Ｓをプライマーとし、ＰＣＲ 拡張を行って、産物をゲル回収して純化すると、破片Ｆである。
(3)破片ＣＭ３２の取得：上記取得した破片Ｅと破片Ｆをそれぞれ鋳型及びプライマーとし、ＰＣＲ拡張を５個循環を行った後、直接にＰＣＲ体系にプライマーｔａＡＴ ＳとｔａＨＮ Ａを添加し、ＰＣＲ拡張を重ねて、産物をゲル回収して純化すると、破片ＣＭ３２である。
(4)組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２の取得：ＮｄｅＩとＸｈｏＩを利用して、上記破片ＣＭ３２とｐＥＴ−２２ｂ（＋）とを同時に酵素消化を行って、T４ ＤＮＡ接続酵素で接続反応させ、接続産物を大腸菌ＤＨ５α菌株の受容性細胞に形質転換し、振分盤による復活を経て、アンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃の培養器で一夜培養する。上記ペトリ皿上のシングルコロニーを選択してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質に接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎで一夜振動培養し、プラスミドを抽出し、ＰＣＲと酵素消化認定を行って、酵素消化認定結果は図５に示す。
図５はｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２プラスミドをＮｄｅＩ酵素とＸｈｏＩ酵素との二つの酵素消化を経た後の認定結果を示す図で、１はＤＮＡ分子サイズマークを表し（上から下へそれぞれ、１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ）、２はｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２−ＤＨ５αを表し、３はｐＥＴ２２ｂ空きベクターを表す。
図５に示すように、制限酵素消化後の破片サイズが１０００ｂｐ程度である比較的に弱いストライプが目標破片であって（目標破片を切り出した後のプラスミドストライプは比較的に強い）、これにより、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２の挿入配列の挿入方向及びサイズは正確であることを確定することができ、組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２を取得できる。
(5)ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２の取得：上記取得した組換えプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２を直接に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、振分盤による復活を経てアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢペトリ皿に塗布し、３７℃で一夜培養する。上記ペトリ皿中のシングルコロニーを選択してアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質５ｍＬに接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎ で一夜培養する。菌液を生工生物工程（上海）有限会社に持っていて番号測定し、遺伝子の番号測定を経て正確と検定された後、ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２と命名した。
ここで、番号測定結果を図６に示した。図６に示すように、番号測定の結果においてＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２プラスミドが含む遺伝子配列は予期したものと完全に一致し、突然変異した塩基はなかった。番号測定を経て正確であると検定されると、該組換えプラスミドが目標プラスミド配列である。
(6)ＡＨ−ＴＡＣＭ３２トランスアミナーゼの製造：上記ＢＬ２１／ｐＥＴ２２ｂ−ＣＭ３２菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質に接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、１６h誘導した後、菌液を取り出し、１２０００r／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心処理して菌体を得た。菌体を細胞破砕し、４℃、１２０００r／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理を経て、上澄みを取得し、それが製造されたトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３２であって、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すとおりで、対応するヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.： １に示すとおりであった。
実施例５：ＡＨ−ＴＡＣＭ３２トランスアミナーゼの活性テスト
反応瓶に０.１ｇ主原料（２−アセトナフトン、ＣＡＳ：９３−０８−３）と１ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２４ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨが７.０）、０.１７ｇイソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.００４ｇ上記ＡＨ−ＴＡＣＭ３２トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは７.０で、２０℃の恒温で４８ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物（（（Ｒ）−（＋）−１−（２−ナフチル）エチルアミン、ＣＡＳ：３９０６−１６−９）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は２０％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
反応瓶に０.１ｇ主原料（２−アセトナフトン、ＣＡＳ：９３−０８−３）と１ｍＬポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を分散させた後、２４ｍＬリン酸塩緩衝液（ｐＨが７.０）、０.１７ｇイソプロピルアミン、０.０１ｇピリドキサールリン酸、０.００４ｇ上記ＡＨ−ＴＡＣＭ３２トランスアミナーゼを添加し、体系のｐＨは７.０で、２０℃の恒温で４８ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物（（（Ｒ）−（＋）−１−（２−ナフチル）エチルアミン、ＣＡＳ：３９０６−１６−９）を得て、ＧＣ検定の結果、形質転換率は２０％で、ｅ.ｅ値は１００％であった。
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７.８６−７.７６（ｍ，４Ｈ）、７.５２−７.４１ （ｍ，３Ｈ）、４.２９（ｑ，Ｊ ＝ ６.４ Ｈｚ，１Ｈ）、１.７４（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、１.４８（ｄ，Ｊ ＝ ６.４ Ｈｚ，３Ｈ）である。
本発明において、主原料で（２−アセトナフトン、ＣＡＳ：９３−０８−３）トランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３３のトランスアミナーゼ活性をテストし、主原料（Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリドン、ＣＡＳ：９８９７７−３６−７）と主原料（２,４−ジクロロアセトフェノン、ＣＡＳ： ２２３４−１６−４）でトランスアミナーゼＡＨ−ＴＡＣＭ３２のトランスアミナーゼ活性をテストし、具体的な方法は上記実施例と同じである。
実施例６
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２であるトランスアミナーゼであるＡＨ−ＴＡＣＭ３２を基に、該トランスアミナーゼを第３８位のロイシンに突然変異させて、ロイシンをイソロイシンに置換して、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２５であるトランスアミナーゼを得た。
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２であるトランスアミナーゼであるＡＨ−ＴＡＣＭ３２を基に、該トランスアミナーゼを第３８位のロイシンに突然変異させて、ロイシンをイソロイシンに置換して、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２５であるトランスアミナーゼを得た。
該トランスアミナーゼに酵素活性テストを行って検定し、検定工程は以下のようである：
突然変異体菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質１００ｍＬに接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、同時に、ＩＰＴＧ誘導剤を添加していない培養液を陰性対照とした。１６ｈ誘導した後、菌液を取り出して、１２０００r／ｍｉｎで、５ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。０.５ｇの菌体を計って再懸濁させ２.５ｍＬ ０.１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）菌体と超音波破砕器で細胞破砕し、超音波パラメータはプローブ直径が６ｍｍで、出力が２００Ｗで、２ｓ動作し、６ｓ間欠的に休憩し、合計で１０ｍｉｎ行って、超音波処理後に４℃、１２０００r／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理して超音波上澄みと沈殿物を得て、上澄みは酵素活性のテスト反応へ用いた。
突然変異体菌液をアンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬ含有するＬＢ液体培養基質１００ｍＬに接種し、３７℃、１８０r／ｍｉｎで、ＯＤ６００値が０.６〜０.８になるまで振動培養し、最終濃度が０.２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、培養液を２５℃にして誘導発現し、同時に、ＩＰＴＧ誘導剤を添加していない培養液を陰性対照とした。１６ｈ誘導した後、菌液を取り出して、１２０００r／ｍｉｎで、５ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。０.５ｇの菌体を計って再懸濁させ２.５ｍＬ ０.１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）菌体と超音波破砕器で細胞破砕し、超音波パラメータはプローブ直径が６ｍｍで、出力が２００Ｗで、２ｓ動作し、６ｓ間欠的に休憩し、合計で１０ｍｉｎ行って、超音波処理後に４℃、１２０００r／ｍｉｎで、２０ｍｉｎ遠心処理して超音波上澄みと沈殿物を得て、上澄みは酵素活性のテスト反応へ用いた。
反応瓶に０.１ｇ主原料（アセトフェノン、ＣＡＳ：９８−８６−２）を投入して、原料を１３.５ｍＬ ０.１Ｍ リン酸塩緩衝液（ｐＨ８.０）と、０.３５６ｇ Ｄ−アラニンと、０.００２ｇ β−ＮＡＤ＋と、０.０１９２ｇ 乳酸脱水素酵素と、０.００６ｇ グルコース脱水素酵素と、０.４３２ グルコースと、０.００４ｇ ピリドキサールリン酸と、２.５ｍＬ 配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２５であるＲ体Ω−トランスアミナーゼとに分散させ、体系のｐＨは７.０で、３０℃の恒温で１６ｈ攪拌した。体系のｐＨを２Ｎ ＮａＯＨを利用して１０以上に調節し、酢酸エチルを利用して二回抽出し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗生成物 （中国語名称：（Ｒ）−１−フェネチルアミン，ＣＡＳ：３８８６−６９−９）を得て、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）検定の結果、形質転換率は８３％で、ｅ.ｅ値は９９.５％であった。
得られた製品の核磁気データは、１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ ＭＨｚ，３００ Ｋ）δ （ｐｐｍ）：７.３６−７.２９（ｍ，４Ｈ）、７.２６−７.１９（ｍ，１Ｈ）、４.１１（ｑ，Ｊ＝６.６ Ｈｚ，１Ｈ）、１.５３ （ｂｓ，２ｈ）、１.３８（ｄ，Ｊ＝６.６ Ｈｚ，３Ｈ）である。
当該結果から分かるように、本発明の上記実施例中のトランスアミナーゼによると、いずれも類似する収率及び鏡像体の純度を得られ、対応するＲ体キラルアミンを得ることができる。
上述のように、本発明の上記実施例によると、以下のような技術効果を実現できる：本発明に開示された新規のトランスアミナーゼは、アミノ基供与体の中のアミノ基がプロキラルケトン又はアルデヒド系へ移転することを触媒し、対応するＲ体のキラルアミンを生成する。本発明の新規のトランスアミナーゼの合成方法によると高純度の目標産物が得られ、得られた製品の光学純度は９８％以上に安定することになる。上述した合成方法に用いられる原料は容易に入手できるものであって、方法は簡単で、化学反応の条件は温和であって、収率及び鏡像体の純度も高く、生産全般において操作が簡単で、実行可能なものであって且つ汚染の低い合成工程で、キラルアミンの製造のために新しいルート及び方法を提供した。
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。当業者であれば本発明に様々な修正や変形が可能である。本発明の精神や原則内での如何なる修正、置換、改良などは本発明の保護範囲内に含まれる。
Claims (11)
- アミノ酸配列が、
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：４に示すアミノ酸配列、
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：２に示すアミノ酸配列中の第３８位のロイシンをイソロイシンに置換したアミノ酸配列
から選ばれた一つであることを特徴とするトランスアミナーゼ。 - 請求項１に記載のトランスアミナーゼの符号化を行うことを特徴とするヌクレオチド。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.：３又は２５に示すヌクレオチド配列から選ばれたことを特徴とする請求項２に記載のヌクレオチド。
- 請求項２または３に記載のヌクレオチドが有効に接続されていることを特徴とする組換えベクター。
- 請求項４に記載の組換えベクターを有することを特徴とする宿主細胞。
- ケトン系化合物と、請求項１に記載のトランスアミナーゼと、ピリドキサールリン酸と、アミノ基供与体とを、反応系で反応させてキラルアミンを得ることを特徴とするキラルアミンの合成方法。
- 上記ケトン系化合物は
- 上記ケトン系化合物
- 上記反応系にカオトロピック剤をさらに含有し、上記カオトロピック剤はジメチルスルホキシド又はポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
- 上記ポリエチレングリコールがＰＥＧ−４００であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 上記Ｃ１〜Ｃ８アルキル基はＣ１〜Ｃ８直鎖アルキル基で、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基はピリジン基で、アルコキシル基はＣ１〜Ｃ６アルコキシル基で、Ｃ５〜Ｃ１０複素環基の中の複素環基はピペリジンで、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基の中のアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基の中のヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環基中の炭素環基又はＣ５〜Ｃ１０複素環基中の複素環基の置換基はそれぞれ独自に、Ｃ１〜Ｃ６直鎖アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル基であって、アミノ基供与体はイソプロピルアミン又はＤ−アラニンであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
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