CN104328094A - 转氨酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转氨酶及其应用。该转氨酶具有SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性或经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的氨基酸序列，其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1倍。本发明的转氨酶能够高效地合成手性纯度较高的R构型手性胺，适合手性胺合成的工业化应用。

Description

转氨酶及其应用
技术领域
本发明涉及手性化合物的合成领域，具体而言，一种转氨酶及其应用。 
背景技术
手性胺广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体，很多手性胺还可成为重要的手性助剂和手性拆分试剂。所以，手性胺化合物的制备有很重要的经济意义。 
现阶段，手性胺的制备主要采用化学还原的方法，利用前手性酮制备得到光学活性的胺。在Pd/C及喹宁的催化作用下，前手性酮与甲酸以及无机氨/有机伯胺进行反应生成手性胺；另有研究者以钌配合物为催化剂，通过前手性酮不对称胺化还原得到手性胺(Renat Kadyrov et al.Highly Enantioselective Hydrogen-Transfer Reductive Amination:Catalytic Asymmetric Synthesis of Primary Amines.Angewandte Chemie International Edition.2003，42(44)，第5472-5474页)，此类反应中金属催化剂是非常关键的因素，且对金属催化剂要求苛刻，反应需要在高压条件下完成，操作设备要求高，同时金属催化剂价格昂贵，对环境污染也较大(Ohkuma T et al.Trans-RuH(eta1-BH4)(binap)(1，2-diamine):a catalyst for asymmetric hydrogenation of simple ketones under base-free conditions.Journal of the American Chemical Society.2002，124(23)，第6508-6509页)。 
氨基转移酶，也称为转氨酶，可以催化一个氨基与羰基互换的过程。ω-转氨酶属于转氨酶之一，但有少许不同。ω-转氨酶是指一类酶，只要在其催化的转氨反应中，反应的底物或产物中不含有α-氨基酸，就可以称该酶为ω-转氨酶。ω-转氨酶可以利用酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，高效生产手性胺。因其底物相对廉价、产物纯度高的特点，受到研究人员越来越多的关注。人们希望能充分发掘其潜力，将其推广用于手性胺的工业生产，但目前对该酶的研究及应用仍然比较少。 
本领域仍然存在对具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的需求，以满足制备手性胺化合物的需求。 
发明内容
本发明旨在提供一种新的转氨酶及其应用，以适应手性胺的工业化生产需求。 
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，该转氨酶的氨基酸序列包含选自如下序列的序列：a)如SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性 且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；c)在SEQ ID NO.：2或4中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而由SEQ ID NO.：2衍生而来且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的蛋白质，其中该氨基酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1倍。 
进一步地，转氨酶的氨基酸序列是将SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列的第38位上的亮氨酸替换为异亮氨酸的氨基酸序列。 
根据本发明的另一个方面，提供了一种核苷酸，该核苷酸编码上述的转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体。 
进一步地，上述核苷酸的序列包含选自如下序列的序列：a)如SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列；c)在高严谨条件下与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列杂交且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列；其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1倍。 
根据本发明的再一个方面，提供了一种重组载体，该重组载体中有效连接有上述核苷酸。 
进一步地，重组载体为pET22b-CM32或pET22b-CM33。 
根据本发明的又一个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化或转染有上述重组载体。 
根据本发明的一个方面，提供了一种手性胺的方法，该方法包括如下步骤：使酮类化合物、上述转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，磷酸吡哆醛和氨基供体在反应体系中反应，由此获得手性胺。 
进一步地，上述酮类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，酮类化合物选自
进一步地，反应体系中还含有促溶剂，促溶剂为二甲基亚砜或聚乙二醇，优选聚乙二醇为PEG-400。 
进一步地，C1～C8烷基为C1～C8直链烷基，C5～C10杂芳基为吡啶基团，烷氧基为C1～C6烷氧基，C5～C10杂环基中的杂环基为哌啶，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基上的取代基各自独立为C1～C6直链烷基、C1～C6烷氧基，氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。 
应用本发明的技术方案，通过利用具有高度立体选择性的R型ω-转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，可以高效地合成手性纯度较高的R构型的手性胺，适合用于手性胺的工业化生产。 
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 
图1为本发明一个实施方式所述的来源于土曲霉和海王生丝单胞菌的转氨酶在手性胺合成中的应用的化学反应流程图； 
图2为本发明一个实施方式所述的来源于土曲霉和海王生丝单胞菌的转氨酶在手性胺合成中的应用的化学反应方程式； 
图3示出了本发明的实施例1中的酶切鉴定结果； 
图4示出了本发明实施例1中的突变基因PCR后的测序结果； 
图5示出了本发明的实施例4中的酶切鉴定结果；以及 
图6示出了本发明实施例4中的突变基因PCR后的测序结果。 
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 
定义 
术语“任选/任意”或“任选地/任意地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，根据下文的定义，“任选取代的烷基”是指“未取代的烷基”(未被取代基取代的烷基)或“取代的烷基”(被取代基取代的烷基)。 
本文所用C1～Cn包括C1～C2、C1～C3、……C1～Cn。举例而言，所述“C1～C4”基团是指该部分中具有1～4个碳原子，即基团包含1个碳原子，2个碳原子、3个碳原子或4个碳原子。 
本文单独或组合使用的术语“烷基”是指任选取代的直链或任选取代的支链的脂肪族烃 类。本文的“烷基”优选可具有1～约20个碳原子，例如具有1～约10个碳原子，具有1～约8个碳原子，或1～约6个碳原子，或1～约4个碳原子或1～约3个碳原子。本文单独或组合使用的术语“烷氧基”是指烷基醚基(O～烷基)，烷氧基的非限定性实施例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。 
本文单独或组合使用的术语“卤代”或“卤素取代”是指任选被取代的基团(如烷基、烯基和炔基)的其中一个或多个氢原子被替换成氟、氯、溴、碘原子或其组合。 
本文单独或组合使用的术语“芳香基/芳基”是指任选取代的芳香烃基，其具有6～约20个，如6～12个或6～10个成环碳原子。其可以是稠合芳环或非稠合芳环。 
本文单独或组合使用的术语“杂芳基”是指任意取代的一价杂芳基，其包含约5至约20个，如5至12个或5至10个骨架成环原子，其中一个或多个(如1～4个、1～3个、1～2个)成环原子为杂原子，所述杂原子独立地选自氧、氮、硫、磷、硅、硒和锡中的杂原子，但不限于此。所述基团的环不包含两个相邻的O或S原子。杂芳基包括单环杂芳基或多环杂芳基(例如双环杂芳基、三环杂芳基等)。 
本文单独或组合使用的术语“杂环”或“杂环基”是指非芳香杂环，包括杂环烷基和杂环烯基。其中一个或者多个(如1～4个、1～3个、1～2个)成环的原子是杂原子，如氧、氮或硫原子。杂环基可以包括单环杂环基(杂环基具有一个环)或多环杂环基(例如，双环杂环基(杂环基具有两个环)、三环杂环基等)。 
本文单独或组合使用的术语“碳环基”是指非芳香族的碳环，包括环烷基和环烯基。环烷基可以是单环环烷基或多环环烷基(例如，有2、3或4个环；如双环环烷基)，其可以是螺环或桥环。碳环基可以具有3至20碳原子，例如具有3～约15个成环碳原子或3～约10个成环碳原子或3～6个成环碳原子，并可以具有0、1、2或3个双键和/或0、1或2个三键。例如具有3～8个或3～6个成环碳原子的环烷基。 
“卤素”是指氟，氯，溴，碘。首选是氟，氯和溴。氰基是指“-CN”；羟基是指“-OH”；巯基是指“-SH”；氨基是指“-NH2”。 
术语“被取代的”意思是在一个特定的原子上一个或更多的氢被指定的基团所替代，如果指定的原子的正常化合价在现有的情况下没有超出，那么取代后结果是一个稳定的化合物。 
如背景技术所提到的，现有技术中的ω-转氨酶仍存在不能满足制备手性胺化合物需求的缺陷，为了改善上述状况，本发明提供了一种R型ω-转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，该R型ω-转氨酶的氨基酸序列包含选自如下序列的序列：a)如SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；c)在SEQ ID NO.：2或4中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的由SEQ ID NO.：2或4所衍生的蛋白质，其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1倍。 
本发明的上述R型ω-转氨酶是指具有高度R构型立体选择性的ω-转氨酶，在一个实施方案中，本发明的转氨酶是指序列如SEQ ID NO.：2或4所示的转氨酶。上述转氨酶是本发明 采用分子生物学技术，将来源于土曲霉(Aspergillus terreus)和海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)的转氨酶基因taAT和taHN进行突变及分子改造获得新的转氨酶。 
上述与SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的氨基酸序列是指与SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列至少具有例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的同一性且不为SEQ ID NO.：5所示的氨基酸序列的序列。在保留SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列中对转氨酶的催化活性起关键作用的氨基酸序列保持不变的情况下，本领域技术人员可以对其余非活性位点的氨基酸序列进行改变，使得到的转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列的同一性至少在80％以上。这样得到转氨酶具有与氨基酸序列为SEQ ID NO.：2或4所示的转氨酶相同的转氨酶活性。 
同理，在保留SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列中对转氨酶的催化活性起关键作用的氨基酸序列保持不变的情况下，可以对上述SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列中的氨基酸进行取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，这样，由SEQ ID NO.：2或4所衍生的蛋白质就能保持SEQ ID NO.：2或4所示的转氨酶的高度立体选择性。其中，取代、缺失或添加的碱基可以为一个或多个，例如1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个或50个氨基酸，例如保守氨基酸的取代，其中该氨基酸序列不是如SEQ ID NO.：5所示的氨基酸序列；“保守氨基酸的替换”是指如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr的组合。 
其中立体选择性是指，当一个反应生成A、B两个立体异构体时，A的产量比B多。高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1，例如至少约1.2倍，至少约1.3倍，至少约1.4倍，至少约1.5倍，至少约2倍，至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约70倍，至少约90倍，至少约100倍，或更高。 
在发明中，上述R型ω-转氨酶的修饰物可以是化学修饰物，如酰基化、烷基化、PEG化产物，只要这些修饰物保留了上述高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性即可。上述功能等同物是指能够实现R型ω-转氨酶活性的其他多肽片段。上述功能片段是指保留了高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的蛋白质片段。上述变体是指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个氨基酸进行改变，即通过取代、插入和/或缺失而从亲本蛋白衍生出来的多肽。 
在本发明一种优选的实施例中，该转氨酶的氨基酸序列是将SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列的第38位上的亮氨酸替换为异亮氨酸的氨基酸序列，这种性质相似的氨基酸之间的替换使得具有这种替换后的氨基酸序列的转氨酶保持了具有SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列的转氨酶的活性和高度立体选择性。 
本发明所获得的上述转氨酶拥有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶，可以高效地合成手性纯度较高的R构型的手性胺，适合用于手性胺合成的工业化。本发明通过对拼接对象及拼接位点的优化选择，使得改造所得的新的转氨酶变体在既不影响蛋白的折叠，又能保留转氨酶的活性，拥有较高的转氨酶活性，且有高度立体选择性。 
在另一种典型的实施方式中，提供了一种核苷酸，该核苷酸编码上述R型ω-转氨酶或其 修饰物、功能等同物、功能片段或变体。本发明的上所述的R型ω-转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体的核苷酸的编码规则符合常规的密码子使用表。 
在本发明一种更优选的实施例中，上述核苷酸的序列包含选自如下序列的序列：a)如SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列；c)在高严谨条件下与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列杂交且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列；高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1。 
上述与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，例如至少具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性，其中该核苷酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列的基础上，对转氨酶催化活性起关键作用的核苷酸序列保持不变的情况下，本领域技术人员可以对其余非活性位点的核苷酸序列进行改变，使得到的转氨酶的核苷酸序列与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列的同一性至少在80％以上。这样得到转氨酶具有与核苷酸序列为SEQ ID NO.：1或3的转氨酶相同的转氨酶活性。 
上述在高严谨条件下与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列杂交且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列；同样，在SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列的基础上，通过在高严谨条件下筛选能够与其杂交并编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，这样得到的SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列的变体序列，具有与核苷酸序列为SEQ ID NO.：1或3的转氨酶相同的转氨酶活性。 
其中立体选择性是指，当一个反应生成A、B两个立体异构体时，A的产量比B多。高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1，例如至少约1.2倍，至少约1.3倍，至少约1.4倍，至少约1.5倍，至少约2倍，至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约70倍，至少约90倍，至少约100倍，或更高。 
一个示例性的高严谨条件可为用6 X SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2 X SSC，0.1％SDS和1 X SSC，0.1％SDS各洗膜一次。 
本发明中所使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的活性。本领域技术人员公知如何利用该高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。 
本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述氨基酸序列或多核苷酸时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在上述氨基酸序列或核苷酸序列两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在所述多核苷酸的两端添加 合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定上述序列将不能真实地覆盖这些情形。 
本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，上述核苷酸序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如将由CTT编码的亮氨酸Leu替换为CTA、CTC或CTG.。替换的密码子数目可以是一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。 
在发明的又一方面，提供了一种重组载体，该重组载体中有效连接有上述任一种核苷酸。本发明的重组载体包括但不限于重组表达载体，还可以包括重组克隆载体。重组载体可以是原核表达载体或真核表达载体，在本发明一个具有的实施例中，上述重组载体是可诱导表达的重组原核表达载体，如利用IPTG诱导基因表达的pET系列载体，如pET22b载体。在本发明中，更优选带有SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：3所示核苷酸序列的重组载体为pET22b-CM32和pET22b-CM33。其中，“有效连接”是指这样的连接方式，即将多核苷酸置于载体的适当位置，使得多核苷酸正确地、顺利地复制、转录和/或翻译。 
在本发明的再一方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化或转染有上述任一种的重组载体。本发明的宿主细胞包括原核宿主细胞和真核宿主细胞，在本发明的一个实施例中，上述宿主细胞是原核宿主细胞，如大肠杆菌，更优选大肠杆菌DH5α(DE3)。 
在本发明的另一方面中，提供了一种合成手性胺的方法，该方法包括如下步骤：使酮类化合物、上述任一种的R型ω-转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，磷酸吡哆醛和氨基供体在反应体系中反应，由此获得手性胺。本发明的合成手性胺的方法在本领域常规的通过生物酶催化反应来制备手性化合物的方法基础上，利用本发明转氨酶，并适当调整反应体系的各种反应原料的成分、比例、用量、pH值、温度、反应时间等参数即可。 
在本发明一种优选的实施例中，上述酮类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，酮类化合物选自 上述酮类化合物为商业化的原料或者易制备的原料且价格低廉，可以满足规模化生产的需要。 
在本发明另一种优选的实施例中，上述反应体系中还含有促溶剂，促溶剂为二甲基亚砜或聚乙二醇，优选聚乙二醇为PEG-400。促溶剂的作用能够很好地溶解上述原料，以方便反应的进行，PEG-400的促溶效果更好。 
在本发明又一种优选的实施例中，上述C1～C8烷基为C1～C8直链烷基，C5～C10杂芳基为吡啶基团，烷氧基为C1～C6烷氧基，C5～C10杂环基中的杂环基为哌啶，C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基上的取代基各自独立为C1～C6直链烷基、C1～C6烷氧基，氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。上述原料为商业化的原料或者易制备的原料且价格低廉，可以满足规模化生产的需要。 
在本发明的一个优选的实施例中，上述反应体系含有使反应体系的pH值维持在7.0～9.5范围内的缓冲液；和/或其中酮类化合物与促溶剂的用量比为1g/1mL～15mL；和/或其中，酮类化合物与缓冲液的用量比为1g/15mL～50mL；和/或其中酮类化合物与磷酸吡哆醛的用量比为1g/0.01g～0.1g；和/或其中酮类化合物与氨基供体的用量比为1eq/1eq～5eq；和/或其中酮类化合物与R型ω-转氨酶的用量比为1g/0.2g～10g；和/或其中反应体系的温度为20～45℃且反应12h～48h；和/或其中缓冲液为磷酸盐缓冲液或pH＝9.3～9.5的三乙醇胺缓冲液。 
在本发明另一个优选的实施例中，上述方法还包括用碱调节反应体系至pH≥10，用有机溶剂萃取水相中的产品手性胺的步骤，优选地，碱为氢氧化钠或氢氧化钾，有机溶剂为乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或2-甲基四氢呋喃。 
在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种R型手性胺，该R型手性胺采用上述任一种方法合成。利用本发明的上述转氨酶所制备的R型手性胺，手性纯度高，可高达98％以上。 
下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。 
下述实施例中如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。 
实施例1：制备来源于土曲霉和海王生丝单胞菌的转氨酶AH-TACM33 
本发明的转氨酶AH-TACM33的制备方法的具体步骤如下： 
(1)模板的构建： 
委托生工生物工程(上海)有限公司全基因合成来源于土曲霉和海王生丝单胞菌的转氨酶基因taAT(土曲霉)(其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.：5所示的基因序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.：23所示)和taHN(海王生丝单胞菌)(其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.：6所示的基因序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.：24所示)，合成的taAT基因和taHN基因分别连接到pUC57载体上，获得重组质粒pUC57-taAT和pUC57-taHN。然后利用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶将重组质粒pUC57-taAT和pUC57-taHN同时进行酶切，经胶回收获得纯化的回收片段taAT和taHN，并将其作为下一步PCR的模板。 
(2)引物设计： 
根据土曲霉来源的转氨酶基因设计的特异性引物如下： 
taAT A:5’-CCGCTCGAGGTTACGCTCGTTGTAGTCAATTTC-3’(SEQ ID NO.：7) 
taAT S:5’-GGAATTCCATATGGCGTCTATGGACAAAG-3’(SEQ ID NO.：8) 
根据海王生丝单胞菌来源的转氨酶基因设计的特异性引物如下： 
taHN A:5’-CCGCTCGAGCGGTGCATAGGTTACCGGTTC-3’(SEQ ID NO.：9) 
taHN S:5’-GGAATTCCATATGCTGACCTTCCAAAAAGTACTGAC-3’(SEQ ID NO.：10) 
同时根据不同位点设计了6对引物，分别为： 
CM31A：5’-GAACTTCAGACCGCGGGTGACAATCAG-3’(SEQ ID NO.：11) 
CM31S：5’-CACCCGCGGTCTGAAGTTCCTGC-3’(SEQ ID NO.：12) 
CM32A：5’-CGGCGGAACACGACGAACGGTACG-3’(SEQ ID NO.：13) 
CM32S：5’-TTCGTCGTACTCCGCCGGGCGCAC-3’(SEQ ID NO.：14) 
CM33A：5’-TAGCCTGCGCCCTCGGTCAGGTGAG-3’(SEQ ID NO.：15) 
CM33S：5’-GACCGAGGGCGCAGGCTACAATATC-3’(SEQ ID NO.：16) 
CM34A：5’-CCCTTCAGACCACGCGTAACGATGATC-3’(SEQ ID NO.：17) 
CM34S：5’-TTACGCGTGGTCTGAAGGGTGTGCGTG-3’(SEQ ID NO.：18) 
CM35A：5’-CCAGGCGGAGTACGACGTACAGTACGAG-3’(SEQ ID NO.：19) 
CM35S：5’-TACGTCGTGTTCCGCCTGGCGCAATC-3’(SEQ ID NO.：20) 
CM36A：5’-GCCGCTGCCTTCCGTCGCGTTACC-3’(SEQ ID NO.：21) 
CM36S：5’-GACGGAAGGCAGCGGCTTCAACATC-3’(SEQ ID NO.：22) 
(3)新转氨酶的获得： 
按照在土曲霉来源的转氨酶基因上设计的特异性引物taAT S(正向引物)与上述6对引物中的3条反向引物(CM31A、CM32A、CM33A)中的任一条反向引物进行组合，用来扩增土曲霉来源的转氨酶基因的片段；或者利用taHN A(反向引物)与上述6对引物中的3条正向引物(CM36S、CM35S以及CM34S)中的任一条进行组合，用来扩增海王生丝单胞菌来源的转氨酶基因的片段。然后将上述扩增得到的来源不同的两个片段进行整合，从而得到改造的转氨酶基因。 
同样，按照在土曲霉来源的转氨酶基因上设计的特异性引物taAT A(反向引物)与上述6对引物中的3条正向引物(CM33S、CM32S、CM31S)中的任一条正向引物进行组合，用来扩增土曲霉来源的转氨酶基因的片段；或者利用taHN S(正向引物)与上述6对引物中的3条反向引物(CM34A、CM35A以及CM36A)中的任一条进行组合，用来扩增海王生丝单胞菌来源的转氨酶基因的片段。然后将上述扩增得到的来源不同的两个片段进行整合，从而得到改造的转氨酶基因。 
具体改造步骤以taAT S正向引物和CM33A反向引物扩增的片段与taHN A反向引物和CM33S正向引物扩增得到的片段整合得到的转氨酶以及taAT S正向引物和CM32A反向引物扩增的片段与taHN A反向引物和CM32S正向引物扩增的片段整合得到的转氨酶为例进行详细说明。 
以下是获得转氨酶AH-TACM33的步骤： 
①片段A的获得：以上述回收片段taAT为PCR模板，以taAT S和CM33A为引物，进行PCR扩增，产物经胶回收纯化后即为片段A。 
②片段B的获得：以上述回收片段taHN为PCR模板，以taHN A和CM33S为引物，进行PCR扩增，产物经胶回收纯化后即为片段B。 
③片段CM33的获得：以上述获得的片段A和片段B互为模板和引物，PCR扩增5个循环后直接向PCR体系中添加引物taAT S和taHN A，重叠PCR扩增，产物经胶回收纯化后即为片段CM33。 
PCR体系：片段A 1μL，片段B 1μL，PCR MIX 5μL，ddH2O 4.5μl； 
PCR程序：95℃3min；(95℃30s，57℃30s，72℃90s，5个循环)；72℃1min； 
体系中加入引物taAT S和taHN A各0.2μL。 
PCR程序：95℃3min；(95℃30s，57℃30s，72℃90s，30个循环)；72℃10min。 
④重组质粒pET22b-CM33的获得：利用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ将上述片段CM33和pET-22b(+)同时酶切，T4 DNA连接酶进行连接反应，并将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中，经摇床复苏后涂布于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB培养皿中，37℃培养箱培养过夜。挑取上述培养皿上的单菌落接种于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜，提取质粒，经PCR和酶切鉴定，酶切鉴定结果见图3。 
图3显示的是pET22b-CM33质粒经Nde Ⅰ酶和Xho Ⅰ酶双酶切后的鉴定图，其中，1表示pET22b空载体；2表示DNA分子大小标记(从上至下分别为10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)；3表示pET22b-CM33-DH5α。从图3中可以看出，酶切后的片段大小为1000bp左右的比较弱的条带即为目的片段(切除目的片度后的质粒条带相对较强)，从而可以确定，重组质粒pET22b-CM33的插入序列的插入方向和大小正确。 
⑤BL21/pET22b-CM33的获得：将上述获得的重组质粒pET22b-CM33直接转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经摇床复苏后涂布于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB培养皿中，37℃培养过夜。挑取上述培养皿中的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养过夜。取菌液送至生工生物工程(上海)有限公司测序，经基因测序验证正确后，命名为BL21/pET22b-CM33。 
其中，测序结果见图4。从图4中可以看出，测序结果中BL21/pET22b-CM33质粒所携带的基因序列与预期完全一致，无突变碱基。经测序验证正确后，将该重组质粒即为目标质粒序列。 
⑥AH-TACM33转氨酶的制备：取上述BL21/pET22b-CM33菌液转接于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养至OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，并将培养液转置25℃进行诱导表达，诱导16h后，取出菌液，12000r/min离心10min收集菌体。菌体经细胞破碎后于4℃，12000r/min离心20min获得上清 液，即为制备所得的转氨酶AH-TACM33，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示。 
实施例2：AH-TACM33转氨酶的活性实验1 
向反应瓶中加入1g主原料(N-BOC-哌啶酮，CAS：79099-07-3)和1mL二甲基亚砜，原料分散后，加入50mL 0.2mol/L在冰浴条件下用浓盐酸调节pH为9.3～9.5的三乙醇胺缓冲液、0.765g异丙胺、0.01g磷酸吡哆醛和0.01g上述AH-TACM33转氨酶，体系pH为9.5，30℃恒温搅拌12h。体系用2N NaOH调节pH至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品(中文名称：(R)-1-N-Boc-3-氨基哌啶，CAS：188111-79-7)，气相色谱法(GC)检测，转化率90％，e.e值100％。 
所得产品的核磁数据如下：1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ4.00-3.78(m，2H)，3.80(m，2H)，3.60(m，1H)，1.90(m，1H)，1.70(m，1H)，1.60-1.40(m，12H)，1.30(m，1H)ppm 
实施例3：AH-TACM33转氨酶的活性实验2 
向反应瓶中加入0.1g主原料(2，4-二氯苯乙酮，CAS:2234-16-4)和1.5mL聚乙二醇PEG-400，原料分散后，加入23.5ml磷酸盐缓冲液(pH8.0)、0.031g异丙胺、0.0075g磷酸吡哆醛，0.02g上述AH-TACM33转氨酶，体系pH为8.0，45℃恒温搅拌20h。体系用2N NaOH调节pH至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品((R)-2，4-二氯苯乙胺)，GC检测，转化率82％，e.e值100％。 
所得产品的核磁数据如下：1H NMR(400MHz，DMSO D6):δ＝7.67(d 1H)，7.60(d，1H)，7.47(dd,1H)，7.34(dd，4H)，7.23-7.12(m，6H)，4.84(s，1H)，4.47(quartet，1H)，1.31(d，3H) 
实施例4：制备来源于土曲霉和海王生丝单胞菌的转氨酶AH-TACM32 
本发明的转氨酶AH-TACM32的制备方法的具体步骤如下： 
(1)模板的构建： 
按实施例1所述的方法获得重组质粒pUC57-taAT和pUC57-taHN。利用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶将重组质粒pUC57-taAT和pUC57-taHN同时进行酶切，经胶回收纯化后获得回收片段taAT和taHN，并将其作为下一步PCR的模板。 
(2)引物设计： 
同实施例1。 
(3)新转氨酶的获得： 
①片段E的获得：以上述回收片段taAT为PCR模板，以taAT S和CM32A为引物，进行PCR扩增，产物经胶回收纯化后即为片段E。 
②片段F的获得：以上述回收片段taHN为PCR模板，以taHN A和CM32S为引物，进行PCR扩增，产物经胶回收纯化后即为片段F。 
③片段CM32的获得：以上述获得的片段E和片段F互为模板和引物，PCR扩增5个循环后直接向PCR体系中添加引物taAT S和taHN A，重叠PCR扩增，产物经胶回收纯化后即为片段CM32。 
④重组质粒pET22b-CM32的获得：利用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ将上述片段CM32和pET-22b(+)同时酶切，T4 DNA连接酶进行连接反应，并将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中，经摇床复苏后涂布于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB培养皿中，37℃培养箱培养过夜。挑取上述培养皿上的单菌落接种于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养过夜，提取质粒，经PCR和酶切鉴定，酶切鉴定结果见图5。 
图5显示的是pET22b-CM32质粒经Nde Ⅰ酶和Xho Ⅰ酶双酶切后的鉴定图，其中，1表示DNA分子大小标记(从上至下分别为10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)；2表示pET22b-CM32-DH5α，3表示pET22b空载体。 
从图5中可以看出，酶切后的片段大小为1000bp左右的比较弱的条带即为目的片段(切除目的片度后的质粒条带相对较强)，从而可以确定，重组质粒pET22b-CM32的插入序列的插入方向和大小正确，获得重组质粒pET22b-CM32。 
⑤BL21/pET22b-CM32的获得：将上述获得的重组质粒pET22b-CM32直接转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经摇床复苏后涂布于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB培养皿中，37℃培养过夜。挑取上述培养皿中的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养过夜。取菌液送至生工生物工程(上海)有限公司测序，经基因测序验证正确后，命名为BL21/pET22b-CM32。 
其中，测序结果见图6。从图6中可以看出，测序结果中BL21/pET22b-CM32质粒所携带的基因序列与预期完全一致，无突变碱基。经测序验证正确后，将该重组质粒即为目标质粒序列。 
⑥AH-TACM32转氨酶的制备：取上述BL21/pET22b-CM32菌液转接于含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养至OD600＝0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，并将培养液转置25℃进行诱导表达，诱导16h后，取出菌液，12000r/min离心10min收集菌体。菌体经细胞破碎后于4℃，12000r/min离心20min获得上清液，即为制备所得的转氨酶AH-TACM32，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。 
实施例5：AH-TACM32转氨酶的活性实验 
向反应瓶中加入0.1g主原料(2-萘乙酮，CAS：93-08-3)和1mL聚乙二醇PEG-400，原料分散后，加入24ml磷酸盐缓冲液(pH为7.0)、0.17g异丙胺、0.01g磷酸吡哆醛和0.004g上述AH-TACM32转氨酶，体系pH为7.0，20℃恒温搅拌48h。体系用2N NaOH调节pH至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，GC检测，转化率20％，e.e值100％。 
所得产品的核磁数据如下：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.86-7.76(m，4H)，7.52-7.41 (m，3H)，4.29(q，J＝6.4Hz，1H)，1.74(br s，2H)，1.48(d，J＝6.4Hz，3H) 
本发明还用主原料(2-萘乙酮，CAS：93-08-3)验证了转氨酶AH-TACM33的转氨酶活性，用主原料(N-BOC-哌啶酮，CAS：79099-07-3)和主原料(2，4-二氯苯乙酮，CAS:2234-16-4)验证了转氨酶AH-TACM32的转氨酶活性，具体方法步骤同上述实施例。 
实施例6 
在氨基酸序列为SEQ ID NO.：2的转氨酶即AH-TACM32的基础上，对该转氨酶在38位的亮氨酸进行定点突变，将亮氨酸替换为异亮氨酸，得到序列为SEQ ID NO.：25的转氨酶。 
对该转氨酶进行酶活性实验进行检测，检测步骤如下： 
将突变体菌液转接于100ml含氨苄青霉素终浓度为50μg/ml的LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养至OD600值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，并将培养液转置25℃进行诱导表达，同时设立不加IPTG诱导剂的培养液为阴性对照。诱导16h后，取出菌液，12000r/min离心5min收集菌体。称取0.5g菌泥重悬与2.5mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)菌体用超声破碎仪破碎细胞，超声参数为：探头直径6mm，功率200W，工作2s，间歇6s，共计10min，超声完毕后于4℃，12000r/min离心20min获得超声上清液和沉淀，上清液用于投反应验证酶活。 
向反应瓶中加入0.1g主原料(苯乙酮，CAS：98-86-2)，原料分散与13.5mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)、0.356g D-丙氨酸、0.002g β-NAD+，0.0192g乳酸脱氢酶0.006g葡萄糖脱氢酶，0.432葡萄糖，0.004g磷酸吡哆醛和2.5mL序列为SEQ ID NO.：25编码的R型Ω-转氨酶，体系pH为7.0，30℃恒温搅拌16h。体系用2N NaOH调节pH至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品(中文名称：(R)-1-苯乙胺，CAS：3886-69-9)，气相色谱(GC)检测，转化率83％，e.e值99.5％。 
所得产品的核磁数据如下：1H NMR(CDCl3，400MHz，300K)δ(ppm)：7.36-7.29(m，4H)，7.26-7.19(m，1H)，4.11(q，J＝6.6Hz，1H)，1.53(bs，2H)，1.38(d，J＝6.6Hz，3H)。 
结果表明，本发明的上述实施例中的转氨酶均可得到类似的收率和对映体纯度，获得相应的R构型手性胺。 
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明公开的新型转氨酶催化了氨基供体中的氨基转移给前手性酮或醛类，从而产生相应R构型的手性胺，利用本发明的新型转氨酶的合成方法可以得到高纯度的目标产物，所得产品光学纯度稳定在98％以上。所述合成方法采用的原料易得，方法简单，化学反应条件温和，收率和对映体的纯度均很高，整个生产过程中，操作简单，是可行的、污染较低的合成工艺，为制备手性胺提供了一种新的思路和方法。 
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 
。

Claims (11)

1.一种转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列包含选自如下序列之一的序列：
a)如SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO.：2或4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列不是如SEQ IDNO.：5或6所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；
c)在SEQ ID NO.：2或4中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而由SEQ ID NO.：2或4中衍生而来且具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶活性的蛋白质，其中该氨基酸序列不是如SEQ ID NO.：5或6所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；
其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1倍。
2.根据权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列是将SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列的第38位上的亮氨酸替换为异亮氨酸的氨基酸序列。
3.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码权利要求1或2所述的转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体。
4.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列包含选自如下序列之一的序列：
a)如SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ IDNO.：5或6所示的核苷酸序列；
c)在高严谨条件下与SEQ ID NO.：1或3所示的核苷酸序列杂交且编码具有高度立体选择性-R构型催化活性的ω-转氨酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不是如SEQ IDNO.：5或6所示的核苷酸序列；
其中，高度立体选择性是指其中一个立体异构体的含量是另一个的至少约1.1倍。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中有效连接有权利要求3或4所述的核苷酸。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pET22b-CM32或pET22b-CM33。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化或转染有权利要求5或6所述的重组载体。
8.一种手性胺的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使酮类化合物、权利要求1所述的转氨酶或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，磷酸吡哆醛和氨基供体在反应体系中反应，由此获得手性胺。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述酮类化合物选自
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有促溶剂，所述促溶剂为二甲基亚砜或聚乙二醇，优选所述聚乙二醇为PEG-400。
11.根据权利要求9所述的合成手性胺的方法，其特征在于，所述C1～C8烷基为C1～C8直链烷基，所述C5～C10杂芳基为吡啶基团，所述烷氧基为C1～C6烷氧基，所述C5～C10杂环基中的杂环基为哌啶，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基上的取代基各自独立为C1～C6直链烷基、C1～C6烷氧基，所述氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。
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